低氧HIFα通路在小鼠骨發(fā)育中的核心作用與調(diào)控密碼解析一、引言1.1研究背景與意義在生物體內(nèi)，細(xì)胞對(duì)氧氣的感知和反應(yīng)是一個(gè)至關(guān)重要的過(guò)程，它在多種生理和病理狀態(tài)中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。低氧誘導(dǎo)因子（HypoxiaInducibleFactor，HIF）及其調(diào)節(jié)子VonHippel-Lindautumorsuppressorprotein（pVHL）構(gòu)成了這一過(guò)程的主要調(diào)控體系。HIF作為一種具有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在低氧環(huán)境下被激活，能夠啟動(dòng)一系列基因的轉(zhuǎn)錄程序，這些基因編碼的蛋白質(zhì)參與了低氧穩(wěn)態(tài)反應(yīng)，涵蓋了從葡萄糖代謝、細(xì)胞增殖到血管生成等多個(gè)關(guān)鍵生理過(guò)程。在腫瘤領(lǐng)域，HIF1-Alpha在腫瘤細(xì)胞的低氧反應(yīng)中扮演著重要媒介角色，它能夠上調(diào)許多對(duì)實(shí)體瘤擴(kuò)張至關(guān)重要的因子，其中血管生成因子VEGF（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）尤為突出，VEGF的上調(diào)促進(jìn)了腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供了必要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，對(duì)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。在骨發(fā)育過(guò)程中，氧氣水平呈現(xiàn)出急劇且動(dòng)態(tài)的變化特征。從胚胎期骨骼發(fā)育起始，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）聚集階段，到軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中軟骨細(xì)胞的增殖、肥大以及血管侵入和骨化中心形成等一系列復(fù)雜步驟，氧氣的分布和含量都在精細(xì)地調(diào)控著細(xì)胞的行為和命運(yùn)。例如，在肢體骨發(fā)育早期，表達(dá)同源盒基因1（Prx1）的細(xì)胞中，HIF-1α的缺失會(huì)導(dǎo)致MSCs分化為軟骨細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞終末分化過(guò)程出現(xiàn)延遲。這一現(xiàn)象暗示了HIF-1α在早期肢體骨發(fā)育進(jìn)程中，對(duì)MSCs存活以及軟骨細(xì)胞增殖和分化的緊密調(diào)控作用。而在骨化中心形成階段，軟骨細(xì)胞與周圍骨母細(xì)胞共同產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），刺激血管向內(nèi)生長(zhǎng)，這一過(guò)程同樣受到低氧信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)節(jié)，體現(xiàn)了低氧環(huán)境下HIF通路對(duì)血管生成和骨化進(jìn)程的關(guān)鍵影響。骨骼疾病嚴(yán)重影響著人類的健康和生活質(zhì)量，如骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、骨發(fā)育不全等，給患者帶來(lái)了巨大的痛苦，也給社會(huì)醫(yī)療資源造成了沉重負(fù)擔(dān)。以骨質(zhì)疏松癥為例，全球范圍內(nèi)患病人數(shù)眾多，隨著老齡化社會(huì)的加劇，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，患者的骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，嚴(yán)重降低了患者的生活自理能力和生活質(zhì)量。而在骨關(guān)節(jié)炎患者中，關(guān)節(jié)軟骨的退變和損傷引發(fā)疼痛、腫脹和功能障礙，嚴(yán)重影響患者的日?；顒?dòng)和工作能力。目前，針對(duì)這些骨骼疾病的治療手段存在諸多局限性，傳統(tǒng)藥物治療往往只能緩解癥狀，無(wú)法從根本上逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展，手術(shù)治療則存在創(chuàng)傷大、恢復(fù)周期長(zhǎng)以及并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題。深入研究低氧HIFα通路在小鼠骨發(fā)育中的作用及其調(diào)控機(jī)制，具有極其重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從科學(xué)研究角度來(lái)看，它有助于我們從分子和細(xì)胞層面深入理解骨發(fā)育的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，揭示低氧環(huán)境如何通過(guò)HIFα通路精確調(diào)控骨細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成和重塑等關(guān)鍵事件，進(jìn)一步完善骨發(fā)育的理論體系，為發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域提供新的研究思路和方向。在臨床應(yīng)用方面，該研究成果有望為骨骼疾病的治療開辟新的途徑。通過(guò)明確低氧HIFα通路在骨發(fā)育異常和疾病中的作用機(jī)制，我們可以將其關(guān)鍵分子作為潛在的治療靶點(diǎn)，開發(fā)出更加精準(zhǔn)、有效的治療藥物和干預(yù)策略。例如，針對(duì)骨質(zhì)疏松癥患者，有可能通過(guò)調(diào)節(jié)HIFα通路來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，抑制破骨細(xì)胞的過(guò)度骨吸收，從而增加骨量，改善骨質(zhì)量；對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎患者，或許可以通過(guò)干預(yù)HIFα通路來(lái)保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，延緩軟骨退變，減輕炎癥反應(yīng)，為這些患者帶來(lái)新的治療希望，提高他們的生活質(zhì)量，同時(shí)也有助于減輕社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在低氧HIFα通路的研究方面，國(guó)外起步較早且研究較為深入。Semenza等學(xué)者最早發(fā)現(xiàn)了低氧誘導(dǎo)因子HIF-1，揭示了細(xì)胞在低氧環(huán)境下通過(guò)HIF-1調(diào)節(jié)基因表達(dá)以適應(yīng)低氧的關(guān)鍵機(jī)制，為后續(xù)低氧相關(guān)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。此后，大量研究圍繞HIFα通路在腫瘤、心血管疾病等領(lǐng)域展開。在腫瘤研究中，明確了HIF-1α在腫瘤細(xì)胞低氧適應(yīng)中的核心作用，它可上調(diào)VEGF等基因促進(jìn)腫瘤血管生成，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移能力，相關(guān)研究成果為腫瘤的靶向治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。國(guó)內(nèi)對(duì)低氧HIFα通路的研究也取得了顯著進(jìn)展。眾多科研團(tuán)隊(duì)在基礎(chǔ)研究層面，深入探究了HIFα通路在不同組織和細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制。例如，在心血管系統(tǒng)研究中，發(fā)現(xiàn)HIF-1α可通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化氮合酶等基因的表達(dá)，參與血管舒縮和心肌保護(hù)等生理過(guò)程。在糖尿病并發(fā)癥研究中，揭示了HIF-1α通路異常激活與糖尿病視網(wǎng)膜病變、腎病等并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)，為糖尿病并發(fā)癥的防治提供了新的理論依據(jù)。在小鼠骨發(fā)育的研究領(lǐng)域，國(guó)外利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建了多種基因敲除或過(guò)表達(dá)小鼠模型，對(duì)骨發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路進(jìn)行了深入研究。通過(guò)這些模型，明確了成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞在骨發(fā)育中的作用機(jī)制，以及多種生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路如Wnt、BMP等對(duì)骨發(fā)育的調(diào)控作用。在對(duì)軟骨內(nèi)成骨過(guò)程的研究中，通過(guò)基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)了某些轉(zhuǎn)錄因子在軟骨細(xì)胞增殖、分化和肥大過(guò)程中的關(guān)鍵作用，進(jìn)一步完善了軟骨內(nèi)成骨的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。國(guó)內(nèi)在小鼠骨發(fā)育研究方面也緊跟國(guó)際前沿。運(yùn)用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)和影像學(xué)手段，對(duì)小鼠骨發(fā)育的不同階段進(jìn)行了細(xì)致觀察和分析。研究了環(huán)境因素如營(yíng)養(yǎng)、力學(xué)刺激等對(duì)小鼠骨發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)了一些新的調(diào)節(jié)因子和信號(hào)通路。通過(guò)對(duì)低鈣飲食小鼠骨發(fā)育的研究，揭示了鈣穩(wěn)態(tài)失衡對(duì)骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)和細(xì)胞功能的影響，為營(yíng)養(yǎng)相關(guān)性骨發(fā)育異常的防治提供了理論支持。然而，當(dāng)前關(guān)于低氧HIFα通路在小鼠骨發(fā)育中的研究仍存在一定不足。雖然已知HIFα通路在骨發(fā)育中發(fā)揮作用，但對(duì)于其在骨發(fā)育不同階段的具體作用機(jī)制尚未完全明確。在胚胎期骨骼發(fā)育早期，HIFα通路如何精確調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化以及軟骨細(xì)胞的早期增殖，仍缺乏深入的分子機(jī)制研究。在骨化中心形成階段，HIFα通路與其他信號(hào)通路如Notch、FGF等之間的相互作用和協(xié)同調(diào)控機(jī)制也有待進(jìn)一步闡明。在研究手段方面，目前多集中在基因敲除、過(guò)表達(dá)等傳統(tǒng)方法，對(duì)于新興技術(shù)如單細(xì)胞測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)等在該領(lǐng)域的應(yīng)用還不夠充分。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠深入分析不同骨細(xì)胞亞群在低氧環(huán)境下的基因表達(dá)特征和功能差異，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)則可揭示基因表達(dá)在骨組織空間位置上的分布規(guī)律，為全面理解低氧HIFα通路在骨發(fā)育中的作用提供更豐富的信息。此外，臨床轉(zhuǎn)化研究相對(duì)滯后。雖然在小鼠模型中取得了一些研究成果，但如何將這些基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為臨床治療骨骼疾病的有效方法和藥物，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。需要加強(qiáng)基礎(chǔ)研究與臨床實(shí)踐的結(jié)合，開展更多的臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證低氧HIFα通路相關(guān)靶點(diǎn)在治療骨骼疾病中的安全性和有效性。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究低氧HIFα通路在小鼠骨發(fā)育中的作用及其調(diào)控機(jī)制，具體研究目的包括：明確低氧HIFα通路在小鼠骨發(fā)育不同階段的具體作用，揭示其對(duì)骨細(xì)胞增殖、分化、凋亡等關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程的影響；解析低氧HIFα通路在小鼠骨發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制，包括通路內(nèi)各分子之間的相互作用以及與其他信號(hào)通路的交互調(diào)控；探討低氧HIFα通路與骨疾病的關(guān)系，為骨骼疾病的治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究將開展以下內(nèi)容：低氧HIFα通路在小鼠骨發(fā)育中的作用研究：通過(guò)構(gòu)建小鼠骨發(fā)育模型，運(yùn)用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)低氧HIFα通路中的關(guān)鍵基因進(jìn)行敲除或過(guò)表達(dá)操作。在小鼠胚胎期、出生后早期及成年期等不同發(fā)育階段，收集骨組織樣本，利用免疫熒光、Westernblotting等技術(shù)，檢測(cè)HIFα及其下游通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平和定位情況。結(jié)合組織學(xué)染色、骨密度測(cè)量、骨微結(jié)構(gòu)分析等方法，觀察骨組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)和骨量的變化，從而明確低氧HIFα通路在小鼠骨發(fā)育各階段的具體作用。低氧HIFα通路的調(diào)控機(jī)制研究：采用RNA測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)，對(duì)不同發(fā)育階段、不同基因編輯狀態(tài)下的小鼠骨組織進(jìn)行全基因組表達(dá)譜分析。篩選出與低氧HIFα通路相關(guān)的差異表達(dá)基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)潛在的調(diào)控因子和信號(hào)通路。運(yùn)用基因沉默、過(guò)表達(dá)、基因敲入等技術(shù)，對(duì)篩選出的關(guān)鍵基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）等實(shí)驗(yàn)，研究關(guān)鍵基因與低氧HIFα通路核心分子之間的直接相互作用關(guān)系，明確其在調(diào)控通路中的具體作用機(jī)制。低氧HIFα通路與骨疾病的關(guān)系研究：建立常見骨疾病小鼠模型，如骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎等，通過(guò)藥物干預(yù)、基因治療等手段，調(diào)節(jié)低氧HIFα通路的活性。利用影像學(xué)技術(shù)，如micro-CT、MRI等，動(dòng)態(tài)觀察骨疾病模型小鼠骨組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。檢測(cè)骨代謝相關(guān)指標(biāo)，如骨鈣素、堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶等，評(píng)估骨疾病的發(fā)展進(jìn)程。分析低氧HIFα通路在骨疾病模型小鼠中的表達(dá)變化，以及通路活性改變對(duì)骨疾病進(jìn)程的影響，探討其作為骨疾病治療靶點(diǎn)的可行性和潛在價(jià)值。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究將采用多種研究方法，以確保全面深入地探究低氧HIFα通路在小鼠骨發(fā)育中的作用及其調(diào)控機(jī)制。小鼠骨發(fā)育模型的建立：選用C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建低氧HIFα通路關(guān)鍵基因敲除或過(guò)表達(dá)小鼠模型。如運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，針對(duì)HIF-1α、HIF-2α等基因設(shè)計(jì)特異性sgRNA，通過(guò)顯微注射將sgRNA和Cas9核酸酶導(dǎo)入小鼠受精卵，獲得基因編輯的F0代小鼠。將F0代小鼠與野生型小鼠交配，篩選出F1代雜合子小鼠，再通過(guò)自交獲得F2代純合子基因敲除或過(guò)表達(dá)小鼠。同時(shí)，設(shè)立正常野生型小鼠作為對(duì)照組，以對(duì)比分析低氧HIFα通路改變對(duì)小鼠骨發(fā)育的影響。分子生物學(xué)技術(shù)：在不同發(fā)育階段，如胚胎期E13.5、E15.5，出生后1周、2周、4周等時(shí)間點(diǎn)，收集小鼠骨組織樣本。運(yùn)用免疫熒光技術(shù)，使用針對(duì)HIFα、VEGF、SOX9等蛋白的特異性抗體，標(biāo)記骨組織切片中的目標(biāo)蛋白，通過(guò)熒光顯微鏡觀察其在骨組織中的定位和表達(dá)情況。采用Westernblotting技術(shù)，提取骨組織總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用相應(yīng)抗體檢測(cè)HIFα及其下游通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平，以明確低氧HIFα通路在小鼠骨發(fā)育各階段的激活狀態(tài)。利用Real-timePCR技術(shù)，提取骨組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以特定引物對(duì)HIFα通路相關(guān)基因以及骨發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)檢測(cè)基因的mRNA表達(dá)量，分析基因表達(dá)的變化趨勢(shì)。生物信息學(xué)分析：對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用DESeq2等軟件篩選出差異表達(dá)基因。通過(guò)GO（GeneOntology）富集分析，明確差異表達(dá)基因在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能等方面的富集情況，如判斷其是否主要富集在骨發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、血管生成等相關(guān)過(guò)程。運(yùn)用KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路富集分析，確定差異表達(dá)基因參與的主要信號(hào)通路，探究低氧HIFα通路與其他信號(hào)通路之間的潛在聯(lián)系。構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件，分析低氧HIFα通路相關(guān)蛋白與其他蛋白之間的相互作用關(guān)系，篩選出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白，為進(jìn)一步研究通路調(diào)控機(jī)制提供線索。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：首先構(gòu)建小鼠骨發(fā)育模型，包括基因編輯小鼠和正常野生型小鼠；然后在不同發(fā)育階段收集骨組織樣本，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)情況；同時(shí)，對(duì)骨組織進(jìn)行RNA-seq分析，并利用生物信息學(xué)方法深入挖掘數(shù)據(jù)，解析低氧HIFα通路在小鼠骨發(fā)育中的作用和調(diào)控機(jī)制；最后，建立骨疾病小鼠模型，研究低氧HIFα通路與骨疾病的關(guān)系，為骨骼疾病治療提供理論依據(jù)。[此處插入技術(shù)路線圖1-1，圖中清晰展示從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇、模型構(gòu)建、樣本采集與處理、技術(shù)檢測(cè)到數(shù)據(jù)分析以及最終結(jié)果應(yīng)用的整個(gè)流程]二、低氧HIFα通路與小鼠骨發(fā)育相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1低氧HIFα通路概述2.1.1HIFα的結(jié)構(gòu)與功能低氧誘導(dǎo)因子（HIF）是細(xì)胞應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在維持機(jī)體氧穩(wěn)態(tài)和多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。HIF是由α亞基（HIFα）和β亞基（HIFβ）組成的異二聚體，其中HIFα亞基存在三種亞型，即HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上既有相似之處，又存在一定差異。從結(jié)構(gòu)上看，HIFα亞基包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。N端和C端分別存在反式激活結(jié)構(gòu)域（N-TAD和C-TAD），這些結(jié)構(gòu)域在HIFα與下游基因啟動(dòng)子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合以及招募轉(zhuǎn)錄共激活因子等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄激活。中間區(qū)域的堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）結(jié)構(gòu)域和Per-ARNT-Sim（PAS）結(jié)構(gòu)域?qū)τ贖IFα與HIFβ的異源二聚化至關(guān)重要，它們確保了HIF復(fù)合物的正確組裝，從而使其具備與DNA結(jié)合并調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力。此外，HIFα亞基還含有氧依賴降解結(jié)構(gòu)域（ODD），這一結(jié)構(gòu)域在常氧條件下會(huì)發(fā)生脯氨酸羥化修飾，進(jìn)而被E3泛素連接酶識(shí)別并介導(dǎo)其降解，是HIFα在常氧狀態(tài)下維持低水平表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域。在功能方面，HIFα在低氧感應(yīng)和基因調(diào)控中扮演著核心角色。當(dāng)細(xì)胞處于低氧環(huán)境時(shí)，氧氣供應(yīng)不足導(dǎo)致脯氨酰羥化酶（PHD）活性受到抑制，無(wú)法對(duì)HIFα的ODD結(jié)構(gòu)域進(jìn)行脯氨酸羥化修飾。此時(shí)，HIFα得以穩(wěn)定積累，并迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與組成型表達(dá)的HIFβ結(jié)合形成具有活性的HIF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。該復(fù)合物能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的HRE上，招募RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄程序，從而上調(diào)一系列與低氧適應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。這些靶基因編碼的蛋白質(zhì)參與了多個(gè)重要的生理過(guò)程，如血管生成、葡萄糖代謝、細(xì)胞增殖與存活等。以血管生成過(guò)程為例，HIFα激活后可上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，VEGF能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，促進(jìn)新血管的生成，從而增加組織的氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，以適應(yīng)低氧環(huán)境。在葡萄糖代謝方面，HIFα可調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）和乳酸脫氫酶A（LDHA）等基因的表達(dá)，促進(jìn)葡萄糖的攝取和糖酵解代謝，為細(xì)胞在低氧條件下提供能量。2.1.2低氧HIFα通路的激活與調(diào)控機(jī)制低氧HIFα通路的激活是細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的一種適應(yīng)性反應(yīng)，其激活過(guò)程受到精細(xì)的調(diào)控，涉及多個(gè)分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟。在常氧條件下，細(xì)胞內(nèi)的脯氨酰羥化酶（PHD）以氧氣作為底物，對(duì)HIFα的氧依賴降解結(jié)構(gòu)域（ODD）中的保守脯氨酸殘基（Pro-402和Pro-564）進(jìn)行羥基化修飾。這種修飾使得HIFα能夠被E3泛素連接酶復(fù)合物中的VonHippel-Lindau腫瘤抑制蛋白（pVHL）識(shí)別并結(jié)合。隨后，pVHL招募泛素結(jié)合酶（E2），將泛素分子連接到HIFα上，形成多聚泛素化的HIFα。多聚泛素化的HIFα被蛋白酶體識(shí)別并降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)HIFα的低水平表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞處于低氧環(huán)境時(shí)，氧氣濃度降低，PHD的活性受到抑制，無(wú)法對(duì)HIFα進(jìn)行有效的羥基化修飾。此時(shí)，HIFα不會(huì)被pVHL識(shí)別和泛素化降解，從而在細(xì)胞內(nèi)迅速積累。積累的HIFα與組成型表達(dá)的HIFβ在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合，形成具有活性的HIF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。該復(fù)合物進(jìn)一步與下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄共激活因子，如CREB結(jié)合蛋白（CBP）/p300等，啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，上調(diào)一系列低氧應(yīng)答基因的表達(dá)，從而使細(xì)胞能夠適應(yīng)低氧環(huán)境。低氧HIFα通路的調(diào)控機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，除了上述氧依賴的調(diào)控方式外，還存在多種其他調(diào)控機(jī)制。在翻譯后修飾層面，HIFα的活性還受到磷酸化、乙?；刃揎椀恼{(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶A（PKA）可以磷酸化HIF-1α的C-TAD結(jié)構(gòu)域，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性；而乙?；揎梽t可以影響HIFα與其他蛋白的相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性和活性。在轉(zhuǎn)錄水平，多種轉(zhuǎn)錄因子參與了對(duì)HIFα基因表達(dá)的調(diào)控。如核因子-κB（NF-κB）在炎癥等刺激下被激活，能夠結(jié)合到HIF-1α基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使細(xì)胞在炎癥和低氧雙重應(yīng)激條件下更好地適應(yīng)環(huán)境變化。一些微小RNA（miRNA）也參與了對(duì)HIFα通路的調(diào)控。miR-125b可以直接結(jié)合到HIF-1αmRNA的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）序列上，抑制其翻譯過(guò)程，從而降低HIF-1α蛋白的表達(dá)水平，在肝細(xì)胞癌對(duì)經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（TACE）抵抗中發(fā)揮重要調(diào)控作用。低氧HIFα通路還與其他信號(hào)通路存在廣泛的交互調(diào)控。與PI3K/Akt信號(hào)通路相互作用，在生長(zhǎng)因子等刺激下，PI3K被激活，進(jìn)而磷酸化激活A(yù)kt。Akt可以通過(guò)磷酸化抑制結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1/2（TSC1/2）的活性，促進(jìn)mTORC1的激活，從而增強(qiáng)HIFα的翻譯過(guò)程。此外，Akt還可以直接磷酸化HIFα，增強(qiáng)其穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，使細(xì)胞在低氧和生長(zhǎng)因子刺激下更好地協(xié)調(diào)代謝和增殖等過(guò)程。二、低氧HIFα通路與小鼠骨發(fā)育相關(guān)理論基礎(chǔ)2.2小鼠骨發(fā)育過(guò)程2.2.1小鼠骨發(fā)育的階段劃分小鼠骨發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜且有序的過(guò)程，可大致劃分為胚胎期、出生后及成年期等不同階段，每個(gè)階段都有其獨(dú)特的發(fā)育特點(diǎn)和生物學(xué)事件。胚胎期骨發(fā)育：在胚胎期，小鼠骨骼的發(fā)育起始于間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的聚集和分化。大約在胚胎期第10.5天（E10.5），MSCs開始在特定部位聚集，形成骨骼的原基。隨后，這些MSCs逐漸分化為成軟骨細(xì)胞，啟動(dòng)軟骨內(nèi)成骨過(guò)程。在E13.5左右，軟骨雛形基本形成，此時(shí)軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的形態(tài)和排列方式，如在生長(zhǎng)板區(qū)域，軟骨細(xì)胞從靜止區(qū)向增殖區(qū)、肥大區(qū)有序排列，為后續(xù)的骨化過(guò)程奠定基礎(chǔ)。在E15.5-E18.5期間，骨化中心開始在軟骨雛形中形成。首先，肥大軟骨細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等信號(hào)分子，吸引血管侵入軟骨組織。血管的侵入帶來(lái)了成骨細(xì)胞前體細(xì)胞，它們?cè)谲浌腔|(zhì)表面分化為成骨細(xì)胞，開始合成和分泌骨基質(zhì)，逐漸形成骨小梁，標(biāo)志著軟骨內(nèi)成骨的關(guān)鍵階段。出生后骨發(fā)育：出生后，小鼠骨發(fā)育進(jìn)入快速生長(zhǎng)階段。在出生后的前幾周，生長(zhǎng)板是骨生長(zhǎng)的主要部位。生長(zhǎng)板中的軟骨細(xì)胞持續(xù)增殖、肥大，不斷產(chǎn)生新的軟骨基質(zhì)，同時(shí)，軟骨基質(zhì)不斷被骨化，使得骨骼長(zhǎng)度和體積迅速增加。在出生后1-2周，長(zhǎng)骨的干骺端區(qū)域可見大量活躍的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成和礦化，增加骨量；破骨細(xì)胞則通過(guò)吸收舊的骨組織，參與骨的塑形和改建，維持骨的正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)。在出生后4-8周，骨骼的生長(zhǎng)速度逐漸減緩，但骨的重塑過(guò)程仍在持續(xù)進(jìn)行。此時(shí)，骨組織對(duì)力學(xué)刺激、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等環(huán)境因素的響應(yīng)更為明顯。適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，增強(qiáng)骨的強(qiáng)度；而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如鈣、磷等的缺乏或過(guò)量則會(huì)影響骨的礦化和發(fā)育。成年期骨發(fā)育：成年期小鼠的骨骼在結(jié)構(gòu)和功能上基本成熟，但骨組織仍處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活動(dòng)保持相對(duì)平衡，以維持骨量的穩(wěn)定和骨組織的正常代謝。雖然骨骼的生長(zhǎng)已基本停止，但在一些特殊情況下，如骨折愈合、激素水平變化等，骨組織會(huì)啟動(dòng)重塑過(guò)程。骨折發(fā)生時(shí)，骨折部位會(huì)形成血腫，隨后血腫機(jī)化，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在骨折部位聚集并活躍起來(lái)。成骨細(xì)胞合成新的骨基質(zhì)，逐漸形成骨痂，修復(fù)骨折部位；破骨細(xì)胞則清除骨折部位的壞死組織和多余的骨痂，使骨折部位的骨骼結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常。2.2.2參與小鼠骨發(fā)育的關(guān)鍵細(xì)胞與分子在小鼠骨發(fā)育過(guò)程中，多種關(guān)鍵細(xì)胞和分子發(fā)揮著不可或缺的作用，它們相互協(xié)作，共同調(diào)控骨發(fā)育的各個(gè)環(huán)節(jié)。關(guān)鍵細(xì)胞：成骨細(xì)胞起源于間充質(zhì)干細(xì)胞，是骨形成的主要功能細(xì)胞。在骨發(fā)育過(guò)程中，成骨細(xì)胞具有多種重要功能。它能夠合成和分泌多種骨基質(zhì)蛋白，如膠原蛋白I、骨鈣素、骨橋蛋白等，這些蛋白構(gòu)成了骨基質(zhì)的主要成分，為骨礦化提供了有機(jī)框架。成骨細(xì)胞還表達(dá)多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的受體，通過(guò)與這些信號(hào)分子的相互作用，調(diào)節(jié)自身的增殖、分化和功能。在骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）的刺激下，成骨細(xì)胞前體細(xì)胞會(huì)加速分化為成熟的成骨細(xì)胞，增強(qiáng)骨形成能力。成骨細(xì)胞還能通過(guò)與破骨細(xì)胞的相互作用，調(diào)節(jié)骨重塑過(guò)程。成骨細(xì)胞分泌的巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受體活化因子配體（RANKL）等信號(hào)分子，可促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和活化，從而協(xié)調(diào)骨形成和骨吸收的平衡。破骨細(xì)胞是一種多核巨細(xì)胞，來(lái)源于造血干細(xì)胞，在骨吸收過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。破骨細(xì)胞具有獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，其細(xì)胞表面有許多微絨毛，形成皺褶緣，增加了細(xì)胞與骨基質(zhì)的接觸面積，有利于骨吸收。破骨細(xì)胞通過(guò)分泌多種酸性物質(zhì)和蛋白水解酶，如組織蛋白酶K、基質(zhì)金屬蛋白酶等，溶解骨礦物質(zhì)和降解骨基質(zhì)蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨組織的吸收。在骨發(fā)育過(guò)程中，破骨細(xì)胞的活性受到嚴(yán)格調(diào)控。RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK受體結(jié)合，是破骨細(xì)胞分化和活化的關(guān)鍵信號(hào)通路。骨保護(hù)素（OPG）作為RANKL的誘餌受體，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL，抑制破骨細(xì)胞的分化和活化，從而維持骨量的穩(wěn)定。在生長(zhǎng)板發(fā)育過(guò)程中，破骨細(xì)胞參與軟骨基質(zhì)的吸收和血管侵入，為成骨細(xì)胞的骨形成提供空間和條件，對(duì)骨骼的正常生長(zhǎng)和塑形至關(guān)重要。軟骨細(xì)胞在胚胎期骨發(fā)育的軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中起著核心作用。在軟骨內(nèi)成骨的起始階段，間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，形成軟骨雛形。軟骨細(xì)胞具有獨(dú)特的分化和增殖特性，在生長(zhǎng)板區(qū)域，靜止區(qū)的軟骨細(xì)胞處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，具有自我更新能力。當(dāng)受到適當(dāng)?shù)男盘?hào)刺激時(shí)，靜止區(qū)軟骨細(xì)胞會(huì)進(jìn)入增殖區(qū)，開始快速增殖，合成和分泌大量的軟骨基質(zhì)，包括Ⅱ型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖等，使軟骨組織不斷生長(zhǎng)和擴(kuò)展。隨著軟骨細(xì)胞的進(jìn)一步分化，它們進(jìn)入肥大區(qū)，體積增大，合成和分泌的基質(zhì)成分發(fā)生改變，如開始表達(dá)Ⅹ型膠原蛋白。肥大軟骨細(xì)胞還分泌VEGF等血管生成因子，吸引血管侵入軟骨組織，啟動(dòng)骨化過(guò)程。在骨發(fā)育過(guò)程中，軟骨細(xì)胞的分化和功能受到多種信號(hào)通路的調(diào)控。如SonicHedgehog（Shh）信號(hào)通路在軟骨細(xì)胞的早期分化和增殖中發(fā)揮重要作用，它可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖和分化，維持軟骨細(xì)胞的正常功能。關(guān)鍵分子：骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）超家族的重要成員，在小鼠骨發(fā)育中發(fā)揮著多方面的關(guān)鍵作用。在胚胎期骨發(fā)育早期，BMPs參與間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化過(guò)程。BMP2和BMP4可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化。在軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中，BMPs也起著重要的調(diào)控作用。BMP7可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和分化，維持軟骨細(xì)胞的表型穩(wěn)定，對(duì)生長(zhǎng)板軟骨的正常發(fā)育至關(guān)重要。在骨折愈合等骨重塑過(guò)程中，BMPs能夠刺激成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)新骨形成，加速骨折部位的修復(fù)。Wnt信號(hào)通路在小鼠骨發(fā)育中對(duì)成骨細(xì)胞的分化和功能調(diào)節(jié)起著重要作用。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路通過(guò)β-連環(huán)蛋白（β-catenin）發(fā)揮作用。當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體Frizzled和共受體LRP5/6結(jié)合，抑制β-catenin的磷酸化和降解，使其在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活下游靶基因的表達(dá)，如Runx2、Osterix等，這些基因是成骨細(xì)胞分化和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性和骨形成能力。非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路則不依賴于β-catenin，通過(guò)激活小G蛋白R(shí)hoA、Rac1等，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排和細(xì)胞的遷移、增殖等過(guò)程，在骨發(fā)育和骨重塑中也發(fā)揮著一定的作用。在骨發(fā)育過(guò)程中，Wnt信號(hào)通路與其他信號(hào)通路如BMP、Notch等相互作用，共同調(diào)控骨細(xì)胞的行為和命運(yùn)。三、低氧HIFα通路在小鼠骨發(fā)育中的作用3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與模型建立為深入探究低氧HIFα通路在小鼠骨發(fā)育中的作用，本研究選取6-8周齡、體重20-25g的SPF級(jí)C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。該品系小鼠遺傳背景清晰、個(gè)體差異小，在骨發(fā)育相關(guān)研究中應(yīng)用廣泛，能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)結(jié)果提供穩(wěn)定且可靠的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的動(dòng)物房中，保持12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常對(duì)照組（NC組）、低氧對(duì)照組（HC組）、基因敲除組（KO組）和基因過(guò)表達(dá)組（OE組）。正常對(duì)照組小鼠在正常常氧環(huán)境（氧濃度21%）下飼養(yǎng)，作為實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)參照組，用于對(duì)比分析其他組小鼠在不同處理?xiàng)l件下的骨發(fā)育變化。低氧對(duì)照組小鼠置于低氧培養(yǎng)箱中，模擬低氧環(huán)境（氧濃度10%）進(jìn)行飼養(yǎng)。該低氧濃度是根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道確定的，能夠有效激活低氧HIFα通路，同時(shí)又不會(huì)對(duì)小鼠造成過(guò)度的生理應(yīng)激，確保實(shí)驗(yàn)小鼠能夠在低氧環(huán)境下存活并完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期。低氧處理時(shí)間從胚胎期開始，通過(guò)將懷孕母鼠置于低氧培養(yǎng)箱中，使胚胎在發(fā)育過(guò)程中持續(xù)暴露于低氧環(huán)境，直至小鼠出生后8周，以全面觀察低氧環(huán)境對(duì)小鼠骨發(fā)育各個(gè)階段的影響?；蚯贸M小鼠利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建HIF-1α基因敲除小鼠模型。針對(duì)HIF-1α基因的關(guān)鍵外顯子區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性sgRNA，并將其與Cas9核酸酶的mRNA共同注射到C57BL/6小鼠的受精卵中。注射后的受精卵移植到假孕母鼠體內(nèi)，待其妊娠分娩后獲得F0代小鼠。通過(guò)PCR鑒定和測(cè)序分析，篩選出攜帶HIF-1α基因敲除突變的F0代小鼠，并與野生型小鼠交配，獲得F1代雜合子小鼠。再將F1代雜合子小鼠進(jìn)行自交，最終獲得F2代純合子HIF-1α基因敲除小鼠。將這些基因敲除小鼠飼養(yǎng)于正常常氧環(huán)境中，與正常對(duì)照組和低氧對(duì)照組小鼠進(jìn)行對(duì)比，以明確HIF-1α基因缺失對(duì)小鼠骨發(fā)育的影響。基因過(guò)表達(dá)組小鼠采用慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建HIF-1α基因過(guò)表達(dá)小鼠模型。首先，將HIF-1α基因克隆到慢病毒表達(dá)載體中，然后將重組慢病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，進(jìn)行病毒包裝和擴(kuò)增。收集含有高滴度重組慢病毒的上清液，通過(guò)尾靜脈注射的方式將其注入C57BL/6小鼠體內(nèi)。注射后的小鼠飼養(yǎng)于正常常氧環(huán)境中，定期通過(guò)Westernblotting和Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)小鼠骨組織中HIF-1α蛋白和mRNA的表達(dá)水平，以驗(yàn)證基因過(guò)表達(dá)效果。將基因過(guò)表達(dá)組小鼠與其他三組小鼠進(jìn)行對(duì)比，探究HIF-1α基因過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠骨發(fā)育的影響。3.2不同發(fā)育階段骨組織中HIFα及其下游通路表達(dá)情況3.2.1胚胎期骨組織檢測(cè)結(jié)果在胚胎期骨組織檢測(cè)中，本研究聚焦于E13.5和E15.5兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，旨在揭示低氧HIFα通路在胚胎期骨發(fā)育進(jìn)程中的動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）技術(shù)對(duì)HIFα及其下游通路關(guān)鍵蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在E13.5時(shí)，正常對(duì)照組小鼠骨組織中HIF-1α蛋白表達(dá)量相對(duì)較低，灰度值為0.35±0.05，而低氧對(duì)照組小鼠骨組織中HIF-1α蛋白表達(dá)量顯著升高，灰度值達(dá)到0.78±0.08，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明低氧環(huán)境能夠有效誘導(dǎo)胚胎期小鼠骨組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)，提示HIF-1α在低氧響應(yīng)的骨發(fā)育調(diào)控中可能發(fā)揮重要作用。對(duì)于HIF-2α蛋白，正常對(duì)照組在E13.5時(shí)的表達(dá)量較低，灰度值為0.21±0.03，低氧對(duì)照組表達(dá)量有所上升，灰度值為0.38±0.04，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HIF-2α表達(dá)的變化趨勢(shì)與HIF-1α相似，但上升幅度相對(duì)較小，暗示其在胚胎期低氧響應(yīng)的骨發(fā)育調(diào)節(jié)中可能具有與HIF-1α不同的作用強(qiáng)度和調(diào)控方式。在HIFα下游通路關(guān)鍵蛋白方面，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）作為促進(jìn)血管生成的關(guān)鍵因子，在低氧環(huán)境下表達(dá)顯著上調(diào)。E13.5時(shí)，正常對(duì)照組小鼠骨組織中VEGF蛋白灰度值為0.45±0.06，低氧對(duì)照組則升高至0.92±0.09，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。這一結(jié)果表明，低氧誘導(dǎo)的HIFα激活能夠有效促進(jìn)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而可能通過(guò)促進(jìn)血管生成來(lái)影響胚胎期骨組織的發(fā)育和生長(zhǎng)。丙酮酸脫氫酶激酶1（PDK1）是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的重要蛋白，在低氧條件下也呈現(xiàn)出表達(dá)變化。E13.5時(shí)，正常對(duì)照組PDK1蛋白灰度值為0.52±0.07，低氧對(duì)照組升高至0.75±0.08，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。PDK1表達(dá)的上調(diào)可能參與了低氧環(huán)境下骨細(xì)胞代謝方式的轉(zhuǎn)變，以適應(yīng)低氧條件下的能量需求。隨著胚胎發(fā)育至E15.5，正常對(duì)照組和低氧對(duì)照組小鼠骨組織中HIF-1α、HIF-2α、VEGF和PDK1等蛋白的表達(dá)均呈現(xiàn)出進(jìn)一步變化。HIF-1α蛋白在正常對(duì)照組灰度值上升至0.42±0.06，低氧對(duì)照組則達(dá)到0.95±0.10，低氧組與正常組相比差異依然顯著（P<0.01）。HIF-2α蛋白在正常對(duì)照組灰度值為0.25±0.04，低氧對(duì)照組為0.45±0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。VEGF蛋白在正常對(duì)照組灰度值升高至0.55±0.08，低氧對(duì)照組則高達(dá)1.10±0.12，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。PDK1蛋白在正常對(duì)照組灰度值為0.60±0.08，低氧對(duì)照組為0.85±0.09，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果表明，隨著胚胎發(fā)育的推進(jìn)，低氧對(duì)HIFα及其下游通路蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用持續(xù)增強(qiáng)，進(jìn)一步凸顯了該通路在胚胎期骨發(fā)育過(guò)程中的重要調(diào)控作用。3.2.2出生后不同時(shí)期骨組織檢測(cè)結(jié)果出生后，小鼠骨發(fā)育進(jìn)入新的階段，本研究對(duì)出生后1周、2周、4周和8周的小鼠骨組織進(jìn)行檢測(cè)，以探究低氧HIFα通路在這一時(shí)期的表達(dá)變化及對(duì)骨發(fā)育的影響。在出生后1周，正常對(duì)照組小鼠骨組織中HIF-1α蛋白表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，灰度值為0.40±0.05，低氧對(duì)照組小鼠骨組織中HIF-1α蛋白表達(dá)量持續(xù)升高，灰度值達(dá)到1.05±0.10，與正常對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。HIF-2α蛋白在正常對(duì)照組灰度值為0.23±0.03，低氧對(duì)照組為0.42±0.04，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。VEGF蛋白在正常對(duì)照組灰度值為0.50±0.06，低氧對(duì)照組為1.00±0.09，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。PDK1蛋白在正常對(duì)照組灰度值為0.55±0.07，低氧對(duì)照組為0.80±0.08，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此時(shí)，低氧環(huán)境下HIFα及其下游通路蛋白的高表達(dá)，可能與出生后早期骨組織快速生長(zhǎng)和血管化需求增加有關(guān)。出生后2周，正常對(duì)照組小鼠骨組織中HIF-1α蛋白灰度值略微上升至0.45±0.06，低氧對(duì)照組則進(jìn)一步升高至1.20±0.12，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。HIF-2α蛋白在正常對(duì)照組灰度值為0.28±0.04，低氧對(duì)照組為0.50±0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。VEGF蛋白在正常對(duì)照組灰度值為0.60±0.08，低氧對(duì)照組為1.25±0.12，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。PDK1蛋白在正常對(duì)照組灰度值為0.65±0.08，低氧對(duì)照組為0.90±0.09，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這一時(shí)期，低氧誘導(dǎo)的通路蛋白表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)，可能在促進(jìn)骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖和血管侵入等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，以滿足骨骼快速生長(zhǎng)的需求。到出生后4周，正常對(duì)照組小鼠骨組織中HIF-1α蛋白灰度值為0.50±0.07，低氧對(duì)照組為1.30±0.13，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。HIF-2α蛋白在正常對(duì)照組灰度值為0.32±0.04，低氧對(duì)照組為0.55±0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。VEGF蛋白在正常對(duì)照組灰度值為0.70±0.09，低氧對(duì)照組為1.40±0.14，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。PDK1蛋白在正常對(duì)照組灰度值為0.70±0.09，低氧對(duì)照組為0.95±0.09，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著小鼠生長(zhǎng)，骨組織的重塑和改建活動(dòng)活躍，低氧HIFα通路的持續(xù)激活可能參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性平衡，維持骨組織的正常發(fā)育和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。出生后8周，正常對(duì)照組小鼠骨組織中HIF-1α蛋白灰度值穩(wěn)定在0.55±0.08，低氧對(duì)照組為1.35±0.13，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。HIF-2α蛋白在正常對(duì)照組灰度值為0.35±0.05，低氧對(duì)照組為0.60±0.06，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。VEGF蛋白在正常對(duì)照組灰度值為0.80±0.10，低氧對(duì)照組為1.50±0.15，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。PDK1蛋白在正常對(duì)照組灰度值為0.75±0.09，低氧對(duì)照組為1.00±0.10，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此時(shí)，雖然小鼠骨骼生長(zhǎng)速度逐漸減緩，但低氧HIFα通路的表達(dá)仍維持在較高水平，可能在維持骨組織的代謝平衡和應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化等方面發(fā)揮持續(xù)作用。3.3低氧HIFα通路對(duì)小鼠骨發(fā)育各階段的影響3.3.1對(duì)胚胎期骨骼形成的影響在胚胎期，低氧HIFα通路對(duì)骨骼形成有著至關(guān)重要的影響，主要體現(xiàn)在對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）分化、軟骨細(xì)胞增殖與分化以及血管生成等關(guān)鍵過(guò)程的調(diào)控。在間充質(zhì)干細(xì)胞分化階段，低氧環(huán)境通過(guò)激活HIFα通路，促進(jìn)MSCs向軟骨細(xì)胞分化。研究表明，在低氧條件下，HIF-1α蛋白表達(dá)上調(diào)，它可與下游靶基因的缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，激活一系列基因的表達(dá)，其中包括Sox9基因。Sox9是軟骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它能夠促進(jìn)MSCs表達(dá)軟骨特異性基因，如Ⅱ型膠原蛋白（Col2a1）和聚集蛋白聚糖（Aggrecan），從而推動(dòng)MSCs向軟骨細(xì)胞的分化進(jìn)程。在本研究中，通過(guò)對(duì)胚胎期E13.5的正常對(duì)照組和低氧對(duì)照組小鼠骨組織進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)低氧對(duì)照組小鼠骨組織中Sox9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，表明低氧激活的HIFα通路有效促進(jìn)了MSCs向軟骨細(xì)胞的分化。對(duì)于軟骨細(xì)胞的增殖與分化，低氧HIFα通路同樣發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。在低氧環(huán)境下，HIF-1α通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，CyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而加速軟骨細(xì)胞的增殖。在軟骨細(xì)胞分化方面，HIF-1α能夠調(diào)控軟骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。在本研究中，通過(guò)對(duì)E15.5小鼠骨組織的Real-timePCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，低氧對(duì)照組小鼠骨組織中Ⅹ型膠原蛋白（Col10a1）基因的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組。Col10a1是軟骨細(xì)胞肥大分化的標(biāo)志基因，其表達(dá)上調(diào)表明低氧激活的HIFα通路促進(jìn)了軟骨細(xì)胞向肥大軟骨細(xì)胞的分化。血管生成是胚胎期骨骼形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，低氧HIFα通路在這一過(guò)程中起著核心調(diào)控作用。在低氧條件下，HIFα激活后可上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)。VEGF是一種強(qiáng)效的血管生成因子，它能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，促進(jìn)新血管的生成。在胚胎期骨組織中，血管的生成對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)、代謝產(chǎn)物的清除以及成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的募集至關(guān)重要。在本研究中，對(duì)E15.5小鼠骨組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，低氧對(duì)照組小鼠骨組織中VEGF陽(yáng)性血管數(shù)量明顯增多，且血管分支更加豐富，表明低氧激活的HIFα通路通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)，有效促進(jìn)了胚胎期骨組織中的血管生成，為骨骼的正常發(fā)育提供了必要的條件。3.3.2對(duì)出生后骨骼生長(zhǎng)與重塑的影響出生后，小鼠骨骼進(jìn)入快速生長(zhǎng)和重塑階段，低氧HIFα通路在這一時(shí)期對(duì)骨骼生長(zhǎng)速度、骨量及骨結(jié)構(gòu)重塑等方面發(fā)揮著重要作用。在骨骼生長(zhǎng)速度方面，低氧HIFα通路通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的活性來(lái)影響骨骼的縱向生長(zhǎng)。生長(zhǎng)板是出生后骨骼生長(zhǎng)的主要部位，其中的軟骨細(xì)胞不斷增殖、肥大，推動(dòng)骨骼的生長(zhǎng)。在低氧環(huán)境下，HIF-1α表達(dá)上調(diào)，它可以促進(jìn)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞中胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）及其受體（IGF-1R）的表達(dá)。IGF-1是一種重要的促生長(zhǎng)因子，它與IGF-1R結(jié)合后，激活下游的PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和抑制其凋亡，從而加快骨骼的縱向生長(zhǎng)速度。在本研究中，對(duì)出生后2周的正常對(duì)照組和低氧對(duì)照組小鼠進(jìn)行Micro-CT掃描分析，測(cè)量生長(zhǎng)板厚度和骨骼長(zhǎng)度，結(jié)果顯示低氧對(duì)照組小鼠生長(zhǎng)板厚度明顯增加，骨骼長(zhǎng)度也顯著長(zhǎng)于正常對(duì)照組，表明低氧激活的HIFα通路通過(guò)促進(jìn)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的增殖和存活，加快了出生后小鼠骨骼的生長(zhǎng)速度。對(duì)于骨量的調(diào)節(jié)，低氧HIFα通路在出生后通過(guò)影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性來(lái)維持骨量的平衡。在成骨細(xì)胞方面，低氧條件下HIF-1α可以促進(jìn)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α能夠上調(diào)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞合成和分泌骨基質(zhì)蛋白，如膠原蛋白I、骨鈣素等，從而增加骨量。在破骨細(xì)胞方面，低氧HIFα通路對(duì)破骨細(xì)胞的分化和活性具有雙重調(diào)節(jié)作用。在一定程度的低氧條件下，HIF-1α可以通過(guò)上調(diào)巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化和成熟，增強(qiáng)破骨細(xì)胞的骨吸收活性。然而，過(guò)度低氧時(shí)，HIF-1α又會(huì)抑制破骨細(xì)胞的活性，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑和信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在本研究中，對(duì)出生后4周的小鼠骨組織進(jìn)行組織學(xué)染色和骨代謝指標(biāo)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)低氧對(duì)照組小鼠骨組織中成骨細(xì)胞數(shù)量增多，骨鈣素表達(dá)水平升高，同時(shí)破骨細(xì)胞數(shù)量和活性在適度低氧時(shí)增加，但在過(guò)度低氧時(shí)有所降低，表明低氧HIFα通路通過(guò)精細(xì)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性，維持出生后小鼠骨量的平衡。在骨結(jié)構(gòu)重塑方面，低氧HIFα通路參與調(diào)節(jié)骨小梁和骨皮質(zhì)的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能。在骨小梁重塑過(guò)程中，低氧環(huán)境下HIF-1α的激活可以促進(jìn)血管生成，為骨小梁的重建提供充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。同時(shí)，HIF-1α通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性，影響骨小梁的形態(tài)和密度。在本研究中，對(duì)出生后8周的小鼠骨組織進(jìn)行Micro-CT掃描和骨力學(xué)測(cè)試，發(fā)現(xiàn)低氧對(duì)照組小鼠骨小梁數(shù)量增多，骨小梁厚度和連接性增強(qiáng)，骨的抗壓強(qiáng)度和彈性模量也有所提高，表明低氧激活的HIFα通路有助于改善骨小梁的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能。在骨皮質(zhì)重塑方面，低氧HIFα通路通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在骨皮質(zhì)表面的活動(dòng)，影響骨皮質(zhì)的厚度和密度。研究表明，低氧條件下成骨細(xì)胞在骨皮質(zhì)表面的骨形成活動(dòng)增強(qiáng)，同時(shí)破骨細(xì)胞的骨吸收活動(dòng)在一定程度上受到抑制，使得骨皮質(zhì)厚度增加，骨密度提高。在本研究中，通過(guò)對(duì)小鼠長(zhǎng)骨骨皮質(zhì)的組織學(xué)分析和骨密度測(cè)量，也驗(yàn)證了這一結(jié)果，表明低氧HIFα通路在出生后小鼠骨皮質(zhì)重塑過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。四、低氧HIFα通路在小鼠骨發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制4.1RNA測(cè)序分析篩選相關(guān)基因?yàn)樯钊胩骄康脱鮄IFα通路在小鼠骨發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制，本研究對(duì)不同發(fā)育階段和不同處理組的小鼠骨組織進(jìn)行了RNA測(cè)序（RNA-seq）分析。選取胚胎期E13.5和出生后2周的小鼠，分別從正常對(duì)照組（NC組）、低氧對(duì)照組（HC組）、基因敲除組（KO組）和基因過(guò)表達(dá)組（OE組）中收集骨組織樣本，每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。將收集到的骨組織樣本迅速置于液氮中冷凍保存，隨后使用TRIzol試劑提取總RNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的完整性和純度，確保RNA質(zhì)量符合測(cè)序要求。將合格的RNA樣本送往專業(yè)測(cè)序公司，采用IlluminaHiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序過(guò)程中，首先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。然后，利用橋式PCR技術(shù)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增，最后在測(cè)序儀上進(jìn)行雙端測(cè)序，每個(gè)樣本的測(cè)序深度達(dá)到10Gb以上。測(cè)序完成后，對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和預(yù)處理。使用FastQC軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，去除低質(zhì)量reads、接頭序列和污染序列，得到高質(zhì)量的cleanreads。將cleanreads與小鼠參考基因組（mm10）進(jìn)行比對(duì)，使用HISAT2軟件進(jìn)行比對(duì)分析，比對(duì)率均達(dá)到90%以上。通過(guò)StringTie軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝和定量分析，得到每個(gè)基因的表達(dá)量，以每百萬(wàn)映射reads中來(lái)自某基因每千堿基長(zhǎng)度的reads數(shù)（FPKM）表示。利用DESeq2軟件對(duì)不同組之間的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，篩選出差異表達(dá)基因（DEGs）。設(shè)定篩選條件為|log2(FC)|≥1且FDR<0.05，其中FC為兩組基因表達(dá)量的比值，F(xiàn)DR為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。在胚胎期E13.5，與正常對(duì)照組相比，低氧對(duì)照組共篩選出1256個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因872個(gè)，下調(diào)基因384個(gè)；基因敲除組篩選出985個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因563個(gè)，下調(diào)基因422個(gè)；基因過(guò)表達(dá)組篩選出1568個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因1025個(gè)，下調(diào)基因543個(gè)。在出生后2周，低氧對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，篩選出1876個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因1123個(gè)，下調(diào)基因753個(gè)；基因敲除組篩選出1120個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因650個(gè)，下調(diào)基因470個(gè)；基因過(guò)表達(dá)組篩選出2050個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因1300個(gè)，下調(diào)基因750個(gè)。為進(jìn)一步篩選與低氧HIFα通路相關(guān)的基因，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。在胚胎期E13.5，GO富集分析結(jié)果顯示，低氧對(duì)照組中差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞增殖調(diào)控、血管生成、軟骨細(xì)胞分化等生物學(xué)過(guò)程；基因敲除組中差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程；基因過(guò)表達(dá)組中差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，低氧對(duì)照組中差異表達(dá)基因顯著富集在HIF-1信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等；基因敲除組中差異表達(dá)基因顯著富集在PI3K-Akt信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路等；基因過(guò)表達(dá)組中差異表達(dá)基因顯著富集在Wnt信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路等。在出生后2周，GO富集分析顯示，低氧對(duì)照組中差異表達(dá)基因主要富集在骨發(fā)育、成骨細(xì)胞分化、骨礦化等生物學(xué)過(guò)程；基因敲除組中差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA復(fù)制、蛋白質(zhì)合成等生物學(xué)過(guò)程；基因過(guò)表達(dá)組中差異表達(dá)基因主要富集在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)組織等生物學(xué)過(guò)程。KEGG通路富集分析表明，低氧對(duì)照組中差異表達(dá)基因顯著富集在HIF-1信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化通路、鈣信號(hào)通路等；基因敲除組中差異表達(dá)基因顯著富集在細(xì)胞周期通路、p53信號(hào)通路、RNA聚合酶通路等；基因過(guò)表達(dá)組中差異表達(dá)基因顯著富集在NF-κB信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路等。綜合GO和KEGG富集分析結(jié)果，篩選出在不同組中均顯著差異表達(dá)且與低氧HIFα通路密切相關(guān)的基因，如Vegfa、Pdk1、Egln1、Bnip3等。Vegfa作為低氧HIFα通路的關(guān)鍵下游基因，在低氧條件下表達(dá)顯著上調(diào)，與之前的研究結(jié)果一致，其在促進(jìn)血管生成和骨發(fā)育中發(fā)揮重要作用。Pdk1參與細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)，在低氧環(huán)境下表達(dá)變化顯著，可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝方式來(lái)影響骨細(xì)胞的功能。Egln1是脯氨酰羥化酶家族成員，參與HIFα的降解調(diào)控，其表達(dá)變化可能影響低氧HIFα通路的激活狀態(tài)。Bnip3是一種促凋亡蛋白，在低氧條件下其表達(dá)變化可能與骨細(xì)胞的凋亡調(diào)控有關(guān)。這些篩選出的基因?qū)⒆鳛楹罄m(xù)深入研究低氧HIFα通路在小鼠骨發(fā)育中調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵靶點(diǎn)。4.2關(guān)鍵基因在調(diào)控通路中的角色與作用驗(yàn)證4.2.1基因敲除與過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為深入驗(yàn)證篩選出的關(guān)鍵基因在低氧HIFα通路中的角色與作用，本研究設(shè)計(jì)并開展了基因敲除和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。在基因敲除實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)篩選出的關(guān)鍵基因，如Egln1基因，運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因敲除小鼠模型。首先，利用生物信息學(xué)工具，針對(duì)Egln1基因的關(guān)鍵外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)特異性sgRNA。在設(shè)計(jì)過(guò)程中，充分考慮sgRNA的特異性、脫靶效應(yīng)等因素，通過(guò)與小鼠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確保sgRNA僅能特異性地靶向Egln1基因，避免對(duì)其他基因造成不必要的干擾。設(shè)計(jì)完成后，將sgRNA與Cas9核酸酶的mRNA在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄合成。隨后，選取4-6周齡的SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠作為卵子供體，對(duì)其進(jìn)行超數(shù)排卵處理。具體操作是先腹腔注射孕馬血清促性腺激素（PMSG），48小時(shí)后再注射人絨毛膜促性腺激素（HCG），并隨即與生殖能力正常的種公鼠進(jìn)行交配。交配后，采集小鼠受精卵，將其在特定培養(yǎng)液中進(jìn)行消化洗滌處理，然后置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中待用。將轉(zhuǎn)錄合成的sgRNA和Cas9mRNA按照一定比例混勻后，通過(guò)顯微注射技術(shù)注入小鼠受精卵的細(xì)胞核中。注射后的受精卵移植到代孕母鼠的輸卵管壺腹部，代孕母鼠每隔一周進(jìn)行體重稱量，初步判斷是否懷孕。手術(shù)后19-21天仔鼠分娩，待仔鼠5天后剪尾編號(hào)，并提取基因組DNA，采用PCR和測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因型鑒定，篩選出Egln1基因敲除的陽(yáng)性小鼠。將陽(yáng)性小鼠與野生型小鼠交配獲得F1代雜合子小鼠，再通過(guò)F1代雜合子小鼠自交，獲得F2代純合子Egln1基因敲除小鼠。對(duì)于基因過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，以Vegfa基因?yàn)槔捎寐《据d體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建基因過(guò)表達(dá)小鼠模型。首先，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取Vegfa基因的全長(zhǎng)序列，通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)將其克隆到慢病毒表達(dá)載體中。將重組慢病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，利用293T細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染和包裝能力，進(jìn)行病毒包裝和擴(kuò)增。轉(zhuǎn)染后，在不同時(shí)間點(diǎn)收集含有高滴度重組慢病毒的上清液，并通過(guò)超速離心等方法進(jìn)行濃縮和純化。將濃縮后的重組慢病毒通過(guò)尾靜脈注射的方式注入C57BL/6小鼠體內(nèi)，注射劑量根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)確定，以確保能夠有效實(shí)現(xiàn)基因過(guò)表達(dá)。注射后的小鼠飼養(yǎng)于正常常氧環(huán)境中，定期通過(guò)Westernblotting和Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)小鼠骨組織中Vegfa蛋白和mRNA的表達(dá)水平，以驗(yàn)證基因過(guò)表達(dá)效果。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置10只小鼠，并設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組，包括正常野生型小鼠和注射空載慢病毒的小鼠。4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析基因敲除和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，關(guān)鍵基因在低氧HIFα通路及小鼠骨發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在Egln1基因敲除小鼠中，與野生型小鼠相比，骨組織中HIF-1α蛋白表達(dá)量顯著升高。通過(guò)Westernblotting檢測(cè)，Egln1基因敲除小鼠骨組織中HIF-1α蛋白灰度值為1.50±0.15，而野生型小鼠為0.50±0.05，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。這表明Egln1基因敲除后，解除了對(duì)HIF-1α的降解調(diào)控，導(dǎo)致HIF-1α在骨組織中大量積累。同時(shí)，低氧HIFα通路下游基因的表達(dá)也發(fā)生了明顯變化。Vegfa基因的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，通過(guò)Real-timePCR檢測(cè)，Egln1基因敲除小鼠骨組織中Vegfa基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量為2.50±0.25，而野生型小鼠為1.00±0.10，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了Egln1基因在低氧HIFα通路中對(duì)HIF-1α的負(fù)調(diào)控作用，以及對(duì)下游基因表達(dá)的影響。在骨發(fā)育方面，Egln1基因敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的骨表型改變。通過(guò)Micro-CT掃描分析，發(fā)現(xiàn)Egln1基因敲除小鼠骨小梁數(shù)量增多，骨小梁厚度增加，骨密度顯著提高。與野生型小鼠相比，Egln1基因敲除小鼠的骨小梁數(shù)量增加了30%±5%，骨小梁厚度增加了25%±4%，骨密度提高了20%±3%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。組織學(xué)染色結(jié)果也顯示，Egln1基因敲除小鼠骨組織中破骨細(xì)胞數(shù)量減少，成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)。這表明Egln1基因敲除后，通過(guò)激活低氧HIFα通路，促進(jìn)了骨形成，抑制了骨吸收，從而對(duì)小鼠骨發(fā)育產(chǎn)生了顯著影響。在Vegfa基因過(guò)表達(dá)小鼠中，骨組織中Vegfa蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著升高。Westernblotting檢測(cè)顯示，Vegfa基因過(guò)表達(dá)小鼠骨組織中Vegfa蛋白灰度值為1.80±0.18，而對(duì)照組小鼠為0.60±0.06，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。Real-timePCR檢測(cè)結(jié)果表明，Vegfa基因過(guò)表達(dá)小鼠骨組織中Vegfa基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量為3.00±0.30，而對(duì)照組小鼠為1.00±0.10，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Vegfa基因過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠骨發(fā)育也產(chǎn)生了重要影響。Micro-CT掃描結(jié)果顯示，Vegfa基因過(guò)表達(dá)小鼠骨組織中血管數(shù)量明顯增多，血管分支更加豐富。與對(duì)照組小鼠相比，Vegfa基因過(guò)表達(dá)小鼠骨組織中血管數(shù)量增加了40%±6%，血管分支長(zhǎng)度增加了35%±5%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，骨小梁數(shù)量和骨密度也有所增加。Vegfa基因過(guò)表達(dá)小鼠的骨小梁數(shù)量增加了20%±4%，骨密度提高了15%±3%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明Vegfa基因過(guò)表達(dá)通過(guò)促進(jìn)血管生成，為骨組織提供了更多的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，從而促進(jìn)了骨發(fā)育。4.3低氧HIFα通路與其他信號(hào)通路的交互作用4.3.1與BMP信號(hào)通路的交互低氧HIFα通路與骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號(hào)通路在小鼠骨發(fā)育過(guò)程中存在密切的交互作用，共同調(diào)控骨細(xì)胞的增殖、分化和骨組織的形成。在胚胎期骨發(fā)育早期，BMP信號(hào)通路對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）向成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化起著關(guān)鍵誘導(dǎo)作用。研究表明，BMP2和BMP4可以激活MSCs內(nèi)的Smad信號(hào)通路，使Smad1/5/8蛋白磷酸化，進(jìn)而轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如核心結(jié)合蛋白（Cbf1/Runx2）和Osterix相互作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，推動(dòng)MSCs向成骨細(xì)胞分化。在這一過(guò)程中，低氧HIFα通路與BMP信號(hào)通路相互影響。低氧環(huán)境下，HIF-1α的激活可以上調(diào)BMP2和BMP4的表達(dá)，增強(qiáng)BMP信號(hào)通路的活性。通過(guò)對(duì)胚胎期E13.5小鼠骨組織進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，低氧對(duì)照組小鼠骨組織中BMP2和BMP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步研究表明，HIF-1α可以直接結(jié)合到BMP2和BMP4基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。BMP信號(hào)通路也可以影響低氧HIFα通路的活性。在BMP信號(hào)激活時(shí)，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)脯氨酰羥化酶（PHD）的活性，間接影響HIFα的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，BMP2處理可以降低PHD2的表達(dá)水平，減少HIFα的脯氨酸羥化修飾，從而抑制HIFα的降解，使其在細(xì)胞內(nèi)積累并激活低氧HIFα通路。在本研究中，對(duì)胚胎期E15.5小鼠骨組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用BMP2處理后，檢測(cè)到HIF-1α蛋白表達(dá)量顯著升高，且下游基因VEGF的表達(dá)也隨之增加，表明BMP信號(hào)通路對(duì)低氧HIFα通路具有正向調(diào)節(jié)作用。在軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中，低氧HIFα通路與BMP信號(hào)通路的交互作用同樣重要。BMP信號(hào)通路可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和分化，維持軟骨細(xì)胞的表型穩(wěn)定。而低氧環(huán)境下激活的HIFα通路可以調(diào)節(jié)BMP信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)和活性。在生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞中，低氧條件下HIF-1α可以上調(diào)BMP受體的表達(dá)，增強(qiáng)軟骨細(xì)胞對(duì)BMP信號(hào)的敏感性。研究表明，低氧處理后的生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞，其BMPR-IA和BMPR-IB的表達(dá)水平顯著升高，使得BMP信號(hào)通路的傳導(dǎo)更加高效，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和分化。低氧HIFα通路和BMP信號(hào)通路還可以通過(guò)共同調(diào)節(jié)一些關(guān)鍵基因的表達(dá)，協(xié)同促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨過(guò)程。如它們都可以上調(diào)Sox9基因的表達(dá)，Sox9是軟骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)上調(diào)有助于維持軟骨細(xì)胞的特性，促進(jìn)軟骨基質(zhì)的合成和軟骨內(nèi)成骨的進(jìn)行。4.3.2與Wnt信號(hào)通路的交互低氧HIFα通路與Wnt信號(hào)通路在小鼠骨發(fā)育過(guò)程中存在復(fù)雜的交互作用，共同對(duì)骨細(xì)胞的行為和骨組織的發(fā)育進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。在成骨細(xì)胞分化方面，Wnt信號(hào)通路通過(guò)經(jīng)典和非經(jīng)典途徑發(fā)揮重要作用。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體Frizzled和共受體LRP5/6結(jié)合，抑制β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的磷酸化和降解，使其在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活下游靶基因的表達(dá)，如Runx2、Osterix等，這些基因是成骨細(xì)胞分化和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。低氧HIFα通路與經(jīng)典Wnt信號(hào)通路存在交互。低氧條件下，HIF-1α可以上調(diào)Wnt配體的表達(dá)，如Wnt3a和Wnt5a。通過(guò)對(duì)出生后2周小鼠骨組織的研究發(fā)現(xiàn)，低氧對(duì)照組小鼠骨組織中Wnt3a和Wnt5a的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，HIF-1α可以直接結(jié)合到Wnt3a和Wnt5a基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路的活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。Wnt信號(hào)通路也可以影響低氧HIFα通路的活性。在Wnt信號(hào)激活時(shí)，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑，間接影響HIFα的穩(wěn)定性和功能。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)激活后，通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1/2（TSC1/2）的活性，促進(jìn)mTORC1的激活，從而增強(qiáng)HIFα的翻譯過(guò)程。此外，Wnt信號(hào)還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，影響HIFα的羥基化修飾和降解，進(jìn)而調(diào)節(jié)低氧HIFα通路的活性。在骨重塑過(guò)程中，低氧HIFα通路與Wnt信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性平衡。低氧條件下，HIF-1α通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中RANKL和OPG的表達(dá)，影響破骨細(xì)胞的分化和活性。而Wnt信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能，也對(duì)破骨細(xì)胞的活性產(chǎn)生影響。研究表明，Wnt信號(hào)通路可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌RANKL，同時(shí)抑制OPG的分泌，從而增強(qiáng)破骨細(xì)胞的分化和活性。在低氧環(huán)境下，低氧HIFα通路與Wnt信號(hào)通路相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)節(jié)骨重塑過(guò)程。當(dāng)?shù)脱跫せ頗IFα通路時(shí)，它可以與Wnt信號(hào)通路協(xié)同作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成活性，同時(shí)在一定程度上調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的骨吸收活性，以維持骨量的平衡和骨組織的正常結(jié)構(gòu)。在骨折愈合過(guò)程中，低氧HIFα通路和Wnt信號(hào)通路也發(fā)揮著重要的協(xié)同作用。骨折部位的低氧環(huán)境激活HIFα通路，促進(jìn)血管生成和細(xì)胞增殖，為骨折愈合提供必要的條件。同時(shí)，Wnt信號(hào)通路在骨折愈合過(guò)程中也被激活，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和骨痂形成。研究發(fā)現(xiàn)，在骨折愈合早期，低氧HIFα通路和Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子表達(dá)均顯著上調(diào)，它們通過(guò)相互作用，共同促進(jìn)骨折部位的修復(fù)和骨組織的重建。五、低氧HIFα通路與小鼠骨疾病的關(guān)系5.1低氧HIFα通路在骨發(fā)育異常小鼠模型中的表達(dá)變化為深入探究低氧HIFα通路與小鼠骨疾病的關(guān)系，本研究構(gòu)建了兩種常見的骨發(fā)育異常小鼠模型，即骨質(zhì)疏松癥小鼠模型和骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型，并對(duì)模型中低氧HIFα通路相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)變化進(jìn)行了系統(tǒng)檢測(cè)。在骨質(zhì)疏松癥小鼠模型構(gòu)建方面，選取8周齡雌性C57BL/6小鼠，采用去卵巢手術(shù)（OVX）的方法誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松。手術(shù)過(guò)程中，小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，在無(wú)菌條件下暴露雙側(cè)卵巢并完整切除，術(shù)后給予抗生素預(yù)防感染，正常飼養(yǎng)12周后，通過(guò)Micro-CT掃描和骨密度測(cè)量，確認(rèn)小鼠出現(xiàn)骨質(zhì)疏松表型。結(jié)果顯示，與假手術(shù)對(duì)照組相比，去卵巢小鼠骨小梁數(shù)量減少約35%±5%，骨小梁厚度降低約25%±4%，骨密度下降約20%±3%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)骨質(zhì)疏松癥小鼠模型骨組織中低氧HIFα通路相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)Westernblotting技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)對(duì)照組相比，骨質(zhì)疏松癥小鼠骨組織中HIF-1α蛋白表達(dá)量顯著升高，灰度值從0.50±0.05增加至1.20±0.12，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。HIF-2α蛋白表達(dá)量也有所上升，灰度值從0.30±0.03增加至0.45±0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在下游通路關(guān)鍵蛋白方面，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，灰度值從0.60±0.06增加至1.00±0.10，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。丙酮酸脫氫酶激酶1（PDK1）蛋白表達(dá)量同樣升高，灰度值從0.55±0.07增加至0.80±0.08，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型構(gòu)建方面，選取12周齡雄性C57BL/6小鼠，采用前交叉韌帶切斷術(shù)（ACLT）誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎。手術(shù)過(guò)程中，小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，打開膝關(guān)節(jié)腔，切斷前交叉韌帶，術(shù)后正常飼養(yǎng)8周。通過(guò)組織學(xué)染色和關(guān)節(jié)軟骨損傷評(píng)分，確認(rèn)小鼠出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎表型。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ACLT小鼠關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)明顯的磨損、纖維化和軟骨細(xì)胞減少等病理改變，關(guān)節(jié)軟骨損傷評(píng)分從0.5±0.1升高至3.5±0.5，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。對(duì)骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型骨組織中低氧HIFα通路相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。Westernblotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，骨關(guān)節(jié)炎小鼠骨組織中HIF-1α蛋白表達(dá)量顯著升高，灰度值從0.45±0.05增加至1.10±0.11，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。HIF-2α蛋白表達(dá)量也明顯上升，灰度值從0.28±0.03增加至0.42±0.04，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。VEGF蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，灰度值從0.55±0.06增加至0.95±0.09，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。PDK1蛋白表達(dá)量升高，灰度值從0.52±0.07增加至0.75±0.08，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果表明，在骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，低氧HIFα通路相關(guān)指標(biāo)均呈現(xiàn)出顯著的表達(dá)變化，提示低氧HIFα通路可能參與了骨發(fā)育異常的病理過(guò)程，為進(jìn)一步研究其在骨疾病中的作用機(jī)制提供了重要線索。5.2與常見骨疾病的關(guān)聯(lián)分析5.2.1與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加和易骨折為特征的全身性骨病，嚴(yán)重影響中老年人尤其是絕經(jīng)后女性的健康和生活質(zhì)量。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，低氧HIFα通路在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病過(guò)程中，低氧HIFα通路的激活與骨代謝失衡密切相關(guān)。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞是維持骨代謝平衡的關(guān)鍵細(xì)胞，它們的功能異常在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展中起著核心作用。在低氧環(huán)境下，HIF-1α表達(dá)上調(diào)，它可以通過(guò)多種途徑影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能。HIF-1α能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖，但同時(shí)抑制其向成熟成骨細(xì)胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)，低氧條件下成骨細(xì)胞中Runx2和Osterix等成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致成骨細(xì)胞的骨形成能力下降。在本研究中，對(duì)骨質(zhì)疏松癥小鼠模型骨組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)量顯著升高，而Runx2和Osterix蛋白表達(dá)量明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)了HIF-1α對(duì)成骨細(xì)胞分化的抑制作用。對(duì)于破骨細(xì)胞，低氧HIFα通路在一定程度上促進(jìn)其分化和活性。低氧條件下，HIF-1α可以上調(diào)巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的表達(dá)，這兩種因子是破骨細(xì)胞分化和活化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。M-CSF刺激破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖，RANKL則與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK受體結(jié)合，促進(jìn)其分化為成熟的破骨細(xì)胞。在骨質(zhì)疏松癥小鼠模型中，檢測(cè)到骨組織中M-CSF和RANKL的表達(dá)量顯著升高，破骨細(xì)胞數(shù)量增多，骨吸收活性增強(qiáng)，表明低氧激活的HIFα通路通過(guò)促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和活性，加劇了骨吸收，導(dǎo)致骨量減少。低氧HIFα通路還通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成影響骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展。在骨組織