第二章固相析出技術(shù)

固相析出技術(shù)：通過改變?nèi)芤簵l件或加入沉淀劑，使生化物質(zhì)以固體形式從溶液中沉降析出的分離純化稱為固相析出分離技術(shù)。前言沉淀與結(jié)晶沉淀法與結(jié)晶法都是將溶質(zhì)以固體形式從溶液中析出的方法，若析出的是晶體，則稱為結(jié)晶；析出的是無定形物質(zhì)，則稱為沉淀。

固相析出技術(shù)的種類：鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)聚合物沉淀法、金屬離子沉淀法、結(jié)晶法等區(qū)別：

構(gòu)成單位（原子、離子或分子）的排列方式不同晶體：有規(guī)則無定形沉淀：無規(guī)則

條件緩慢變化時(shí)，溶質(zhì)分子有足夠時(shí)間排列，有利于結(jié)晶形成；條件變化劇烈，強(qiáng)迫快速析出，溶質(zhì)分子來不及排列就析出，形成無定形沉淀。結(jié)晶法：高度的選擇性（原因：只有同類分子或離子才能排列成晶體）。沉淀法：濃縮與分離，但所得的沉淀物聚集多種物質(zhì)，或含有鹽類，或包裹著溶劑。分離效果

沉淀法：利用某種沉淀劑或改變條件，使所需提取的物質(zhì)或雜質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程。具有濃縮和分離的雙重作用。在蛋白質(zhì)、酶、多肽、核酸和其他細(xì)胞組分的回收和分離中應(yīng)用的很多。沉淀需要考慮的因素沉淀劑或者沉淀?xiàng)l件對(duì)生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)是否有破壞作用沉淀劑是否容易除去用于食品、醫(yī)藥時(shí)，沉淀劑是否對(duì)人體有害第一節(jié)鹽析法第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法第三節(jié)等電點(diǎn)沉淀法第四節(jié)其他沉淀法目錄第二章固相析出技術(shù)第五節(jié)結(jié)晶技術(shù)重點(diǎn)難點(diǎn)第二章固相析出技術(shù)掌握

鹽析法基本原理、影響鹽析的因素、鹽析操作、結(jié)晶條件的選擇與控制、結(jié)晶操作

熟悉

等電點(diǎn)沉淀法的原理、等電點(diǎn)沉淀法的操作及注意事項(xiàng)、其他沉淀方法的基本原理

了解

有機(jī)溶劑沉淀法的基本原理和影響沉淀效果的因素鹽析法第一節(jié)第二章固相析出技術(shù)應(yīng)用實(shí)例第一節(jié)鹽析法在高濃度中性鹽存在的情況下，蛋白質(zhì)（或酶）等生物大分子在水溶液中的溶解度降低并沉淀析出的現(xiàn)象，稱為鹽析。鹽析法是生物大分子制備中最常用的沉淀方法之一不同于變性，鹽析是可逆的，而變性是不可逆的。優(yōu)點(diǎn)：成本低，設(shè)備要求低，操作安全，應(yīng)用范圍廣，對(duì)生物活性物質(zhì)有穩(wěn)定作用。缺點(diǎn)：分辨率不高，一般用于初步純化階段。

蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，表面：大部分是親水基團(tuán)內(nèi)部：大部分是疏水基團(tuán)蛋白質(zhì)呈穩(wěn)定的分散狀態(tài)兩性物質(zhì)，一定pH下表面帶有一定的電荷，靜電斥力作用使分子間相互排斥蛋白質(zhì)周圍的水分子有序排列，在表面形成水化膜，這一層能保護(hù)蛋白質(zhì)粒子避免因碰撞而聚沉。一、鹽析法的原理及鹽析公式11

大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。

蛋白質(zhì)分子吸附鹽類離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥（同性相斥）；而蛋白質(zhì)與水分子的相互作用卻加強(qiáng)，溶解性增大。。12鹽析（破壞水化膜、中和電荷）

繼續(xù)增大中性鹽離子強(qiáng)度時(shí)→大量的鹽奪取了自由水，將其轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水→蛋白質(zhì)膠體外層的水化膜因鹽的奪取而遭到破壞→蛋白質(zhì)膠體表面的疏水區(qū)域暴露出來，彼此相互聚集，沉淀；第一節(jié)鹽析法（一）鹽析原理1.中性鹽離子破壞蛋白質(zhì)表面水膜2.中性鹽離子中和蛋白質(zhì)表面電荷第一節(jié)鹽析法當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時(shí)可能出現(xiàn)以下兩種情況：1)鹽溶:低鹽濃度下，增加蛋白質(zhì)分子間靜電斥力，蛋白質(zhì)溶解度增大。2)鹽析:高鹽濃度下，中和電荷、破壞水化膜，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降。

蛋白質(zhì)在水中的溶解度不僅與中性鹽離子的濃度有關(guān)，還與離子所帶電荷數(shù)有關(guān)，高價(jià)離子影響更顯著。通常用離子強(qiáng)度表示對(duì)鹽析的影響。。第一節(jié)鹽析法一、鹽析法的原理及鹽析公式（二）鹽析公式

S——蛋白質(zhì)溶解度，mol/L；

β——常數(shù),為縱坐標(biāo)上的截距;I——鹽離子強(qiáng)度,

I=1/2∑CiZi2

Ci——i離子濃度，mol/L；Zi——i離子化合價(jià)；Ks——鹽析常數(shù)。㏒S=β-ＫsＩKS是鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和鹽的種類有關(guān)，但與溫度和pH無關(guān)。β為縱坐標(biāo)上的截距，是外推截距，與蛋白質(zhì)、溫度和pH有關(guān)，與無機(jī)鹽種類無關(guān)。第一節(jié)鹽析法蛋白質(zhì)鹽析的操作方法：1.第一類叫Ks分級(jí)鹽析法——固定pH，溫度，改變鹽濃度，多用于早期的粗提液。2.第二種叫β分級(jí)鹽析法——固定離子強(qiáng)度，改變pH及溫度，多用于后期進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶。一、鹽析法的原理及鹽析公式鹽析一般最好在純化的開始階段使用。因?yàn)榧兓笃?，目的物較純，濃度往往較低。第一節(jié)鹽析法

（一）選用中性鹽的原則

1.鹽析作用要強(qiáng)

2.鹽析用鹽需有較大的溶解度

3.鹽析用鹽必須是惰性的

4.來源豐富、經(jīng)濟(jì)二、中性鹽的選擇第一節(jié)鹽析法（二）常用中性鹽種類及選擇

在蛋白質(zhì)鹽析中，常用的中性鹽有(NH4)2SO4,Na2SO4，MgSO4，NaH2PO4，NaCl，Na3PO4,K3PO4。常用于蛋白質(zhì)沉淀的鹽為硫酸銨。二、中性鹽的選擇(NH4)2SO4原因離子強(qiáng)度大，鹽析能力強(qiáng)在水中溶解度大，且溶解度隨溫度變化小，低溫下仍具有較大的溶解度穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，不易使蛋白質(zhì)變性價(jià)格低廉，不污染環(huán)境020406080100中性鹽溫度（oC）(NH4)2SO4Na2SO4MgSO4NaH2PO470.675.481.088.095.31034.918.948.345.343.342.2--34.544.454.663.670.81.67.854.182.693.8101常用鹽析劑在水中的溶解度（g/100ml水）缺點(diǎn)：高PH條件下釋放出氨，腐蝕性強(qiáng)，鹽析后要除去硫酸銨。第一節(jié)鹽析法

硫酸鈉雖無腐蝕性但低于40℃就不易溶解，因此只適用于熱穩(wěn)定性較好的蛋白質(zhì)的沉淀過程。磷酸鈉與磷酸鉀也常用于蛋白質(zhì)沉淀過程，但它們的價(jià)格較昂貴。至于其他鹽類的沉淀效果都比硫酸銨差。二、中性鹽的選擇第一節(jié)鹽析法（一）蛋白質(zhì)性質(zhì)可采取的方式是加入不同量無機(jī)鹽的辦法來分級(jí)沉淀蛋白質(zhì)，達(dá)到分離目的。

不同量的無機(jī)鹽可以用不同的飽和度來表示。（二）蛋白質(zhì)濃度

蛋白質(zhì)濃度大，鹽的用量小，共沉作用明顯，分辨率低；蛋白質(zhì)濃度小，鹽的用量大，共沉作用小、分辨率高。

一般較適當(dāng)?shù)臉悠窛舛仁?.5%-3.0%。（三）離子強(qiáng)度和類型離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)溶解度越低；陰離子的影響大于陽離子。相同離子強(qiáng)度下，半徑小的高價(jià)離子的鹽析作用較強(qiáng)，半徑大的低價(jià)離子作用較弱。三、

影響鹽析的因素第一節(jié)鹽析法（四）pH蛋白質(zhì)在pI時(shí)的溶解度最小，最容易從溶液中析出，因此選擇在被鹽析的蛋白質(zhì)的pI附近。耗鹽少，蛋白質(zhì)收率也高（五）溫度低鹽濃度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度升高而增加；一般在高鹽濃度下，溫度升高，其溶解度反而下降。

溫度適當(dāng)提高有利于蛋白質(zhì)沉淀。

高溫容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)鹽析一般在室溫下進(jìn)行，某些溫度敏感性的蛋白質(zhì)鹽析最好在低溫下進(jìn)行。

三、

影響鹽析的因素第一節(jié)鹽析法（一）鹽析用鹽的選擇（二）操作方式

1.加硫酸銨的飽和溶液

實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模生產(chǎn)中溶劑體積不大時(shí)，或硫酸銨濃度不需要太高時(shí)可采用。可防止溶液局部過濃，但料液會(huì)被稀釋，不利于下一步的分離純化。為達(dá)到一定的飽和度，所需加入的飽和硫酸銨溶液的體積可由下式求得式中V——加入的飽和硫酸銨溶液的體積，LV0——溶液的原始體積，L；

S1及S2—硫酸銨溶液初始和最終飽和度，％。四、鹽析操作過程及其注意事項(xiàng)（以硫酸銨為例）飽和硫酸銨溶液配制應(yīng)達(dá)到真正飽和，配制時(shí)加入過量的硫酸銨，加熱至50～60℃，保溫?cái)?shù)分鐘，趁熱濾去不溶物，在0～25℃下平衡1～2天，有固體析出，即達(dá)到100%飽和第一節(jié)鹽析法（二）操作方式

2.直接加固體硫酸銨

在工業(yè)生產(chǎn)溶液體積較大時(shí)，或硫酸銨濃度需要達(dá)到較高飽和度時(shí)，可采用。加入的速度不能太快，應(yīng)緩慢、均勻、少量、多次加入并充分?jǐn)嚢?，注意防止局部過濃。為達(dá)到所需的飽和度，應(yīng)加入固體硫酸銨的量，可由表查得，或由下式求得

式中:S1及S2——硫酸銨溶液初始和最終飽和度，％；X—1L溶液所需加入得固體硫酸銨的克數(shù)；G—經(jīng)驗(yàn)常數(shù)，0℃時(shí)為515；20℃為513；A—常數(shù)，0℃時(shí)為0.27；20℃為0.29。第一節(jié)鹽析法（三）脫鹽脫鹽——將小分子的鹽與目的物分開常用的脫鹽方式有兩種：①透析；②凝膠過濾透析：容器盡可能大，低溫、攪拌、常換液（旋轉(zhuǎn)透析器、連續(xù)循環(huán)透析器）凝膠過濾層析此法脫鹽時(shí)間短，效果好。第一節(jié)鹽析法（四）注意事項(xiàng)1.加固體硫酸銨時(shí)，必須看清楚“硫酸銨添加量”表上所規(guī)定的溫度，一般有室溫25℃和0℃兩種，加入固體鹽后所引起的體積變化已考慮在表中。2.分段鹽析時(shí)，要考慮到每次分段后蛋白質(zhì)濃度的變化。蛋白質(zhì)濃度不同。第一節(jié)鹽析法3.為了獲得試驗(yàn)的重復(fù)性，鹽析的條件（如pH、溫度和硫酸銨的純度）都必須嚴(yán)格控制。4.鹽析后一般須放置0.5～1小時(shí)，待沉淀完全后才過濾離心，過早的分離將影響收率，低濃度的硫酸銨溶液鹽析后固-液分離采用離心方法，高濃度硫酸銨溶液則常用過濾方法。5.鹽析過程中，攪拌必須是有規(guī)則的和溫和的。攪拌太快將引起蛋白質(zhì)的變性，其變性特征是起泡。6.為了平衡硫酸銨溶解時(shí)發(fā)生的輕微酸化作用，沉淀反應(yīng)至少應(yīng)在50mmol/L緩沖溶液中進(jìn)行。第一節(jié)鹽析法鹽析廣泛應(yīng)用于各類蛋白質(zhì)的初級(jí)純化和濃縮。例：人干擾素的培養(yǎng)液經(jīng)硫酸銨鹽析沉淀，可使人干擾素純化1.7倍，回收率99%。鹽析沉淀法不僅是蛋白質(zhì)初級(jí)純化的常用手段，在某些情況下還可用于蛋白質(zhì)的高度純化。例：從胰臟中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可利用反復(fù)鹽析沉淀并結(jié)合其他沉淀法，制備純度較高的酶制劑。五、

鹽析的應(yīng)用案例分析IgG是動(dòng)物和人體血漿的重要成分之一,試用鹽析法得到IgG粗提物。

思考題：為測(cè)定硫酸銨鹽析法分離某種蛋白質(zhì)的最佳硫酸銨濃度，請(qǐng)你設(shè)計(jì)一種工作程序測(cè)定鹽析目的蛋白質(zhì)的硫酸銨最佳濃度。鹽析范圍的確定分級(jí)鹽析沉淀實(shí)驗(yàn)分離混合蛋白質(zhì)，不同蛋白質(zhì)鹽析峰有重疊。鹽析范圍要權(quán)衡純度和回收率進(jìn)行選擇。若蛋白質(zhì)在某一范圍內(nèi)有90%的蛋白質(zhì)沉淀下來，如果鹽析范圍加寬，雖然回收率提高，但是會(huì)帶入雜蛋白，使鹽析的分辨率降低?？刹捎名}濃度對(duì)蛋白質(zhì)沉淀量的鹽析曲線測(cè)得。需回收率高，采用40-80，回收率為94%，純化倍數(shù)為1.9；如需純度高，采用48-65，回收率為75%，純化倍數(shù)為3.0。有機(jī)溶劑沉淀法第二節(jié)第二章固相析出技術(shù)有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一，常用丙酮、異丙酮、乙醇、甲醇等。定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法，稱為有機(jī)溶劑沉淀法。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法基本原理：①降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀；②有機(jī)溶劑的親水性比溶質(zhì)分子的親水性強(qiáng)，會(huì)搶奪本來與親水溶質(zhì)結(jié)合的自由水，破壞其表面的水化膜，導(dǎo)致溶質(zhì)分子間相互作用增強(qiáng)而發(fā)生聚集，從而沉淀析出。一、

有機(jī)溶劑沉淀的特點(diǎn)和基本原理溶劑介電常數(shù)溶劑介電常數(shù)水802.5mol/L尿素8420%乙醇702.5mol/L甘氨酸13740%乙醇60丙酮2260%乙醇48甲醇33100%乙醇24丙醇23部分常用溶劑介電常數(shù)介電常數(shù):表征介質(zhì)在外電場(chǎng)作用下極化程度介電常數(shù)越大,絕緣性越大優(yōu)點(diǎn)：分辨能力比鹽析高,即一種生物分子或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉析；有機(jī)溶劑沸點(diǎn)低，容易除去或回收，產(chǎn)品更純凈，分離容易。缺點(diǎn)：是某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，沉淀操作需在低溫下進(jìn)行；需用大量的有機(jī)溶劑，成本較高，且易燃易爆。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法（一）有機(jī)溶劑選擇的基本標(biāo)準(zhǔn)

1.介電常數(shù)要小，沉淀作用強(qiáng)2.致變性作用要小，對(duì)生物大分子的變性作用小3.毒性要小、揮發(fā)性適中4.水溶性要好，與水無限互溶二、

常用的有機(jī)溶劑及其選擇（二）常用的有機(jī)溶劑

沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法二、

常用的有機(jī)溶劑及其選擇溶劑用量V=V0（S2－S1）/（100－S2）

V:需加入有機(jī)溶劑體積；V0：原溶液體積；S1：原溶液中有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)，%；S2：所需要的有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)，%。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法二、

常用的有機(jī)溶劑及其選擇案例：果膠是一種廣泛分布在植物體內(nèi)的膠體性多糖物質(zhì)，包括原果膠、水溶性果膠和果膠酸三大類。用酸提取沉淀法時(shí)可以選擇乙醇沉淀法或者鹽析法。請(qǐng)選擇較為優(yōu)化的方法，并說明理由。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法（一）溫度

（低溫）進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀，溫度重要的因素。大多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度降低減小，故低溫沉淀較為完全；生物大分子在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度敏感，易變性，且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)。在用有機(jī)溶劑沉淀生物大分子時(shí)，操作是在低溫下進(jìn)行的，同時(shí)要保持低溫的恒定。三、影響有機(jī)溶劑沉淀的因素第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法（一）溫度

（低溫）具體操作，待分離的溶液和有機(jī)溶劑分別進(jìn)行預(yù)冷。有機(jī)溶劑必須預(yù)先冷至較低溫度，一般在0℃以下，操作時(shí)要在冰浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑必須緩慢，并不斷攪拌以免局部濃度過濃。為減少變性作用，通常低溫沉淀短時(shí)間（0.5-2h）后進(jìn)行過濾或離心分離；真空抽去剩余溶劑或者沉淀溶于緩沖液中，減少目的物與有機(jī)溶劑的接觸。三、影響有機(jī)溶劑沉淀的因素第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法（二）樣品濃度樣品濃度低時(shí)增加有機(jī)溶劑投入量和損耗，降低了溶質(zhì)回收率，易產(chǎn)生稀釋變性，但共沉的作用小，有利于提高分離效果；對(duì)于高濃度的生物樣品，節(jié)省了有機(jī)溶劑，減少了變性的危險(xiǎn)，但共沉作用大，分離效果下降。

蛋白質(zhì)（5-20mg/ml）0.5％～2％，粘多糖（10-20mg/ml）1％～2％三、影響有機(jī)溶劑沉淀的因素第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法（三）pH盡可能選擇樣品溶解度最低的pH，通常是選在等電點(diǎn)附近，以提高該沉析的分辨能力;要選擇在樣品穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，少數(shù)生物分子在等電點(diǎn)附近不穩(wěn)定，影響其活性。盡量避免目的物與雜質(zhì)帶相反電荷而加劇共沉現(xiàn)象的發(fā)生。三、影響有機(jī)溶劑沉淀的因素注意：使溶液中大多數(shù)蛋白質(zhì)帶相同電荷，不要讓目的物與主要雜質(zhì)分子帶相反電荷，以致出現(xiàn)較嚴(yán)重的共沉作用。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法（四）離子強(qiáng)度

低鹽：有利于沉淀，還有保護(hù)蛋白質(zhì)，防止變性。高鹽：增大蛋白質(zhì)溶解度，降低效果，沉淀物中可能夾帶鹽。

一般中性鹽濃度以0.01～0.05mol/L為好，常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化鈉等。三、影響有機(jī)溶劑沉淀的因素第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法三、影響有機(jī)溶劑沉淀的因素（五）多價(jià)金屬離子的影響某些金屬離子具有助沉作用，蛋白質(zhì)與Zn2+、Ca2+等形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)在水和有機(jī)溶液中的溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉析形成，并降低有機(jī)溶劑的耗量；0.005～0.02mol/L的Zn2+可使有機(jī)溶劑用量減少l/3至1/2；使用時(shí)要避免會(huì)與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子(如磷酸根)的存在。實(shí)際操作時(shí)，經(jīng)常預(yù)先加入有機(jī)溶劑除雜蛋白，再加陽離子Zn2+、Ca2+沉淀目的物。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法總結(jié)：1、有機(jī)溶劑沉淀法經(jīng)常用于蛋白質(zhì)、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分離，使用時(shí)先選擇合適的有機(jī)溶劑，然后注意調(diào)整樣品的濃度、溫度、pH和離子強(qiáng)度，來達(dá)到最佳效果。2、沉淀所得到的固體樣品，盡可能抽干沉淀，減少其中有機(jī)溶劑的含量。第二節(jié)有機(jī)溶劑沉淀法三、

影響有機(jī)溶劑沉淀的因素應(yīng)用實(shí)例胰島素的精制胰島素粗提液調(diào)pH4.2加30%丙酮調(diào)pH6.0加Zn2+上清液上清液（回收）沉析(胰島素鋅鹽)沉析（雜蛋白）應(yīng)用實(shí)例-乙醇沉淀法提取柑橘皮中的果膠材料新鮮柑橘皮50g正磷酸、0.2mol/L鹽酸、焦磷酸鈉（又稱磷酸四鈉）組織搗碎機(jī)、大燒杯（≥500mL）、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、搪瓷桶、酸度計(jì)、不銹鋼鍋提取液分離將提取液加入1％的硅藻土作助濾劑，然后送入板框壓濾機(jī)，過濾后得無色透明的果膠稀溶液，濾渣棄去。濃縮將過濾收集的濾液置于真空濃縮裝置中，于75℃溫度下濃縮，直至濃縮到果膠濃度為4％左右。沉析將濃縮液置于搪瓷桶中，并冷至室溫，然后乙醇以噴淋方式加至已濃縮好的果膠溶液中，乙醇含量控制在40-50％的范圍內(nèi)，不斷攪動(dòng)，果膠聚結(jié)成海綿狀析出。分離將果膠/乙醇混合物經(jīng)1~2h靜置后，送入板框壓濾機(jī)過濾。收集濾餅(果膠)，然后用80％乙醇溶液洗滌濾餅1~2次，再用95％的乙醇洗滌1~2次，洗完后壓干。干燥將以上濾好的果膠置于真空干燥器中于55℃左右干燥，即得果膠純品。應(yīng)用實(shí)例-銀耳多糖的提取純化銀耳多糖主要成分含有酸性雜多糖、中性雜多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖不含核酸、蛋白質(zhì)類物質(zhì)實(shí)驗(yàn)儀器：燒杯、布氏漏斗、抽濾瓶、分液漏斗、量筒、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、透析袋、濾紙、組織搗碎機(jī)、不銹鋼鍋。實(shí)驗(yàn)試劑：（1）1％復(fù)合酶制劑(含果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶食品級(jí)復(fù)合酶)；（2）2％溴化十六烷基三甲銨（CTAB）配制：取2gCTAB溶于100mL蒸餾水中，搖勻備用；（3）α-萘酚配制：α-萘酚5g溶于95％乙醇；（4）5%三氯乙酸-正丁醇溶液；（5）2mol／L的氫氧化鈉溶液；（6）0.5％甲苯胺乙醇溶液；（7）2mol／L氯化鈉溶液；（8）2mol／L鹽酸溶液；（9）活性炭；硅藻土。（10）1％融菌酶制劑；（11）無水乙醇；（12）濃硫酸；（13）乙醚。1.銀耳預(yù)處理

20g不銹鋼鍋中

加水1600mL

20℃～25℃浸泡30min

搗碎機(jī)中搗碎

銀耳漿液

2mol／L鹽酸溶液調(diào)pH至6.3

加入1％復(fù)合酶制劑

50℃下酶促反應(yīng)40min

銀耳漿液

2.酶浸提

80℃滅酶，保溫浸提約1.5h

80℃水浴濃縮

等體積5％三氯乙酸-正丁醇溶液

搖勻

離心（3000r/min）15min

濃縮液

3.多糖的沉淀（有機(jī)酸除雜）

下層清液備用

吸去上層正丁醇中層變性蛋白

2mol／L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7

搖勻

抽濾

3.多糖的沉淀（脫色、透析

）

下層清液備用

加1％活性炭80℃加熱15min脫色

濾液扎袋流水透析12h

80℃水浴濃縮抽濾

加3倍量95％乙醇

搖勻

3.多糖的沉淀（乙醇沉析

）

抽濾液離心（3000r/min）15min

沉淀用無水乙醇洗2次

乙醚洗滌1次

50℃以下真空干燥

作業(yè)：用丙酮沉淀大蒜細(xì)胞中的SOD酶第二章固相析出技術(shù)等電點(diǎn)沉淀法第三節(jié)第二章固相析出技術(shù)第三節(jié)等電點(diǎn)沉淀法一、

等電點(diǎn)沉淀法原理

等電點(diǎn)沉淀的定義：利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的特性，向含有目的藥物成分的混合液中加入酸或堿，調(diào)節(jié)其pH，是蛋白質(zhì)沉淀析出的方法，稱為等電點(diǎn)沉淀法。

等電點(diǎn)沉淀可以單獨(dú)使用，也可以和鹽析法、有機(jī)溶劑法以及其他沉淀法一起使用，提高沉淀的效果。

既可用于生化物質(zhì)的提取，也可用于去除雜蛋白二、等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)(pI)是兩性物質(zhì)在其質(zhì)點(diǎn)的凈電荷為零時(shí)介質(zhì)的pH值，溶質(zhì)凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，沉淀析出，此時(shí)溶質(zhì)的溶解度最低。在等電點(diǎn)時(shí)，許多物理性質(zhì)如黏度、膨脹性、滲透壓都變小，有利于懸浮液的過濾。一、

等電點(diǎn)沉淀法原理第三節(jié)等電點(diǎn)沉淀法

等電點(diǎn)沉淀法的操作條件：

①低離子濃度的溶液；pH=pI；大部分蛋白質(zhì)等電點(diǎn)是在偏酸性范圍，所以操作中可以加入無機(jī)酸調(diào)節(jié)pH。②適用于疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)；應(yīng)用實(shí)例工業(yè)生產(chǎn)胰島素（pH5.3）時(shí)，先調(diào)節(jié)pH至8.0除去堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)節(jié)pH至3.0除去酸性蛋白質(zhì)，同時(shí)配合其他沉淀技術(shù)以提高沉淀效果。二、等電點(diǎn)沉淀法操作③通常與鹽析、有機(jī)溶劑沉淀法等聯(lián)合使用。63實(shí)例①從豬胰臟中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，除去共存的許多酸性蛋白質(zhì)(pI=3．O)。工業(yè)生產(chǎn)胰島素(pI＝5.3)時(shí)，先調(diào)pH至8.0除去堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)pH至3.0除去酸性蛋白質(zhì)(同時(shí)加入一定濃度的有機(jī)溶劑以提高沉淀效果)。②堿性磷酸酯酶的pI沉淀提取：發(fā)酵液調(diào)pH4.0后出現(xiàn)含堿性磷酸酯酶的沉淀物，離心收集沉淀物。用pH9.0的0.1mol/LTris-HCl緩沖液重新溶解，加入20～40%飽和度的硫酸銨分級(jí)，離心收集的沉淀Tris-HCl緩沖液再次沉淀，即得較純的堿性磷酸酯酶。第三節(jié)等電點(diǎn)沉淀法不同蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)

目的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)比較高，可以先調(diào)至低于等電點(diǎn)的雜蛋白。比如：細(xì)胞色素C的等電點(diǎn)為10.7，調(diào)節(jié)pH=6.0除去酸性蛋白，再調(diào)pH為7.5-8.0除去酸性蛋白。2.同一種蛋白質(zhì)在不同條件下等電點(diǎn)不同由于無機(jī)離子的影響，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)通常會(huì)發(fā)生“漂移”。

陽-高，陰-低。三、等電點(diǎn)沉淀法的操作注意事項(xiàng)第三節(jié)等電點(diǎn)沉淀法3.目的藥物成分對(duì)pH的要求盡可能避免直接用強(qiáng)酸強(qiáng)堿；

盡量不引入新的物質(zhì)；4.考慮采用幾種方法結(jié)合來實(shí)現(xiàn)沉淀分離三、等電點(diǎn)沉淀法的操作注意事項(xiàng)應(yīng)用在生化產(chǎn)品的分離純化過程中，常利用兩性物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸等具有不同的等電點(diǎn)的特性來進(jìn)行產(chǎn)品的分離純化。等電點(diǎn)沉淀只適用于水化程度不大，在等電點(diǎn)時(shí)溶解度很低的物質(zhì)，如四環(huán)素等在等電點(diǎn)(pH=5.4)附近，難溶于水，能產(chǎn)生沉析；疏水性較大的蛋白質(zhì)（如酪蛋白）可以與其他沉淀方法結(jié)合使用應(yīng)用實(shí)例等電點(diǎn)沉淀法分離牛乳中的酪蛋白材料鮮牛奶醋酸鈉、優(yōu)級(jí)純醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸餾水、0.2mol/LpH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液等電點(diǎn)沉淀法分離牛乳中的酪蛋白將鮮牛奶30mL及醋酸-醋酸鈉緩沖液30mL分別水浴加熱40℃左右，并用8層紗布過濾牛奶量取加熱后的牛奶20ml，在攪拌下慢慢加入加熱后的醋酸-醋酸鈉緩沖液20ml，用酸度計(jì)調(diào)pH至4.7將上述混合液冷至室溫，離心（3500r/min）15min，棄去上清液，得酪蛋白粗制品用緩沖液洗沉淀3次，離心（3500r/min）10min，棄去上清液在沉淀中加入20ml乙醇，攪拌片刻，將全部的懸濁液轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾，用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干將沉淀攤開在表面皿上，風(fēng)干得酪蛋白純品準(zhǔn)確稱量，計(jì)算含量和收率其他沉淀法第四節(jié)第二章固相析出技術(shù)第四節(jié)其他沉淀法

一、

非離子型聚合物沉淀法

某些水溶性非離子型高分子聚合物，包括不同相對(duì)分子質(zhì)量的聚乙二醇（polyethyeneglycol，簡(jiǎn)寫成PEG）、聚乙烯吡咯烷酮和葡萄糖等，都能使蛋白質(zhì)水合作用減弱而發(fā)生沉淀。

應(yīng)用最多的是聚乙二醇，它的親水性強(qiáng)，溶于水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有廣范圍的相對(duì)分子質(zhì)量。第四節(jié)其他沉淀法

1.PEG沉淀作用的機(jī)制（1）共沉淀作用；（2）聚合物親水性強(qiáng)，使得生物大分子脫水而發(fā)生沉淀；（3）聚合物與生物大分子之間以氫鍵作用形成復(fù)合物，在重力作用下形成沉淀；（4）通過空間位阻，生物大分子聚集在一起形成沉淀。

一、

非離子型聚合物沉淀法第四節(jié)其他沉淀法2.PEG的沉淀效果主要與PEG的濃度和相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān)，同時(shí)還受離子強(qiáng)度、溶液pH和溫度等因素的影響。在PEG一定濃度條件下，相對(duì)分子量越大，沉淀效果越好；一般，PEG濃度為20%；生物大分子相對(duì)分子質(zhì)量越高，沉淀效果越好。第四節(jié)其他沉淀法3.PEG沉淀法的主要優(yōu)點(diǎn)條件溫和；沉淀效果好；沉淀后多聚物易除去，也可回收。4.除去PEG的方法有：吸附法（離子交換層析）、乙醇沉淀法（20%乙醇沉淀）、鹽析法（35%硫酸銨沉淀）第四節(jié)其他沉淀法（一）金屬離子沉淀法1.與羧基、含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物強(qiáng)烈結(jié)合的金屬離子，如Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+；2.與羧基結(jié)合而不與含氮化合物結(jié)合的金屬離子，如Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+；3.與巰基化合物強(qiáng)烈結(jié)合的金屬離子，如Hg2+、Ag+、Pb2+。復(fù)合物中金屬離子的去除，可用離子交換法或EDTA金屬螯合劑。二、

成鹽沉淀法（二）有機(jī)酸沉淀法1.鞣酸（單寧）2.雷凡諾3.三氯乙酸（TCA）（三）無機(jī)酸沉淀法磷鎢酸、磷鉬酸等能與陽離子形式的蛋白質(zhì)形成溶解度極低的復(fù)合鹽，從而使蛋白質(zhì)沉淀析出。第四節(jié)其他沉淀法

選擇一定的條件，使溶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀下來，與目的物分開。

按方法分類：①選擇性變性劑——利用生物大分子對(duì)變性劑的敏感性不同；②選擇性熱變性——利用生物大分子對(duì)熱的穩(wěn)定性不同；③選擇性酸堿變性——利用生物大分子對(duì)pH的穩(wěn)定性不同。三、

選擇性變性沉淀法

選擇性變性沉淀法是使雜質(zhì)變性沉淀，又對(duì)目的物沒有明顯影響，所以在操作之前要對(duì)欲分離的物質(zhì)中的雜蛋白等雜質(zhì)的種類、含量及其物理化學(xué)性質(zhì)等有比較全面的了解。應(yīng)用實(shí)例：對(duì)于α-淀粉酶等熱穩(wěn)定性好的酶，可以通過加熱進(jìn)行熱處理，使大多數(shù)雜蛋白受熱變性沉淀而被除去。第四節(jié)其他沉淀法

1、表面活性劑或有機(jī)溶劑變性分離例如：核酸提取和蛋白質(zhì)的變性電泳過程中，乙醇、飽和酚、氯仿、SDS等試劑的加入都是為了沉淀蛋白質(zhì)的。

2、熱變性：在較高溫度下，熱穩(wěn)定性差的蛋白質(zhì)將發(fā)生變性沉淀，利用這一現(xiàn)象，可根據(jù)蛋白質(zhì)間的熱穩(wěn)定性的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)的熱沉淀，分離純化熱穩(wěn)定性高的目標(biāo)產(chǎn)物。適用對(duì)象：熱穩(wěn)定性高的蛋白質(zhì)第四節(jié)其他沉淀法例如：脂肪酶和淀粉酶對(duì)熱的敏感性

40℃、pH3.4下處理2.5小時(shí)，可將黑曲霉發(fā)酵液中90％以上的淀粉酶除去。又如：大豆蛋白對(duì)熱的敏感性

50～60℃時(shí)，大豆蛋白開始變性，70～80℃大部分蛋白變性沉淀，煮沸后蛋白從溶液中分離出來。

第四節(jié)其他沉淀法3、選擇性的酸堿變性例如：2.5％的TCA處理胰蛋白酶、抑肽酶或細(xì)胞色素Ｃ等粗酶提取物，可去除大量雜蛋白。對(duì)大豆蛋白而言，當(dāng)酸堿濃度過高（pH低于2.2或高于12時(shí)），蛋白質(zhì)會(huì)出現(xiàn)明顯的變性現(xiàn)象。

課后作業(yè)請(qǐng)結(jié)合本課所學(xué)各種沉淀技術(shù)，查找相關(guān)文獻(xiàn)，撰寫一個(gè)沉淀技術(shù)（鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或等電點(diǎn)沉淀法），應(yīng)用于生物大分子分離的實(shí)例，包括實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理和實(shí)驗(yàn)方案（200字左右）。結(jié)晶技術(shù)第五節(jié)第二章固相析出技術(shù)第五節(jié)結(jié)晶技術(shù)結(jié)晶技術(shù)是溶質(zhì)從過飽和溶液中以晶體狀態(tài)析出的操作技術(shù)。結(jié)晶過程沒有其他物質(zhì)的引入，結(jié)晶操作的選擇性高，可制備高純度或者超純產(chǎn)品。通過結(jié)晶的產(chǎn)品均有一定的外形，便于干燥、包裝、運(yùn)輸、貯存等。（1）固體的兩種狀態(tài)：結(jié)晶、無定形固體

1）結(jié)晶：析出速度慢，溶質(zhì)分子有足夠時(shí)間進(jìn)行排列，粒子排列有規(guī)則2）沉淀：無定形固體，析出速度快，粒子排列無規(guī)則第五節(jié)結(jié)晶技術(shù)（2）結(jié)晶的概念：結(jié)晶是制備純物質(zhì)的有效方法。溶液中的溶質(zhì)在一定條件下，因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體。（3）結(jié)晶的特征：通常只有同類分子或者離子才能排列成晶體，所以結(jié)晶過程有很好的選擇性。晶體的化學(xué)成分均一，具有各種對(duì)稱的晶體，離子和分子在空間晶格的結(jié)點(diǎn)上呈規(guī)則的排列。第五節(jié)結(jié)晶技術(shù)（4）結(jié)晶過程的特點(diǎn)①能從雜質(zhì)含量相當(dāng)多的溶液或多組分的熔融混合物中形成純凈的晶體。②結(jié)晶過程可賦予固體產(chǎn)品以特定的晶體結(jié)構(gòu)和形態(tài)。③能量消耗少，操作溫度低，對(duì)設(shè)備材質(zhì)要求不高。④結(jié)晶產(chǎn)品包裝、運(yùn)輸、儲(chǔ)存或使用都很方便。一、結(jié)晶過程溶液達(dá)到過飽和是結(jié)晶的前提溶液的過飽和度是結(jié)晶的推動(dòng)力。第五節(jié)結(jié)晶技術(shù)溶解度曲線與過飽和曲線示意圖結(jié)晶，是指溶質(zhì)自動(dòng)從過飽和溶液中析出新相的過程。包括三個(gè)過程：①過飽和溶液的形成；②晶核的生成；③晶體的成長(zhǎng)。第五節(jié)結(jié)晶技術(shù)1.

過飽和溶液的形成方法（1）溶劑蒸發(fā)法：要求物質(zhì)具有一定的熱穩(wěn)定性（2）溫度誘導(dǎo)法：熱盒技術(shù)（適合耐熱的生化物質(zhì)）（3）鹽析結(jié)晶法：生物大分子及酶類藥物常用方法（4）透析結(jié)晶法：結(jié)晶條件苛刻的蛋白質(zhì)（5）有機(jī)溶劑結(jié)晶法（乙醇、丙酮、甲醇、丁醇等）（6）等電點(diǎn)法（常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法一起使用）（7）化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法：調(diào)節(jié)溶液的pH或向溶液中加入反應(yīng)劑，生成新物質(zhì)，結(jié)晶析出。（8）共沸蒸餾結(jié)晶二、

結(jié)晶過程第五節(jié)結(jié)晶技術(shù)2.晶核的形成溶質(zhì)在溶液中成核現(xiàn)象即生成晶核，按照成核機(jī)制不同分為初級(jí)成核和二次成核。晶核形成的幾種機(jī)制工業(yè)結(jié)晶操作一般是在有晶種的存在下進(jìn)行，有幾種不同的起晶方法：自然起晶法、刺激起晶法、晶種起晶法。晶種起晶法容易控制，所得晶型形狀、大小均理想。第五節(jié)結(jié)晶技術(shù)3.晶體的生長(zhǎng)晶體生長(zhǎng)速度是影響晶體產(chǎn)品粒度大小的一個(gè)重要因素。二、

結(jié)晶過程實(shí)際生產(chǎn)中，一般希望得到粗大而均勻的晶體，因?yàn)檫@樣的晶體便于以后的過濾、洗滌、干燥等操作，且產(chǎn)品質(zhì)量也較高。一般情況下，過飽和度增大，攪拌速率提高，溫度升高，都有利于晶體的生長(zhǎng)。第五節(jié)結(jié)晶技術(shù)

晶體質(zhì)量包括以下三方面：

晶體大小

晶體形狀

晶體純度內(nèi)在質(zhì)量二、結(jié)晶條件的選擇和控制外觀性狀

由結(jié)晶過程可知，溶液的過飽和度、結(jié)晶溫度、時(shí)間、攪拌以及晶種加入等操作條件對(duì)于晶體的質(zhì)量有很大影響。實(shí)際生產(chǎn)時(shí)，必須根據(jù)藥物在粒度大小、分布、晶型以及純度等方面的要求，選擇合理的結(jié)晶條件，并嚴(yán)格控制結(jié)晶過程。

工業(yè)上通常希望得到粗大而均勻的晶體，便于過濾與洗滌，在儲(chǔ)存過程中也不容易結(jié)塊。但某些抗生素作為藥品時(shí)有其特殊要求，如：非水溶性抗生素一般為了使人體容易吸收，粒度要求較細(xì)。第五節(jié)結(jié)晶技術(shù)

（1）過飽和度

（2）晶漿濃度

（3）溫度

（4）時(shí)間（5）溶劑

pH二、

結(jié)晶條件的選擇和控制過飽和度高－成核速度大于晶體生長(zhǎng)的速度（晶體細(xì)?。┻^飽和度低－成核速度小于晶體生長(zhǎng)的速度（晶體粗大）

一般要求在較低的溫度下結(jié)晶;

降溫快，則結(jié)晶顆粒小；降溫慢，則結(jié)晶顆粒大。

生化小分子，水、乙醇、甲醇、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、異丙醇、丁醇、乙醚、N-甲基甲酰胺等溶劑使用較多。蛋白質(zhì)、酶和核酸等大分子，使用較多的是硫酸銨溶液、氯化鈉溶液、磷酸緩沖液、Tris緩沖液和丙酮、乙醇等。第五節(jié)結(jié)晶技術(shù)

（6）晶種

（7）攪拌與混合

（8）結(jié)晶系統(tǒng)的晶垢

（9）共存雜質(zhì)的影響

二、

結(jié)晶條件的選擇和控制工業(yè)生產(chǎn)中對(duì)于不易結(jié)晶的物質(zhì)常采用加入晶種的方法，提高結(jié)晶速率。選擇攪拌槳的形式，確定適宜的攪拌速率。第五節(jié)結(jié)晶技術(shù)

結(jié)晶操作的方法有：分批結(jié)晶和連續(xù)結(jié)晶兩種。

（1）分批結(jié)晶分批結(jié)晶有以下4種操作方式。

1）不加晶種，迅速冷卻：無控制結(jié)晶

2）不加晶種，緩慢冷卻：對(duì)結(jié)晶過程控