HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化中的調(diào)控機(jī)制研究：從分子到臨床的深入探索一、引言1.1研究背景與意義慢性腎臟疾?。–KD）已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題。據(jù)統(tǒng)計，CKD約占全球人口的8%-16%，我國CKD發(fā)病率約為10.8%，且發(fā)病率呈穩(wěn)步上升趨勢。絕大多數(shù)CKD均可導(dǎo)致腎纖維化，如原發(fā)性腎小球疾病、慢性腎盂腎炎、狼瘡性腎炎和糖尿病腎病等。腎纖維化是多種CKD的共同結(jié)局，其主要病理改變?yōu)槟I臟組織內(nèi)纖維結(jié)締組織增多，實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少。當(dāng)腎纖維化持續(xù)進(jìn)展，會導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)破壞和功能減退，乃至衰竭，最終發(fā)展為終末期腎?。‥SRD）。腎小管間質(zhì)纖維化是腎纖維化的重要組成部分，在CKD進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。腎小管間質(zhì)纖維化以腎間質(zhì)中細(xì)胞及膠原成分聚集增多、伴腎小管萎縮和擴(kuò)張變形、小管周圍毛細(xì)血管減少、荒廢、腎單位進(jìn)行性破壞、致腎小球?yàn)V過率持續(xù)下降為特點(diǎn)。臨床研究表明，腎小管間質(zhì)損害程度是反映腎功能下降嚴(yán)重程度和判斷預(yù)后最重要的指標(biāo)。一旦腎小管間質(zhì)發(fā)生纖維化，腎臟功能將受到嚴(yán)重影響，患者可能出現(xiàn)水腫、高血壓、蛋白尿、血尿、夜尿增多等癥狀，隨著病情進(jìn)展，還會引發(fā)腎功能不全、慢性腎衰竭至尿毒癥，出現(xiàn)多臟器功能障礙或衰竭，如心力衰竭、呼吸衰竭、肝瘀血、肺水腫、水電解質(zhì)及酸堿平衡紊亂、感染等，嚴(yán)重威脅患者生命健康。對患者而言，CKD導(dǎo)致的終末期腎病往往需要終生接受透析或腎移植治療，這不僅給患者帶來極大的身心痛苦，也給家庭、醫(yī)療機(jī)構(gòu)和社會造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而，目前針對腎纖維化的治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)。直接靶向腎纖維化較為困難，現(xiàn)有的治療腎纖維化的藥物大多是通過多靶點(diǎn)、多途徑來緩解纖維化的發(fā)生。目前進(jìn)入臨床應(yīng)用及試驗(yàn)的藥物主要有腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）抑制劑、腎素阻斷劑、鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑（MRA）、CC類趨化因子受體2抑制劑、鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體（SGLT2抑制劑）、磷酸二酯酶抑制劑、利妥昔單抗、內(nèi)皮素受體拮抗劑、TGF-β1拮抗劑、結(jié)締組織生長因子阻斷劑等。但目前針對纖維化的上市藥物僅吡非尼酮和尼達(dá)尼布兩種，且它們均為多靶點(diǎn)抑制劑，適應(yīng)癥主要為肺纖維化，由于副作用問題，難以在腎纖維化患者中廣泛應(yīng)用。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和藥物對于改善腎纖維化患者的預(yù)后至關(guān)重要。近年來，同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2（HIPK2）已被確認(rèn)為調(diào)節(jié)炎癥及腎纖維化的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，HIPK2蛋白表達(dá)水平在多種動物模型及腎病患者中升高。高表達(dá)的HIPK2可通過多種機(jī)制致使腎小管間質(zhì)纖維化，例如活化p53，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡；激活TGFβ-Smad3和Wnt-Notch信號通路，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)多種纖維化標(biāo)記物，包括αSMA、I型膠原和纖連蛋白等。HIPK2促腎纖維化的作用在多個轉(zhuǎn)基因動物模型中得到證實(shí)，其高表達(dá)在人類局灶節(jié)段性腎小球硬化病、糖尿病腎病和IgA腎病中也得到確認(rèn)，這表明HIPK2在腎纖維化治療中具有作為新潛在靶點(diǎn)的可能性。深入研究HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化中的調(diào)控機(jī)制，有望為腎纖維化的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對于HIPK2在腎纖維化中的研究起步較早。2012年，美國西奈山醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊在《自然醫(yī)學(xué)》上發(fā)表重要研究成果，他們通過對三種小鼠纖維化模型（攜帶HIV病毒蛋白基因小鼠、高劑量葉酸注射小鼠以及單側(cè)腎臟過濾封阻小鼠）的研究，運(yùn)用新計算系統(tǒng)生物學(xué)方法及軟件，發(fā)現(xiàn)HIPK2蛋白激酶在腎間質(zhì)纖維化小鼠中高度活躍，且HIPK2能調(diào)控特定基因表達(dá)，其高度活躍會導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。后續(xù)研究進(jìn)一步表明，高表達(dá)的HIPK2可通過激活TGFβ-Smad3和Wnt-Notch信號通路，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)αSMA、I型膠原和纖連蛋白等纖維化標(biāo)記物，促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化。同時，在人類局灶節(jié)段性腎小球硬化病、糖尿病腎病和IgA腎病患者樣本中，也確認(rèn)了HIPK2的高表達(dá)。在國內(nèi)，相關(guān)研究也在逐步深入。眾多學(xué)者利用動物模型和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，對HIPK2在腎纖維化中的作用機(jī)制進(jìn)行探索。有研究通過構(gòu)建單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）小鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型小鼠腎臟中HIPK2表達(dá)顯著升高，且與腎間質(zhì)纖維化程度呈正相關(guān)。在細(xì)胞水平，用高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞，可誘導(dǎo)HIPK2表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，加劇纖維化進(jìn)程。但國內(nèi)研究多集中在驗(yàn)證HIPK2與腎纖維化的關(guān)聯(lián)及相關(guān)信號通路的初步探索，對于HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化中更深入的調(diào)控機(jī)制，如HIPK2與其他信號分子的交互作用、其在不同細(xì)胞類型中的特異性調(diào)控等方面，研究還相對較少。在腎小管間質(zhì)纖維化整體研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者已明確多種參與其發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素，如轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）等。針對這些靶點(diǎn)的治療研究也取得一定進(jìn)展，像RAS抑制劑在臨床已廣泛應(yīng)用，能在一定程度上延緩腎纖維化進(jìn)程。但這些治療方法存在局限性，無法完全阻止疾病進(jìn)展。目前，對于HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化中的研究仍存在諸多空白。雖然已知HIPK2能通過多條信號通路促進(jìn)纖維化，但HIPK2自身的活性調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全明確，例如何種上游信號分子或細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化能精準(zhǔn)調(diào)控HIPK2的表達(dá)和活性。此外，HIPK2與其他已知的腎纖維化相關(guān)因子之間是否存在協(xié)同或拮抗作用，以及這些相互作用如何影響腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，也有待進(jìn)一步研究。同時，盡管HIPK2作為腎纖維化治療潛在靶點(diǎn)已受到關(guān)注，但如何開發(fā)高效、低毒的HIPK2抑制劑，并將其成功轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用，還需要大量深入的研究。本文將聚焦于HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化中的調(diào)控機(jī)制，從細(xì)胞和動物水平深入探究，有望填補(bǔ)相關(guān)研究空白，為腎纖維化治療提供新的理論依據(jù)和治療思路，具有一定的創(chuàng)新性。1.3研究目標(biāo)與方法1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在深入探討同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2（HIPK2）在腎小管間質(zhì)纖維化中的調(diào)控機(jī)制，具體目標(biāo)如下：明確HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化中的作用：通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，觀察HIPK2表達(dá)變化對腎小管間質(zhì)纖維化相關(guān)指標(biāo)的影響，包括細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的沉積、腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等，確定HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)程中是促進(jìn)還是抑制作用。揭示HIPK2調(diào)控腎小管間質(zhì)纖維化的分子機(jī)制：研究HIPK2參與的信號通路，如TGFβ-Smad3、Wnt-Notch等信號通路，以及HIPK2與其他已知腎纖維化相關(guān)因子之間的相互作用，明確HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制。探索以HIPK2為靶點(diǎn)的潛在治療策略：基于對HIPK2調(diào)控機(jī)制的研究，評估針對HIPK2的干預(yù)措施，如使用HIPK2抑制劑或基因沉默技術(shù)，對腎小管間質(zhì)纖維化的治療效果，為腎纖維化的臨床治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。1.3.2研究方法為實(shí)現(xiàn)上述研究目標(biāo)，本研究將綜合運(yùn)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動物實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，從多個層面深入探究HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化中的調(diào)控機(jī)制。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng)與處理：選用人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）和小鼠腎小管上皮細(xì)胞（TCMK-1細(xì)胞）進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞分為對照組、模型組、HIPK2過表達(dá)組、HIPK2抑制組等。模型組通過給予TGF-β1刺激來誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT及纖維化相關(guān)改變；HIPK2過表達(dá)組通過轉(zhuǎn)染HIPK2過表達(dá)質(zhì)粒來上調(diào)HIPK2表達(dá)；HIPK2抑制組則利用siRNA干擾技術(shù)或特異性抑制劑來下調(diào)HIPK2表達(dá)。檢測指標(biāo)與方法：采用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測纖維化相關(guān)基因（如αSMA、I型膠原、纖連蛋白等）、EMT相關(guān)基因（如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等）以及HIPK2和相關(guān)信號通路分子的mRNA表達(dá)水平；運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測上述基因的蛋白表達(dá)水平；通過免疫熒光染色觀察細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞形態(tài)變化；使用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。動物實(shí)驗(yàn)：動物模型構(gòu)建：選用健康的C57BL/6小鼠，構(gòu)建單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）小鼠模型作為腎小管間質(zhì)纖維化動物模型。將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、UUO模型組、UUO+HIPK2抑制劑組等。假手術(shù)組僅進(jìn)行手術(shù)暴露輸尿管但不結(jié)扎；UUO模型組通過結(jié)扎左側(cè)輸尿管誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化；UUO+HIPK2抑制劑組在造模的同時給予HIPK2抑制劑進(jìn)行干預(yù)。標(biāo)本采集與檢測：在術(shù)后不同時間點(diǎn)（如第3天、第7天、第14天）處死小鼠，收集腎臟組織。通過蘇木精-伊紅（HE）染色、Masson染色和天狼星紅染色觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)變化和膠原纖維沉積情況；運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色檢測腎臟組織中HIPK2、αSMA、I型膠原等蛋白的表達(dá)定位；采用qRT-PCR和Westernblot檢測腎臟組織中相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平；檢測小鼠血清和尿液中的腎功能指標(biāo)，如血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿蛋白等。分子生物學(xué)技術(shù)：基因沉默與過表達(dá)：在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，利用小干擾RNA（siRNA）技術(shù)沉默HIPK2基因表達(dá)，將針對HIPK2的siRNA轉(zhuǎn)染至腎小管上皮細(xì)胞中，通過qRT-PCR和Westernblot驗(yàn)證沉默效果；構(gòu)建HIPK2過表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)HIPK2的過表達(dá)。信號通路阻斷與激活：使用信號通路特異性抑制劑或激活劑，如TGFβ-Smad3信號通路抑制劑SB431542、Wnt-Notch信號通路激活劑CHIR99021等，處理細(xì)胞或動物，觀察對HIPK2調(diào)控腎小管間質(zhì)纖維化相關(guān)指標(biāo)的影響，以明確HIPK2與各信號通路之間的關(guān)系。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究：運(yùn)用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)檢測HIPK2與其他相關(guān)蛋白（如Smad3、β-catenin等）之間的相互作用；通過蛋白質(zhì)芯片技術(shù)篩選與HIPK2相互作用的潛在蛋白，進(jìn)一步深入研究HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1腎小管間質(zhì)纖維化概述2.1.1定義與病理特征腎小管間質(zhì)纖維化（tubulointerstitialfibrosis，TIF）是指在各種致病因素作用下，腎臟腎小管間質(zhì)區(qū)域發(fā)生的一種病理性改變，其以細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在腎間質(zhì)內(nèi)過度沉積和間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生為主要特征，是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎病（ESRD）的共同病理過程和主要病理基礎(chǔ)。在病理形態(tài)學(xué)上，腎小管間質(zhì)纖維化表現(xiàn)出一系列特征性變化。腎間質(zhì)中細(xì)胞及膠原成分明顯聚集增多，正常的腎臟組織結(jié)構(gòu)被破壞。腎間質(zhì)內(nèi)可見大量成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞和膠原纖維增生，腎小管間的間隙被大量間質(zhì)膠原、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞所替代，導(dǎo)致腎小球與小球間的距離縮短。同時，腎小管出現(xiàn)萎縮和擴(kuò)張變形，小管周圍毛細(xì)血管減少、荒廢。隨著病情進(jìn)展，腎單位進(jìn)行性破壞，腎小球?yàn)V過率持續(xù)下降。這些病理改變不僅影響腎臟的正常結(jié)構(gòu)，更導(dǎo)致腎臟功能逐漸減退，最終發(fā)展為腎衰竭。在顯微鏡下觀察，可發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，引發(fā)炎癥性反應(yīng)，進(jìn)一步損傷腎小管組織細(xì)胞。腎間質(zhì)纖維化程度及范圍與腎功能損害的輕重程度密切相關(guān)，其程度越嚴(yán)重，腎功能受損越明顯，患者的預(yù)后也越差。2.1.2發(fā)病機(jī)制腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞和信號通路的異常變化，目前尚未完全明確。以下是一些主要的發(fā)病機(jī)制：腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的活化：正常情況下，間質(zhì)成纖維細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，對維持ECM內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要作用。然而，在各種刺激損傷因素，如炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞因子（如轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）等）、細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸、缺氧及高血糖等作用下，成纖維細(xì)胞會被活化增殖，發(fā)生表型改變，轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的肌成纖維細(xì)胞。α-SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞是導(dǎo)致病理條件下腎間質(zhì)中ECM過度沉積的主要效應(yīng)細(xì)胞。其來源除了間質(zhì)固有成纖維細(xì)胞外，還可能包括骨髓源性干細(xì)胞、循環(huán)纖維細(xì)胞以及通過腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT）產(chǎn)生。在纖維化疾病愈合過程中，這些活化的成纖維細(xì)胞的清除機(jī)制尚未完全闡明，可能通過細(xì)胞凋亡或恢復(fù)到靜息表型等方式。腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）：EMT指成熟的上皮細(xì)胞失去其上皮表型，而獲得未成熟的間充質(zhì)表型的過程。在胚胎發(fā)育過程中，上皮母細(xì)胞通過EMT形成中胚層的原始間充質(zhì)細(xì)胞，成體分化發(fā)育成熟的上皮細(xì)胞在炎癥、創(chuàng)傷等因素作用下，也會通過EMT產(chǎn)生間質(zhì)纖維母細(xì)胞，參與組織纖維化的形成。在腎臟中，腎小管上皮細(xì)胞在某些因素刺激下，如TGF-β1等細(xì)胞因子的作用，上皮細(xì)胞決定基因如E-cadherin基因關(guān)閉，某些間充質(zhì)細(xì)胞決定基因如FSP-1基因等被激活，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)從上皮樣變?yōu)殚g質(zhì)樣，同時表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物如α-SMA、Vimentin等，失去上皮細(xì)胞標(biāo)記物如E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。炎癥細(xì)胞浸潤與細(xì)胞因子釋放：各種致病因素引起腎臟損傷后，腎小管上皮細(xì)胞會釋放致炎因子，如趨化因子（MCP-1、RANTES、IL-8、IL-10）和化學(xué)趨化物，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤到腎間質(zhì)。巨噬細(xì)胞和活化的腎小管上皮細(xì)胞會釋放大量的細(xì)胞因子，如TGF-β、CTGF、AngII、PDGF等，這些細(xì)胞因子一方面促使間質(zhì)成纖維細(xì)胞和小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，合成大量的ECM；另一方面抑制基質(zhì)蛋白降解酶活性，增強(qiáng)蛋白酶抑制物活性，導(dǎo)致ECM大量堆積，促使小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生。此外，炎癥細(xì)胞釋放的活性氧（ROS）等物質(zhì)也會進(jìn)一步損傷腎臟細(xì)胞，加重炎癥反應(yīng)和纖維化進(jìn)程。細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡：正常情況下，腎臟中ECM的合成和降解處于動態(tài)平衡狀態(tài)，以維持腎臟的正常結(jié)構(gòu)和功能。在腎小管間質(zhì)纖維化過程中，這種平衡被打破。一方面，肌成纖維細(xì)胞等合成ECM的能力增強(qiáng)，導(dǎo)致纖維連接蛋白（Fn）、膠原（如I型膠原、III型膠原等）等ECM成分大量合成；另一方面，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等降解ECM的酶活性降低，而其抑制劑如組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）活性增強(qiáng)，使得ECM降解減少，最終導(dǎo)致ECM在腎間質(zhì)過度沉積，促進(jìn)纖維化進(jìn)展。2.1.3影響因素腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展受到多種因素的影響，這些因素相互作用，共同推動疾病的進(jìn)程。腎臟感染：細(xì)菌、病毒、支原體等病原體感染腎臟后，可引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷，釋放炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，激活腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，促進(jìn)ECM合成，進(jìn)而導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化。例如，慢性腎盂腎炎是由細(xì)菌感染引起的腎臟疾病，長期反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化，嚴(yán)重影響腎功能。原發(fā)性和繼發(fā)性腎炎：原發(fā)性腎小球疾病如IgA腎病、膜性腎病等，以及繼發(fā)性腎炎如狼瘡性腎炎、糖尿病腎病等，由于免疫復(fù)合物沉積、炎癥反應(yīng)等機(jī)制，導(dǎo)致腎臟固有細(xì)胞損傷，引發(fā)一系列病理生理變化，最終可導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化。以糖尿病腎病為例，高血糖狀態(tài)可通過多種途徑損傷腎臟，如激活蛋白激酶C（PKC）信號通路、增加晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的生成等，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化。腎毒性藥物：某些藥物如氨基糖苷類抗生素、非甾體類抗炎藥、化療藥物等具有腎毒性，使用不當(dāng)或長期使用可直接損傷腎小管上皮細(xì)胞，引起腎小管功能障礙和結(jié)構(gòu)破壞，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化。例如，慶大霉素等氨基糖苷類抗生素可與腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣膜上的磷脂結(jié)合，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡，引發(fā)腎間質(zhì)纖維化。其他因素：高血壓、高血脂、高尿酸血癥等代謝紊亂，以及尿路梗阻、腎缺血-再灌注損傷等，也與腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。高血壓可通過機(jī)械應(yīng)力損傷腎臟血管和腎小管，激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS），促進(jìn)炎癥和纖維化；高血脂可導(dǎo)致脂質(zhì)在腎臟沉積，引發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，損傷腎臟細(xì)胞；高尿酸血癥時，尿酸鹽結(jié)晶在腎臟沉積，可引起炎癥反應(yīng)和腎小管間質(zhì)損傷，促進(jìn)纖維化。尿路梗阻會導(dǎo)致尿液排出受阻，腎盂內(nèi)壓力升高，引起腎實(shí)質(zhì)缺血缺氧，激活腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，促進(jìn)纖維化。腎缺血-再灌注損傷過程中，會產(chǎn)生大量ROS，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷腎小管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤和纖維化相關(guān)信號通路的激活。2.2同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2（HIPK2）概述2.2.1發(fā)現(xiàn)與定位1999年，Pizette等學(xué)者以小鼠Dlx-2同源蛋白的一部分（96-225aa）作為誘餌，借助酵母雙雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了一個全新的核蛋白激酶家族。該家族蛋白具有一個保守的激酶結(jié)構(gòu)域以及一個同源蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，由于能夠增強(qiáng)同源蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，故而被命名為同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶。當(dāng)前已知該家族包含三個成員，分別為HIPK1、HIPK2和HIPK3。2000年，Gouzi-Iacovoni等成功克隆出人類HIPK2，并通過免疫熒光原位雜交技術(shù)確定人類HIPK2位于染色體7q22.1，而小鼠的HIPK2則位于染色體5。HIPK2從秀麗隱桿線蟲到人類在進(jìn)化過程中高度保守，小鼠與人類之間的氨基酸序列有87%的同源性。HIPK2mRNA在人類組織中，除神經(jīng)組織呈現(xiàn)高表達(dá)外，在其他組織中普遍低表達(dá)。HIPK2擁有4個轉(zhuǎn)錄本，分別為1.9kb、3.8kb、4.7kb和11kb，其中主要以11kb的轉(zhuǎn)錄本為主，且在各個組織中的表達(dá)情況存在差異。2.2.2結(jié)構(gòu)與細(xì)胞內(nèi)分布HIPK2含有1140個氨基酸，歸屬于STE20/SPS1激酶家族。其氨基端142-433位氨基酸殘基構(gòu)成一個蛋白激酶基序，這是其發(fā)揮激酶活性的關(guān)鍵區(qū)域，參與底物的磷酸化過程。474-609位為同源結(jié)構(gòu)域相互作用結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與同源結(jié)構(gòu)域蛋白相互作用，在HIPK2參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控等功能中起著重要作用。646-849位為SAM區(qū)，羧基端則富含酪氨酸和組氨酸（PY結(jié)構(gòu)域）。HIPK2的第221位賴氨酸高度保守，在激酶基序與ATP的結(jié)合中至關(guān)重要，一旦該位點(diǎn)發(fā)生突變，激酶活性將完全喪失。研究還發(fā)現(xiàn)，野生型HIPK2可以被磷酸化，而激酶喪失型HIPK2很少被磷酸化，這提示野生型HIPK2很可能存在自身磷酸化現(xiàn)象。通過將HIPK2與GFP融合的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)HIPK2定位于核斑，少數(shù)位于核漿。核斑滯留信號（NLS）位于809-814位氨基酸，這一信號對于HIPK2在核斑的定位起著關(guān)鍵作用。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，HIPK2不僅存在于細(xì)胞核，還出現(xiàn)胞質(zhì)再定位的現(xiàn)象，且其表達(dá)及胞質(zhì)再定位與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。在不同的細(xì)胞生理狀態(tài)或病理條件下，HIPK2的細(xì)胞內(nèi)分布可能會發(fā)生動態(tài)變化，這種變化可能與其功能的發(fā)揮密切相關(guān)。2.2.3功能與特性HIPK2作為核內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有多種重要功能。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，HIPK2作為輔助因子廣泛參與其中。它位于核斑，在共激活因子CBP和p300的輔助下，能夠磷酸化p53的46位絲氨酸，加速p53的乙?；卓筂DM2對p53的抑制作用，從而強(qiáng)化p53的功能。p53是一種重要的腫瘤抑制因子，HIPK2對p53的調(diào)節(jié)在細(xì)胞應(yīng)對DNA損傷、細(xì)胞周期調(diào)控以及腫瘤抑制等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在細(xì)胞凋亡方面，HIPK2通過磷酸化，能夠加速M(fèi)cl-1和c-FLIP被蛋白酶體降解，引起細(xì)胞發(fā)生不依賴p53的凋亡。Mcl-1和c-FLIP是細(xì)胞凋亡的抑制因子，HIPK2對它們的降解促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這在腫瘤細(xì)胞的清除以及組織發(fā)育過程中細(xì)胞數(shù)量的調(diào)控等方面具有重要意義。在細(xì)胞分化過程中，HIPK2也發(fā)揮著重要作用。在造血干細(xì)胞分化過程中，HIPK2的表達(dá)水平和活性變化與細(xì)胞的分化進(jìn)程密切相關(guān)。當(dāng)HIPK2表達(dá)上調(diào)時，可促進(jìn)造血干細(xì)胞向特定血細(xì)胞系分化。在胚胎發(fā)育過程中，HIPK2參與了多種組織和器官的形成與發(fā)育，如在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，HIPK2對神經(jīng)干細(xì)胞的分化和神經(jīng)元的成熟起到調(diào)控作用。此外，HIPK2還參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。在炎癥刺激下，HIPK2的表達(dá)會發(fā)生改變，進(jìn)而影響炎癥相關(guān)因子的表達(dá)和信號通路的激活。在腎纖維化的病理過程中，HIPK2已被確認(rèn)為調(diào)節(jié)炎癥及纖維化的關(guān)鍵因素。高表達(dá)的HIPK2可通過活化p53，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡；激活TGFβ-Smad3和Wnt-Notch信號通路，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)多種纖維化標(biāo)記物，包括αSMA、I型膠原和纖連蛋白等，從而致使腎小管間質(zhì)纖維化。三、HIPK2與腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)聯(lián)研究3.1HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化中的表達(dá)變化3.1.1動物實(shí)驗(yàn)研究為了深入探究HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化過程中的表達(dá)變化，本研究選用了經(jīng)典的單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）小鼠模型。該模型能夠模擬人類腎臟因輸尿管梗阻而引發(fā)的腎小管間質(zhì)纖維化病理過程，具有病變穩(wěn)定、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)選取6-8周齡、體重20-25g的健康雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組和UUO模型組，每組10只。假手術(shù)組小鼠僅進(jìn)行手術(shù)暴露輸尿管，但不進(jìn)行結(jié)扎操作；UUO模型組小鼠則通過手術(shù)結(jié)扎左側(cè)輸尿管，誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生。在術(shù)后第3天、第7天和第14天，分別從兩組中隨機(jī)選取5只小鼠，處死并迅速取出左側(cè)腎臟組織。采用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測腎臟組織中HIPK2的mRNA表達(dá)水平，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測HIPK2的蛋白表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠腎臟組織中HIPK2的mRNA表達(dá)水平相對穩(wěn)定，在術(shù)后各時間點(diǎn)無明顯變化。而UUO模型組小鼠腎臟組織中HIPK2的mRNA表達(dá)水平在術(shù)后第3天開始顯著升高，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。隨著時間的推移，到術(shù)后第7天和第14天，HIPK2的mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高，分別是假手術(shù)組的2.5倍和3.8倍（P<0.01）。Westernblot檢測結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致。假手術(shù)組小鼠腎臟組織中HIPK2的蛋白表達(dá)水平維持在較低水平。UUO模型組小鼠腎臟組織中HIPK2的蛋白表達(dá)在術(shù)后第3天明顯上調(diào)，在第7天和第14天持續(xù)升高，呈現(xiàn)出時間依賴性的增加趨勢。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)一步表明，HIPK2主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，在UUO模型組小鼠腎臟的腎小管間質(zhì)區(qū)域，HIPK2陽性染色明顯增強(qiáng)，且陽性細(xì)胞數(shù)量增多。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，在單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的腎小管間質(zhì)纖維化小鼠模型中，HIPK2在腎臟組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，且其表達(dá)水平隨著纖維化進(jìn)程的發(fā)展而逐漸升高，提示HIPK2可能在腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。3.1.2臨床樣本分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化中的表達(dá)變化，本研究收集了臨床患者的腎活檢樣本。樣本來源包括30例因慢性腎臟疾病接受腎活檢的患者，其中20例患者經(jīng)病理診斷為腎小管間質(zhì)纖維化，10例為正常對照樣本。正常對照樣本取自因腎腫瘤行腎部分切除術(shù)患者的正常腎組織邊緣，這些患者腎功能正常，無腎臟疾病史。對腎活檢樣本進(jìn)行常規(guī)的蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色，以明確腎臟組織的病理形態(tài)學(xué)改變。同時，采用免疫組織化學(xué)染色和Westernblot方法檢測樣本中HIPK2的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在正常腎組織樣本中，HIPK2在腎小管上皮細(xì)胞中呈低水平表達(dá)，陽性染色較弱，主要分布于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中也有少量表達(dá)。而在腎小管間質(zhì)纖維化患者的腎活檢樣本中，HIPK2的陽性染色明顯增強(qiáng)，不僅在腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)增加，在腎間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等也可見HIPK2的表達(dá)。且隨著腎小管間質(zhì)纖維化程度的加重，HIPK2陽性細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度均逐漸增加。根據(jù)腎小管間質(zhì)纖維化的病理分級（采用Katafuchi評分系統(tǒng)），將患者分為輕度纖維化組（Katafuchi評分1-2分）、中度纖維化組（Katafuchi評分3-4分）和重度纖維化組（Katafuchi評分5-6分）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，輕度纖維化組中HIPK2陽性細(xì)胞數(shù)較正常對照組顯著增加（P<0.05），中度和重度纖維化組中HIPK2陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增多，且與輕度纖維化組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Westernblot檢測結(jié)果也表明，與正常腎組織樣本相比，腎小管間質(zhì)纖維化患者腎活檢樣本中HIPK2的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。進(jìn)一步對不同纖維化程度組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)HIPK2蛋白表達(dá)水平隨著纖維化程度的加重而逐漸升高，重度纖維化組HIPK2蛋白表達(dá)量約為正常對照組的4.5倍，中度纖維化組約為正常對照組的3.2倍（P<0.01）。通過對臨床患者腎活檢樣本的分析，證實(shí)了HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，且其表達(dá)水平與腎小管間質(zhì)纖維化的程度密切相關(guān)，為深入研究HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化中的作用機(jī)制提供了臨床依據(jù)。三、HIPK2與腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)聯(lián)研究3.2HIPK2對腎小管間質(zhì)纖維化相關(guān)細(xì)胞過程的影響3.2.1對腎小管上皮細(xì)胞EMT的影響為了深入探究HIPK2對腎小管上皮細(xì)胞EMT的影響，本研究選用人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將HK-2細(xì)胞分為對照組、模型組、HIPK2過表達(dá)組和HIPK2抑制組。對照組細(xì)胞給予常規(guī)培養(yǎng)條件；模型組細(xì)胞給予TGF-β1（10ng/mL）刺激24h，以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生；HIPK2過表達(dá)組細(xì)胞先轉(zhuǎn)染HIPK2過表達(dá)質(zhì)粒，48h后給予TGF-β1刺激；HIPK2抑制組細(xì)胞則先轉(zhuǎn)染針對HIPK2的siRNA，48h后給予TGF-β1刺激。轉(zhuǎn)染效率通過熒光顯微鏡和qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。在熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染HIPK2過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA的細(xì)胞均可見明顯的綠色熒光，表明轉(zhuǎn)染成功。qRT-PCR結(jié)果顯示，HIPK2過表達(dá)組細(xì)胞中HIPK2的mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組和模型組（P<0.01），而HIPK2抑制組細(xì)胞中HIPK2的mRNA表達(dá)水平顯著低于對照組和模型組（P<0.01）。采用qRT-PCR和Westernblot檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和αSMA的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。在HIPK2過表達(dá)組中，給予TGF-β1刺激后，E-cadherin的mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步降低，而N-cadherin、Vimentin和αSMA的mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在HIPK2抑制組中，給予TGF-β1刺激后，E-cadherin的mRNA表達(dá)水平較模型組有所升高，而N-cadherin、Vimentin和αSMA的mRNA表達(dá)水平較模型組有所降低（P<0.05）。Westernblot檢測結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致。模型組細(xì)胞中E-cadherin的蛋白表達(dá)水平顯著降低，N-cadherin、Vimentin和αSMA的蛋白表達(dá)水平顯著升高。HIPK2過表達(dá)組細(xì)胞中E-cadherin的蛋白表達(dá)水平更低，N-cadherin、Vimentin和αSMA的蛋白表達(dá)水平更高。HIPK2抑制組細(xì)胞中E-cadherin的蛋白表達(dá)水平升高，N-cadherin、Vimentin和αSMA的蛋白表達(dá)水平降低。通過免疫熒光染色觀察細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞形態(tài)變化。對照組細(xì)胞呈典型的上皮樣形態(tài)，E-cadherin在細(xì)胞膜上呈強(qiáng)陽性表達(dá)，N-cadherin和Vimentin表達(dá)較弱。模型組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，呈梭形，類似間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，E-cadherin表達(dá)減弱，N-cadherin和Vimentin表達(dá)增強(qiáng)。HIPK2過表達(dá)組細(xì)胞形態(tài)變化更為明顯，E-cadherin表達(dá)進(jìn)一步減弱，N-cadherin和Vimentin表達(dá)更強(qiáng)。HIPK2抑制組細(xì)胞形態(tài)相對接近對照組，E-cadherin表達(dá)有所恢復(fù)，N-cadherin和Vimentin表達(dá)減弱。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIPK2可以促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，下調(diào)上皮標(biāo)志物的表達(dá)，使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，提示HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化過程中，通過促進(jìn)EMT，加速了纖維化進(jìn)程。3.2.2對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化的影響本研究旨在探討HIPK2對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化的影響，選用小鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞（NRK-49F細(xì)胞）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將NRK-49F細(xì)胞分為對照組、模型組、HIPK2過表達(dá)組和HIPK2抑制組。對照組細(xì)胞在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)；模型組細(xì)胞給予TGF-β1（10ng/mL）刺激24h，以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化；HIPK2過表達(dá)組細(xì)胞先轉(zhuǎn)染HIPK2過表達(dá)質(zhì)粒，48h后給予TGF-β1刺激；HIPK2抑制組細(xì)胞先轉(zhuǎn)染針對HIPK2的siRNA，48h后給予TGF-β1刺激。轉(zhuǎn)染效率通過熒光顯微鏡和qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞發(fā)出明顯綠色熒光，qRT-PCR結(jié)果顯示，HIPK2過表達(dá)組細(xì)胞中HIPK2的mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組和模型組（P<0.01），HIPK2抑制組細(xì)胞中HIPK2的mRNA表達(dá)水平顯著低于對照組和模型組（P<0.01）。采用qRT-PCR和Westernblot檢測成纖維細(xì)胞活化標(biāo)志物的表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞中αSMA、I型膠原和纖連蛋白的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。在HIPK2過表達(dá)組中，給予TGF-β1刺激后，αSMA、I型膠原和纖連蛋白的mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在HIPK2抑制組中，給予TGF-β1刺激后，αSMA、I型膠原和纖連蛋白的mRNA表達(dá)水平較模型組有所降低（P<0.05）。Westernblot檢測結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致。模型組細(xì)胞中αSMA、I型膠原和纖連蛋白的蛋白表達(dá)水平顯著升高。HIPK2過表達(dá)組細(xì)胞中αSMA、I型膠原和纖連蛋白的蛋白表達(dá)水平更高。HIPK2抑制組細(xì)胞中αSMA、I型膠原和纖連蛋白的蛋白表達(dá)水平降低。使用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)（P<0.01）。HIPK2過表達(dá)組細(xì)胞的增殖能力進(jìn)一步增強(qiáng)，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。HIPK2抑制組細(xì)胞的增殖能力較模型組減弱（P<0.05）。采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力。在Transwell小室下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，上室加入各組細(xì)胞。培養(yǎng)24h后，固定、染色，計數(shù)穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞的遷移能力明顯高于對照組（P<0.01）。HIPK2過表達(dá)組細(xì)胞的遷移能力更強(qiáng)，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。HIPK2抑制組細(xì)胞的遷移能力較模型組降低（P<0.05）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIPK2能夠促進(jìn)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化，上調(diào)活化標(biāo)志物的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和遷移能力，在腎小管間質(zhì)纖維化過程中，對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化起到了促進(jìn)作用，進(jìn)而加速了纖維化進(jìn)程。3.2.3對炎癥細(xì)胞浸潤的調(diào)節(jié)作用為了探究HIPK2對炎癥細(xì)胞浸潤的調(diào)節(jié)作用，本研究利用小鼠單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）模型以及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。在UUO模型實(shí)驗(yàn)中，將小鼠分為假手術(shù)組、UUO模型組和UUO+HIPK2抑制劑組。假手術(shù)組小鼠僅進(jìn)行手術(shù)暴露輸尿管但不結(jié)扎；UUO模型組小鼠結(jié)扎左側(cè)輸尿管誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化；UUO+HIPK2抑制劑組小鼠在結(jié)扎輸尿管的同時，給予HIPK2抑制劑（每天腹腔注射，劑量為5mg/kg）。在術(shù)后第7天，取小鼠腎臟組織，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80和淋巴細(xì)胞標(biāo)志物CD3的表達(dá)，以評估炎癥細(xì)胞浸潤情況。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，UUO模型組小鼠腎臟組織中F4/80和CD3陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，表明炎癥細(xì)胞浸潤明顯增加（P<0.01）。而在UUO+HIPK2抑制劑組中，F(xiàn)4/80和CD3陽性細(xì)胞數(shù)量較UUO模型組明顯減少（P<0.05）。采用qRT-PCR檢測腎臟組織中炎癥細(xì)胞趨化因子的表達(dá)水平，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）和RANTES等。結(jié)果顯示，UUO模型組小鼠腎臟組織中MCP-1、MIP-1α和RANTES的mRNA表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組（P<0.01）。給予HIPK2抑制劑后，UUO+HIPK2抑制劑組小鼠腎臟組織中MCP-1、MIP-1α和RANTES的mRNA表達(dá)水平較UUO模型組明顯降低（P<0.05）。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選用人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞），分為對照組、模型組和HIPK2抑制組。模型組細(xì)胞給予脂多糖（LPS，1μg/mL）刺激24h，以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)；HIPK2抑制組細(xì)胞先轉(zhuǎn)染針對HIPK2的siRNA，48h后給予LPS刺激。采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中MCP-1、MIP-1α和RANTES的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清中MCP-1、MIP-1α和RANTES的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。在HIPK2抑制組中，給予LPS刺激后，MCP-1、MIP-1α和RANTES的蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低（P<0.05）。通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測炎癥細(xì)胞對腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清的趨化作用。在Transwell小室下室加入各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，上室加入人外周血單核細(xì)胞。培養(yǎng)24h后，固定、染色，計數(shù)穿過小室膜的單核細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清對單核細(xì)胞的趨化能力明顯高于對照組（P<0.01）。HIPK2抑制組細(xì)胞培養(yǎng)上清對單核細(xì)胞的趨化能力較模型組降低（P<0.05）。綜合上述體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIPK2能夠促進(jìn)炎癥細(xì)胞趨化因子的表達(dá)，增強(qiáng)對炎癥細(xì)胞的趨化作用，從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞在腎間質(zhì)的浸潤。抑制HIPK2的表達(dá)或活性，可以減少炎癥細(xì)胞趨化因子的產(chǎn)生，降低炎癥細(xì)胞的浸潤，提示HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化過程中，通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤，參與了纖維化的發(fā)生發(fā)展。四、HIPK2調(diào)控腎小管間質(zhì)纖維化的分子機(jī)制4.1HIPK2參與的信號通路4.1.1TGF-β/Smad信號通路TGF-β/Smad信號通路在腎小管間質(zhì)纖維化過程中扮演著關(guān)鍵角色，而HIPK2與該信號通路之間存在著緊密的關(guān)聯(lián)。在正常生理狀態(tài)下，TGF-β以無活性的前體形式存在于細(xì)胞外基質(zhì)中。當(dāng)受到各種刺激，如炎癥、氧化應(yīng)激等，TGF-β被激活并與細(xì)胞表面的TGF-β受體結(jié)合。TGF-β受體主要包括I型受體（TβRI）和II型受體（TβRII）。TβRII具有組成型激酶活性，當(dāng)TGF-β與TβRII結(jié)合后，TβRII招募并磷酸化TβRI，激活的TβRI進(jìn)而磷酸化下游的Smad蛋白。在本研究中，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)深入探究了HIPK2對TGF-β/Smad信號通路的影響。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選用人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）和小鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞（NRK-49F細(xì)胞）。對HK-2細(xì)胞進(jìn)行分組處理，對照組給予常規(guī)培養(yǎng)條件，模型組給予TGF-β1（10ng/mL）刺激以激活TGF-β/Smad信號通路，HIPK2過表達(dá)組先轉(zhuǎn)染HIPK2過表達(dá)質(zhì)粒，48h后給予TGF-β1刺激，HIPK2抑制組先轉(zhuǎn)染針對HIPK2的siRNA，48h后給予TGF-β1刺激。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，模型組細(xì)胞中TGF-β1刺激后，Smad2和Smad3的磷酸化水平顯著升高。在HIPK2過表達(dá)組中，給予TGF-β1刺激后，Smad2和Smad3的磷酸化水平進(jìn)一步升高，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而在HIPK2抑制組中，給予TGF-β1刺激后，Smad2和Smad3的磷酸化水平較模型組明顯降低（P<0.05）。這表明HIPK2能夠促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的Smad2和Smad3的磷酸化，增強(qiáng)TGF-β/Smad信號通路的活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HIPK2可能通過與Smad3相互作用來調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號通路。運(yùn)用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，HIPK2與Smad3之間存在直接的相互作用。在HIPK2過表達(dá)細(xì)胞中，HIPK2與Smad3的結(jié)合明顯增強(qiáng)，而在HIPK2抑制細(xì)胞中，兩者的結(jié)合減弱。這種相互作用可能影響Smad3的磷酸化及其與其他蛋白的相互作用，從而調(diào)控TGF-β/Smad信號通路的傳導(dǎo)。在體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）小鼠模型。將小鼠分為假手術(shù)組、UUO模型組和UUO+HIPK2抑制劑組。通過免疫組織化學(xué)染色和Westernblot檢測腎臟組織中TGF-β/Smad信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，UUO模型組小鼠腎臟組織中TGF-β1、磷酸化Smad2和Smad3的表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組。給予HIPK2抑制劑后，UUO+HIPK2抑制劑組小鼠腎臟組織中TGF-β1、磷酸化Smad2和Smad3的表達(dá)水平較UUO模型組明顯降低。這進(jìn)一步證實(shí)了在體內(nèi)環(huán)境下，HIPK2能夠促進(jìn)TGF-β/Smad信號通路的激活，而抑制HIPK2可以減弱該信號通路的活性。綜上所述，HIPK2通過促進(jìn)TGF-β與受體結(jié)合后Smad2和Smad3的磷酸化，以及與Smad3的相互作用，增強(qiáng)了TGF-β/Smad信號通路的活性，進(jìn)而促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。4.1.2MAPK信號通路絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MAPK信號通路主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38）等三條主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在腎小管間質(zhì)纖維化過程中，MAPK信號通路的異常激活與疾病的進(jìn)展密切相關(guān)。為了探究HIPK2對MAPK信號通路的影響，本研究進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，以人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）為研究對象。將細(xì)胞分為對照組、模型組、HIPK2過表達(dá)組和HIPK2抑制組。模型組給予TGF-β1（10ng/mL）刺激以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生纖維化相關(guān)改變，同時激活MAPK信號通路。HIPK2過表達(dá)組先轉(zhuǎn)染HIPK2過表達(dá)質(zhì)粒，48h后給予TGF-β1刺激；HIPK2抑制組先轉(zhuǎn)染針對HIPK2的siRNA，48h后給予TGF-β1刺激。采用Westernblot檢測MAPK信號通路中關(guān)鍵激酶的磷酸化水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞中ERK、JNK和p38的磷酸化水平顯著升高（P<0.01）。在HIPK2過表達(dá)組中，給予TGF-β1刺激后，ERK、JNK和p38的磷酸化水平進(jìn)一步升高，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而在HIPK2抑制組中，給予TGF-β1刺激后，ERK、JNK和p38的磷酸化水平較模型組明顯降低（P<0.05）。這表明HIPK2能夠促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的MAPK信號通路中ERK、JNK和p38的磷酸化，增強(qiáng)該信號通路的活性。為了進(jìn)一步明確HIPK2影響MAPK信號通路的具體機(jī)制，通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測HIPK2與MAPK信號通路中相關(guān)激酶的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIPK2與MEK1/2（ERK的上游激酶）、MKK4/7（JNK的上游激酶）和MKK3/6（p38的上游激酶）之間存在相互作用。在HIPK2過表達(dá)細(xì)胞中，HIPK2與這些上游激酶的結(jié)合增強(qiáng)，可能促進(jìn)了上游激酶對ERK、JNK和p38的磷酸化激活。而在HIPK2抑制細(xì)胞中，HIPK2與上游激酶的結(jié)合減弱，導(dǎo)致ERK、JNK和p38的磷酸化水平降低。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，利用UUO小鼠模型進(jìn)行研究。將小鼠分為假手術(shù)組、UUO模型組和UUO+HIPK2抑制劑組。術(shù)后第7天，取小鼠腎臟組織，采用Westernblot和免疫組織化學(xué)染色檢測MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化水平。結(jié)果顯示，UUO模型組小鼠腎臟組織中ERK、JNK和p38的磷酸化水平顯著高于假手術(shù)組。給予HIPK2抑制劑后，UUO+HIPK2抑制劑組小鼠腎臟組織中ERK、JNK和p38的磷酸化水平較UUO模型組明顯降低。這進(jìn)一步證實(shí)了在體內(nèi)環(huán)境下，HIPK2能夠促進(jìn)MAPK信號通路的激活，而抑制HIPK2可以減弱該信號通路的活性。綜上所述，HIPK2通過促進(jìn)MAPK信號通路中ERK、JNK和p38的磷酸化，以及與上游激酶的相互作用，增強(qiáng)了MAPK信號通路的活性，在腎小管間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。4.1.3其他可能的信號通路除了TGF-β/Smad信號通路和MAPK信號通路外，PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等信號通路也與腎小管間質(zhì)纖維化密切相關(guān)，并且與HIPK2之間可能存在相互作用，共同調(diào)節(jié)腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞的生長、增殖、存活以及代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腎小管間質(zhì)纖維化過程中，PI3K/Akt信號通路的激活可促進(jìn)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖和活化，抑制細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，加速纖維化進(jìn)程。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討了HIPK2與PI3K/Akt信號通路的關(guān)聯(lián)。以小鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞（NRK-49F細(xì)胞）為研究對象，分為對照組、模型組、HIPK2過表達(dá)組和HIPK2抑制組。模型組給予TGF-β1（10ng/mL）刺激以激活PI3K/Akt信號通路，HIPK2過表達(dá)組先轉(zhuǎn)染HIPK2過表達(dá)質(zhì)粒，48h后給予TGF-β1刺激，HIPK2抑制組先轉(zhuǎn)染針對HIPK2的siRNA，48h后給予TGF-β1刺激。采用Westernblot檢測PI3K/Akt信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和磷酸化水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞中p-Akt（磷酸化Akt）的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。在HIPK2過表達(dá)組中，給予TGF-β1刺激后，p-Akt的表達(dá)水平進(jìn)一步升高，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而在HIPK2抑制組中，給予TGF-β1刺激后，p-Akt的表達(dá)水平較模型組明顯降低（P<0.05）。這表明HIPK2能夠促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的PI3K/Akt信號通路的激活。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HIPK2可能通過與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85相互作用，影響PI3K的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)Akt的磷酸化水平。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HIPK2與p85之間存在相互結(jié)合。在HIPK2過表達(dá)細(xì)胞中，HIPK2與p85的結(jié)合增強(qiáng)，可能促進(jìn)了PI3K的活化，導(dǎo)致Akt磷酸化水平升高。而在HIPK2抑制細(xì)胞中，HIPK2與p85的結(jié)合減弱，PI3K/Akt信號通路的活性受到抑制。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化以及組織穩(wěn)態(tài)維持等過程中起著重要作用。在腎小管間質(zhì)纖維化過程中，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），促進(jìn)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化和增殖，增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，從而推動纖維化的發(fā)展。本研究利用人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）和小鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞（NRK-49F細(xì)胞）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探究HIPK2與Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)系。將HK-2細(xì)胞分為對照組、模型組、HIPK2過表達(dá)組和HIPK2抑制組。模型組給予Wnt3a（100ng/mL）刺激以激活Wnt/β-catenin信號通路，HIPK2過表達(dá)組先轉(zhuǎn)染HIPK2過表達(dá)質(zhì)粒，48h后給予Wnt3a刺激，HIPK2抑制組先轉(zhuǎn)染針對HIPK2的siRNA，48h后給予Wnt3a刺激。采用Westernblot檢測Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和磷酸化水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），且β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移增加。在HIPK2過表達(dá)組中，給予Wnt3a刺激后，β-catenin的表達(dá)水平進(jìn)一步升高，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的含量也明顯增加，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而在HIPK2抑制組中，給予Wnt3a刺激后，β-catenin的表達(dá)水平較模型組明顯降低，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的含量也減少（P<0.05）。這表明HIPK2能夠促進(jìn)Wnt3a誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號通路的激活。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HIPK2可能通過抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的活性，減少β-catenin的磷酸化降解，從而穩(wěn)定β-catenin的表達(dá)，促進(jìn)其向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。通過檢測GSK3β的磷酸化水平發(fā)現(xiàn)，在HIPK2過表達(dá)細(xì)胞中，p-GSK3β（磷酸化GSK3β）的水平升高，而在HIPK2抑制細(xì)胞中，p-GSK3β的水平降低。這表明HIPK2通過調(diào)節(jié)GSK3β的活性，參與了Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控。綜上所述，PI3K/Akt和Wnt/β-catenin等信號通路與HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化中存在密切關(guān)聯(lián)。HIPK2通過調(diào)節(jié)這些信號通路的活性，在腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。對這些信號通路之間相互作用機(jī)制的深入研究，將有助于進(jìn)一步揭示HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化中的調(diào)控機(jī)制，為腎纖維化的治療提供更多的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。4.2HIPK2對相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的調(diào)控4.2.1促纖維化基因和蛋白結(jié)締組織生長因子（CTGF）和纖連蛋白（FN）等是腎小管間質(zhì)纖維化過程中重要的促纖維化基因和蛋白，它們在細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究深入探究了HIPK2對這些促纖維化基因和蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選用人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）和小鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞（NRK-49F細(xì)胞）。將HK-2細(xì)胞分為對照組、模型組、HIPK2過表達(dá)組和HIPK2抑制組。模型組給予TGF-β1（10ng/mL）刺激，以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生纖維化相關(guān)改變；HIPK2過表達(dá)組先轉(zhuǎn)染HIPK2過表達(dá)質(zhì)粒，48h后給予TGF-β1刺激；HIPK2抑制組先轉(zhuǎn)染針對HIPK2的siRNA，48h后給予TGF-β1刺激。采用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測CTGF和FN基因的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞中CTGF和FN的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。在HIPK2過表達(dá)組中，給予TGF-β1刺激后，CTGF和FN的mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而在HIPK2抑制組中，給予TGF-β1刺激后，CTGF和FN的mRNA表達(dá)水平較模型組明顯降低（P<0.05）。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測CTGF和FN蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，模型組細(xì)胞中CTGF和FN蛋白表達(dá)顯著增加，HIPK2過表達(dá)組中CTGF和FN蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高，HIPK2抑制組中CTGF和FN蛋白表達(dá)降低。在體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）小鼠模型。將小鼠分為假手術(shù)組、UUO模型組和UUO+HIPK2抑制劑組。通過免疫組織化學(xué)染色和Westernblot檢測腎臟組織中CTGF和FN的表達(dá)。結(jié)果顯示，UUO模型組小鼠腎臟組織中CTGF和FN的表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組。給予HIPK2抑制劑后，UUO+HIPK2抑制劑組小鼠腎臟組織中CTGF和FN的表達(dá)水平較UUO模型組明顯降低。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIPK2能夠促進(jìn)促纖維化基因CTGF和FN的表達(dá)，上調(diào)其mRNA和蛋白水平，從而增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，在腎小管間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮了促進(jìn)作用。4.2.2抗纖維化基因和蛋白Smad7是TGF-β/Smad信號通路中的重要負(fù)調(diào)控因子，在腎小管間質(zhì)纖維化過程中，它通過抑制TGF-β/Smad信號通路的激活，發(fā)揮抗纖維化作用。本研究分析了HIPK2對Smad7基因和蛋白表達(dá)的影響。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，以人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）為研究對象，分為對照組、模型組、HIPK2過表達(dá)組和HIPK2抑制組。模型組給予TGF-β1（10ng/mL）刺激，以激活TGF-β/Smad信號通路；HIPK2過表達(dá)組先轉(zhuǎn)染HIPK2過表達(dá)質(zhì)粒，48h后給予TGF-β1刺激；HIPK2抑制組先轉(zhuǎn)染針對HIPK2的siRNA，48h后給予TGF-β1刺激。采用qRT-PCR檢測Smad7基因的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞中Smad7的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。在HIPK2過表達(dá)組中，給予TGF-β1刺激后，Smad7的mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步降低，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而在HIPK2抑制組中，給予TGF-β1刺激后，Smad7的mRNA表達(dá)水平較模型組有所升高（P<0.05）。通過Westernblot檢測Smad7蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，模型組細(xì)胞中Smad7蛋白表達(dá)顯著減少，HIPK2過表達(dá)組中Smad7蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，HIPK2抑制組中Smad7蛋白表達(dá)升高。在體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)中，利用UUO小鼠模型進(jìn)行研究。將小鼠分為假手術(shù)組、UUO模型組和UUO+HIPK2抑制劑組。術(shù)后第7天，取小鼠腎臟組織，采用免疫組織化學(xué)染色和Westernblot檢測Smad7的表達(dá)。結(jié)果顯示，UUO模型組小鼠腎臟組織中Smad7的表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組。給予HIPK2抑制劑后，UUO+HIPK2抑制劑組小鼠腎臟組織中Smad7的表達(dá)水平較UUO模型組明顯升高。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIPK2能夠抑制抗纖維化基因Smad7的表達(dá)，下調(diào)其mRNA和蛋白水平，減弱Smad7對TGF-β/Smad信號通路的負(fù)調(diào)控作用，從而促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。4.2.3表觀遺傳調(diào)控層面近年來研究表明，表觀遺傳調(diào)控在腎小管間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮著重要作用，DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳過程能夠調(diào)控纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響疾病的進(jìn)展。本研究探討了HIPK2是否通過影響這些表觀遺傳過程，調(diào)控纖維化相關(guān)基因表達(dá)。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選用人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞），分為對照組、模型組、HIPK2過表達(dá)組和HIPK2抑制組。模型組給予TGF-β1（10ng/mL）刺激，以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生纖維化相關(guān)改變；HIPK2過表達(dá)組先轉(zhuǎn)染HIPK2過表達(dá)質(zhì)粒，48h后給予TGF-β1刺激；HIPK2抑制組先轉(zhuǎn)染針對HIPK2的siRNA，48h后給予TGF-β1刺激。采用甲基化特異性PCR（MSP）檢測纖維化相關(guān)基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞中促纖維化基因（如CTGF、FN等）啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平降低，抗纖維化基因（如Smad7等）啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平升高。在HIPK2過表達(dá)組中，給予TGF-β1刺激后，促纖維化基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平進(jìn)一步降低，抗纖維化基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平進(jìn)一步升高，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而在HIPK2抑制組中，給予TGF-β1刺激后，促纖維化基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平較模型組有所升高，抗纖維化基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平較模型組有所降低（P<0.05）。通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)檢測組蛋白修飾情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組細(xì)胞中促纖維化基因啟動子區(qū)域的組蛋白H3賴氨酸9乙酰化（H3K9ac）水平升高，組蛋白H3賴氨酸27三甲基化（H3K27me3）水平降低；抗纖維化基因啟動子區(qū)域的組蛋白H3K9ac水平降低，組蛋白H3K27me3水平升高。在HIPK2過表達(dá)組中，給予TGF-β1刺激后，促纖維化基因啟動子區(qū)域的H3K9ac水平進(jìn)一步升高，H3K27me3水平進(jìn)一步降低；抗纖維化基因啟動子區(qū)域的H3K9ac水平進(jìn)一步降低，H3K27me3水平進(jìn)一步升高，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而在HIPK2抑制組中，給予TGF-β1刺激后，促纖維化基因啟動子區(qū)域的H3K9ac水平較模型組有所降低，H3K27me3水平較模型組有所升高；抗纖維化基因啟動子區(qū)域的H3K9ac水平較模型組有所升高，H3K27me3水平較模型組有所降低（P<0.05）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIPK2可能通過影響DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳過程，調(diào)控纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。HIPK2促進(jìn)促纖維化基因的表達(dá)，可能是通過降低其啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平，增加組蛋白H3K9ac修飾，減少組蛋白H3K27me3修飾來實(shí)現(xiàn)的；而抑制抗纖維化基因的表達(dá)，則可能是通過升高其啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平，減少組蛋白H3K9ac修飾，增加組蛋白H3K27me3修飾來實(shí)現(xiàn)的。這為深入理解HIPK2在腎小管間質(zhì)纖維化中的調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。五、基于HIPK2的干預(yù)策略及效果研究5.1針對HIPK2的干預(yù)方法設(shè)計5.1.1基因干預(yù)手段基因干預(yù)是調(diào)控HIPK2表達(dá)的重要策略之一，主要通過抑制或敲除HIPK2基因來減少其表達(dá)，從而阻斷其在腎小管間質(zhì)纖維化中的促纖維化作用。在本研究中，采用了多種基因干預(yù)技術(shù)，包括小干擾RNA（siRNA）、短發(fā)卡RNA（shRNA）和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)。siRNA是一種長度為21-23個核苷酸的雙鏈RNA分子，能夠通過RNA干擾（RNAi）機(jī)制特異性地降解靶mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的抑制。針對HIPK2基因，設(shè)計并合成了三條不同序列的siRNA，分別命名為siRNA-HIPK2-1、siRNA-HIPK2-2和siRNA-HIPK2-3。為了確保siRNA能夠高效地轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，選用了陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000。在轉(zhuǎn)染前，將對數(shù)生長期的人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時，按照Lipofectamine3000試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將siRNA與Lipofectamine3000試劑在Opti-MEM培養(yǎng)基中混合，室溫孵育15分鐘，形成siRNA-Lipofectamine3000復(fù)合物，然后將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻。轉(zhuǎn)染后4-6小時，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48小時后，采用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測HIPK2基因和蛋白的表達(dá)水平，以篩選出干擾效率最高的siRNA。結(jié)果顯示，siRNA-HIPK2-2的干擾效果最佳，能夠顯著降低HIPK2的mRNA和蛋白表達(dá)水平（P<0.01）。shRNA是一種具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA分子，可被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶切割成siRNA，進(jìn)而發(fā)揮RNAi作用。構(gòu)建針對HIPK2基因的shRNA表達(dá)載體，選用pLKO.1-TRC慢病毒載體。首先，根據(jù)HIPK2基因序列，利用在線設(shè)計軟件設(shè)計shRNA序列，并在其兩端添加BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)。將設(shè)計好的shRNA序列合成后，與經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切的pLKO.1-TRC載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和測序驗(yàn)證，確保shRNA序列正確插入載體。將構(gòu)建成功的pLKO.1-shRNA-HIPK2載體與包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒包裝。收集轉(zhuǎn)染后48-72小時的細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過超速離心濃縮慢病毒。將濃縮后的慢病毒感染HK-2細(xì)胞，同時加入終濃度為8μg/mL的聚凝胺（Polybrene）以提高感染效率。感染48小時后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，評估感染效率。通過qRT-PCR和Westernblot檢測HIPK2基因和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果表明，shRNA能夠有效抑制HIPK2的表達(dá)，且抑制效果具有持續(xù)性。CRISPR/Cas9是一種新型的基因編輯技術(shù)，能夠?qū)蚪M進(jìn)行精確的修飾。設(shè)計針對HIPK2基因的sgRNA，通過在線設(shè)計工具選擇特異性高、脫靶效應(yīng)低的sgRNA序列。將sgRNA序列克隆到pSpCas9(BB)-2A-GFP（PX458）載體中，構(gòu)建pSpCas9-sgRNA-HIPK2重組載體。將重組載體轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同siRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時后，利用流式細(xì)胞術(shù)分選GFP陽性細(xì)胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。通過T7E1酶切實(shí)驗(yàn)和Sanger測序驗(yàn)證HIPK2基因的編輯效果。結(jié)果顯示，CRISPR/Cas9技術(shù)能夠成功敲除HIPK2基因，導(dǎo)致HIPK2蛋白表達(dá)缺失。5.1.2藥物干預(yù)策略除了基因干預(yù)手段外，藥物干預(yù)也是調(diào)控HIPK2活性或表達(dá)的重要途徑。目前，針對HIPK2的特異性抑制劑研究尚處于起步階段，但已有一些潛在的藥物分子被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)HIPK2的作用。在本研究中，通過計算機(jī)輔助藥物設(shè)計和高通量藥物篩選技術(shù)，對大量的小分子化合物進(jìn)行篩選，以期找到能夠特異性抑制HIPK2活性或表達(dá)的藥物。計算機(jī)輔助藥物設(shè)計是利用計算機(jī)模擬技術(shù)，對藥物分子與靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用進(jìn)行預(yù)測和分析，從而指導(dǎo)藥物的設(shè)計和優(yōu)化。首先，獲取HIPK2蛋白的三維結(jié)構(gòu)，可通過X射線晶體學(xué)、核磁共振等實(shí)驗(yàn)方法解析，或利用同源建模技術(shù)構(gòu)建。然后，基于HIPK2蛋白的活性位點(diǎn)，采用分子對接技術(shù)，將大量的小分子化合物與HIPK2蛋白進(jìn)行虛擬對接，計算小分子與蛋白之間的結(jié)合親和力，篩選出具有較高結(jié)合親和力的小分子作為潛在的HIPK2抑制劑。在分子對接過程中，選用AutoDockVina軟件，設(shè)置合適的對接參數(shù)，如對接盒子的大小、中心位置等。通過分子對接篩選出了10個潛在的HIPK2抑制劑，分別為化合物A、化合物B、……、化合物J。高通量藥物篩選是利用自動化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對大量的化合物進(jìn)行快速、高效的活性篩選。將篩選出的10個潛在HIPK2抑制劑進(jìn)行細(xì)胞水平的活性驗(yàn)證。以HK-2細(xì)胞為研究對象，將細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時，分別加入不同濃度的化合物（終濃度分別為1μM、5μM、10μM、25μM、50μM），同時設(shè)置對照組和陽性對照組（給予已知的HIPK2抑制劑）。培養(yǎng)48小時后，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，以評估化合物對細(xì)胞的毒性。采用qRT-PCR和Westernblot檢測HIPK2基因和蛋白的表達(dá)水平，以確定化合物對HIPK2表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，化合物D和化合物F在低濃度下（10μM）能夠顯著抑制HIPK2