3.2基因工程的基本操作程序第三章

基因工程目標(biāo)與問(wèn)題1.基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？2.基因工程操作的每一步涉及的技術(shù)和方法有哪些？3.針對(duì)人類(lèi)生產(chǎn)或生活中的某一需求，選取適當(dāng)?shù)幕蚬こ痰募夹g(shù)和方法，嘗試設(shè)計(jì)獲得某一轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的方案。4.通過(guò)設(shè)計(jì)引物和模擬PCR的過(guò)程，進(jìn)一步加深對(duì)PCR原理和過(guò)程的理解，闡明PCR技術(shù)的原理和基本過(guò)程。1997年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉。到2015年，我國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬(wàn)噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。非轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉

從社會(huì)中來(lái)問(wèn)題探討1.為什么傳統(tǒng)的雜交育種培育不出轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉，而基因工程卻可以？2.轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉抗蟲(chóng)的機(jī)制是什么？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉一般需要哪些步驟？

普通棉花（無(wú)抗蟲(chóng)特性）

棉花細(xì)胞抗蟲(chóng)棉提取表達(dá)Bt基因?qū)肱c載體拼接重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測(cè)與鑒定Bt基因請(qǐng)表述出培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的四個(gè)步驟蘇云金桿菌閱讀教材P76-77內(nèi)容，思考以下問(wèn)題1.什么是目的基因？抗蟲(chóng)棉的目的基因是什么？2.篩選合適的目的基因的方法有哪些？【目的基因的篩選與獲取】3.獲取目的基因的方法有哪些？①通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因前提：基因比較小、核苷酸序列已知通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成③利用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因②人工合成目的基因方法：任務(wù)一序列數(shù)據(jù)庫(kù)，如Genbank序列比對(duì)工具，如BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址：/genbank/包括：所有已知的核苷酸及蛋白質(zhì)序列、以及與之相關(guān)的生物學(xué)信息和參考文獻(xiàn)簡(jiǎn)介：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院維護(hù)的基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)，匯集并注釋了所有公開(kāi)的核酸序列與日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)（DDBJ）和歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室核酸數(shù)據(jù)庫(kù)（EMBL）構(gòu)成國(guó)際核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)合作，每天交換數(shù)據(jù)檢索方式：輸入基因名稱(chēng)、物種名稱(chēng)二、篩選合適的目的基因6序列數(shù)據(jù)庫(kù)，如Genbank序列比對(duì)工具，如BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址：/Blast.cgi簡(jiǎn)介：可將輸入的核酸或蛋白質(zhì)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，獲得序列相似度等信息，從而判斷序列的來(lái)源或進(jìn)化關(guān)系。二、篩選合適的目的基因包括：75’3’

怎樣獲取Bt基因呢？體內(nèi)DNA復(fù)制所需的基本條件在DNA復(fù)制中的作用體內(nèi)DNA復(fù)制條件DNA母鏈解旋酶4種脫氧核苷酸DNA聚合酶提供DNA復(fù)制的模板打開(kāi)DNA雙鏈合成子鏈DNA的原料催化形成磷酸二酯鍵，進(jìn)而合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸引物任務(wù)一閱讀教材P77-79內(nèi)容，思考以下問(wèn)題1.說(shuō)出體外擴(kuò)增目的基因的方法、原理、優(yōu)點(diǎn)、條件2.什么是引物？PCR擴(kuò)增為什么需要引物？【利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因】方法：PCR,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，原理：DNA半保留復(fù)制優(yōu)點(diǎn)：特異性快速擴(kuò)增目的基因條件：緩沖液（一般要添加Mg2+)、DNA模版、引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫DNA聚合酶、

控制溫度引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸

在DNA復(fù)制中的作用體內(nèi)DNA復(fù)制條件DNA母鏈解旋酶4種脫氧核苷酸DNA聚合酶提供DNA復(fù)制的模板打開(kāi)DNA雙鏈合成子鏈DNA的原料催化形成磷酸二酯鍵，進(jìn)而合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸引物PCR的條件

耐高溫DNA聚合酶

高溫DNA母鏈4種脫氧核苷酸引物歸納總結(jié)：

比較PCR反應(yīng)和體內(nèi)DNA復(fù)制所需的基本條件活動(dòng)1.根據(jù)查詢(xún)的Bt基因編碼鏈序列，嘗試設(shè)計(jì)引物。小組內(nèi)合作討論完成（3min）要求：1.寫(xiě)出互補(bǔ)鏈的堿基序列，并注明方向。2.從①－④中選擇2個(gè)合適的位置設(shè)計(jì)引物，寫(xiě)出引物的部分序列，并注明方向。5’ATG……ATCGAGACCGGT……TAA3’3’TAC……TAGCTCTGGCCA……ATT5’①②

③④3’…ATT5’5’ATG…3’要求：請(qǐng)利用所給材料和活動(dòng)1中設(shè)計(jì)的引物，小組合作討論并模擬PCR擴(kuò)增的過(guò)程（4min）活動(dòng)2.模擬PCR擴(kuò)增過(guò)程14【利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因】活動(dòng)2.模擬PCR擴(kuò)增過(guò)程思考：觀察下列過(guò)程，回答問(wèn)題15①n次循環(huán)后，DNA分子有_____個(gè)②n次循環(huán)后，DNA鏈有_____條③第____次循環(huán)出現(xiàn)完整的目的基因④n次循環(huán)后，含引物的DNA分子有__個(gè)⑤n次循環(huán)后，共消耗_______個(gè)引物⑥第n次循環(huán)時(shí)，消耗______個(gè)引物⑦n次循環(huán)后，完整的目的基因有_______個(gè)2n2n+132n2n+1-22n2n-2nPCR結(jié)果分析16（1）引物的作用是

引物應(yīng)結(jié)合在模板鏈的

（5’端、3’端）。（2）1個(gè)DNA分子經(jīng)PCR擴(kuò)增n次，可得到

個(gè)DNA分子，從而在體外快速擴(kuò)增目的基因。

（3）鑒定PCR產(chǎn)物的方法是

。歸納總結(jié)：

使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸3’端2n瓊脂糖凝膠電泳18常見(jiàn)的PCR儀：Veriti熱循環(huán)儀練習(xí)與嘗試

1.變性過(guò)程破壞的是哪種化學(xué)鍵？是否需要酶？2.引物是什么？在復(fù)性過(guò)程中引物結(jié)合到模板鏈的哪一端？3.延伸過(guò)程是否需要ATP供能？4.PCR為什么需要引物？氫鍵；不需要酶，需要90℃以上的高溫短單鏈核酸3’端不需要，由dNTP水解供能DNA復(fù)制不能從頭開(kāi)始，DNA聚合酶只能從引物的3'端延伸DNA鏈（DNA聚合酶只能催化單個(gè)核苷酸加到已有核苷酸片段的3’端的羥基上）195.旁欄思考：用PCR技術(shù)可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。獲取了足夠量的目的基因后，能直接把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞嗎？直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后一般不能表達(dá)，就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無(wú)法隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞不再含有目的基因游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會(huì)直接被分解

不能原因P80頁(yè)旁欄思考任務(wù)二閱讀教材P80內(nèi)容，思考以下問(wèn)題1.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的？2.基因表達(dá)載體由哪些元件組成？它們的作用分別是什么？【基因表達(dá)載體的構(gòu)建】——基因工程的核心任務(wù)二【基因表達(dá)載體的構(gòu)建】——基因工程的核心①

;②

。啟動(dòng)子：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。終止子：終止轉(zhuǎn)錄1.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用2.組成標(biāo)記基因：目的基因：復(fù)制原點(diǎn)：鑒別或篩選含有重組DNA分子的受體細(xì)胞目的基因必須插入到

與

之間。終止子DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)。載體的種類(lèi)：質(zhì)粒（常用）、噬菌體、動(dòng)植物病毒啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子？02復(fù)制原點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)標(biāo)記基因：作用為鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心步驟啟動(dòng)子：本質(zhì)：有特殊序列結(jié)構(gòu)的

片段位置：基因的

。功能：

識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出

。DNA上游RNA聚合酶mRNA抗生素抗性基因，熒光蛋白基因等。終止子：本質(zhì)：有特殊序列結(jié)構(gòu)的

片段位置：基因的

。功能：終止

。DNA下游轉(zhuǎn)錄目的基因：能控制表達(dá)所需要的特殊性狀必須插到

和

之間啟動(dòng)子終止子項(xiàng)目啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)_________________________位置功能_________________________________________________________________________________________________________________________DNADNAmRNAmRNARNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)翻譯的起始信號(hào)(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(hào)(不編碼氨基酸)啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端活動(dòng)3.模擬基因表達(dá)載體的構(gòu)建（5min）要求：1.利用所給材料，從4個(gè)方案中選擇一個(gè)最優(yōu)方案,模擬基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程

2.各組選派代表展示成果，并說(shuō)明其它方案的不足之處。

活動(dòng)3.模擬基因表達(dá)載體的構(gòu)建

EcoRⅠ

XbaⅠ

HindⅢ

BamHⅠ

XbaⅠ

Bt基因方案一：HindⅢ方案二：EcoRⅠ、HindⅢ方案三:XbaⅠ、BamHⅠ方案四:HindⅢ、BamHⅠ

利用所給材料，從4個(gè)方案中選擇一個(gè)最優(yōu)方案,模擬基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程

歸納總結(jié)：

限制酶的選擇原則(1)不破壞目的基因，所以不能選擇方案

。(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)。(3)善用“雙酶切”，注意方向性。常使

切割目的基因和質(zhì)粒，優(yōu)點(diǎn)是可以避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接（或?yàn)榱吮ＷC目的基因和質(zhì)粒發(fā)生定向連接），因此不選擇方案

。目的基因和載體啟動(dòng)子的方向必須是

，否則目的基因?qū)牒鬅o(wú)法正常轉(zhuǎn)錄，因此不選擇方案

。三不同的限制酶相同的二一典例1.如圖表示pBR322質(zhì)粒和人生長(zhǎng)激素基因所在片段的結(jié)構(gòu)信息，將二者構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌并進(jìn)行篩選。下列有關(guān)敘述不正確的是(

)

注：AmpR為氨芐青霉素抗性基因，TetR為四環(huán)素抗性基因。A.可選擇的限制酶組合是酶F和酶GB.所選用的受體菌不能含有AmpR和TetR基因C.用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基就能篩選出含重組質(zhì)粒的受體菌D.啟動(dòng)子是RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合部位，可以驅(qū)動(dòng)遺傳信息的轉(zhuǎn)錄

C任務(wù)二【基因表達(dá)載體的構(gòu)建】——基因工程的核心載體（質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同種[易錯(cuò)提醒]若考慮兩兩相連，則DNA連接酶連接DNA片段會(huì)出現(xiàn)三種情況：目的基因與目的基因連接；目的基因與質(zhì)粒連接；質(zhì)粒與質(zhì)粒的連接，需篩選出重組質(zhì)粒。任務(wù)三【將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞】閱讀教材P81-82內(nèi)容，完成表格：生物種類(lèi)植物動(dòng)物微生物常用方法

處理法受體細(xì)胞_______________________轉(zhuǎn)化過(guò)程農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法（我國(guó)創(chuàng)造）體細(xì)胞或受精卵受精卵Ca2＋將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上→表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2＋處理細(xì)胞→細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達(dá)載體導(dǎo)入顯微注射法原核細(xì)胞只有該步驟沒(méi)涉及堿基互補(bǔ)配對(duì)原則將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:花粉管通道法1.花粉管通道法我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法。②可以在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。31①可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:花粉管通道法優(yōu)點(diǎn)①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，將外源基因攜帶進(jìn)

入胚囊，此時(shí)的受精卵未形成細(xì)胞壁，且正在進(jìn)行活躍的DNA復(fù)制，容易將外源DNA片段整合到受體基因組中。②操作簡(jiǎn)單、技術(shù)成本低，免去了組織培養(yǎng)以及誘導(dǎo)再生植株

的全套人工培養(yǎng)過(guò)程。受體細(xì)胞：受精卵32將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：a.能在自然條件下侵染_____________和___________，而對(duì)大多數(shù)____________沒(méi)有侵染能力。雙子葉植物裸子植物單子葉植物隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。采用最多將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法b.當(dāng)植物體受到損傷時(shí)，傷口處的細(xì)胞會(huì)分泌大量酚類(lèi)化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞，農(nóng)桿菌能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)

轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法②載體：農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒（T-DNA)·毒性區(qū)(vir區(qū))︰激活T-DNA的轉(zhuǎn)移·T-DNA區(qū):侵染植物時(shí)，從Ti質(zhì)粒上被切割，轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，帶有與腫瘤形成有關(guān)的基因。該區(qū)內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控序列與真核生物類(lèi)似，因而可以不在農(nóng)桿菌中表達(dá)而在植物中表達(dá)。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因插入__________________中，通過(guò)農(nóng)桿菌的________作用，就可以使目的基因__________________并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩(wěn)定和表達(dá)。③利用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化的思路：Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化目的基因進(jìn)入____________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程。受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。構(gòu)建表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒表現(xiàn)出新性狀的植株導(dǎo)入植物細(xì)胞植物細(xì)胞將目的基因插入染色體DNA中目的基因Ti質(zhì)粒T-DNA含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌過(guò)程Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞T-DNA攜帶目的基因插入植物細(xì)胞染色體DNA中表達(dá)新性狀植物組織培養(yǎng)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法⑤方法①將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株；②可以將花序直接浸沒(méi)在含有農(nóng)桿菌的溶液一段時(shí)間，然后培植植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。受體細(xì)胞為_(kāi)______體細(xì)胞受體細(xì)胞為_(kāi)______受精卵38將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株；將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法39可以將花序直接浸沒(méi)在含有農(nóng)桿菌的溶液一段時(shí)間，然后培植植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法40該過(guò)程經(jīng)過(guò)____次拼接、____次導(dǎo)入？(1)第一次拼接______________________________________________________________________(2)第二次拼接______________________________________________________________________(3)第一次導(dǎo)入_____________________________________________________________________(4)第二次導(dǎo)入____________________________________________________________________將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上（非人工操作）兩兩將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞（非人工操作）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法【P83拓展應(yīng)用】

提示：外源基因插入基因組中可能為單位點(diǎn)插入，或者同一染色體多位點(diǎn)插入，或者不同染色體多位點(diǎn)插入。大多數(shù)情況下，插入的位點(diǎn)難以做到定點(diǎn)插入;插入的拷貝數(shù)也是隨機(jī)的。因此，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳是很復(fù)雜的。

例如，科研人員在對(duì)轉(zhuǎn)GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因）的煙草進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植株的染色體DNA中整合了多個(gè)拷貝的基因，從而導(dǎo)致GUS基因失活。除此之外，外源基因丟失、基因重排等也都可能影響外源基因的穩(wěn)定性。42將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——?jiǎng)游锛?xì)胞顯微注射法受精卵注射器固定吸管顯微注射儀將含有目的基因的表達(dá)載體提純→顯微注射入動(dòng)物的受精卵→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物受體細(xì)胞：受精卵43將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——微生物細(xì)胞1.原核生物的作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)①繁殖快②單細(xì)胞③遺傳物質(zhì)少2.導(dǎo)入方法：Ca2+處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Ca2+混合表達(dá)載體緩沖液溶于吸收DNA，完成轉(zhuǎn)化使大腸桿菌處于一種易于吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

用CaCl2處理大腸桿菌，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞。44將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——微生物細(xì)胞胰腺提取篩選胰島素mRNA胰島素cDNA逆轉(zhuǎn)錄重組質(zhì)粒質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌mRNA胰島素原胰島素加工用原核生物生產(chǎn)胰島素示意圖注：原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒(méi)有生物活性，需要在體外進(jìn)行再加工。45受體細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法顯微注射技術(shù)Ca2+處理法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上↓轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中↓導(dǎo)入植物細(xì)胞↓整合到受體細(xì)胞的DNA上提純含目的基因的表達(dá)載體↓顯微注射↓受精卵發(fā)育↓具有新性狀的個(gè)體Ca2＋處理細(xì)胞↓感受態(tài)細(xì)胞↓基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合↓感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子46將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡(jiǎn)便嗎？如果這么做，效果會(huì)怎樣？

有人采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個(gè)生物的總DNA提取出來(lái)，通過(guò)注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒(méi)有進(jìn)行基因表達(dá)載體的構(gòu)建。這種方法針對(duì)性差，完全靠運(yùn)氣，也無(wú)法確定哪些基因?qū)肓耸荏w植物。4748①目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞？②受體細(xì)胞的染色體DNA中是否插入了目的基因(DNA)？③目的基因是否轉(zhuǎn)錄（mRNA）？④是否有翻譯產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）？⑤是否賦予了生物個(gè)體新性狀？篩選含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞檢測(cè)與鑒定分子水平個(gè)體水平第四步：檢測(cè)和鑒定目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。任務(wù)四【目的基因的檢測(cè)與鑒定】閱讀教材P82內(nèi)容，思考下列問(wèn)題：49①目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞？篩選含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞插入目的基因自身環(huán)化a.重組質(zhì)粒b.空質(zhì)粒酶連接注：僅有少數(shù)質(zhì)粒能進(jìn)入受體細(xì)胞，使細(xì)胞轉(zhuǎn)化A.導(dǎo)入重組質(zhì)粒C.未導(dǎo)入質(zhì)粒B.導(dǎo)入空質(zhì)粒青霉素X-galA含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落B含有空質(zhì)粒的大腸桿菌菌落C不含質(zhì)粒的大腸桿菌菌落生長(zhǎng)生長(zhǎng)不生長(zhǎng)白色藍(lán)色AmpR：檢測(cè)質(zhì)粒是否進(jìn)入大腸桿菌LacZ：區(qū)分空質(zhì)粒（藍(lán)色）和重組質(zhì)粒（白色）【實(shí)例】藍(lán)白斑篩選P98變式：將混合處理后的細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長(zhǎng)的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)菌，如下圖1、2、3、4、5菌落，再利用無(wú)菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如下圖能生長(zhǎng)的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的即為含有目的基因的菌落，如下圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。51②受體細(xì)胞的染色體DNA中是否插入了目的基因(DNA)？檢測(cè)與鑒定PCR等技術(shù)方法：過(guò)程：1）設(shè)計(jì)引物2）模板DNA的制備提取植物基因組DNA或總DNA;檢測(cè)時(shí)要有陽(yáng)性和陰性對(duì)照,

陽(yáng)性對(duì)照可用質(zhì)粒DNA，

陰性對(duì)照可從未轉(zhuǎn)基因的植株中提取。3）PCR反應(yīng)4）電泳結(jié)果分析52②受體細(xì)胞的染色體DNA中是否插入了目的基因(DNA)？檢測(cè)與鑒定PCR等技術(shù)方法：過(guò)程：結(jié)果示例：53【練一練】B②受體細(xì)胞的染色體DNA中是否插入了目的基因(DNA)？檢測(cè)與鑒定(2019·江蘇高考真題）為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是__________________________54【練一練】乙丙②受體細(xì)胞的染色體DNA中是否插入了目的基因(DNA)？檢測(cè)與鑒定55③目的基因是否轉(zhuǎn)錄（mRNA）？檢測(cè)與鑒定PCR等技術(shù)方法：過(guò)程：RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄PCR）以植物總RNA或mRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后再經(jīng)PCR擴(kuò)增。如果從細(xì)胞總RNA提取物中得到特異的cDNA擴(kuò)增條帶，則表明外源基因?qū)崿F(xiàn)了轉(zhuǎn)錄。56④是否有翻譯產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）？檢測(cè)與鑒定抗原-抗體雜交技術(shù)方法：過(guò)程：從轉(zhuǎn)基因生物中提取出蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原－抗體雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品。57⑤是否賦予了生物個(gè)體新性狀？檢測(cè)與鑒定觀察是否賦予個(gè)體生物新的特性或抗性方法：轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲(chóng)植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲(chóng)（抗蟲(chóng)接種實(shí)驗(yàn)）害蟲(chóng)死亡病毒（菌）接種實(shí)驗(yàn)未染病鹽水澆灌正常生長(zhǎng)噴灑除草劑正常生長(zhǎng)提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常目的基因的篩選和獲取利用PCR獲取和擴(kuò)增化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體-核心目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動(dòng)物)、Ca2+處理(微生物);目的基因的檢測(cè)與鑒定分子檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯個(gè)體水平：是否具有抗性以及抗性強(qiáng)度等?；蚬こ痰幕静僮鞒绦颍?個(gè)步驟）1.研究人員將一種海魚(yú)的抗凍蛋白基因afp整合到土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上，然后用它侵染番茄細(xì)胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關(guān)表述是否正確。（1）afp基因是培育抗凍番茄用到的目的基因。（

）（2）構(gòu)建含有afp基因的Ti質(zhì)粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶（

）（3）只要檢測(cè)出番茄細(xì)胞中含有afp基因，就代表抗凍番茄培育成功（

）2.利用PCR既可以快速擴(kuò)增特定基因，也可以檢測(cè)基因的表達(dá)。下列有關(guān)PCR的敘述錯(cuò)誤的是（

）

A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶

B.變性過(guò)程中雙鏈DNA的解開(kāi)不需要解旋酶

C.復(fù)