GB/T××××—201×

生物活性肽抗菌性測定方法抑菌圈法

1范圍

本標準規(guī)定了抑菌圈測定生物活性肽抗菌性能的方法。

本標準適用于生物活性肽抗細菌和抗絲狀真菌性能測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T4789.2食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

生物活性肽bioactivepeptide

對生物體的生命活動具有特定調(diào)控作用的肽類化合物。

3.2

抑菌圈zoneofmicrobialinhibition

固體培養(yǎng)基表面與試樣接觸邊界處無菌繁殖的環(huán)帶區(qū)域。

4原理

利用生物活性肽在固體平板中與測試指示菌接觸后，使其周圍的菌株生長受到抑制，形成無菌繁殖區(qū)

域，根據(jù)測試菌在固體平板表面表現(xiàn)出的生長程度可確定抗菌肽的抑菌能力。

5試劑或材料

除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。

5.1水：GB/T6682二級。

5.20.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6.0

稱取35.8g磷酸氫二鈉和13.8g磷酸二氫鈉于容量瓶中，蒸餾水溶解，定容至1000mL。121℃±1℃高壓

蒸汽滅菌20min。

5.30.85%（w/v）生理鹽水

稱取8.5g氯化鈉于容量瓶中，蒸餾水溶解，定容至1000mL。121℃±1℃高壓蒸汽滅菌20min。

5.4培養(yǎng)基，參見附錄A。

6儀器設備

6.1恒溫培養(yǎng)箱，溫度范圍為5℃～50℃。

6.2恒溫振蕩器。

6.3電子天平，感量值為0.0001g和0.01g。

6.4分光光度計，波長范圍為190nm～900nm。

6.5血球計數(shù)板，規(guī)格為16格×25格或25格×16格。

6.6游標卡尺或抑菌圈測量儀，精度0.1～0.01mm。

2

GB/T××××—201×

7測定

7.1抗細菌性能

見附錄B。

7.2抗絲狀真菌性能

見附錄C。

8結果計算

抗菌性按式（1）計算：

1

U=

X

V100

……………………...（1）

式中：

U——抗菌性（AU/mg）；

V——牛津杯中所加生物活性肽的體積（mL）；

X0——生物活性肽濃度對數(shù)值與抑菌圈直徑所得線性方程的X軸截距；

10X0——X軸截距所對應的生物活性肽濃度（mg/mL）；

計算結果以平行測定值的算術平均值表示，保留三位有效數(shù)字。

9重復性

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

3

GB/T××××—201×

附錄A

（資料性附錄）

培養(yǎng)基

A.1營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NutrientBroth，NB）

蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化鈉5g

蒸餾水1000mL

將上述各成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，分裝后于高壓蒸汽滅菌器中，121℃±1℃

滅菌20min。

可采用市售的商業(yè)培養(yǎng)基，使用時嚴格遵照制造商的使用說明。

A.2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NutrientAgar，NA）

蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化鈉5g

瓊脂15g

蒸餾水1000mL

將上述各成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，分裝后于高壓蒸汽滅菌器中，121℃±1℃

滅菌20min。

可采用市售的商業(yè)培養(yǎng)基，使用時嚴格遵照制造商的使用說明。

A.3馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PotatoDextroseAgar，PDA）

馬鈴薯（去皮切塊）200g

葡萄糖20g

瓊脂15g

蒸餾水1000mL

pH5.4-5.8

將馬鈴薯去皮切塊，加1000mL蒸餾水，煮沸10min~20min。用紗布過濾，補加蒸餾水至1000mL。

加入葡萄糖和瓊脂，加熱溶化，分裝，121℃±1℃滅菌20min。

可采用市售的商業(yè)培養(yǎng)基，使用時嚴格遵照制造商的使用說明。

4

GB/T××××—201×

附錄B

（規(guī)范性附錄）

抗細菌性能測定

B.1指示菌標準菌株

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）ATCC25923、藤黃微球菌（Micrococcusluteus）ATCC10240、

蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）ATCC11778。大腸桿菌（Escherichiacoli）ATCC25922、鼠傷寒沙門氏

菌（Salmonellatyphimurium）ATCC14028、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）ATCC9027。

注：根據(jù)樣本的使用要求，可以選擇其他菌種或菌株作為試驗指示菌，但所有的試驗菌株均應選擇來自國家級菌種保藏

中心的標準菌株或具有資質(zhì)的菌種保藏機構提供的分類地位明確的菌株。

B.2樣品制備

B.2.1待檢測樣品

精確稱取生物活性肽樣本0.1000g，溶于1.0mL無菌緩沖溶液中，充分混合均勻，使其濃度為100mg/mL，

作為儲備液，4℃~6℃冰箱中保存?zhèn)溆?。使用時，將生物活性肽儲備液進行稀釋，分別制備成至少5個不

同濃度的待測溶液，使其抑菌圈直徑處于10.0mm~25.0mm范圍內(nèi)。

B.2.2空白對照樣品

以未添加生物活性肽的溶液作為空白對照樣品。

B.2.3陽性對照樣品

考察生物活性肽對革蘭氏陽性菌的抗菌性能，以桿菌肽標準品（CAS：1405-87-4）作為陽性對照品；

考察多肽對革蘭氏陰性菌的抗菌性能，以硫酸多粘菌素B標準品（CAS：1405-20-5）作為陽性對照品。

B.3指示菌懸液制備

B.3.1菌種活化

將B.1中的指示菌分別接種于5mLNB培養(yǎng)基的試管，37℃±1℃、200r/min±1r/min，培養(yǎng)18h~24

h進行第一次傳代培養(yǎng)；挑取1環(huán)~2環(huán)第一代培養(yǎng)液于5mLNB培養(yǎng)基的試管，37℃±1℃、200r/min

±1r/min，恒溫培養(yǎng)18h~24h進行第二次傳代培養(yǎng)；取第二代培養(yǎng)液以1%的接種量接種于5mLNB培養(yǎng)

基的試管或50mLNB培養(yǎng)基的錐形瓶，37℃±1℃、200r/min±1r/min，恒溫培養(yǎng)12h~14h，至指示菌

的穩(wěn)定期，作為第三代培養(yǎng)液，備用。

B.3.2菌種純度檢測

分別挑取B.3.1的第三代培養(yǎng)液，劃線接種于NA培養(yǎng)基平板，37℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，觀察純

度。

B.3.3菌懸液制備

將B.3.1制備的第三代培養(yǎng)液用NB培養(yǎng)基調(diào)整至吸光度為0.1~0.5（OD600），按照GB/T4789.2進行

平板活菌計數(shù)，測定指示菌的活菌數(shù)；采用0.85%生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液，使其濃度為1×108cfu/mL~5×108

cfu/mL，備用。

B.4檢測平板制備

將配制的NA培養(yǎng)基加熱溶解，冷卻至45℃~50℃，將B.3.3制備的指示菌菌懸液按照1%的添加量

加入到NA培養(yǎng)基中，充分混和均勻，量取15mL傾倒入直徑90mm、高16mm~17mm的平底平皿，輕

輕搖動平板使之均勻鋪平，待其凝固后備用。

5

GB/T××××—201×

B.5測定

在B.4制備的含指示菌的檢測平板中等距離安放5個~6個牛津杯，輕輕按壓，量取B.2.1中制備的生

物活性肽樣品100μL，緩緩加入牛津杯中，將平板移入4℃~6℃冰箱中預擴散6h~10h，取出平板，放入

37℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中，正置培養(yǎng)12h~24h至抑菌圈清晰，采用游標卡尺或抑菌圈測量儀測定抑菌圈直

徑，每個抑菌圈沿不同方向測量三次，并記錄平均值。

測定多肽抗菌性時，同時分別設置空白對照組和陽性對照組?？瞻讓φ战M：采用PBS溶液替代多肽溶

液；陽性對照組：分別采用桿菌肽或硫酸多粘菌素B替代多肽溶液。

以生物活性肽濃度的對數(shù)值為自變量（橫坐標），以濃度對應的抑菌圈直徑為因變量（縱坐標），建立

生物活性肽濃度和其抑菌圈直徑的線性方程。

若生物活性肽試驗組和陽性對照組均表現(xiàn)出抑菌圈，則判定該生物活性肽樣品中存在抗菌活性物質(zhì)。

6

GB/T××××—201×

附錄C

（規(guī)范性附錄）

抗絲狀真菌性能測定

C.1指示菌標準菌株

黑曲霉（Aspergillusniger）ATCC16404、產(chǎn)黃青霉（Penicilliumchrysogenum）ATCC10106。

注：根據(jù)樣本的使用要求，可以選擇其他菌種或菌株作為試驗指示菌，但所有的試驗菌株均應選擇來自國家級菌種保藏

中心的標準菌株或具有資質(zhì)的菌種保藏機構提供的分類地位明確的菌株。

C.2樣品制備

C.2.1待檢測樣品

同B.2.1。

C.2.2空白對照樣品

同B.2.2。

C.2.3陽性對照樣品

以硫酸多粘菌素B標準品（CAS：1405-20-5）硫酸多粘菌素B為陽性對照品，其制備同B.2.3。

C.3指示菌孢子懸液制備

C.3.1菌種活化

將C.1保藏的指示菌分別挑取1環(huán)~2環(huán)孢子或菌液，接種于PDA培養(yǎng)基的固體平板上，28℃~30℃

恒溫培養(yǎng)48h~72h，作為第一代培養(yǎng)液；挑取1環(huán)~2環(huán)孢子接種于PDA培養(yǎng)基的固體平板上，28℃~30℃

恒溫培養(yǎng)48h~72h，作為第二代培養(yǎng)液；再次挑取1環(huán)~2環(huán)孢子接種于PDA培養(yǎng)基的固體平板上，28℃

~30℃恒溫培養(yǎng)48h~72h，第三代培養(yǎng)液，備用。

C.3.2菌種純度檢測

分別挑取C.3.1的第三代培養(yǎng)液，劃線接種于PDA培養(yǎng)基平板，28℃~30℃培養(yǎng)24h~48h，觀察純

度。

C.3.3孢子懸液制備

將C.3.1中培養(yǎng)的指示菌用0.85%生理鹽水洗脫孢子，血球計數(shù)板計數(shù)，采用0.85%生理鹽水將孢子懸

液濃度調(diào)整至1×106個/mL~5×106個/mL，備用。

C.4檢測平板制備

將配制的PDA培養(yǎng)基加熱溶解，冷卻至45℃~50℃，將C.3.3制備的指示菌孢子懸液按照1%的添

加量加入到PDA培養(yǎng)基中，充分混和均勻，量取15mL傾倒入直徑90mm、高16mm~17mm的平底平皿，

輕輕搖動平板使之均勻鋪平，待其凝固后備用。

C.5測定

在C.4制備的含指示菌的檢測平板中等距離安放5個~6個牛津杯，輕輕按壓，量取C.2.1中制備的多

肽樣品100μL，緩緩加入牛津杯中，將平板移入4℃~6℃冰箱中預擴散6h~10h，取出平板，放入28℃

~30℃恒溫培養(yǎng)箱中，正置培養(yǎng)18h~24h至抑菌圈清晰，此時指示菌為菌苔狀，基本還未形成菌絲；采

用游標卡尺或抑菌圈測量儀測定抑菌圈直徑，每個抑菌圈沿不同方向測量三次，并記錄平均值。

測定多肽抗菌性時，同時分別設置空白對照組和陽性對照組?？瞻讓φ战M：采用PBS溶液替代多肽溶

液；陽性對照組：采用硫酸多粘菌素B替代多肽溶液。

7

GB/T××××—201×

以生物活性肽濃度的對數(shù)值為自變量（橫坐標），以濃度對應的抑菌圈直徑為因變量（縱坐標），建立

生物活性肽濃度和其抑菌圈直徑的線性方程。

若生物活性肽試驗組和陽性對照組均表現(xiàn)出抑菌圈，則判定該生物活性肽樣品中存在抗菌活性物質(zhì)。

__________________________

8

ICS07.080

A40

中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—201X

生物活性肽抗菌性測定方法抑菌圈法

Testmethodofantimicrobialactivityforbioactivepeptide—Inhibitionzone

method

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實施

國家市場監(jiān)督管理總局

發(fā)布

中國國家標準化管理委員會

1

GB/T××××—201×

生物活性肽抗菌性測定方法抑菌圈法

1范圍

本標準規(guī)定了抑菌圈測定生物活性肽抗菌性能的方法。

本標準適用于生物活性肽抗細菌和抗絲狀真菌性能測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T4789.2食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

生物活性肽bioactivepeptide

對生物體的生命活動具有特定調(diào)控作用的肽類化合物。

3.2

抑菌圈zoneofmicrobialinhibition

固體培養(yǎng)基表面與試樣接觸邊界處無菌繁殖的環(huán)帶區(qū)域。

4原理

利用生物活性肽在固體平板中與測試指示菌接觸后，使其周圍的菌株生長受到抑制，形成無菌繁殖區(qū)

域，根據(jù)測試菌在固體平板表面表現(xiàn)出的生長程度可確定抗菌肽的抑菌能力。

5試劑或材料

除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。

5.1水：GB/T6682二級。

5.20.1mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6.0

稱取35.8g磷酸氫二鈉和13.8g磷酸二氫鈉于容量瓶中，蒸餾水溶解，定容至1000mL。121℃±1℃高壓

蒸汽滅菌20min。

5.30.85%（w/v）生理鹽水

稱取8.5g氯化鈉于容量瓶中，蒸餾水溶解，定容至1000mL。121℃±1℃高壓蒸汽滅菌20min。

5.4培養(yǎng)基，參見附錄A。

6儀器設備

6.1恒溫培養(yǎng)箱，溫度范圍為5℃～50℃。

6.2恒溫振蕩器。

6.3電子天平，感量值為0.0001g和0.01g。

6.4分光光度計，波長范圍為190nm～900nm。

6.5血球計數(shù)板，規(guī)格為16格×25格或25格×16格。

6.6游標卡尺或抑菌圈測量儀，精度0.1～0.01mm。

2

GB/T××××—201×

7測定

7.1抗細菌性能

見附錄B。

7.2抗絲狀真菌性能

見附錄C。

8結果計算

抗菌性按式（1）計算：

1

U=

X

V100

……………………...（1）

式中：

U——抗菌性（AU/mg）；

V——牛津杯中所加生物活性肽的體積（mL）；

X0——生物活性肽濃度對數(shù)值與抑菌圈直徑所得線性方程的X軸截距；

10X0——X軸截距所對應的生物活性肽濃度（mg/mL）；

計算結果以平行測定值的算術平均值表示，保留三位有效數(shù)字。

9重復性

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

3