CUEDC2與ATF6α：心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡調(diào)控的分子密碼一、引言1.1研究背景與意義心血管疾病嚴(yán)重威脅人類健康，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一。心肌細(xì)胞作為心臟的基本功能單位，其死亡在急性心力衰竭發(fā)生和慢性心功能不全進(jìn)展中起著核心作用。急性心肌梗死時(shí)，冠狀動脈阻塞導(dǎo)致心肌細(xì)胞急性缺血缺氧，大量心肌細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)死亡，心臟收縮和舒張功能急劇受損，引發(fā)急性心力衰竭，若不及時(shí)治療，死亡率極高。在慢性心功能不全中，心肌細(xì)胞持續(xù)受到各種病理因素的刺激，如高血壓導(dǎo)致的心臟后負(fù)荷增加、心肌病引起的心肌結(jié)構(gòu)和功能異常等，心肌細(xì)胞逐漸凋亡或壞死，心臟逐漸擴(kuò)大，心功能進(jìn)行性下降，最終發(fā)展為終末期心力衰竭，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和壽命。因此，深入研究調(diào)控心肌細(xì)胞死亡的分子機(jī)制并尋找促進(jìn)心肌細(xì)胞存活的新靶點(diǎn)，一直是心血管疾病基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是心肌細(xì)胞內(nèi)最重要的細(xì)胞器之一，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡是其發(fā)揮多種生物學(xué)功能的關(guān)鍵。低氧、鈣離子失衡、超負(fù)荷應(yīng)激等病理因素都會打破內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERStress），并激活未折疊蛋白反應(yīng)（UnfoldedProteinResponse，UPR）。正常情況下，UPR通過一系列復(fù)雜的信號通路，如上調(diào)分子伴侶的表達(dá)來促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊、減少蛋白質(zhì)的合成以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān)等，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡，促進(jìn)細(xì)胞存活。研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注損傷早期，UPR被激活，相關(guān)分子伴侶如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）表達(dá)上調(diào)，幫助心肌細(xì)胞應(yīng)對短暫的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，維持細(xì)胞的正常功能。但如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在且不能緩解，UPR則會走向另一個(gè)方向，通過上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)，如CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在持續(xù)的高壓力負(fù)荷引起的心肌肥厚模型中，長期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活了UPR的凋亡信號通路，心肌細(xì)胞凋亡增加，最終導(dǎo)致心肌纖維化和心功能減退。然而，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，決定細(xì)胞最終走向存活或是凋亡的選擇機(jī)制尚不清楚，這極大地限制了我們對心血管疾病發(fā)病機(jī)制的理解和有效治療策略的開發(fā)。既往研究表明，UPR主要由肌醇依賴酶1（IRE1）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）和激活轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）三條信號通路組成，其中IRE1和ATF6作用分支影響細(xì)胞死亡且作用效果與應(yīng)激持續(xù)時(shí)程相關(guān)。在短暫的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中，IRE1通過激活X盒結(jié)合蛋白1（XBP1），促進(jìn)細(xì)胞存活相關(guān)基因的表達(dá)；而在長期應(yīng)激下，IRE1則會激活凋亡相關(guān)信號通路。ATF6在應(yīng)激早期被激活，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控一系列基因的轉(zhuǎn)錄，對細(xì)胞存活起到保護(hù)作用，但隨著應(yīng)激時(shí)間延長，其具體作用及調(diào)控機(jī)制變得復(fù)雜且有待進(jìn)一步明確。CUEDC2（CUEDomainContainingProtein2）是一個(gè)功能尚不明確的蛋白質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn)CUEDC2具有多種生物學(xué)功能，它通過與GADD34相互作用招募蛋白磷酸酶1（ProteinPhosphatase1，PP1），使IKKβ去磷酸化，抑制NF-κB信號通路的持續(xù)激活，從而避免炎癥反應(yīng)過度和自身組織損傷，完成機(jī)體對炎癥反應(yīng)的精確調(diào)控。CUEDC2還能介導(dǎo)雌激素受體ER和孕激素受體PR的泛素化降解，是乳腺癌耐藥的重要原因之一，并證明它能調(diào)控細(xì)胞周期，最終導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)生。然而，CUEDC2在心臟中的作用尚無研究報(bào)道。生物信息學(xué)分析和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均發(fā)現(xiàn)CUEDC2在心臟中高表達(dá)，提示其可能在心臟發(fā)育和功能中具有重要作用。基于CUEDC2對NF-κB活性調(diào)節(jié)和對多種重要蛋白質(zhì)泛素化修飾的功能基礎(chǔ)，以及UPR和NF-κB活性的相互影響，推測CUEDC2可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)中有重要功能。本課題擬深入研究CUEDC2在急性和慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下參與細(xì)胞存活或凋亡的作用，尤其是對IRE1和ATF6α激活后生物學(xué)效應(yīng)的影響及分子機(jī)制。這不僅有助于我們深入理解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)心肌細(xì)胞命運(yùn)決定的分子機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域的研究空白，為心血管疾病的發(fā)病機(jī)制提供全新的理論依據(jù)；還可能為心血管疾病的治療開辟新的道路，通過靶向調(diào)控CUEDC2和ATF6α，為開發(fā)更有效的治療策略提供潛在的靶點(diǎn)，有望改善心血管疾病患者的預(yù)后，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的本研究旨在深入剖析CUEDC2和ATF6α在心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致細(xì)胞凋亡過程中的具體作用及分子機(jī)制，具體目標(biāo)如下：明確CUEDC2在心臟中的功能：借助生物信息學(xué)手段，全面分析CUEDC2基因于心臟中的表達(dá)情況、可能存在相互作用的蛋白質(zhì)以及可能發(fā)生的翻譯后修飾，以此預(yù)測CUEDC2在心臟中的潛在作用。并通過構(gòu)建和研究CUEDC2基因敲除小鼠，對比基因敲除小鼠與野生型小鼠在發(fā)育、心臟結(jié)構(gòu)以及生理功能上的差異，從而明確CUEDC2在心臟正常發(fā)育和生理功能維持中的作用。探究CUEDC2對心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響：在急性心肌缺血再灌注損傷和慢性壓力超負(fù)荷心肌肥厚這兩種不同的病理模型中，深入研究CUEDC2對心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度和細(xì)胞凋亡水平的影響。通過檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子標(biāo)記物如GRP78、CHOP等的表達(dá)變化，以及細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)如caspase-3活性、TUNEL陽性細(xì)胞比例等，明確CUEDC2在心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致細(xì)胞凋亡過程中的作用方向。揭示CUEDC2調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子機(jī)制：深入研究CUEDC2對UPR中IRE1和ATF6α信號通路的影響機(jī)制。檢測IRE1的磷酸化水平、XBP1的剪接情況，以及ATF6α的激活、轉(zhuǎn)位和下游靶基因的表達(dá)，明確CUEDC2是否通過調(diào)控這些關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)來影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。同時(shí)，探索CUEDC2與ATF6α之間是否存在直接或間接的相互作用，以及這種相互作用對心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制。尋找潛在的治療靶點(diǎn)：基于上述研究結(jié)果，尋找可作為心血管疾病治療靶點(diǎn)的關(guān)鍵分子或信號通路。評估通過調(diào)節(jié)CUEDC2和ATF6α的表達(dá)或活性，來干預(yù)心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，從而為心血管疾病的治療提供新的策略和靶點(diǎn)。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀心血管疾病作為全球范圍內(nèi)的重大健康威脅，一直是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的核心焦點(diǎn)。心肌細(xì)胞死亡在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演著至關(guān)重要的角色，因此，深入探究調(diào)控心肌細(xì)胞死亡的分子機(jī)制以及尋找促進(jìn)心肌細(xì)胞存活的新靶點(diǎn)，成為了國內(nèi)外學(xué)者不懈努力的方向。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為心肌細(xì)胞內(nèi)不可或缺的重要細(xì)胞器，其穩(wěn)態(tài)平衡對于心肌細(xì)胞的正常功能維系起著關(guān)鍵作用。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)遭受低氧、鈣離子失衡、超負(fù)荷應(yīng)激等多種病理因素的破壞時(shí)，便會引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而激活未折疊蛋白反應(yīng)。在國外，學(xué)者們針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)展開了大量深入的研究。例如，[學(xué)者姓名1]等人通過對小鼠心肌缺血再灌注模型的研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在心肌細(xì)胞凋亡過程中呈現(xiàn)出動態(tài)變化的特征。在缺血早期，未折疊蛋白反應(yīng)被迅速激活，相關(guān)分子伴侶如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78的表達(dá)顯著上調(diào)，這一變化有助于心肌細(xì)胞應(yīng)對短暫的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，維持細(xì)胞的正常生理功能。然而，若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在且無法得到有效緩解，未折疊蛋白反應(yīng)則會促使促凋亡基因如CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白的表達(dá)上調(diào)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。[學(xué)者姓名2]的研究團(tuán)隊(duì)利用基因敲除技術(shù)，構(gòu)建了未折疊蛋白反應(yīng)關(guān)鍵信號通路分子缺陷的小鼠模型，深入剖析了各信號通路在心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的具體作用機(jī)制。研究結(jié)果表明，肌醇依賴酶1和激活轉(zhuǎn)錄因子6信號通路在心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的早期階段發(fā)揮著重要的細(xì)胞保護(hù)作用，而隨著應(yīng)激時(shí)間的延長，這些信號通路的過度激活反而會促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在國內(nèi)，相關(guān)研究也取得了豐碩的成果。[學(xué)者姓名3]團(tuán)隊(duì)通過對急性心肌梗死患者的臨床樣本分析以及動物實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在急性心肌梗死發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。他們發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者心肌組織中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著升高，且與心肌細(xì)胞凋亡程度密切相關(guān)。通過給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑進(jìn)行干預(yù)治療，能夠有效減輕心肌細(xì)胞凋亡，改善心臟功能。[學(xué)者姓名4]等人則聚焦于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與心血管疾病相關(guān)信號通路的交互作用機(jī)制展開研究。他們發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠通過激活絲裂原活化蛋白激酶信號通路，進(jìn)一步加劇心肌細(xì)胞的損傷和凋亡。對于CUEDC2的研究，國外[學(xué)者姓名5]的團(tuán)隊(duì)前期發(fā)現(xiàn)CUEDC2能夠與GADD34相互作用，招募蛋白磷酸酶1，使IKKβ去磷酸化，從而抑制NF-κB信號通路的持續(xù)激活，避免炎癥反應(yīng)過度和自身組織損傷。此外，他們還證實(shí)了CUEDC2能夠介導(dǎo)雌激素受體ER和孕激素受體PR的泛素化降解，這一發(fā)現(xiàn)為乳腺癌耐藥機(jī)制的研究提供了新的視角。然而，關(guān)于CUEDC2在心臟中的作用，目前尚未有相關(guān)研究報(bào)道。在國內(nèi)，本研究團(tuán)隊(duì)通過生物信息學(xué)分析以及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CUEDC2在心臟中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，這一結(jié)果提示CUEDC2可能在心臟發(fā)育和功能維持中發(fā)揮著重要作用。基于CUEDC2對NF-κB活性調(diào)節(jié)以及對多種重要蛋白質(zhì)泛素化修飾的功能基礎(chǔ)，結(jié)合未折疊蛋白反應(yīng)和NF-κB活性之間的相互影響，我們推測CUEDC2可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)過程中具有關(guān)鍵作用。在ATF6α的研究方面，國外[學(xué)者姓名6]等人的研究揭示了ATF6α在未折疊蛋白反應(yīng)中的核心作用機(jī)制。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，ATF6α被切割激活，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這些靶基因參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊、降解以及鈣離子穩(wěn)態(tài)維持等多個(gè)過程，對緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、維持細(xì)胞存活發(fā)揮著重要作用。[學(xué)者姓名7]的研究團(tuán)隊(duì)則進(jìn)一步探討了ATF6α在不同病理?xiàng)l件下的作用差異。他們發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)退行性疾病模型中，ATF6α的激活能夠保護(hù)神經(jīng)元免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷；而在腫瘤細(xì)胞中，ATF6α的異常激活卻與腫瘤的生長和耐藥性密切相關(guān)。國內(nèi)[學(xué)者姓名8]等人通過對糖尿病心肌病模型的研究，發(fā)現(xiàn)ATF6α信號通路的激活在糖尿病心肌病內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程中起著雙重作用。在早期階段，ATF6α的激活能夠減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制心肌細(xì)胞凋亡；然而，隨著病程的進(jìn)展，過度激活的ATF6α反而會促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，加重心肌損傷。盡管國內(nèi)外在上述領(lǐng)域已取得了一定的研究成果，但目前仍存在諸多不足之處。對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)決定細(xì)胞最終走向存活或是凋亡的選擇機(jī)制，雖然已明確未折疊蛋白反應(yīng)中各信號通路的作用，但具體的調(diào)控節(jié)點(diǎn)和分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入探究。在CUEDC2的研究中，其在心臟中的功能以及在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制尚屬空白。對于ATF6α，雖然已了解其在未折疊蛋白反應(yīng)中的基本作用，但在心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致細(xì)胞凋亡過程中，其與其他信號通路的交互作用以及在不同病理階段的精細(xì)調(diào)控機(jī)制仍不清楚。這些研究空白為我們后續(xù)的研究提供了明確的方向和重要的契機(jī)，本研究旨在填補(bǔ)這些空白，為心血管疾病的發(fā)病機(jī)制研究和治療策略開發(fā)提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。二、CUEDC2與ATF6α的生物學(xué)特性2.1CUEDC2的結(jié)構(gòu)與功能CUEDC2基因，又被稱為MGC2491，定位于人類染色體10q24.32位置。該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于含CUE結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族，其結(jié)構(gòu)包含N端的3個(gè)封閉錐形結(jié)構(gòu)以及C端的CUE結(jié)構(gòu)域。CUE結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其主要功能是與泛素或泛素樣蛋白相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)泛素化水平。這種特殊的結(jié)構(gòu)使得CUEDC2在細(xì)胞內(nèi)參與了多種重要的生物過程。在炎癥調(diào)控方面，CUEDC2發(fā)揮著不可或缺的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，CUEDC2能夠與GADD34相互作用，招募蛋白磷酸酶1（PP1）。PP1使IKKβ去磷酸化，從而抑制NF-κB信號通路的持續(xù)激活。NF-κB信號通路在炎癥反應(yīng)中處于核心地位，其過度激活會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，引發(fā)自身組織損傷。CUEDC2通過對NF-κB信號通路的精確調(diào)控，避免了炎癥反應(yīng)的過度發(fā)生，維持了機(jī)體的免疫平衡。在感染性炎癥模型中，當(dāng)機(jī)體受到病原體感染時(shí)，NF-κB信號通路被激活，炎癥因子大量釋放。而CUEDC2表達(dá)正常的機(jī)體能夠及時(shí)調(diào)控NF-κB信號通路，使炎癥反應(yīng)在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)進(jìn)行，有效清除病原體的同時(shí)，減少對自身組織的損傷。相反，當(dāng)CUEDC2表達(dá)缺失或功能異常時(shí)，NF-κB信號通路過度激活，炎癥因子持續(xù)大量釋放，導(dǎo)致組織器官的嚴(yán)重?fù)p傷，甚至引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征等嚴(yán)重后果。蛋白質(zhì)泛素化降解是細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制機(jī)制，CUEDC2在這一過程中扮演著關(guān)鍵角色。研究表明，CUEDC2能夠介導(dǎo)雌激素受體ER和孕激素受體PR的泛素化降解。在乳腺癌細(xì)胞中，CUEDC2的高表達(dá)會加速ER和PR的泛素化降解過程，導(dǎo)致細(xì)胞對雌激素和孕激素的敏感性降低，這是乳腺癌耐藥的重要原因之一。此外，CUEDC2還參與了細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)的泛素化降解，通過調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)的水平，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。在細(xì)胞周期的不同階段，特定的蛋白質(zhì)需要被及時(shí)降解，以確保細(xì)胞周期的正常進(jìn)行。CUEDC2通過識別這些蛋白質(zhì)，并介導(dǎo)它們的泛素化修飾，使其被蛋白酶體識別并降解。當(dāng)CUEDC2功能異常時(shí)，細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)的降解受到影響，導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，進(jìn)而可能引發(fā)細(xì)胞增殖異常和腫瘤發(fā)生。生物信息學(xué)分析以及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，CUEDC2在心臟中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。這一現(xiàn)象強(qiáng)烈暗示了CUEDC2在心臟中具有重要的潛在功能。心臟作為人體最重要的器官之一，其正常發(fā)育和生理功能的維持依賴于多種基因和蛋白質(zhì)的精細(xì)調(diào)控。CUEDC2在心臟中的高表達(dá)，可能使其參與了心臟發(fā)育過程中的細(xì)胞增殖、分化和組織構(gòu)建等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在心臟發(fā)育的胚胎期，細(xì)胞需要進(jìn)行有序的增殖和分化，形成不同的心臟組織和結(jié)構(gòu)。CUEDC2可能通過調(diào)控相關(guān)信號通路和蛋白質(zhì)的表達(dá)，影響心臟細(xì)胞的增殖和分化速率，確保心臟的正常發(fā)育。在心臟的生理功能維持方面，CUEDC2可能參與了心肌細(xì)胞的收縮、舒張調(diào)節(jié)，以及心臟的電生理活動等過程。心肌細(xì)胞的正常收縮和舒張是心臟泵血功能的基礎(chǔ)，而電生理活動則保證了心臟節(jié)律的穩(wěn)定。CUEDC2可能通過與心肌細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)離子通道的功能、鈣信號的傳導(dǎo)等，從而維持心臟的正常生理功能。2.2ATF6α的結(jié)構(gòu)與功能ATF6α是一種II型跨膜蛋白，屬于堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子家族。其基因位于人類染色體1q23.3位置。ATF6α蛋白包含一個(gè)N端的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔結(jié)構(gòu)域，中間由一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域連接。N端的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有bZIP結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏TF6α與DNA的結(jié)合以及與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用至關(guān)重要。bZIP結(jié)構(gòu)域由一個(gè)富含堿性氨基酸的DNA結(jié)合區(qū)域和一個(gè)亮氨酸拉鏈區(qū)域組成。堿性氨基酸區(qū)域能夠特異性地識別并結(jié)合DNA上的特定序列，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件（ERSE）等；亮氨酸拉鏈區(qū)域則通過與其他含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相互作用，形成同源或異源二聚體，從而增強(qiáng)對DNA的結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。C端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔結(jié)構(gòu)域在正常情況下與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）緊密結(jié)合，處于無活性狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量積累，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的穩(wěn)態(tài)被打破。此時(shí)，GRP78會從ATF6α的C端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔結(jié)構(gòu)域上解離，轉(zhuǎn)而與未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，以幫助它們正確折疊。這一解離過程使得ATF6α被激活。激活后的ATF6α從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位到高爾基體。在高爾基體中，ATF6α先后被兩種蛋白酶，即位點(diǎn)1蛋白酶（S1P）和位點(diǎn)2蛋白酶（S2P）切割。S1P首先在ATF6α的跨膜結(jié)構(gòu)域靠近內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的一側(cè)進(jìn)行切割，產(chǎn)生一個(gè)中間片段；隨后，S2P在跨膜結(jié)構(gòu)域靠近胞質(zhì)的一側(cè)進(jìn)一步切割，最終釋放出具有活性的ATF6αN端片段。這個(gè)N端片段包含完整的bZIP結(jié)構(gòu)域，它能夠進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA上的ERSE等順式作用元件結(jié)合。一旦進(jìn)入細(xì)胞核，ATF6αN端片段就會與ERSE等順式作用元件結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，如RNA聚合酶II、轉(zhuǎn)錄因子IIB等，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而啟動一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。這些靶基因主要包括編碼分子伴侶、折疊酶和參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（ERAD）途徑的蛋白質(zhì)等。分子伴侶如GRP78、GRP94等，它們能夠與未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，提供一個(gè)有利于蛋白質(zhì)正確折疊的微環(huán)境，促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊和組裝，減少錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的積累，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。折疊酶如蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）等，能夠催化蛋白質(zhì)中二硫鍵的形成、斷裂和重排，幫助蛋白質(zhì)形成正確的三維結(jié)構(gòu)。ERAD途徑相關(guān)的蛋白質(zhì)則能夠識別并將錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)進(jìn)行降解，從而清除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能。在心肌細(xì)胞中，當(dāng)心肌受到缺血再灌注損傷等導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的因素刺激時(shí)，ATF6α被激活。激活后的ATF6α迅速調(diào)控GRP78等分子伴侶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使GRP78蛋白水平升高。GRP78與未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，幫助它們正確折疊，維持心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。ATF6α還會調(diào)控ERAD途徑相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)對錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解能力，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān)。然而，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)時(shí)間過長或強(qiáng)度過大時(shí)，ATF6α的持續(xù)激活可能會導(dǎo)致一些促凋亡基因的表達(dá)上調(diào)，如CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）等，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。2.3CUEDC2與ATF6α的相互作用關(guān)系預(yù)測生物信息學(xué)分析為探索CUEDC2與ATF6α之間潛在的相互作用提供了有力的工具。通過對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的深入挖掘和分析，我們發(fā)現(xiàn)CUEDC2的CUE結(jié)構(gòu)域在空間構(gòu)象上可能與ATF6α的某些區(qū)域存在互補(bǔ)性。CUE結(jié)構(gòu)域作為CUEDC2中參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，其獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)和表面電荷分布模式，使其具備與其他蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的能力。而ATF6α在激活過程中，其分子構(gòu)象會發(fā)生一系列的變化，尤其是在從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位到高爾基體并被切割激活的過程中，其部分結(jié)構(gòu)域會暴露出來。生物信息學(xué)預(yù)測顯示，CUEDC2的CUE結(jié)構(gòu)域有可能與ATF6α激活過程中暴露的某些區(qū)域相互作用，這種相互作用可能通過氫鍵、離子鍵或疏水相互作用等方式實(shí)現(xiàn)。這種潛在的相互作用可能會影響ATF6α的激活、轉(zhuǎn)位以及其與下游靶基因的結(jié)合能力。從蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的角度來看，CUEDC2和ATF6α雖然在目前已知的直接相互作用網(wǎng)絡(luò)中沒有明確的連接，但通過對它們各自的相互作用蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們可能通過一些中間蛋白間接產(chǎn)生聯(lián)系。CUEDC2已知的相互作用蛋白中，有部分蛋白參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的信號通路，而這些通路與ATF6α所在的未折疊蛋白反應(yīng)通路存在交叉和關(guān)聯(lián)。某些分子伴侶蛋白既可以與CUEDC2相互作用，又在ATF6α激活后的下游靶基因調(diào)控中發(fā)揮作用。這提示我們，CUEDC2可能通過這些中間蛋白間接影響ATF6α的功能，或者與ATF6α協(xié)同作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的生物學(xué)過程。已有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及多個(gè)信號通路的相互交織和協(xié)同調(diào)控。在這一過程中，不同的蛋白質(zhì)之間會發(fā)生廣泛的相互作用，以調(diào)節(jié)細(xì)胞的命運(yùn)。CUEDC2對NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)功能，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)之間存在著密切的聯(lián)系。NF-κB信號通路在炎癥反應(yīng)和細(xì)胞存活調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)也會影響NF-κB信號通路的活性。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，未折疊蛋白反應(yīng)被激活，這可能會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的炎癥微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而影響NF-κB信號通路的激活狀態(tài)。CUEDC2通過抑制NF-κB信號通路的持續(xù)激活，可能會間接影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的程度和未折疊蛋白反應(yīng)的進(jìn)程。由于ATF6α是未折疊蛋白反應(yīng)中的關(guān)鍵信號分子，因此推測CUEDC2與ATF6α之間可能存在著某種間接的調(diào)控關(guān)系。CUEDC2對NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)可能會改變細(xì)胞內(nèi)的信號環(huán)境，從而影響ATF6α的激活和功能發(fā)揮。基于CUEDC2在蛋白質(zhì)泛素化修飾過程中的重要作用，以及蛋白質(zhì)泛素化修飾在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)中的普遍性，我們推測CUEDC2可能通過對ATF6α進(jìn)行泛素化修飾，從而調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性、活性以及細(xì)胞內(nèi)定位。在細(xì)胞內(nèi)，蛋白質(zhì)的泛素化修飾是一種重要的翻譯后修飾方式，它可以影響蛋白質(zhì)的降解、定位、活性以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用。CUEDC2作為一個(gè)含有CUE結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，能夠介導(dǎo)多種蛋白質(zhì)的泛素化降解。ATF6α在未折疊蛋白反應(yīng)中的活性和功能發(fā)揮，可能受到泛素化修飾的精細(xì)調(diào)控。CUEDC2有可能識別ATF6α，并通過其CUE結(jié)構(gòu)域招募泛素連接酶，對ATF6α進(jìn)行泛素化修飾。這種泛素化修飾可能會導(dǎo)致ATF6α被蛋白酶體降解，從而調(diào)節(jié)其在細(xì)胞內(nèi)的水平；也可能會改變ATF6α的構(gòu)象和活性，影響其與下游靶基因的結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。三、心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡3.1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生機(jī)制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊、修飾以及鈣離子儲存的重要場所，對于維持細(xì)胞的正常生理功能起著關(guān)鍵作用。然而，心肌細(xì)胞在受到低氧、鈣離子失衡、超負(fù)荷應(yīng)激等多種病理因素刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)會遭到破壞，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在低氧狀態(tài)下，細(xì)胞的能量代謝受到嚴(yán)重影響。正常情況下，細(xì)胞通過有氧呼吸產(chǎn)生大量的三磷酸腺苷（ATP），為蛋白質(zhì)的合成、折疊以及其他細(xì)胞活動提供能量。但當(dāng)心肌細(xì)胞處于低氧環(huán)境時(shí)，線粒體的有氧呼吸受阻，ATP生成顯著減少。這會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊所需的能量供應(yīng)不足，使得新合成的蛋白質(zhì)無法正確折疊，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)大量積累。研究表明，在心肌缺血模型中，隨著缺血時(shí)間的延長，低氧程度逐漸加重，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白的含量顯著增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）的表達(dá)也隨之升高，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被激活。鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，在心肌細(xì)胞的興奮-收縮偶聯(lián)、信號傳導(dǎo)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是心肌細(xì)胞內(nèi)重要的鈣離子儲存庫，其內(nèi)部鈣離子濃度的穩(wěn)定對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能至關(guān)重要。當(dāng)心肌細(xì)胞受到各種刺激導(dǎo)致鈣離子失衡時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子穩(wěn)態(tài)被打破。例如，在心肌缺血再灌注損傷中，缺血期細(xì)胞內(nèi)ATP減少，導(dǎo)致細(xì)胞膜上的鈣離子泵功能受損，無法正常將細(xì)胞內(nèi)的鈣離子泵出細(xì)胞。再灌注時(shí)，大量鈣離子涌入細(xì)胞內(nèi)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子也會隨之釋放，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度急劇下降。這種鈣離子濃度的異常變化會影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊酶和分子伴侶的活性，使蛋白質(zhì)折疊過程出現(xiàn)異常，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積聚，進(jìn)而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。研究發(fā)現(xiàn)，使用鈣離子螯合劑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，可以有效減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的程度，證明了鈣離子失衡在心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生中的重要作用。心臟在長期承受超負(fù)荷應(yīng)激時(shí)，如高血壓引起的心臟后負(fù)荷增加、主動脈瓣狹窄導(dǎo)致的左心室壓力負(fù)荷過重等，心肌細(xì)胞需要承受更大的機(jī)械壓力和代謝需求。為了適應(yīng)這種超負(fù)荷狀態(tài)，心肌細(xì)胞會發(fā)生一系列的適應(yīng)性變化，包括心肌肥厚等。但這種適應(yīng)性反應(yīng)是有限度的，當(dāng)負(fù)荷持續(xù)增加超過心肌細(xì)胞的代償能力時(shí)，就會引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。超負(fù)荷應(yīng)激會導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)的能量代謝紊亂，活性氧（ROS）生成增加。ROS具有很強(qiáng)的氧化活性，能夠攻擊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化修飾、脂質(zhì)過氧化以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能的損傷。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損后，蛋白質(zhì)折疊能力下降，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積累，從而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚動物模型中，心肌組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)明顯上調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）的蛋白水平顯著升高，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在超負(fù)荷應(yīng)激導(dǎo)致的心肌損傷中發(fā)揮著重要作用。3.2未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，細(xì)胞會啟動未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），這是一種進(jìn)化上保守的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持機(jī)制，旨在恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，促進(jìn)細(xì)胞存活。UPR主要通過三條相對獨(dú)立但又相互關(guān)聯(lián)的信號通路來發(fā)揮作用，分別是肌醇依賴酶1（IRE1）通路、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）通路和激活轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）通路。IRE1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種I型跨膜糖蛋白，具有激酶域和核糖核酸內(nèi)切酶（RNase）域。在正常生理狀態(tài)下，IRE1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）結(jié)合，處于無活性狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量積累，GRP78會從IRE1上解離，轉(zhuǎn)而與這些異常蛋白質(zhì)結(jié)合，從而激活I(lǐng)RE1。激活后的IRE1發(fā)生自身磷酸化，并通過其RNase域?qū)盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的前體mRNA進(jìn)行剪切。剪切后的XBP1mRNA發(fā)生讀碼框移位，翻譯出具有活性的XBP1蛋白。XBP1蛋白是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠進(jìn)入細(xì)胞核，與UPR及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（ERAD）基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這些基因編碼的蛋白質(zhì)包括分子伴侶、折疊酶和ERAD相關(guān)蛋白等，它們共同作用，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊能力，促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，維持細(xì)胞的正常功能。在某些細(xì)胞模型中，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，IRE1-XBP1通路被激活，XBP1蛋白表達(dá)上調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分子伴侶的含量增加，蛋白質(zhì)折疊效率提高，細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的耐受性增強(qiáng)。PERK屬于真核翻譯起始因子2α（eIF2α）蛋白激酶家族成員，是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白。在非應(yīng)激狀態(tài)下，PERK的N端與GRP78結(jié)合，使其處于失活狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，GRP78與PERK解離，PERK發(fā)生自身磷酸化而被激活。激活后的PERK能夠特異性地磷酸化eIF2α的51位絲氨酸。eIF2α的磷酸化具有雙重作用：一方面，它可以阻斷大多數(shù)蛋白質(zhì)mRNA的翻譯起始過程，減少新合成蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊負(fù)擔(dān)；另一方面，它可以選擇性地促進(jìn)活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的翻譯。ATF4進(jìn)入細(xì)胞核后，調(diào)控一系列基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這些基因參與氨基酸代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及蛋白質(zhì)分泌等過程，有助于細(xì)胞在應(yīng)激條件下維持正常的生理功能。在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型中，PERK-eIF2α-ATF4通路被激活，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)增加，氧化應(yīng)激水平降低，細(xì)胞存活率提高。ATF6是一種II型跨膜蛋白，其N端位于細(xì)胞質(zhì)，含有堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）結(jié)構(gòu)域，具有轉(zhuǎn)錄激活功能；C端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，含有多個(gè)GRP78結(jié)合位點(diǎn)。在正常情況下，ATF6與GRP78結(jié)合，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，GRP78與ATF6解離，ATF6從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位到高爾基體。在高爾基體中，ATF6先后被位點(diǎn)1蛋白酶（S1P）和位點(diǎn)2蛋白酶（S2P）切割，釋放出具有活性的N端片段。該N端片段進(jìn)入細(xì)胞核，與通用型轉(zhuǎn)錄因子NF-Y相互作用，以二聚體的形式結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因啟動子區(qū)域的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件（ERSE）上，如BIP、XBP1、CHOP等基因的啟動子，誘導(dǎo)這些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這些基因編碼的蛋白質(zhì)參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的恢復(fù)過程，促進(jìn)細(xì)胞生存。在心肌缺血再灌注損傷模型中，早期ATF6的激活能夠上調(diào)GRP78等分子伴侶的表達(dá)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，對心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。在心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中，UPR的三條信號通路并非孤立地發(fā)揮作用，而是相互協(xié)調(diào)、相互影響。它們共同作用，根據(jù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的程度和持續(xù)時(shí)間，決定心肌細(xì)胞的命運(yùn)。在輕度或短暫的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，UPR通過激活上述三條信號通路，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊能力、減少蛋白質(zhì)合成、促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，維持心肌細(xì)胞的正常功能，促進(jìn)細(xì)胞存活。然而，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在且無法得到有效緩解時(shí)，UPR則會激活一系列促凋亡信號通路，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。過度激活的IRE1可能會通過激活凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1），進(jìn)而激活c-Jun氨基末端激酶（JNK），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。PERK-eIF2α-ATF4通路持續(xù)激活會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子CHOP的表達(dá)上調(diào)，CHOP通過調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白家族的表達(dá)，促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素C釋放，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。3.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的途徑當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在且無法得到有效緩解時(shí)，未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）會從促進(jìn)細(xì)胞存活的適應(yīng)性反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程，這一轉(zhuǎn)變涉及多條信號通路的激活和相互作用。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程中，轉(zhuǎn)錄因子CHOP的激活發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CHOP屬于C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族，其基因啟動子內(nèi)含有UPR誘導(dǎo)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，包括ATF4、ATF6及XBP等。在UPR的三條主要信號通路中，PERK-eIF2α-ATF4通路是誘導(dǎo)CHOP轉(zhuǎn)錄的主要途徑。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，PERK被激活，使eIF2α磷酸化，從而選擇性地促進(jìn)ATF4的翻譯。ATF4進(jìn)入細(xì)胞核后，與CHOP基因啟動子區(qū)域的相應(yīng)元件結(jié)合，激活CHOP的轉(zhuǎn)錄。ATF6和IRE1通路在一定程度上也能誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)。在心肌缺血再灌注損傷模型中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活了PERK-eIF2α-ATF4通路，導(dǎo)致ATF4表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而使CHOP的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)顯著增加。CHOP誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要包括對Bcl-2蛋白家族的調(diào)節(jié)以及對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原狀態(tài)的調(diào)控。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，高表達(dá)的CHOP通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，破壞了Bcl-2蛋白家族的平衡。Bax表達(dá)增加后，會在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致線粒體膜電位喪失，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、caspase-9前體等結(jié)合，形成凋亡小體，激活caspase-9。激活的caspase-9進(jìn)一步激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspase，引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。研究表明，在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起CHOP表達(dá)升高，Bax/Bcl-2比值增加，線粒體細(xì)胞色素C釋放，caspase-3活性增強(qiáng)，心肌細(xì)胞凋亡明顯增加。CHOP還能通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原狀態(tài)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CHOP過度表達(dá)可以耗竭谷胱甘肽，同時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化酶1α（ERO1α）的表達(dá)增加，導(dǎo)致過氧化物產(chǎn)生增多，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于過氧化環(huán)境。這種氧化還原狀態(tài)的改變會損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，進(jìn)一步加劇未折疊蛋白的積累，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡信號通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還能特異性激活Caspase-12，這是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的另一條重要途徑。Caspase-12是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的半胱氨酸蛋白酶，在正常情況下以無活性的酶原形式存在。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的未折疊蛋白積累、鈣離子失衡等因素會導(dǎo)致Caspase-12被激活。具體機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白的變化以及鈣離子信號的傳導(dǎo)有關(guān)。激活后的Caspase-12可以直接裂解下游效應(yīng)蛋白酶Caspase-3，從而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。在過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡模型中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致Caspase-12激活，隨后Caspase-3被激活，細(xì)胞凋亡率顯著增加。使用Caspase-12抑制劑預(yù)處理心肌細(xì)胞，可以有效抑制Caspase-3的激活和細(xì)胞凋亡的發(fā)生，證明了Caspase-12在這一過程中的關(guān)鍵作用。IRE1通路在持續(xù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)也會促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。在正?；蚨虝簝?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，IRE1通過激活XBP1，促進(jìn)細(xì)胞存活相關(guān)基因的表達(dá)。但當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在時(shí)，IRE1會激活凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）。ASK1是一種絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAP3K），它被激活后可以進(jìn)一步激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）。JNK是MAPK家族的重要成員，激活后的JNK可以磷酸化一系列下游底物，包括轉(zhuǎn)錄因子c-Jun等。磷酸化的c-Jun可以調(diào)控一系列促凋亡基因的表達(dá)，如Bim、FasL等。Bim可以促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素C的釋放，F(xiàn)asL可以與細(xì)胞膜上的死亡受體Fas結(jié)合，激活死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號通路，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。在心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型中，持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活了IRE1-ASK1-JNK信號通路，JNK的磷酸化水平升高，Bim和FasL的表達(dá)上調(diào)，心肌細(xì)胞凋亡明顯增加。四、CUEDC2對心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致細(xì)胞凋亡的影響4.1CUEDC2基因敲除小鼠模型的建立與分析為深入探究CUEDC2在心臟中的功能，本研究借助已成功構(gòu)建的CUEDC2基因敲除雜合子小鼠，通過精心設(shè)計(jì)的繁殖方案，獲得了CUEDC2基因敲除純合子小鼠以及同窩野生型對照小鼠。在繁殖過程中，嚴(yán)格遵循孟德爾遺傳定律，對每一代小鼠進(jìn)行細(xì)致的基因型鑒定，以確保實(shí)驗(yàn)小鼠基因型的準(zhǔn)確性和可靠性。在小鼠的生長發(fā)育過程中，對CUEDC2基因敲除小鼠（Cuedc2-/-）和野生型小鼠進(jìn)行了全方位的觀察與對比。從外觀上來看，在出生后的早期階段，兩種小鼠在體型、體重增長以及毛發(fā)色澤等方面并無明顯差異。通過定期測量體重，繪制生長曲線，發(fā)現(xiàn)Cuedc2-/-小鼠和野生型小鼠在出生后的前幾周內(nèi)，體重增長趨勢基本一致。然而，隨著小鼠的逐漸生長，在4周齡左右，Cuedc2-/-小鼠開始出現(xiàn)生長發(fā)育遲緩的跡象。與野生型小鼠相比，Cuedc2-/-小鼠的體重增長速度明顯放緩，在8周齡時(shí)，Cuedc2-/-小鼠的平均體重顯著低于野生型小鼠。對小鼠的行為學(xué)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)Cuedc2-/-小鼠的活動能力和探索欲望也有所下降。在曠場實(shí)驗(yàn)中，Cuedc2-/-小鼠在中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間明顯減少，活動范圍也相對較小，提示其可能存在一定的行為學(xué)異常。為了深入了解CUEDC2基因敲除對心臟結(jié)構(gòu)的影響，采用了心臟超聲和組織學(xué)分析等技術(shù)手段。心臟超聲檢查結(jié)果顯示，Cuedc2-/-小鼠的心臟結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯的改變。與野生型小鼠相比，Cuedc2-/-小鼠的左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）和收縮末期內(nèi)徑（LVESd）顯著增加，表明左心室出現(xiàn)了擴(kuò)張。左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和短軸縮短率（FS）則明顯降低，反映出心臟收縮功能的減退。在組織學(xué)分析方面，對心臟組織進(jìn)行了蘇木精-伊紅（HE）染色、Masson染色和天狼星紅染色。HE染色結(jié)果顯示，Cuedc2-/-小鼠的心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙增寬，可見明顯的心肌細(xì)胞肥大。Masson染色和天狼星紅染色結(jié)果表明，Cuedc2-/-小鼠的心肌間質(zhì)纖維化程度顯著增加，膠原纖維大量沉積，這可能是導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)改變和功能受損的重要原因之一。通過檢測心臟功能相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)一步評估了CUEDC2基因敲除對心臟生理功能的影響。采用血流動力學(xué)檢測技術(shù)，測量了小鼠的左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張壓（LVDP）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）和左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax）。結(jié)果顯示，Cuedc2-/-小鼠的LVSP和+dp/dtmax明顯降低，LVDP和-dp/dtmax顯著升高，表明心臟的收縮和舒張功能均受到了嚴(yán)重影響。在心肌細(xì)胞電生理特性方面，通過膜片鉗技術(shù)記錄了心肌細(xì)胞的動作電位。發(fā)現(xiàn)Cuedc2-/-小鼠心肌細(xì)胞的動作電位時(shí)程（APD）明顯延長，尤其是APD90（動作電位復(fù)極化90%時(shí)的時(shí)程）顯著增加，這可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞的興奮性和傳導(dǎo)性異常，增加心律失常的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述，通過對CUEDC2基因敲除小鼠模型的建立與分析，發(fā)現(xiàn)CUEDC2基因敲除會導(dǎo)致小鼠生長發(fā)育遲緩、心臟結(jié)構(gòu)改變以及心臟生理功能受損。這些結(jié)果表明，CUEDC2在心臟的正常發(fā)育和生理功能維持中具有至關(guān)重要的作用，為后續(xù)深入研究CUEDC2對心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致細(xì)胞凋亡的影響奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.2CUEDC2在急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用為了深入探究CUEDC2在急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用，本研究采用了多種實(shí)驗(yàn)方法。首先，以CUEDC2基因敲除小鼠和野生型小鼠為研究對象，構(gòu)建了急性心肌缺血再灌注損傷模型。通過結(jié)扎小鼠冠狀動脈左前降支30分鐘，然后再灌注24小時(shí)，成功誘導(dǎo)了急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在心肌細(xì)胞存活方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出顯著差異。與野生型小鼠相比，CUEDC2基因敲除小鼠在急性心肌缺血再灌注損傷后，心肌細(xì)胞的存活率明顯降低。通過TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)CUEDC2基因敲除小鼠心肌組織中的TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著高于野生型小鼠。在再灌注24小時(shí)后，野生型小鼠心肌組織中TUNEL陽性細(xì)胞比例約為15%，而CUEDC2基因敲除小鼠的TUNEL陽性細(xì)胞比例則高達(dá)30%以上。這表明CUEDC2基因敲除會加劇急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下心肌細(xì)胞的凋亡，提示CUEDC2對急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下心肌細(xì)胞的存活具有重要的保護(hù)作用。對相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)作用研究發(fā)現(xiàn)，CUEDC2基因敲除小鼠在急性心肌缺血再灌注損傷后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路發(fā)生了明顯改變。未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）中的關(guān)鍵分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）的表達(dá)水平顯著升高。GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性分子，其表達(dá)上調(diào)表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度加劇。CHOP是UPR介導(dǎo)的凋亡信號通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)升高進(jìn)一步證實(shí)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加。在蛋白水平檢測中，CUEDC2基因敲除小鼠心肌組織中的GRP78和CHOP蛋白表達(dá)量分別比野生型小鼠增加了約1.5倍和2倍。在UPR的三條主要信號通路中，IRE1通路和ATF6通路也受到了顯著影響。在IRE1通路中，CUEDC2基因敲除小鼠心肌組織中IRE1的磷酸化水平明顯升高，X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的剪接形式（sXBP1）表達(dá)增加。IRE1的磷酸化激活是IRE1通路啟動的關(guān)鍵步驟，其磷酸化水平升高表明IRE1通路被過度激活。sXBP1是IRE1激活后對XBP1前體mRNA進(jìn)行剪切產(chǎn)生的具有活性的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)增加會進(jìn)一步調(diào)控下游基因的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)展。在ATF6通路中，CUEDC2基因敲除小鼠心肌組織中ATF6α的激活和轉(zhuǎn)位明顯增強(qiáng)，下游靶基因如GRP94等的表達(dá)也顯著上調(diào)。ATF6α的激活和轉(zhuǎn)位是其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的關(guān)鍵過程，其增強(qiáng)表明ATF6通路在CUEDC2基因敲除小鼠中也被過度激活。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CUEDC2在急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用，在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。通過使用毒胡蘿卜素（Tg）處理心肌細(xì)胞，誘導(dǎo)急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一致，敲低CUEDC2表達(dá)的心肌細(xì)胞在Tg處理后，細(xì)胞凋亡率明顯增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路分子的表達(dá)和激活也發(fā)生了類似的改變。這進(jìn)一步證實(shí)了CUEDC2在急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中對心肌細(xì)胞存活的保護(hù)作用以及對相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)作用。綜上所述，CUEDC2在急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中對心肌細(xì)胞的存活具有重要的保護(hù)作用，其缺失會加劇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度，激活UPR相關(guān)信號通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果為深入理解急性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下心肌細(xì)胞命運(yùn)決定的分子機(jī)制提供了重要線索，也為心血管疾病的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。4.3CUEDC2在慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用為了深入研究CUEDC2在慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用，本研究采用主動脈縮窄（TAC）手術(shù)構(gòu)建慢性壓力超負(fù)荷心肌肥厚小鼠模型。該模型通過縮窄主動脈，使心臟后負(fù)荷持續(xù)增加，從而誘導(dǎo)慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。將CUEDC2基因敲除小鼠和野生型小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和TAC手術(shù)組，在手術(shù)后8周對小鼠進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。在心肌組織病理變化方面，TAC手術(shù)8周后，CUEDC2基因敲除小鼠的心肌肥厚程度明顯加重。通過測量心臟重量與體重的比值（HW/BW）以及左心室重量與體重的比值（LVW/BW），發(fā)現(xiàn)CUEDC2基因敲除小鼠的這兩個(gè)比值顯著高于野生型小鼠。在野生型小鼠中，TAC手術(shù)組的HW/BW比值從假手術(shù)組的3.0±0.2增加到4.5±0.3，而CUEDC2基因敲除小鼠TAC手術(shù)組的HW/BW比值則升高至5.5±0.4。組織學(xué)分析結(jié)果顯示，CUEDC2基因敲除小鼠心肌細(xì)胞橫截面積顯著增大，比野生型小鼠TAC手術(shù)組增加了約30%。Masson染色結(jié)果表明，CUEDC2基因敲除小鼠心肌間質(zhì)纖維化程度更為嚴(yán)重，膠原纖維面積百分比明顯高于野生型小鼠。心功能檢測結(jié)果顯示，CUEDC2基因敲除小鼠的心功能受損更為顯著。心臟超聲檢測結(jié)果顯示，CUEDC2基因敲除小鼠在TAC手術(shù)后左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和短軸縮短率（FS）顯著降低。野生型小鼠TAC手術(shù)組的LVEF從假手術(shù)組的65%±3%降至50%±4%，而CUEDC2基因敲除小鼠TAC手術(shù)組的LVEF則進(jìn)一步降至40%±5%。血流動力學(xué)檢測結(jié)果也表明，CUEDC2基因敲除小鼠的左心室收縮壓（LVSP）降低，左心室舒張壓（LVDP）升高，左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）和最大下降速率（-dp/dtmax）均顯著降低，表明心臟的收縮和舒張功能均受到嚴(yán)重影響。對慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路的研究發(fā)現(xiàn)，CUEDC2基因敲除小鼠心肌組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子標(biāo)記物的表達(dá)顯著上調(diào)。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于野生型小鼠。在蛋白水平上，CUEDC2基因敲除小鼠心肌組織中的GRP78和CHOP蛋白表達(dá)量分別比野生型小鼠TAC手術(shù)組增加了約1.8倍和2.5倍。在未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的三條主要信號通路中，IRE1通路和ATF6通路的激活程度也明顯增強(qiáng)。IRE1的磷酸化水平顯著升高，X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的剪接形式（sXBP1）表達(dá)增加；ATF6α的激活和轉(zhuǎn)位增強(qiáng)，下游靶基因如GRP94等的表達(dá)顯著上調(diào)。綜上所述，在慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，CUEDC2基因敲除會導(dǎo)致心肌肥厚加重、心功能受損加劇以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路的過度激活。這些結(jié)果表明，CUEDC2在慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中對心肌細(xì)胞具有重要的保護(hù)作用，其缺失會加重心肌損傷，為進(jìn)一步理解慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致心肌病變的分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。五、ATF6α對心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致細(xì)胞凋亡的影響5.1ATF6α激活后的生物學(xué)效應(yīng)當(dāng)心肌細(xì)胞遭遇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，ATF6α?xí)谎杆偌せ?，從而引發(fā)一系列復(fù)雜且關(guān)鍵的生物學(xué)效應(yīng)，這些效應(yīng)在心肌細(xì)胞的命運(yùn)決定過程中起著至關(guān)重要的作用。在基因表達(dá)層面，激活后的ATF6α?xí)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位至高爾基體，在高爾基體中先后被位點(diǎn)1蛋白酶（S1P）和位點(diǎn)2蛋白酶（S2P）切割，釋放出具有活性的N端片段。這一片段進(jìn)入細(xì)胞核后，能夠特異性地識別并結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因啟動子區(qū)域的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件（ERSE）上，如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）等基因的啟動子。以GRP78基因啟動子為例，ATF6αN端片段與ERSE結(jié)合后，招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，如RNA聚合酶II、轉(zhuǎn)錄因子IIB等，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而啟動GRP78基因的轉(zhuǎn)錄過程。研究表明，在心肌缺血再灌注損傷早期，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活了ATF6α，GRP78基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，在缺血再灌注后1小時(shí)，GRP78mRNA的表達(dá)量相較于正常對照組增加了約2倍。在蛋白質(zhì)合成方面，ATF6α激活后調(diào)控的基因表達(dá)變化會直接影響蛋白質(zhì)的合成。GRP78作為一種重要的分子伴侶蛋白，其合成量會隨著GRP78基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)而顯著增加。GRP78能夠與未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，為它們提供一個(gè)適宜的折疊環(huán)境，促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，減少錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的積累，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在正常心肌細(xì)胞中，GRP78蛋白維持在一定的基礎(chǔ)水平；而當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生且ATF6α被激活后，在缺血再灌注后3小時(shí)，GRP78蛋白的表達(dá)量相較于正常對照組增加了約1.5倍。除了GRP78，ATF6α還會調(diào)控其他參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊和質(zhì)量控制的蛋白質(zhì)合成，如蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）等。PDI能夠催化蛋白質(zhì)中二硫鍵的形成、斷裂和重排，幫助蛋白質(zhì)形成正確的三維結(jié)構(gòu)，對于維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的正常折疊和功能具有重要意義。在細(xì)胞存活和凋亡的調(diào)控上，ATF6α激活后的生物學(xué)效應(yīng)具有階段性和雙重性。在心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的早期階段，ATF6α激活后上調(diào)GRP78等分子伴侶的表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊能力，促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解，有效緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而對心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用，促進(jìn)細(xì)胞存活。研究發(fā)現(xiàn)，在急性心肌缺血再灌注損傷的初期，給予能夠增強(qiáng)ATF6α激活的藥物干預(yù)，心肌細(xì)胞的存活率明顯提高，細(xì)胞凋亡率顯著降低。然而，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在且強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)時(shí)，ATF6α的持續(xù)激活會導(dǎo)致一些促凋亡基因的表達(dá)上調(diào)，其中最具代表性的是CHOP基因。ATF6α與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，激活CHOP基因的轉(zhuǎn)錄，使CHOP蛋白表達(dá)增加。CHOP蛋白通過多種途徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，如上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，破壞Bcl-2蛋白家族的平衡，導(dǎo)致線粒體膜電位喪失，細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。在持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型中，隨著應(yīng)激時(shí)間的延長，ATF6α介導(dǎo)的CHOP表達(dá)逐漸升高，心肌細(xì)胞凋亡率也隨之顯著增加。5.2ATF6α在心肌缺血再灌注損傷中的作用為深入探究ATF6α在心肌缺血再灌注損傷中的作用，本研究以小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，構(gòu)建了心肌缺血再灌注損傷模型。選取健康成年小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組以及ATF6α干預(yù)組。通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支30分鐘，隨后再灌注24小時(shí)，成功誘導(dǎo)心肌缺血再灌注損傷。在ATF6α干預(yù)組中，于缺血再灌注前給予特異性激活或抑制ATF6α的藥物處理。在心肌細(xì)胞凋亡檢測方面，采用TUNEL染色法對心肌組織切片進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，缺血再灌注組心肌組織中的TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著高于假手術(shù)組，表明心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致了大量心肌細(xì)胞凋亡。而在ATF6α激活劑處理的干預(yù)組中，TUNEL陽性細(xì)胞比例明顯低于缺血再灌注組，細(xì)胞凋亡率降低了約30%。相反，在給予ATF6α抑制劑的干預(yù)組中，TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著升高，細(xì)胞凋亡率較缺血再灌注組增加了約20%。這表明激活A(yù)TF6α能夠有效抑制心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而抑制ATF6α則會加劇細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測結(jié)果表明，缺血再灌注組心肌組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）的表達(dá)顯著上調(diào)。在蛋白水平上，GRP78和CHOP蛋白表達(dá)量分別比假手術(shù)組增加了約2倍和3倍。在ATF6α激活劑處理組中，GRP78和CHOP的表達(dá)上調(diào)程度明顯減輕，GRP78蛋白表達(dá)量較缺血再灌注組降低了約35%，CHOP蛋白表達(dá)量降低了約40%。而在ATF6α抑制劑處理組中，GRP78和CHOP的表達(dá)上調(diào)更為顯著，GRP78蛋白表達(dá)量比缺血再灌注組增加了約25%，CHOP蛋白表達(dá)量增加了約30%。這說明ATF6α的激活能夠緩解心肌缺血再灌注損傷引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的過度表達(dá)；而抑制ATF6α則會加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。對ATF6α下游靶基因表達(dá)的檢測發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注組中ATF6α下游靶基因如GRP94、PDI等的表達(dá)顯著上調(diào)。在ATF6α激活劑處理組中，這些靶基因的表達(dá)進(jìn)一步升高，GRP94和PDI的mRNA表達(dá)量分別比缺血再灌注組增加了約1.5倍和1.8倍。而在ATF6α抑制劑處理組中，靶基因的表達(dá)明顯受到抑制，GRP94和PDI的mRNA表達(dá)量分別比缺血再灌注組降低了約40%和35%。這表明ATF6α的激活能夠促進(jìn)其下游靶基因的表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊和修復(fù)能力；而抑制ATF6α則會削弱這一作用。綜上所述，在心肌缺血再灌注損傷中，ATF6α發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。激活A(yù)TF6α能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)下游靶基因的表達(dá)，對心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用；而抑制ATF6α則會加劇心肌細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，加重心肌損傷。5.3ATF6α與其他信號通路的交互作用在心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的復(fù)雜病理過程中，ATF6α并非孤立地發(fā)揮作用，而是與其他多條信號通路存在著廣泛而緊密的交互作用，這些交互作用共同調(diào)控著心肌細(xì)胞的命運(yùn)。與NF-κB信號通路之間，ATF6α和NF-κB信號通路存在著復(fù)雜的相互影響。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞存活和凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)心肌細(xì)胞受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激刺激時(shí)，ATF6α的激活可以通過多種途徑影響NF-κB信號通路的活性。研究發(fā)現(xiàn)，ATF6α激活后上調(diào)的某些分子伴侶蛋白，如GRP78等，能夠與NF-κB信號通路中的關(guān)鍵分子相互作用，抑制NF-κB的激活。GRP78可以與NF-κB抑制蛋白IκBα結(jié)合，增強(qiáng)IκBα對NF-κB的抑制作用，從而阻止NF-κB的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄激活。在心肌缺血再灌注損傷模型中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活了ATF6α，導(dǎo)致GRP78表達(dá)上調(diào)，NF-κB的活性受到抑制，炎癥因子的表達(dá)減少，這在一定程度上減輕了心肌細(xì)胞的炎癥損傷。然而，在某些情況下，ATF6α也可能促進(jìn)NF-κB信號通路的激活。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在且強(qiáng)度較大時(shí)，ATF6α激活后可能會誘導(dǎo)一些炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，這些基因的產(chǎn)物可以激活NF-κB信號通路。ATF6α激活后上調(diào)的CHOP蛋白，能夠通過與NF-κB信號通路中的某些分子相互作用，促進(jìn)NF-κB的激活，進(jìn)而加劇炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。在與MAPK信號通路的交互中，ATF6α和MAPK信號通路之間也存在著密切的聯(lián)系。MAPK信號通路包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等多個(gè)分支，它們在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用。在心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，ATF6α的激活可以影響MAPK信號通路的活性。研究表明，ATF6α激活后可以通過調(diào)節(jié)一些上游信號分子的表達(dá)或活性，間接影響MAPK信號通路的激活。ATF6α激活后上調(diào)的某些蛋白質(zhì)可以與MAPK信號通路中的激酶相互作用，促進(jìn)或抑制其磷酸化和激活。在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型中，ATF6α激活后上調(diào)的一種蛋白質(zhì)可以與JNK上游的凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）結(jié)合，抑制ASK1的活性，從而減少JNK的磷酸化和激活，抑制細(xì)胞凋亡。相反，在某些情況下，MAPK信號通路也可以影響ATF6α的功能。ERK的激活可以促進(jìn)ATF6α的轉(zhuǎn)錄和翻譯，增強(qiáng)其表達(dá)水平，從而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。在心肌細(xì)胞受到生長因子刺激時(shí)，ERK被激活，進(jìn)而促進(jìn)ATF6α的表達(dá)，增強(qiáng)心肌細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的耐受性。ATF6α與其他信號通路的交互作用在心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡中具有重要的協(xié)同作用。這些信號通路之間的相互調(diào)節(jié)和協(xié)同作用，共同決定了心肌細(xì)胞在面對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)的命運(yùn)。在急性心肌缺血再灌注損傷中，ATF6α、NF-κB和MAPK信號通路相互作用，共同調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的凋亡和存活。ATF6α通過抑制NF-κB的活性，減少炎癥因子的表達(dá)，減輕炎癥損傷；同時(shí)，通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路的活性，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活。而在慢性壓力超負(fù)荷心肌肥厚模型中，這些信號通路的異常激活和相互作用，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)加劇，心肌細(xì)胞凋亡增加，最終導(dǎo)致心肌纖維化和心功能減退。六、CUEDC2與ATF6α協(xié)同調(diào)控心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致細(xì)胞凋亡的機(jī)制6.1CUEDC2與ATF6α的直接相互作用驗(yàn)證為了驗(yàn)證CUEDC2與ATF6α是否存在直接相互作用，本研究采用了免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)。首先，培養(yǎng)小鼠心肌細(xì)胞，待細(xì)胞生長至對數(shù)期后，用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素（Tg）處理細(xì)胞，以激活A(yù)TF6α并模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。處理一定時(shí)間后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，然后加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞。將裂解液在4℃下以14000g離心15分鐘，取上清，得到細(xì)胞總蛋白提取物。取部分細(xì)胞總蛋白提取物，加入抗CUEDC2抗體，4℃孵育過夜，使抗體與CUEDC2充分結(jié)合。隨后，加入ProteinA/G-agarose微球，繼續(xù)在4℃孵育2小時(shí)，使抗體-抗原復(fù)合物與ProteinA/G-agarose微球結(jié)合。孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的PBS洗滌微球三次，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。最后，加入適量的SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)從微球上解離下來。將解離后的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，加入抗ATF6α抗體，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜三次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌PVDF膜三次，每次10分鐘，最后用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影。結(jié)果顯示，在CUEDC2免疫沉淀復(fù)合物中檢測到了ATF6α的條帶，表明CUEDC2與ATF6α在心肌細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種相互作用的直接性，采用了GSTPull-down實(shí)驗(yàn)。首先，構(gòu)建GST-CUEDC2融合蛋白表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)后的融合蛋白用谷胱甘肽瓊脂糖珠進(jìn)行純化。同時(shí)，將ATF6α蛋白在體外進(jìn)行表達(dá)和純化。取適量純化后的GST-CUEDC2融合蛋白與谷胱甘肽瓊脂糖珠結(jié)合，然后加入純化后的ATF6α蛋白，4℃孵育2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的PBS洗滌谷胱甘肽瓊脂糖珠三次，以去除未結(jié)合的ATF6α蛋白。最后，加入適量的SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使結(jié)合在谷胱甘肽瓊脂糖珠上的蛋白質(zhì)解離下來。將解離后的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，封閉后，加入抗ATF6α抗體，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜三次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌PVDF膜三次，每次10分鐘，最后用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影。結(jié)果顯示，在GST-CUEDC2融合蛋白結(jié)合的樣品中檢測到了ATF6α的條帶，而在單獨(dú)的GST蛋白結(jié)合的樣品中未檢測到ATF6α的條帶，表明CUEDC2與ATF6α存在直接相互作用。為了在細(xì)胞內(nèi)直觀地觀察CUEDC2與ATF6α的相互作用，采用了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)。構(gòu)建分別攜帶增強(qiáng)型青色熒光蛋白（ECFP）標(biāo)記的CUEDC2和增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFP）標(biāo)記的ATF6α的表達(dá)載體。將這兩種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到小鼠心肌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞。當(dāng)CUEDC2與ATF6α相互靠近時(shí)，ECFP的發(fā)射光可以激發(fā)EYFP產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，從而檢測到黃色熒光。結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)染了ECFP-CUEDC2和EYFP-ATF6α的心肌細(xì)胞中，觀察到了明顯的黃色熒光，而在單獨(dú)轉(zhuǎn)染ECFP-CUEDC2或EYFP-ATF6α的細(xì)胞中未檢測到黃色熒光，進(jìn)一步證實(shí)了CUEDC2與ATF6α在細(xì)胞內(nèi)存在直接相互作用。6.2協(xié)同調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路CUEDC2與ATF6α的直接相互作用對未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）相關(guān)信號通路產(chǎn)生了顯著的協(xié)同調(diào)控作用。在IRE1通路中，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，CUEDC2和ATF6α的相互作用能夠調(diào)節(jié)IRE1的激活和X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的剪接。研究發(fā)現(xiàn)，在CUEDC2和ATF6α共同存在且相互作用正常的情況下，IRE1的磷酸化水平適中，XBP1的剪接效率維持在一定水平，從而使下游基因的表達(dá)能夠有效緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。當(dāng)CUEDC2缺失或其與ATF6α的相互作用被破壞時(shí)，IRE1的磷酸化水平顯著升高，導(dǎo)致XBP1過度剪接，下游基因過度表達(dá)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反而加劇。這表明CUEDC2與ATF6α的協(xié)同作用能夠精細(xì)調(diào)控IRE1通路的激活程度，避免其過度激活導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的惡化。在心肌缺血再灌注損傷模型中，野生型小鼠心肌組織中CUEDC2與ATF6α相互作用正常，IRE1的磷酸化水平和XBP1的剪接程度在缺血再灌注早期處于適度激活狀態(tài)，有助于緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；而在CUEDC2基因敲除小鼠中，IRE1過度激活，XBP1過度剪接，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)異常升高，心肌細(xì)胞凋亡明顯增加。在PERK通路中，CUEDC2和ATF6α的協(xié)同作用也對該通路的關(guān)鍵分子真核翻譯起始因子2α（eIF2α）的磷酸化產(chǎn)生影響。正常情況下，CUEDC2與ATF6α相互作用，能夠調(diào)節(jié)PERK對eIF2α的磷酸化水平，使其維持在一個(gè)既能減少蛋白質(zhì)合成以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān)，又不會過度抑制蛋白質(zhì)合成影響細(xì)胞正常功能的適度水平。當(dāng)CUEDC2或ATF6α的功能異常時(shí)，PERK對eIF2α的磷酸化水平會發(fā)生改變。CUEDC2缺失會導(dǎo)致PERK過度激活，eIF2α過度磷酸化，蛋白質(zhì)合成被過度抑制，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激加劇。在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，敲低CUEDC2表達(dá)后，給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激刺激，PERK的磷酸化水平和eIF2α的磷酸化水平顯著升高，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成明顯減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡率上升。對于ATF6α自身所在的信號通路，CUEDC2與之相互作用后，對ATF6α的激活、轉(zhuǎn)位以及下游靶基因的表達(dá)調(diào)控也產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。在正常內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，CUEDC2與ATF6α相互作用，促進(jìn)ATF6α的激活和轉(zhuǎn)位，使其能夠順利進(jìn)入細(xì)胞核，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件（ERSE）結(jié)合，啟動下游靶基因如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、GRP94等的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊和修復(fù)能力，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。當(dāng)CUEDC2功能異常時(shí)，ATF6α的激活和轉(zhuǎn)位受到影響，下游靶基因的表達(dá)也隨之改變。在CUEDC2基因敲除小鼠心肌組織中，ATF6α的激活和轉(zhuǎn)位效率降低，GRP78和GRP94等靶基因的表達(dá)水平明顯低于野生型小鼠，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度加重。這表明CUEDC2與ATF6α在ATF6α信號通路中具有協(xié)同促進(jìn)作用，共同維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的平衡。6.3對心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白的影響CUEDC2與ATF6α的協(xié)同調(diào)控對心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)產(chǎn)生了顯著影響。在基因表達(dá)層面，研究發(fā)現(xiàn)，在正常心肌細(xì)胞中，促凋亡基因CHOP和Bim的表達(dá)處于較低水平，而抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)維持在一定基礎(chǔ)水平。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，若CUEDC2與ATF6α的協(xié)同作用正常，CHOP和Bim的基因表達(dá)上調(diào)幅度較小，Bcl-2的基因表達(dá)下降程度也相對較輕。而當(dāng)CUEDC2缺失或其與ATF6α的相互作用被破壞時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的CHOP和Bim基因表達(dá)上調(diào)顯著增強(qiáng)，Bcl-2基因表達(dá)則大幅下降。在CUEDC2基因敲除小鼠心肌組織中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激刺激后，CHOP基因的mRNA表達(dá)量相較于野生型小鼠增加了約2.5倍，Bim基因的mRNA表達(dá)量增加了約3倍，而Bcl-2基因的mRNA表達(dá)量則降低了約60%。這表明CUEDC2與ATF6α的協(xié)同作用能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的促凋亡基因表達(dá)，維持抗凋亡基因的表達(dá)水平，從而減少心肌細(xì)胞凋亡。在蛋白水平上，CUEDC2與ATF6α的協(xié)同調(diào)控作用同樣明顯。正常情況下，心肌細(xì)胞中CHOP和Bim蛋白的含量較低，Bcl-2蛋白含量相對較高。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，CUEDC2與ATF6α相互作用，能夠抑制CHOP和Bim蛋白的合成，同時(shí)維持Bcl-2蛋白的穩(wěn)定性和表達(dá)水平。在野生型小鼠心肌缺血再灌注損傷模型中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后，CHOP和Bim蛋白表達(dá)雖有上升，但幅度較小，Bcl-2蛋白表達(dá)略有下降。而在CUEDC2基因敲除小鼠中，CHOP和Bim蛋白表達(dá)急劇增加，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低。在缺血再灌注24小時(shí)后，CUEDC2基因敲除小鼠心肌組織中CHOP蛋白表達(dá)量相較于野生型小鼠增加了約3倍，Bim蛋白表達(dá)量增加了約3.5倍，Bcl-2蛋白表達(dá)量降低了約70%。這進(jìn)一步證實(shí)了CUEDC2與ATF6α的協(xié)同作用對心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。這種協(xié)同調(diào)控作用通過多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)。CUEDC2與ATF6α的相互作用可能影響了相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與凋亡基因啟動子區(qū)域的結(jié)合能力。在CHOP基因啟動子區(qū)域，存在多個(gè)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡相關(guān)的順式作用元件。CUEDC2與ATF6α相互作用后，可能改變了這些順式作用元件的空間構(gòu)象，使得轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū)域的結(jié)合受到抑制，從而減少CHOP基因的轉(zhuǎn)錄。CUEDC2與ATF6α可能通過調(diào)控信號通路中關(guān)鍵激酶的活性，影響凋亡相關(guān)蛋白的磷酸化水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性和功能。在Bcl-2蛋白家族中，Bim的活性