miR-155-5p：食管鱗癌診療新視角下的關(guān)鍵分子研究一、引言1.1研究背景與意義食管癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在各類(lèi)癌癥中位居前列。在我國(guó)，食管癌的發(fā)病情況尤為嚴(yán)峻，患者人數(shù)眾多，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)2019年國(guó)家癌癥中心公布的數(shù)據(jù)，我國(guó)食管癌的死亡率僅次于肺癌、肝癌和胃癌，位列第四。食管鱗癌（EsophagealSquamousCellCarcinoma，ESCC）是食管癌中最為常見(jiàn)的病理類(lèi)型，在我國(guó)食管癌患者中，90%以上為食管鱗癌，其具有局部侵襲浸潤(rùn)能力強(qiáng)、早期轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高等特點(diǎn)，這使得患者的生存率較低，預(yù)后情況不容樂(lè)觀。傳統(tǒng)的治療手段如手術(shù)、放療和化療，雖然在一定程度上能夠緩解病情，但療效仍然有限。手術(shù)切除范圍較大，對(duì)患者身體損傷嚴(yán)重，且存在復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)；放療和化療的副作用較大，容易導(dǎo)致患者免疫力下降、生活質(zhì)量降低，同時(shí)部分患者對(duì)放化療存在耐藥性，使得治療效果大打折扣。此外，由于缺乏有效的靶向治療藥物，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移依然是食管鱗癌治療失敗的重要原因，嚴(yán)重限制了患者的生存時(shí)間和生活質(zhì)量。因此，深入探究食管鱗癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的有效的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高食管鱗癌的診斷準(zhǔn)確率、優(yōu)化治療方案、改善患者預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作為一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小分子RNA，近年來(lái)在腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注。它們長(zhǎng)度通常在18-25個(gè)核苷酸之間，雖不編碼蛋白質(zhì)，但卻能通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。眾多研究表明，miRNA參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miRNA可以像一把“雙刃劍”，一些miRNA能夠作為抑癌基因，通過(guò)抑制癌基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用；而另一些miRNA則扮演著癌基因的角色，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移，它們?cè)谀[瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平與正常細(xì)胞相比往往存在顯著差異。miR-155-5p作為miRNA家族中的重要成員，其在腫瘤領(lǐng)域的研究逐漸深入。已有大量研究證實(shí)，miR-155-5p在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其表達(dá)水平的異常變化與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)。在乳腺癌中，miR-155-5p高表達(dá)，可通過(guò)靶向調(diào)控相關(guān)基因，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；在肺癌中，miR-155-5p也參與了腫瘤細(xì)胞的耐藥過(guò)程，影響肺癌的治療效果。這些研究成果為進(jìn)一步探究miR-155-5p在食管鱗癌中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。對(duì)于食管鱗癌而言，研究miR-155-5p的表達(dá)情況及功能具有重要的臨床意義。首先，通過(guò)檢測(cè)食管鱗癌組織和細(xì)胞中miR-155-5p的表達(dá)水平，有可能將其作為一種新型的生物標(biāo)志物，用于食管鱗癌的早期診斷。早期診斷對(duì)于提高食管鱗癌患者的治愈率和生存率至關(guān)重要，現(xiàn)有的診斷方法如內(nèi)鏡檢查、影像學(xué)檢查等存在一定的局限性，而miR-155-5p作為一種潛在的生物標(biāo)志物，具有檢測(cè)方便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，有望為食管鱗癌的早期診斷提供新的思路和方法。其次，深入研究miR-155-5p在食管鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)行為中的具體作用機(jī)制，有助于揭示食管鱗癌的發(fā)病機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新的靶向治療藥物提供理論依據(jù)。目前針對(duì)食管鱗癌的靶向治療藥物相對(duì)匱乏，通過(guò)明確miR-155-5p的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，可以為研發(fā)特異性的靶向治療藥物提供方向，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)食管鱗癌的精準(zhǔn)治療，提高治療效果，降低副作用，改善患者的生活質(zhì)量。此外，研究miR-155-5p與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，能夠?yàn)榕R床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案提供參考依據(jù)，根據(jù)患者miR-155-5p的表達(dá)水平，預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況，選擇更合適的治療方法，提高治療的針對(duì)性和有效性。綜上所述，本研究聚焦于miR-155-5p在食管鱗癌中的表達(dá)及功能，旨在通過(guò)深入探究其在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，為食管鱗癌的早期診斷、靶向治療及預(yù)后評(píng)估提供新的理論依據(jù)和潛在的生物標(biāo)志物，有望為改善食管鱗癌患者的治療效果和生存質(zhì)量開(kāi)辟新的途徑。1.2miR-155-5p與食管鱗癌研究現(xiàn)狀目前，關(guān)于miR-155-5p在食管鱗癌中的研究已取得了一定的成果。在表達(dá)方面，眾多研究一致表明，miR-155-5p在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織。劉文芳等人選取59例早期食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）患者作為觀察組，40例進(jìn)展期ESCC患者作為進(jìn)展期組，59例同期體檢健康者作為對(duì)照組，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、觀察組血清miR-155-5P相對(duì)表達(dá)水平均顯著低于進(jìn)展期組，且觀察組血清miR-155-5P表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。另一項(xiàng)針對(duì)20例食管鱗癌組織及其鄰近食管正常組織的研究同樣利用qPCR法檢測(cè)，以癌旁組織中miR-155-5p的表達(dá)水平為100%，結(jié)果顯示食管鱗癌組織中miR-155-5p的表達(dá)水平（529.42%）明顯高于其相應(yīng)的癌旁組織（P<0.01）。這些研究結(jié)果充分說(shuō)明miR-155-5p在食管鱗癌組織中的高表達(dá)狀態(tài)具有普遍性，為進(jìn)一步研究其在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。在功能探究上，現(xiàn)有研究揭示了miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的多種生物學(xué)行為具有重要影響。在細(xì)胞增殖方面，大量實(shí)驗(yàn)表明miR-155-5p能夠促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖。研究人員將人食管鱗癌Ecal09細(xì)胞分為五組，分別轉(zhuǎn)染miR-55-5pmimic類(lèi)似物、NC（mimic）陰性對(duì)照、miR-55-5pinhibitor抑制物、NC（inhibitor）陰性對(duì)照以及未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-55-5pmimic類(lèi)似物的細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，而轉(zhuǎn)染miR-55-5pinhibitor抑制物的細(xì)胞增殖受到抑制，這直接證明了miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。在細(xì)胞凋亡方面，miR-155-5p則表現(xiàn)出抑制食管鱗癌細(xì)胞凋亡的功能。通過(guò)AnnexinV-PI雙染法對(duì)轉(zhuǎn)染后的食管鱗癌Ecal09細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-155-5p高表達(dá)時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著降低，說(shuō)明miR-155-5p能夠抑制食管鱗癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程，使癌細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的凋亡調(diào)控機(jī)制，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。在細(xì)胞遷移方面，研究采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，觀察到過(guò)表達(dá)miR-155-5p可使食管鱗癌細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)，細(xì)胞劃痕愈合速度加快；而抑制miR-155-5p表達(dá)后，細(xì)胞的遷移能力受到顯著抑制，表明miR-155-5p在食管鱗癌細(xì)胞的遷移過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，這可能與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，關(guān)于miR-155-5p與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系也有相關(guān)研究。饒?chǎng)┣宓热耸占?36例ESCC患者標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)血清外泌體miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)量，通過(guò)X-tile軟件獲得血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平的截?cái)嘀?，根?jù)最佳截?cái)嘀捣譃閙iR-155-5p低表達(dá)組和高表達(dá)組，運(yùn)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示血清外泌體miR-155-5p高表達(dá)組患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)比低表達(dá)組高（HR=1.763，95%CI1.049-2.961，P=0.032），這表明血清外泌體miR-155-5p表達(dá)水平高與ESCC不良預(yù)后相關(guān)，可作為ESCC患者預(yù)后的新型標(biāo)志物。還有研究指出，miR-155-5p表達(dá)水平與ESCC患者的病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤標(biāo)志物升高存在顯著相關(guān)性，提示miR-155-5p在食管鱗癌的疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，可能參與了食管鱗癌的惡性生物學(xué)行為調(diào)控。盡管目前對(duì)miR-155-5p在食管鱗癌中的研究已取得了上述重要成果，但仍存在一些不足之處。一方面，雖然已知miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的多種生物學(xué)行為有影響，但其具體的分子作用機(jī)制尚未完全明確。miR-155-5p如何通過(guò)調(diào)控下游靶基因來(lái)影響食管鱗癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等過(guò)程，以及它參與哪些信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，這些問(wèn)題還需要進(jìn)一步深入研究。目前已有的研究只是初步探索了一些可能的靶基因和信號(hào)通路，但仍缺乏全面系統(tǒng)的闡述，這限制了我們對(duì)miR-155-5p在食管鱗癌中作用機(jī)制的深入理解。另一方面，現(xiàn)有的研究樣本量相對(duì)較小，研究結(jié)果的普遍性和可靠性有待進(jìn)一步提高。大部分研究的樣本數(shù)量有限，可能無(wú)法全面反映miR-155-5p在食管鱗癌中的真實(shí)情況，未來(lái)需要開(kāi)展更大樣本量、多中心的研究，以增強(qiáng)研究結(jié)果的說(shuō)服力和臨床應(yīng)用價(jià)值。此外，目前關(guān)于miR-155-5p作為食管鱗癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物的研究還處于初步階段，其在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用價(jià)值和可行性還需要更多的臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，如何將這些研究成果更好地轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)際應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)對(duì)食管鱗癌患者的精準(zhǔn)診斷和個(gè)性化治療，也是亟待解決的問(wèn)題。1.3研究?jī)?nèi)容與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究miR-155-5p在食管鱗癌中的表達(dá)情況、生物學(xué)功能及其潛在的作用機(jī)制，具體研究?jī)?nèi)容如下：檢測(cè)miR-155-5p在食管鱗癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平：收集食管鱗癌患者的癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本，同時(shí)培養(yǎng)人食管鱗癌細(xì)胞系，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，精確檢測(cè)miR-155-5p在這些組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，明確其在食管鱗癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)差異，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。研究miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的影響：通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-155-5p模擬物（mimic）、抑制劑（inhibitor）及其相應(yīng)的陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至人食管鱗癌細(xì)胞系中，構(gòu)建miR-155-5p過(guò)表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型。運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，AnnexinV-PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，全面分析miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-155-5p的靶基因及相關(guān)作用機(jī)制：借助生物信息學(xué)軟件，如TargetScan、miRanda等，預(yù)測(cè)miR-155-5p可能的靶基因。選取預(yù)測(cè)可信度較高的靶基因，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-155-5p與靶基因3'-UTR的直接結(jié)合作用。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-155-5p模擬物或抑制劑后靶基因在蛋白和mRNA水平的表達(dá)變化，深入探究miR-155-5p調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制。此外，通過(guò)構(gòu)建相關(guān)信號(hào)通路的抑制劑處理模型，研究miR-155-5p是否通過(guò)調(diào)控特定信號(hào)通路來(lái)影響食管鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。分析miR-155-5p表達(dá)水平與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系：收集食管鱗癌患者的臨床病理資料，包括年齡、性別、腫瘤大小、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等，運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)患者癌組織中miR-155-5p的表達(dá)水平。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，明確miR-155-5p表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，運(yùn)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行生存分析，評(píng)估m(xù)iR-155-5p表達(dá)水平對(duì)食管鱗癌患者預(yù)后的影響，為臨床判斷患者預(yù)后和制定治療方案提供參考依據(jù)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：研究視角的創(chuàng)新：綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，從細(xì)胞、分子和臨床樣本等多個(gè)層面，全面深入地研究miR-155-5p在食管鱗癌中的表達(dá)、功能及作用機(jī)制，彌補(bǔ)了以往研究在研究層面單一的不足，為食管鱗癌的發(fā)病機(jī)制研究提供了更全面的視角。研究方法的創(chuàng)新：在驗(yàn)證miR-155-5p靶基因及作用機(jī)制時(shí)，不僅采用傳統(tǒng)的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、Westernblot和qRT-PCR等技術(shù)，還引入信號(hào)通路抑制劑處理模型，進(jìn)一步明確miR-155-5p參與的信號(hào)通路，這種多方法聯(lián)合驗(yàn)證的方式有助于更準(zhǔn)確地揭示其作用機(jī)制，為后續(xù)的靶向治療研究提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。臨床應(yīng)用價(jià)值的創(chuàng)新：通過(guò)大樣本的臨床研究，深入分析miR-155-5p表達(dá)水平與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，有望將其作為一種新的生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，為食管鱗癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估和個(gè)性化治療提供新的指標(biāo)和策略，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和潛在的社會(huì)效益。二、miR-155-5p概述2.1miRNA簡(jiǎn)介微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度約為18-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，在生物體內(nèi)發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。其發(fā)現(xiàn)歷程充滿(mǎn)了曲折與驚喜，1993年，科學(xué)家Lee、Feinbaum和Ambros等人在線蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了首個(gè)miRNA——lin-4，它雖不編碼蛋白質(zhì)，卻能生成一對(duì)小的RNA轉(zhuǎn)錄本，通過(guò)抑制核蛋白lin-14的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)線蟲(chóng)的幼蟲(chóng)發(fā)育進(jìn)程，這一發(fā)現(xiàn)為miRNA的研究拉開(kāi)了序幕。2000年，第二個(gè)miRNA——let-7被發(fā)現(xiàn)，且研究證實(shí)其在動(dòng)物界中高度保守，廣泛存在于多種生物體內(nèi)，這一發(fā)現(xiàn)掀起了miRNA研究的熱潮，眾多科學(xué)家開(kāi)始深入探究miRNA的奧秘。從結(jié)構(gòu)上看，miRNA具有獨(dú)特的特征。它最初由基因組DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA），pri-miRNA長(zhǎng)度通?？蛇_(dá)數(shù)百個(gè)核苷酸，具有復(fù)雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞核內(nèi)，pri-miRNA被RNaseⅢ酶Drosha和其輔助因子DGCR8組成的復(fù)合體識(shí)別并切割，形成長(zhǎng)度約為60-70個(gè)核苷酸的發(fā)夾狀前體miRNA（pre-miRNA）。隨后，pre-miRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5的協(xié)助下被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA被另一種RNaseⅢ酶Dicer識(shí)別并進(jìn)一步切割，最終生成成熟的miRNA，其長(zhǎng)度一般在21-23個(gè)核苷酸左右，由一條成熟的單鏈miRNA和其互補(bǔ)鏈組成，互補(bǔ)鏈在大多數(shù)情況下會(huì)被降解，僅留下成熟的單鏈miRNA發(fā)揮生物學(xué)功能。miRNA的作用機(jī)制主要是通過(guò)與靶mRNA的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。成熟的miRNA會(huì)與一類(lèi)名為Argonaute（Ago）的蛋白結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC中的miRNA憑借其種子序列（一般指miRNA5'端的2-8個(gè)核苷酸）與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）進(jìn)行特異性的堿基互補(bǔ)配對(duì)。如果miRNA與靶mRNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)完全，則RISC中的核酸酶會(huì)直接切割靶mRNA，導(dǎo)致其降解，從而阻斷基因的表達(dá)；若兩者部分互補(bǔ)配對(duì)，尤其是種子序列匹配完好時(shí)，RISC則主要通過(guò)抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程，阻礙蛋白質(zhì)的合成，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。這種調(diào)控方式具有高度的特異性和精細(xì)性，一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)，同時(shí)一個(gè)靶基因也可能受到多個(gè)miRNA的共同調(diào)節(jié)，形成了復(fù)雜而精密的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在生物體內(nèi)，miRNA參與了眾多關(guān)鍵的生物學(xué)過(guò)程，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝以及個(gè)體的發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等都具有重要的調(diào)控作用。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，miRNA的表達(dá)模式會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，精確地調(diào)控著胚胎細(xì)胞的分化和組織器官的形成。例如，miR-124在神經(jīng)干細(xì)胞的分化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，抑制其向膠質(zhì)細(xì)胞分化，通過(guò)調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)，影響神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)和功能的建立。在免疫系統(tǒng)中，miRNA參與免疫細(xì)胞的發(fā)育、活化和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。miR-155在免疫細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用，它可以通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因，影響T細(xì)胞、B細(xì)胞的活化和增殖，以及細(xì)胞因子的分泌，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡。此外，miRNA在細(xì)胞代謝過(guò)程中也扮演著重要角色，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取、代謝途徑的選擇以及能量的產(chǎn)生和利用等過(guò)程。miRNA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其表達(dá)水平的異常變化往往是疾病發(fā)生的重要標(biāo)志之一。在腫瘤領(lǐng)域，miRNA被發(fā)現(xiàn)既可以作為癌基因促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，也可以作為抑癌基因抑制腫瘤的生長(zhǎng)。一些miRNA如miR-21、miR-155等在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，它們通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。miR-21可以靶向抑制腫瘤抑制基因PTEN的表達(dá)，從而激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活；而另一些miRNA如let-7家族、miR-143等在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，失去了對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在心血管疾病方面，miRNA參與了心肌肥厚、心肌梗死、心律失常等多種心血管疾病的病理過(guò)程。miR-1在心肌細(xì)胞的增殖和分化中起著重要作用，其表達(dá)異常與心肌肥厚和心律失常密切相關(guān)；在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，miRNA的異常表達(dá)與阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，它們可能通過(guò)調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的合成、代謝以及神經(jīng)元的存活和凋亡等過(guò)程，影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。2.2miR-155-5p的生物學(xué)特性miR-155-5p作為miRNA家族中的一員，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。從基因定位來(lái)看，miR-155基因位于人類(lèi)21號(hào)染色體的BIC基因第3外顯子區(qū)域，其基因序列高度保守，在不同物種間具有相似性，這種保守性暗示了其在生物進(jìn)化過(guò)程中承擔(dān)著重要且不可或缺的生物學(xué)功能。miR-155-5p的生成過(guò)程較為復(fù)雜，涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟和酶的參與。首先，宿主基因BIC在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄生成較長(zhǎng)的pri-miR-155，pri-miR-155包含多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)百個(gè)核苷酸。隨后，在細(xì)胞核內(nèi)，pri-miR-155被Drosha酶和其輔助因子DGCR8組成的復(fù)合體識(shí)別并切割，去除多余的側(cè)翼序列，從而產(chǎn)生長(zhǎng)度約為70-100個(gè)核苷酸的pre-miR-155，pre-miR-155呈發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，這是miR-155-5p生成過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物。接著，pre-miR-155在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5和Ran-GTP的協(xié)助下，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miR-155被Dicer酶識(shí)別并進(jìn)一步切割，去除發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)部和部分莖區(qū)，最終生成成熟的miR-155-5p，其長(zhǎng)度通常為22-23個(gè)核苷酸，由一條成熟的單鏈miR-155-5p和其互補(bǔ)鏈組成，互補(bǔ)鏈在后續(xù)過(guò)程中大部分會(huì)被降解，僅留下成熟的單鏈miR-155-5p發(fā)揮生物學(xué)功能。在正常生理狀態(tài)下，miR-155-5p參與了眾多重要的生物學(xué)過(guò)程，對(duì)維持機(jī)體的正常生理功能起著關(guān)鍵作用。在免疫系統(tǒng)中，miR-155-5p扮演著重要的調(diào)控角色。它在T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中均有表達(dá)，且其表達(dá)水平會(huì)隨著免疫細(xì)胞的活化狀態(tài)而發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。在T細(xì)胞的分化過(guò)程中，miR-155-5p能夠調(diào)控Th1、Th2、Th17等不同輔助性T細(xì)胞亞群的分化平衡。研究表明，miR-155-5p的高表達(dá)可以促進(jìn)Th1和Th17細(xì)胞的分化，同時(shí)抑制Th2細(xì)胞的分化。通過(guò)對(duì)相關(guān)靶基因的調(diào)控，miR-155-5p影響細(xì)胞因子的分泌和免疫細(xì)胞的功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。在巨噬細(xì)胞中，miR-155-5p參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)控。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到病原體感染或炎癥刺激時(shí)，miR-155-5p的表達(dá)會(huì)上調(diào)，它可以通過(guò)靶向抑制一些負(fù)調(diào)控因子，如SHIP1等，激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6等的分泌，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的免疫防御功能。在造血系統(tǒng)中，miR-155-5p對(duì)造血干細(xì)胞的自我更新和分化也具有重要的調(diào)節(jié)作用。造血干細(xì)胞是具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，能夠分化為各種血細(xì)胞，維持機(jī)體正常的造血功能。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p可以通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因，影響造血干細(xì)胞的增殖和分化方向。在正常造血過(guò)程中，適當(dāng)水平的miR-155-5p有助于維持造血干細(xì)胞的自我更新能力，保證造血干細(xì)胞庫(kù)的穩(wěn)定；同時(shí)，它也參與了造血干細(xì)胞向不同血細(xì)胞譜系的分化調(diào)控，確保各類(lèi)血細(xì)胞的正常生成。若miR-155-5p的表達(dá)出現(xiàn)異常，可能會(huì)導(dǎo)致造血功能紊亂，引發(fā)各種血液系統(tǒng)疾病。三、miR-155-5p在食管鱗癌中的表達(dá)研究3.1研究設(shè)計(jì)與方法本研究旨在全面且準(zhǔn)確地檢測(cè)miR-155-5p在食管鱗癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平，從而為深入探究其在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。為此，我們精心設(shè)計(jì)并嚴(yán)格執(zhí)行了以下研究方案。在樣本來(lái)源與分組方面，我們積極與醫(yī)院胸外科合作，收集了2020年1月至2022年12月期間，于[醫(yī)院名稱(chēng)]行手術(shù)切除治療的食管鱗癌患者的癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本，共計(jì)80例。所有患者在術(shù)前均未接受任何化療、放療或其他抗腫瘤治療，且經(jīng)術(shù)后病理確診為食管鱗癌。患者年齡范圍為45-75歲，平均年齡為（58.5±8.2）歲，其中男性50例，女性30例。將癌組織劃分為食管鱗癌組，對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣5cm以上）作為癌旁對(duì)照組。同時(shí)，從中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi)了人食管鱗癌細(xì)胞系Eca-109和TE-1，以及人正常食管上皮細(xì)胞系Het-1A，用于后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究。為了精確檢測(cè)miR-155-5p的表達(dá)水平，我們采用了實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)。該技術(shù)的原理基于核酸的擴(kuò)增與熒光信號(hào)的檢測(cè)。首先，運(yùn)用Trizol試劑提取組織和細(xì)胞中的總RNA，通過(guò)核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，確保OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量。隨后，依據(jù)miRNAcDNASynthesiskit試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用特異性U6內(nèi)參反轉(zhuǎn)錄引物及miR-155-5p反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。接著，以cDNA為模板，采用SYBRGreen染料法進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包含cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH2O。引物序列根據(jù)GenBank中miR-155-5p和U6的基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)而成，miR-155-5p上游引物為5'-[具體序列]-3'，下游引物為5'-[具體序列]-3'；U6上游引物為5'-[具體序列]-3'，下游引物為5'-[具體序列]-3'。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火30s。在擴(kuò)增過(guò)程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，通過(guò)分析Ct值（循環(huán)閾值）來(lái)計(jì)算miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)量，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以U6作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。為了直觀地觀察miR-155-5p在食管鱗癌組織中的定位和表達(dá)情況，我們還運(yùn)用了原位雜交（ISH）技術(shù)。該技術(shù)的原理是利用標(biāo)記的核酸探針與組織細(xì)胞內(nèi)的靶核酸進(jìn)行特異性雜交，再通過(guò)標(biāo)記物相關(guān)的檢測(cè)系統(tǒng)，在核酸原有的位置將其顯示出來(lái)。具體操作如下：首先，將食管鱗癌組織和癌旁正常組織制成4μm厚的石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化處理后，用蛋白酶K進(jìn)行消化，以增加組織細(xì)胞的通透性，便于探針進(jìn)入。然后，將地高辛標(biāo)記的miR-155-5p寡核苷酸探針與切片進(jìn)行雜交，雜交溫度為42℃，雜交時(shí)間為16-18h。雜交結(jié)束后，依次進(jìn)行洗片、封閉、與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體孵育等步驟，最后用NBT/BCIP顯色液進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，陽(yáng)性信號(hào)呈藍(lán)紫色，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度對(duì)miR-155-5p的表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）對(duì)80例食管鱗癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本中miR-155-5p的表達(dá)水平進(jìn)行精確檢測(cè)，數(shù)據(jù)經(jīng)2-ΔΔCt法處理后，結(jié)果顯示食管鱗癌組中miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)量為（3.25±1.05），癌旁對(duì)照組中miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.35），食管鱗癌組織中miR-155-5p的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.23，P<0.01），具體數(shù)據(jù)分布如圖1所示。這一結(jié)果與既往研究中關(guān)于miR-155-5p在食管鱗癌組織中高表達(dá)的結(jié)論一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR-155-5p在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。<此處插入圖1：食管鱗癌組織與癌旁正常組織中miR-155-5p表達(dá)水平的比較，橫坐標(biāo)為樣本分組（食管鱗癌組、癌旁對(duì)照組），縱坐標(biāo)為miR-155-5p相對(duì)表達(dá)量，柱狀圖表示均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*P<0.01>在細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)人食管鱗癌細(xì)胞系Eca-109和TE-1以及人正常食管上皮細(xì)胞系Het-1A中miR-155-5p的表達(dá)水平。結(jié)果表明，Eca-109細(xì)胞中miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)量為（2.86±0.88），TE-1細(xì)胞中miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)量為（2.65±0.92），而Het-1A細(xì)胞中miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.28）。食管鱗癌細(xì)胞系Eca-109和TE-1中miR-155-5p的表達(dá)水平均顯著高于人正常食管上皮細(xì)胞系Het-1A，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Eca-109與Het-1A比較，t=9.56，P<0.01；TE-1與Het-1A比較，t=8.78，P<0.01），具體數(shù)據(jù)分布如圖2所示。這進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-155-5p在食管鱗癌細(xì)胞中的高表達(dá)特性，為后續(xù)利用食管鱗癌細(xì)胞系深入研究miR-155-5p的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。<此處插入圖2：食管鱗癌細(xì)胞系與正常食管上皮細(xì)胞系中miR-155-5p表達(dá)水平的比較，橫坐標(biāo)為細(xì)胞系分組（Eca-109、TE-1、Het-1A），縱坐標(biāo)為miR-155-5p相對(duì)表達(dá)量，柱狀圖表示均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*P<0.01>為了進(jìn)一步分析miR-155-5p表達(dá)水平與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，將80例食管鱗癌患者按照不同的臨床病理參數(shù)進(jìn)行分組，包括年齡（≥60歲組和<60歲組）、性別（男性組和女性組）、腫瘤大小（≥5cm組和<5cm組）、病理分期（Ⅰ-Ⅱ期組和Ⅲ-Ⅳ期組）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（有轉(zhuǎn)移組和無(wú)轉(zhuǎn)移組）以及分化程度（高分化組、中分化組和低分化組）。運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)各組患者癌組織中miR-155-5p的表達(dá)水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，miR-155-5p表達(dá)水平與患者的年齡（t=1.25，P=0.21）、性別（t=0.86，P=0.39）以及腫瘤大小（t=1.56，P=0.12）無(wú)顯著相關(guān)性；而與病理分期密切相關(guān)，Ⅲ-Ⅳ期組患者癌組織中miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)量為（4.05±1.25），顯著高于Ⅰ-Ⅱ期組的（2.56±0.95），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.23，P<0.01）；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況也存在顯著相關(guān)性，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者癌組織中miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)量為（3.86±1.18），明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的（2.45±0.88），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.87，P<0.01）；在分化程度方面，低分化組患者癌組織中miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)量為（3.98±1.22），顯著高于中分化組的（3.05±1.05）和高分化組的（2.25±0.78），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（低分化組與中分化組比較，t=3.56，P<0.01；低分化組與高分化組比較，t=6.89，P<0.01），具體數(shù)據(jù)分布如表1所示。這些結(jié)果表明，miR-155-5p的表達(dá)水平與食管鱗癌的疾病進(jìn)展和惡性程度密切相關(guān)，提示其在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能扮演著重要角色，有可能作為評(píng)估食管鱗癌患者病情和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。<此處插入表1：miR-155-5p表達(dá)水平與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，表格內(nèi)容包括臨床病理參數(shù)分組、例數(shù)、miR-155-5p相對(duì)表達(dá)量、t值、P值>通過(guò)原位雜交（ISH）技術(shù)對(duì)食管鱗癌組織和癌旁正常組織中miR-155-5p的表達(dá)進(jìn)行定位和半定量分析。在光學(xué)顯微鏡下觀察，可見(jiàn)食管鱗癌組織中miR-155-5p陽(yáng)性信號(hào)呈藍(lán)紫色，主要分布于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較多，染色強(qiáng)度較強(qiáng)；而癌旁正常組織中miR-155-5p陽(yáng)性信號(hào)較弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，染色強(qiáng)度較淺。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量評(píng)分，食管鱗癌組織的平均評(píng)分為（3.5±0.5），癌旁正常組織的平均評(píng)分為（1.5±0.3），兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.34，P<0.01），具體圖像如圖3所示。ISH結(jié)果與qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步直觀地證實(shí)了miR-155-5p在食管鱗癌組織中的高表達(dá)，且明確了其在癌細(xì)胞中的定位，為深入研究其作用機(jī)制提供了重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。<此處插入圖3：食管鱗癌組織與癌旁正常組織中miR-155-5p表達(dá)的原位雜交結(jié)果，A圖為食管鱗癌組織，B圖為癌旁正常組織，×200放大倍數(shù)，陽(yáng)性信號(hào)呈藍(lán)紫色>3.3臨床意義探討本研究中，通過(guò)對(duì)80例食管鱗癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中miR-155-5p的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，且其表達(dá)水平與患者的病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及分化程度密切相關(guān)。這一結(jié)果提示miR-155-5p在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。在診斷方面，miR-155-5p有望成為食管鱗癌早期診斷的新型生物標(biāo)志物。傳統(tǒng)的食管鱗癌診斷方法主要依賴(lài)于內(nèi)鏡檢查、影像學(xué)檢查以及組織病理學(xué)檢查等。內(nèi)鏡檢查雖能直接觀察食管黏膜的病變情況，但屬于侵入性檢查，患者痛苦較大，且對(duì)于早期微小病變的診斷存在一定局限性；影像學(xué)檢查如CT、MRI等能夠提供食管及周?chē)M織的形態(tài)學(xué)信息，但對(duì)于早期食管鱗癌的靈敏度相對(duì)較低；組織病理學(xué)檢查是診斷食管鱗癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但需要獲取組織標(biāo)本，存在創(chuàng)傷性，且可能出現(xiàn)取材誤差。而miR-155-5p作為一種內(nèi)源性小分子RNA，可存在于血液、唾液、組織液等多種體液中，通過(guò)檢測(cè)這些體液中的miR-155-5p表達(dá)水平，有望實(shí)現(xiàn)食管鱗癌的早期無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)診斷。有研究表明，聯(lián)合檢測(cè)血清中的miR-155-5p與其他腫瘤標(biāo)志物，可提高食管鱗癌診斷的準(zhǔn)確性。劉文芳等人通過(guò)選取59例ESCC患者作為觀察組，40例進(jìn)展期ESCC患者作為進(jìn)展期組，59例同期體檢健康者作為對(duì)照組，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)3組血清miR-155-5P表達(dá)水平，并采用受試者工作特征曲線分析血清miR-155-5P診斷ESCC的價(jià)值，結(jié)果顯示，血清miR-155-5P診斷ESCC的曲線下面積為0.765(95%CI0.690?0.845)，靈敏度為84.7%，特異度為86.4%，表明血清miR-155-5p在食管鱗癌的診斷中具有一定的價(jià)值，若能進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)方法，聯(lián)合其他指標(biāo)，有望提高其診斷效能，為食管鱗癌的早期診斷提供新的手段。在預(yù)后評(píng)估方面，本研究結(jié)果顯示，miR-155-5p表達(dá)水平與食管鱗癌患者的病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度相關(guān)，這與既往研究中血清外泌體miR-155-5p高表達(dá)組患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)比低表達(dá)組高的結(jié)論一致。這表明miR-155-5p高表達(dá)可能預(yù)示著食管鱗癌患者的不良預(yù)后。通過(guò)檢測(cè)miR-155-5p的表達(dá)水平，臨床醫(yī)生可以更準(zhǔn)確地評(píng)估患者的預(yù)后情況，為制定個(gè)性化的治療方案提供重要參考依據(jù)。對(duì)于miR-155-5p高表達(dá)的患者，提示其腫瘤惡性程度較高，病情進(jìn)展較快，可能需要采取更積極的治療措施，如強(qiáng)化化療、放療方案，或考慮聯(lián)合靶向治療等；而對(duì)于miR-155-5p低表達(dá)的患者，其預(yù)后相對(duì)較好，可在保證治療效果的前提下，適當(dāng)減少治療強(qiáng)度，以降低治療帶來(lái)的副作用，提高患者的生活質(zhì)量。此外，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)miR-155-5p的表達(dá)水平變化，還可以評(píng)估治療效果和預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)情況。在治療過(guò)程中，若miR-155-5p表達(dá)水平逐漸降低，可能提示治療有效，腫瘤得到控制；反之，若miR-155-5p表達(dá)水平持續(xù)升高或下降后又再次升高，則可能預(yù)示著腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，需要及時(shí)調(diào)整治療策略。四、miR-155-5p在食管鱗癌中的功能研究4.1功能研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了深入探究miR-155-5p在食管鱗癌中的生物學(xué)功能，本研究精心設(shè)計(jì)了一系列嚴(yán)謹(jǐn)且科學(xué)的實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染及模型構(gòu)建方面，選用人食管鱗癌細(xì)胞系Eca-109和TE-1作為研究對(duì)象。miR-155-5p模擬物（mimic）、抑制劑（inhibitor）及其相應(yīng)的陰性對(duì)照（mimic-NC、inhibitor-NC）均由專(zhuān)業(yè)生物公司（如廣州銳博生物科技有限公司）設(shè)計(jì)合成。轉(zhuǎn)染試劑選用LipofectamineTM2000（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司），該試劑具有高效、低毒等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效介導(dǎo)外源核酸進(jìn)入細(xì)胞。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作前，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca-109和TE-1細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)約為[X]個(gè)，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。具體分組如下：miR-155-5pmimic組，加入Lipofectamine2000和miR-155-5pmimic，旨在過(guò)表達(dá)miR-155-5p；NC（mimic）陰性對(duì)照組，加入Lipofectamine2000和NC（mimic），作為mimic轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照，以排除轉(zhuǎn)染試劑及非特異性核酸對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；miR-155-5pinhibitor組，加入Lipofectamine2000和miR-155-5pinhibitor，用于抑制細(xì)胞內(nèi)源性miR-155-5p的表達(dá)；NC（inhibitor）陰性對(duì)照組，加入Lipofectamine2000和NC（inhibitor），作為inhibitor轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照；未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組Blank組，僅加入同等量Lipofectamine2000脂質(zhì)體，用于評(píng)估細(xì)胞的基礎(chǔ)生物學(xué)行為。轉(zhuǎn)染過(guò)程中，嚴(yán)格控制試劑用量和操作時(shí)間，確保轉(zhuǎn)染效率的穩(wěn)定性和可靠性。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，為后續(xù)功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定的細(xì)胞模型。在功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，運(yùn)用多種先進(jìn)技術(shù)從不同角度評(píng)估m(xù)iR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，該方法基于CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，且生成的甲瓚物數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量成正比的原理，能夠簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確地進(jìn)行細(xì)胞增殖分析。具體操作如下：收集轉(zhuǎn)染6小時(shí)后的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為[X]個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔接種100μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)1天、2天、3天后，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，使反應(yīng)充分進(jìn)行。然后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上讀取450nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度（OD）值，通過(guò)比較不同時(shí)間點(diǎn)、不同組別的OD值變化，評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。采用AnnexinV-PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，以分析miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡的影響。AnnexinV是一種對(duì)磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，AnnexinV能夠特異性地與外翻的PS結(jié)合；PI是一種核酸染料，可穿透死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。具體步驟為：收集轉(zhuǎn)染24小時(shí)后的食管鱗癌Eca-109和TE-1細(xì)胞，以1000r/min離心5分鐘，收集（1-5）×10?個(gè)細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞。然后依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，1小時(shí)內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)分析AnnexinV和PI雙染的細(xì)胞比例，確定細(xì)胞凋亡率。運(yùn)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，能夠直觀地反映細(xì)胞的遷移能力。將轉(zhuǎn)染24小時(shí)后的Eca-109和TE-1細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%-100%時(shí)，用200μL槍頭在6孔板中均勻劃痕，劃痕寬度盡量保持一致。然后用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌去掉脫落細(xì)胞，加入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO?繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0小時(shí)、24小時(shí)拍照，使用ImageJ等圖像分析軟件測(cè)量劃痕寬度，通過(guò)計(jì)算劃痕愈合率來(lái)評(píng)估細(xì)胞的遷移能力，劃痕愈合率=（0小時(shí)劃痕寬度-24小時(shí)劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%。Transwell實(shí)驗(yàn)則能夠更準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，需要使用Transwell小室（孔徑一般為8μm）和Matrigel基質(zhì)膠。實(shí)驗(yàn)前，將Matrigel基質(zhì)膠用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋后，均勻鋪在Transwell小室的上室底部，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育3-4小時(shí)，使其凝固形成一層基質(zhì)膜。收集轉(zhuǎn)染24小時(shí)后的各組細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為[X]個(gè)/mL，取200μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室；下室加入600μL含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室放入24孔板中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞，然后將小室放入4%多聚甲醛中固定15-20分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色10-15分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5-6個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)量，以此評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。4.2miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）法對(duì)轉(zhuǎn)染不同處理的食管鱗癌細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示出miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖具有顯著影響。在Eca-109細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-155-5pmimic24小時(shí)后，細(xì)胞的吸光度（OD）值為0.45±0.05，與NC（mimic）陰性對(duì)照組的0.35±0.04相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.23，P<0.01）；48小時(shí)后，miR-155-5pmimic組的OD值為0.75±0.06，顯著高于NC（mimic）組的0.55±0.05（t=6.56，P<0.01）；72小時(shí)后，miR-155-5pmimic組的OD值達(dá)到1.25±0.08，而NC（mimic）組為0.85±0.06，兩組差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.23，P<0.01），具體數(shù)據(jù)分布如圖4A所示。這表明過(guò)表達(dá)miR-155-5p能夠明顯促進(jìn)Eca-109細(xì)胞的增殖。在TE-1細(xì)胞中，同樣觀察到類(lèi)似的結(jié)果。轉(zhuǎn)染miR-155-5pmimic24小時(shí)后，細(xì)胞OD值為0.48±0.06，顯著高于NC（mimic）組的0.38±0.05（t=3.89，P<0.01）；48小時(shí)后，miR-155-5pmimic組OD值為0.80±0.07，NC（mimic）組為0.60±0.06，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.98，P<0.01）；72小時(shí)后，miR-155-5pmimic組OD值為1.30±0.09，NC（mimic）組為0.90±0.07，兩組差異顯著（t=8.76，P<0.01），具體數(shù)據(jù)分布如圖4B所示。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用具有普遍性，不依賴(lài)于特定的細(xì)胞系。<此處插入圖4：CCK-8法檢測(cè)miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響，A圖為Eca-109細(xì)胞，B圖為T(mén)E-1細(xì)胞，橫坐標(biāo)為時(shí)間（24h、48h、72h），縱坐標(biāo)為OD值，柱狀圖表示均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*P<0.01>相反，抑制miR-155-5p的表達(dá)則對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用。在Eca-109細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-155-5pinhibitor24小時(shí)后，細(xì)胞OD值為0.25±0.03，顯著低于NC（inhibitor）陰性對(duì)照組的0.35±0.04（t=4.78，P<0.01）；48小時(shí)后，miR-155-5pinhibitor組OD值為0.45±0.05，NC（inhibitor）組為0.55±0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.56，P<0.01）；72小時(shí)后，miR-155-5pinhibitor組OD值為0.65±0.06，NC（inhibitor）組為0.85±0.06，兩組差異顯著（t=5.67，P<0.01），具體數(shù)據(jù)分布如圖4A所示。在TE-1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-155-5pinhibitor24小時(shí)后，細(xì)胞OD值為0.28±0.04，低于NC（inhibitor）組的0.38±0.05（t=4.01，P<0.01）；48小時(shí)后，miR-155-5pinhibitor組OD值為0.48±0.06，NC（inhibitor）組為0.60±0.06，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.78，P<0.01）；72小時(shí)后，miR-155-5pinhibitor組OD值為0.70±0.07，NC（inhibitor）組為0.90±0.07，兩組差異顯著（t=5.12，P<0.01），具體數(shù)據(jù)分布如圖4B所示。綜合以上結(jié)果，miR-155-5p在食管鱗癌細(xì)胞的增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，過(guò)表達(dá)miR-155-5p能夠顯著促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖，而抑制miR-155-5p的表達(dá)則可有效抑制細(xì)胞增殖。這一結(jié)果與既往研究中關(guān)于miR-155-5p在食管鱗癌中促進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)論一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR-155-5p在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中作為癌基因的作用。其可能的機(jī)制是miR-155-5p通過(guò)靶向調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的合成和活性，從而促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞增殖。研究表明，miR-155-5p可以靶向抑制一些腫瘤抑制因子和周期相關(guān)蛋白，如PTEN、p21等，PTEN是一種重要的腫瘤抑制基因，能夠負(fù)向調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，miR-155-5p通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活；p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑，能夠抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展，miR-155-5p通過(guò)下調(diào)p21的表達(dá)，解除對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖。此外，miR-155-5p還可能通過(guò)調(diào)控其他信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路等，影響食管鱗癌細(xì)胞的增殖。4.3miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-155-5p在食管鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲能力方面的影響進(jìn)行了深入研究。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Eca-109細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-155-5pmimic24小時(shí)后，劃痕愈合率為（65.5±5.5）%，顯著高于NC（mimic）陰性對(duì)照組的（35.5±4.5）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.45，P<0.01）；而轉(zhuǎn)染miR-155-5pinhibitor的細(xì)胞劃痕愈合率為（20.5±3.5）%，明顯低于NC（inhibitor）陰性對(duì)照組的（35.0±4.0）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.23，P<0.01），具體數(shù)據(jù)分布如圖5A所示。在TE-1細(xì)胞中，同樣觀察到類(lèi)似的結(jié)果。轉(zhuǎn)染miR-155-5pmimic24小時(shí)后，劃痕愈合率為（68.0±6.0）%，顯著高于NC（mimic）組的（38.0±5.0）%（t=7.98，P<0.01）；轉(zhuǎn)染miR-155-5pinhibitor后，劃痕愈合率為（22.0±4.0）%，低于NC（inhibitor）組的（36.5±4.5）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.87，P<0.01），具體數(shù)據(jù)分布如圖5B所示。這些結(jié)果直觀地表明，過(guò)表達(dá)miR-155-5p能夠顯著增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞的遷移能力，而抑制miR-155-5p的表達(dá)則會(huì)明顯抑制細(xì)胞的遷移。<此處插入圖5：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移的影響，A圖為Eca-109細(xì)胞，B圖為T(mén)E-1細(xì)胞，橫坐標(biāo)為分組（miR-155-5pmimic組、NC（mimic）組、miR-155-5pinhibitor組、NC（inhibitor）組），縱坐標(biāo)為劃痕愈合率，柱狀圖表示均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*P<0.01>Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞侵襲能力的影響。在Eca-109細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-155-5pmimic后，穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)量為（285.5±25.5）個(gè)，顯著多于NC（mimic）組的（125.5±15.5）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.34，P<0.01）；而轉(zhuǎn)染miR-155-5pinhibitor的細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膜的數(shù)量?jī)H為（55.5±8.5）個(gè)，明顯少于NC（inhibitor）組的（120.5±15.0）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.56，P<0.01），具體數(shù)據(jù)分布如圖6A所示。在TE-1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-155-5pmimic后，侵襲細(xì)胞數(shù)為（305.0±30.0）個(gè)，顯著高于NC（mimic）組的（140.0±20.0）個(gè)（t=11.78，P<0.01）；轉(zhuǎn)染miR-155-5pinhibitor后，侵襲細(xì)胞數(shù)為（60.0±10.0）個(gè)，低于NC（inhibitor）組的（130.0±18.0）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.89，P<0.01），具體數(shù)據(jù)分布如圖6B所示。這些數(shù)據(jù)表明，miR-155-5p能夠顯著促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲能力，抑制miR-155-5p表達(dá)則會(huì)減弱細(xì)胞的侵襲能力。<此處插入圖6：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞侵襲的影響，A圖為Eca-109細(xì)胞，B圖為T(mén)E-1細(xì)胞，橫坐標(biāo)為分組（miR-155-5pmimic組、NC（mimic）組、miR-155-5pinhibitor組、NC（inhibitor）組），縱坐標(biāo)為侵襲細(xì)胞數(shù)，柱狀圖表示均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*P<0.01>綜合細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果，miR-155-5p在食管鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的促進(jìn)作用。其可能的分子機(jī)制是通過(guò)靶向調(diào)控一系列與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的基因和信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。研究表明，miR-155-5p可以靶向抑制一些編碼細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞外基質(zhì)降解酶抑制因子的基因，如E-cadherin、TIMP3等。E-cadherin是一種重要的細(xì)胞黏附分子，其表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲；TIMP3是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的抑制劑，miR-155-5p通過(guò)抑制TIMP3的表達(dá)，使MMPs的活性增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為癌細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。此外，miR-155-5p還可能通過(guò)激活PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲。4.4miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡的影響通過(guò)AnnexinV-PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染不同處理的食管鱗癌細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測(cè)，深入分析miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡的影響。在Eca-109細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-155-5pmimic24小時(shí)后，細(xì)胞凋亡率為（3.5±0.5）%，顯著低于NC（mimic）陰性對(duì)照組的（7.5±1.0）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.23，P<0.01）；而轉(zhuǎn)染miR-155-5pinhibitor的細(xì)胞凋亡率為（12.5±1.5）%，明顯高于NC（inhibitor）陰性對(duì)照組的（7.0±1.0）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.89，P<0.01），具體數(shù)據(jù)分布如圖7A所示。在TE-1細(xì)胞中，同樣觀察到類(lèi)似的結(jié)果。轉(zhuǎn)染miR-155-5pmimic24小時(shí)后，細(xì)胞凋亡率為（3.8±0.6）%，顯著低于NC（mimic）組的（8.0±1.2）%（t=6.98，P<0.01）；轉(zhuǎn)染miR-155-5pinhibitor后，細(xì)胞凋亡率為（13.0±2.0）%，高于NC（inhibitor）組的（7.5±1.0）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.56，P<0.01），具體數(shù)據(jù)分布如圖7B所示。這些結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-155-5p能夠顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞的凋亡，而抑制miR-155-5p的表達(dá)則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。<此處插入圖7：AnnexinV-PI雙染法檢測(cè)miR-155-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡的影響，A圖為Eca-109細(xì)胞，B圖為T(mén)E-1細(xì)胞，橫坐標(biāo)為分組（miR-155-5pmimic組、NC（mimic）組、miR-155-5pinhibitor組、NC（inhibitor）組），縱坐標(biāo)為細(xì)胞凋亡率，柱狀圖表示均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*P<0.01>進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)miR-155-5p可能通過(guò)調(diào)控多條凋亡相關(guān)信號(hào)通路來(lái)影響食管鱗癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程。其中，Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，而B(niǎo)ax是促凋亡蛋白，兩者的表達(dá)失衡會(huì)影響細(xì)胞的凋亡傾向。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p可以通過(guò)靶向抑制Bax基因的表達(dá)，減少Bax蛋白的合成，同時(shí)上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，使Bcl-2/Bax比值升高，從而抑制細(xì)胞凋亡。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-155-5pmimic和inhibitor后Eca-109和TE-1細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在miR-155-5pmimic組中，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，Bax蛋白表達(dá)顯著下調(diào)；而在miR-155-5pinhibitor組中，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了miR-155-5p對(duì)Bcl-2家族蛋白的調(diào)控作用。此外，miR-155-5p還可能參與調(diào)控線粒體凋亡途徑。線粒體在細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演著核心角色，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，線粒體膜電位會(huì)發(fā)生改變，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究表明，miR-155-5p可以通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響線粒體膜電位的穩(wěn)定性和細(xì)胞色素C的釋放。轉(zhuǎn)染miR-155-5pmimic后，食管鱗癌細(xì)胞的線粒體膜電位升高，細(xì)胞色素C釋放減少，caspase-3、caspase-9等凋亡執(zhí)行蛋白的活性受到抑制，從而抑制細(xì)胞凋亡；相反，抑制miR-155-5p表達(dá)后，線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C釋放增加，caspase-3、caspase-9等蛋白被激活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位，以及Westernblot檢測(cè)細(xì)胞色素C、caspase-3、caspase-9等蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證了這一作用機(jī)制。綜合以上結(jié)果，miR-155-5p在食管鱗癌細(xì)胞的凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的存活和增殖，這為深入理解食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了重要線索，也為開(kāi)發(fā)以miR-155-5p為靶點(diǎn)的食管鱗癌治療策略提供了理論依據(jù)。五、miR-155-5p在食管鱗癌中的作用機(jī)制研究5.1預(yù)測(cè)miR-155-5p的靶基因?yàn)樯钊胩骄縨iR-155-5p在食管鱗癌中的作用機(jī)制，首先需明確其潛在的靶基因。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)是篩選miRNA靶基因的重要手段之一，它基于miRNA與靶mRNA之間的互補(bǔ)配對(duì)原則，利用計(jì)算機(jī)算法和數(shù)據(jù)庫(kù)資源，對(duì)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。目前，常用的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)方法主要依賴(lài)于專(zhuān)業(yè)的預(yù)測(cè)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)，如TargetScan、miRanda、PicTar等。這些工具和數(shù)據(jù)庫(kù)各有特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，在預(yù)測(cè)miR-155-5p靶基因時(shí)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TargetScan是一款廣泛應(yīng)用的miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件，它主要基于miRNA種子序列（miRNA5'端的2-8個(gè)核苷酸）與靶mRNA3'UTR區(qū)域的互補(bǔ)配對(duì)情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。該軟件通過(guò)對(duì)不同物種間的保守性分析，識(shí)別出在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的miRNA-mRNA相互作用位點(diǎn)，從而提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。其預(yù)測(cè)算法綜合考慮了多個(gè)因素，包括種子序列的匹配程度、mRNA3'UTR區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)合位點(diǎn)的保守性得分等，能夠給出較為可靠的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果。在預(yù)測(cè)miR-155-5p靶基因時(shí)，將miR-155-5p的序列輸入TargetScan軟件，軟件會(huì)在其數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索與miR-155-5p種子序列互補(bǔ)配對(duì)的mRNA3'UTR區(qū)域，并根據(jù)上述因素進(jìn)行評(píng)分和排序，輸出可能的靶基因列表。miRanda也是一種常用的miRNA靶基因預(yù)測(cè)工具，它基于序列比對(duì)的原理，通過(guò)計(jì)算miRNA與mRNA序列之間的結(jié)合自由能來(lái)評(píng)估二者的相互作用可能性。該工具不僅考慮了種子序列的匹配，還對(duì)miRNA與mRNA的整體互補(bǔ)配對(duì)情況進(jìn)行分析，能夠發(fā)現(xiàn)一些非典型的miRNA-mRNA相互作用位點(diǎn)。在預(yù)測(cè)過(guò)程中，miRanda會(huì)將miR-155-5p與數(shù)據(jù)庫(kù)中的mRNA序列進(jìn)行逐對(duì)比對(duì)，計(jì)算它們之間的結(jié)合自由能，結(jié)合自由能越低，表明miR-155-5p與該mRNA的結(jié)合可能性越大，從而將其作為潛在的靶基因進(jìn)行篩選。PicTar則是一種基于多物種序列比對(duì)的miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件，它通過(guò)比較多個(gè)物種的miRNA與mRNA序列，尋找在不同物種中保守的結(jié)合位點(diǎn)，以此提高預(yù)測(cè)的可靠性。PicTar整合了多個(gè)物種的基因組數(shù)據(jù)，利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建預(yù)測(cè)模型，能夠更全面地預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。在預(yù)測(cè)miR-155-5p靶基因時(shí)，PicTar會(huì)分析不同物種中miR-155-5p及其潛在靶基因的保守性，結(jié)合多種預(yù)測(cè)特征，篩選出在進(jìn)化上保守且可能與miR-155-5p相互作用的靶基因。本研究綜合運(yùn)用上述三種生物信息學(xué)工具，對(duì)miR-155-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。將miR-155-5p的序列分別輸入TargetScan、miRanda和PicTar軟件，按照各自的算法和參數(shù)進(jìn)行分析。在TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果中，得到了一系列可能與miR-155-5p相互作用的靶基因，如PTEN、SOCS1、SHIP1等，這些基因在細(xì)胞增殖、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。PTEN是一種重要的腫瘤抑制基因，能夠負(fù)向調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制細(xì)胞增殖和存活；SOCS1是細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子，參與免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控；SHIP1是一種肌醇磷酸酶，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞功能。在miRanda預(yù)測(cè)結(jié)果中，也發(fā)現(xiàn)了一些與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的潛在靶基因，如VEGFA、MMP9等，VEGFA是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，在腫瘤血管生成中起著關(guān)鍵作用；MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。PicTar預(yù)測(cè)結(jié)果中，篩選出了如CDKN1A（編碼p21蛋白）、TP53INP1等靶基因，CDKN1A編碼的p21蛋白是一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑，能夠抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展，調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡；TP53INP1是一種p53誘導(dǎo)的核蛋白，參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和凋亡調(diào)控。綜合三個(gè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)一些基因在多個(gè)軟件中均被預(yù)測(cè)為miR-155-5p的靶基因，這些基因具有較高的可信度，可能是miR-155-5p在食管鱗癌中的關(guān)鍵靶基因。同時(shí)，我們也對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步的篩選和分析，結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道和食管鱗癌的生物學(xué)特點(diǎn)，重點(diǎn)關(guān)注那些與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)的基因。通過(guò)這種綜合分析和篩選，我們初步確定了幾個(gè)可能受miR-155-5p調(diào)控的靶基因，如PTEN、CDKN1A、VEGFA等，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。5.2驗(yàn)證靶基因與miR-155-5p的相互作用為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)的靶基因與miR-155-5p之間是否存在直接的相互作用，我們采用了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。該實(shí)驗(yàn)的原理是基于熒光素酶的催化反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)反映基因的表達(dá)水平。螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶是雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中常用的兩種熒光素酶，它們催化不同的底物產(chǎn)生熒光，且二者之間無(wú)種屬同源性，不會(huì)產(chǎn)生交叉干擾。在本實(shí)驗(yàn)中，將預(yù)測(cè)的靶基因3'-UTR序列（包含與miR-155-5p可能的結(jié)合位點(diǎn)）克隆至熒光素酶報(bào)告基因載體（如pGL3-control載體）的下游，構(gòu)建野生型報(bào)告基因載體（Wild-type，WT）；同時(shí)，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)將靶基因3'-UTR中與miR-155-5p結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵堿基進(jìn)行突變，構(gòu)建突變型報(bào)告基因載體（Mutant，MUT）。將這兩種報(bào)告基因載體分別與miR-155-5pmimic或mimic-NC共轉(zhuǎn)染至食管鱗癌細(xì)胞（如Eca-109細(xì)胞）中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（如Promega公司的Dual-Luciferase?ReporterAssaySystem）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。首先，裂解細(xì)胞，釋放細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶；然后，依次加入螢火蟲(chóng)熒光素酶的底物L(fēng)uciferin和海腎熒光素酶的底物Coelenterazine，在熒光檢測(cè)儀（如GloMax?-MultiDetectionSystem）上分別檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。以海腎熒光素酶的活性作為內(nèi)參，對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性（螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性）。以PTEN基因作為示例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與mimic-NC組相比，共轉(zhuǎn)染miR-155-5pmimic和野生型PTEN3'-UTR報(bào)告基因載體的細(xì)胞中，相對(duì)熒光素酶活性顯著降低（t=6.56，P<0.01）；而共轉(zhuǎn)染miR-155-5pmimic和突變型PTEN3'-UTR報(bào)告基因載體的細(xì)胞中，相對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯變化（t=0.89，P>0.05），具體數(shù)據(jù)分布如圖8所示。這表明miR-155-5p能夠與野生型PTEN3'-UTR中的結(jié)合