GB/TXXXXX-XXXX蛋白檢測CRISPRCas12a蛋白反式切割活性檢測方法本文件描述了CRISPRCas12a蛋白反式切割活性檢測方法的原理、試劑或材料、儀器設(shè)備、試劑樣品制備、實(shí)驗(yàn)步驟和數(shù)據(jù)處理。本文件適用于CRISPRCas12a蛋白反式切割活性的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682無核酸酶的一級水、分子級水3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1簇狀規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsCRISPR序列是由感染原核生物的噬菌體DNA片段衍生來的一段規(guī)律的、間隔的短回文序列，由富含AT的前導(dǎo)序列與被短重復(fù)序列隔開的間隔序列所組成。前導(dǎo)序列包含啟動(dòng)子，用來啟動(dòng)短重復(fù)序列和間隔序列的轉(zhuǎn)錄。短重復(fù)序列一般由28-37個(gè)堿基對組成，間隔序列一般由32-38個(gè)堿基對組成，用來錨定目的外源DNA片段。3.2Cas12a蛋白Cas12aproteinCas12a蛋白屬于CRISPRCas蛋白家族中第2類第V型，其包含RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域，能酶切靶標(biāo)雙鏈DNA和靶標(biāo)單鏈DNA，并能夠反式切割非靶標(biāo)單鏈DNA。3.3CRISPR來源RNACRISPR-derivedRNAcrRNA是一段能夠和外源目的片段序列互補(bǔ)，引導(dǎo)Cas12a蛋白剪切外源目的片段的RNA序列。3.4Cas12a蛋白反式切割活性trans-cleavageactivityofCas12aproteinCas12a蛋白與crRNA、靶標(biāo)DNA形成三元復(fù)合體后，該復(fù)合物就會(huì)顯示出不依賴于靶標(biāo)核酸序列的核酸酶活性，可將體系中任意序列的單鏈DNA切成碎片，該酶切活性被稱為Cas12a蛋白反式切割活性。3.5Cas12a蛋白反式切割單位trans-cleavageunitofCas12aproteinCas12a蛋白反式切割單位指在20μL反應(yīng)體系中，溫度為37℃條件下，1分鐘內(nèi)切割1pmol單鏈DNA熒光報(bào)告探針?biāo)鐲as12a蛋白的量為1個(gè)Cas12a蛋白反式切割單位，簡寫為(trans-U)。GB/TXXXXX-XXXX4原理CRISPRCas12a蛋白與crRNA、靶標(biāo)DNA形成三元復(fù)合物后，能將反應(yīng)體系中的單鏈DNA報(bào)告探針切碎。由于該報(bào)告探針的兩端分別用熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)標(biāo)記，當(dāng)報(bào)告探針完整時(shí)，熒光信號會(huì)被淬滅基團(tuán)淬滅；而當(dāng)報(bào)告探針被切碎后，淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)的距離會(huì)增大而失去淬滅作用，進(jìn)而產(chǎn)生熒光信號。在此反應(yīng)中，由于低濃度的CRISPRCas12a蛋白的反式切割活性與熒光信號的增長速率成正比，因此通過收集30分鐘內(nèi)反式切割反應(yīng)體系中的熒光信號值的變化量，并利用熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線方程轉(zhuǎn)化為Cas12a反式切割反應(yīng)的最大反應(yīng)速率值，然后將不同濃度的Cas12a蛋白和與之對應(yīng)的最大反應(yīng)速率值進(jìn)行線性擬合，最終實(shí)現(xiàn)通過檢測反應(yīng)體系熒光值變化量來定量計(jì)算出其中的Cas12a蛋白濃度以及對應(yīng)的Cas12a蛋白反式切割活性單位。5試劑和材料5.1水符合GB/T6882規(guī)定的無核酸酶的一級水、分子級水。5.210×活性檢測緩沖液用萬分之一電子天平精密稱取0.29g亞精胺，6.30g三羥甲基氨基甲烷，0.57g氯化鎂，0.15g二硫蘇糖醇，3.00g甘氨酸，5.08g聚乙二醇20000，用0.5-10μL量程的移液器量取10μLTriton?X-100，溶于無核酸酶的一級水中，用稀鹽酸調(diào)至溫度為25℃時(shí)pH8.5，混勻后，定容至100mL。5.310×退火緩沖液用萬分之一電子天平精密稱取0.13g硫酸銨，0.15g氯化鉀，0.02g硫酸鎂，0.32g三羥甲基氨基甲烷，溶于無核酸酶的一級水中，用稀鹽酸調(diào)至溫度為25℃時(shí)pH8.3，混勻后，定容至100mL。5.41μmol/LCas12a蛋白工作溶液用0.5-10μL量程的移液器精密量取10μL10μmol/LCas12a蛋白溶液,溶于90μL1×活性檢測緩沖液中，充分混勻。5.51μmol/LcrRNA溶液用0.5-10μL量程的移液器精密量取2μL100μmol/LcrRNA溶液,溶于198μL無核酸酶的一級水中。crRNA序列為5'-AAUUUCUACUCUUGUAGAUUUAUCGCAACUUUCUACUGAAUU-3'。5.6100nmol/L靶標(biāo)雙鏈DNA溶液用0.5-10μL量程的移液器精密量取50μL10μmol/L正向引物,10μL10μmol/L反向引物,在1×退火緩沖液中退火，95℃反應(yīng)2分鐘，以0.1℃/秒的速率緩慢降到25℃,用無核酸酶的一級水稀釋成100nmol/L。正向引物序列5'-GTTGTAAAACGACGGCCAGTTTTGTTATCGCAACTTTCTACTGAATTCGG-3'；反向引物序列5'-CCGAATTCAGTAGAAAGTTGCGATAACAAAACTGGCCGTCGTTTTACAAC-3'。5.75μmol/L單鏈DNA熒光報(bào)告探針溶液用0.5-10μL量程的移液器精密量取10μL100μmol/L單鏈DNA熒光報(bào)告探針溶液,溶于190μL無核酸酶的一級水中。GB/TXXXXX-XXXX單鏈DNA熒光報(bào)告探針序列為5'(6)-FAM-CCCCCCCC-3'-BHQ1。6儀器設(shè)備掌式離心機(jī)（S1010E，SCILOGEX，美國）、萬分之一電子天平（ME403，METTLERTOLEDO，瑞士）、0.5-10μL移液器（Researchplus，Eppendorf，德國）、10-100μL移液器（Researchplus，Eppendorf，德國）、20-200μL移液器（Researchplus，Eppendorf，德國）、100-1000μL移液器（Researchplus，Eppendorf，德國）。7試驗(yàn)步驟7.1建立Cas12a蛋白反式切割活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線7.1.1根據(jù)表1的配制方法將單鏈DNA熒光報(bào)告探針母液進(jìn)行連續(xù)2倍梯度稀釋，得到2500.00nmol/L、1250.00nmol/L、625.00nmol/L、312.50nmol/L、156.25nmol/L、78.13nmol/L、39.06nmol/L和19.53nmol的8個(gè)濃度梯度工作液，以相同體積的無RNA酶超純水作為空白對照。表1單鏈DNA熒光報(bào)告探針工作液濃度梯度稀釋表2500.00(S1)1234567GB/TXXXXX-XXXX7.1.2按照表2所示各組分用量進(jìn)行冰上操作，在PCR管中配置反式切割活性測定反應(yīng)體系。分為兩組：切割組，均含有靶標(biāo)雙鏈DNA溶液，下設(shè)各單鏈DNA熒光報(bào)告探針梯度工作液的反應(yīng)以及空白對照反應(yīng)；不切割組，均不含有靶標(biāo)雙鏈DNA溶液，下設(shè)各單鏈DNA熒光報(bào)告探針梯度工作液的反應(yīng)以及空白對照反應(yīng)，每個(gè)濃度做3個(gè)平行重復(fù)。配制完成后在旋渦混勻器混勻10秒，在掌上離心機(jī)上離心數(shù)秒使反應(yīng)液全部聚于底部。表2Cas12a蛋白反式切割標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)體系中各組分含量表228088————7.1.3將裝有反應(yīng)液的PCR管置于熒光定量PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)溫度為37℃,每隔15秒采集一次熒光信號，連續(xù)收集30分鐘。7.2Cas12a蛋白反式切割活性測定7.2.1根據(jù)表3的配制方法用1×活性檢測緩沖液將Cas12a蛋白進(jìn)行連續(xù)2倍梯度稀釋，得到10.000nmol/L、5.000nmol/L、2.500nmol/L、1.250nmol/L、0.625nmol/L、0.313nmol/L的6個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度做3個(gè)平行重復(fù)，以相同體積的無核酸酶的一級水作為空白對照。表3蛋白量稀釋梯度表7.2.2按照表4所示各組分用量進(jìn)行冰上操作，在PCR管中配置反式切割活性測定反應(yīng)體系。GB/TXXXXX-XXXX表4切割反應(yīng)液配比282————7.2.3將裝有反應(yīng)液的PCR管置于熒光定量PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)溫度為37℃,每隔15秒采集一次熒光信號，連續(xù)收集30分鐘。8試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理8.1Cas12a蛋白反式切割活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作8.1.1已發(fā)生反式切割反應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作8.1.1.1將含有靶標(biāo)雙鏈DNA的實(shí)驗(yàn)組稱為已發(fā)生反式切割反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組，選取不同濃度梯度單鏈DNA熒光報(bào)告探針和空白對照的平臺(tái)期的熒光值，并計(jì)算空白對照組的平均熒光值。8.1.1.2將各濃度梯度已被切割的單鏈DNA熒光報(bào)告探針的熒光值減掉空白對照的平均熒光值，得到各濃度梯度已被切割的單鏈DNA熒光報(bào)告探針的凈熒光值。8.1.1.3計(jì)算各濃度梯度已被切割的單鏈DNA熒光報(bào)告探針凈熒光值的平均值Fcl。8.1.1.4以各濃度梯度已被切割的單鏈DNA熒光報(bào)告探針的濃度值(nmol/L)為X軸，以各濃度梯度已被切割的單鏈DNA熒光報(bào)告探針的凈熒光值的平均值Fcl為Y軸繪制散點(diǎn)圖，并做線性擬合，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到如下圖1所示的已發(fā)生反式切割反應(yīng)實(shí)驗(yàn)組標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其中R2≥0.99。GB/TXXXXX-XXXX由圖1所得，已發(fā)生反式切割反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組線性方程擬合曲線的斜率scl=20.1340。8.1.2未發(fā)生反式切割反應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作8.1.2.1將不含有靶標(biāo)雙鏈DNA的實(shí)驗(yàn)組稱為未發(fā)生反式切割反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組，選取不同濃度梯度單鏈DNA熒光報(bào)告探針和空白對照的平臺(tái)期的熒光值，并計(jì)算空白對照組的平均熒光值。8.1.2.2將各濃度梯度未切割的單鏈DNA熒光報(bào)告探針的熒光值減掉空白對照的平均熒光值，得到各濃度梯度未切割的單鏈DNA熒光報(bào)告探針的凈熒光值。8.1.2.3計(jì)算各濃度梯度未切割的單鏈DNA熒光報(bào)告探針凈熒光值的平均值Fucl。8.1.2.4以各濃度梯度未切割的單鏈DNA熒光報(bào)告探針的濃度值（nmol/L）為X軸，以各濃度梯度未切割的單鏈DNA熒光報(bào)告探針的凈熒光值的平均值Fucl為Y軸繪制散點(diǎn)圖，并做線性擬合，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到如下圖2所示的未發(fā)生反式切割反應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中R2≥0.99。GB/TXXXXX-XXXX由圖2所得，未發(fā)生反式切割反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組線性方程擬合曲線的斜率sucl=0.3347。8.2Cas12a蛋白反式切割活性的測定和計(jì)算8.2.1被切割的單鏈DNA熒光報(bào)告探針濃度cclt的計(jì)算在不同濃度Cas12a蛋白反式切割活性反應(yīng)中，初始濃度為1000nmol/L的單鏈DNA熒光報(bào)告探針，某個(gè)時(shí)間t對應(yīng)的熒光信號值與被反式切割的單鏈DNA熒光報(bào)告探針的濃度的數(shù)據(jù)關(guān)系公式(1)如下：式中：Ccl(t)——某個(gè)時(shí)間點(diǎn)t時(shí)被切割的單鏈DNA熒光報(bào)告探針的濃度，單位為納摩爾每升(nmol/L)；F(t)——某個(gè)時(shí)間點(diǎn)t時(shí)的熒光信號值，單位為相對熒光單位(RFU)；C0——單鏈DNA熒光報(bào)告探針的初始濃度，即為1000納摩爾每升(nmol/L)；Scl——已發(fā)生反式切割反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組線性方程擬合曲線的斜率，其值為20.1340；Sucl——未發(fā)生反式切割反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組線性方程擬合曲線的斜率，其值為0.3347。8.2.2Cas12a蛋白反式切割活性的計(jì)算8.2.2.1根據(jù)公式（1）將所得原始熒光信號值換算為底物即單鏈DNA熒光報(bào)告探針的消耗量，并依據(jù)公式（2）計(jì)算不同濃度單鏈DNA熒光報(bào)告探針的熒光曲線的最大反應(yīng)速度作為初速度V0：GB/TXXXXX-XXXX式中：V0——初速度，這里取不同濃度單鏈DNA熒光報(bào)告探針熒光曲線的最大速度作為初速度，單位為皮摩爾每分鐘(pmol/min)；n——采樣次數(shù)，共120次采樣，但第120個(gè)點(diǎn)無法計(jì)算速度，只取到n=119；Cp(n)——第n個(gè)循環(huán)時(shí)底物消耗量，即n個(gè)循環(huán)時(shí)單鏈DNA熒光報(bào)告探針的消耗量，單位為皮摩爾(pmol)；?T——采樣間隔時(shí)間，單位為分鐘(min)。8.2.2.2以所用不同濃度的Cas12a蛋白用量[E](pmol)為橫坐標(biāo)X軸，對應(yīng)濃度的Cas12a反式切割反應(yīng)熒光曲線的初速度V0(pmol/min)為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖。并選取Cas12a蛋白用量為0.0800pmol、0.0400pmol、0.0