ICS07.080

CCSA40DB51

四川省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB51/T3184—2024

醫(yī)用供體豬基因鑒定通則

2024-0779發(fā)布2024—08—08實(shí)施

四川省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

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刖百

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由四川省經(jīng)濟(jì)和信息化廳提出、歸口并解釋。

本文件起草單位：中國測(cè)試技術(shù)研究院生物研究所、成都中科奧格生物科技有限公司、四川省醫(yī)學(xué)

科學(xué)院?四川省人民醫(yī)院、四川泰康醫(yī)院、南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院、海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院、華

中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院、空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院、成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司、成都

愛迪眼科醫(yī)院、四川省機(jī)械研究設(shè)計(jì)院（集團(tuán)）有限公司、四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)醫(yī)用豬專業(yè)委員會(huì)。

本文件主要起草人：周李華、潘登科、馬麗俠、邢向陽、陳璐、鄧紹平、王佳梅、李巔遠(yuǎn)、張玉蘭、

王毅、杜嘉祥、陳剛、蔣子敬、竇科峰、楊恒鈕、鐘浩、姚曉明、莊瑛、莫玲。

醫(yī)用供體豬基因鑒定通則

1范圍

本文件規(guī)定了醫(yī)用供體豬基因鑒定的總體原則及鑒定方法。

本文件適用于醫(yī)用供體豬的生產(chǎn)、引種、交付過程中基因鑒定。

基因修飾動(dòng)物的基因鑒定可參考本文件。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件,

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T30989高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)程

GB/T33681.1高通量基因測(cè)序樣本預(yù)處理方法第1部分：動(dòng)物組織樣本預(yù)處理

GB/T35537高通量基因測(cè)序結(jié)果評(píng)價(jià)要求

GB/T38477基因表達(dá)的測(cè)定蛋白印跡法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

醫(yī)用供體豬medicaldonorpigs

通過生物工程技術(shù)獲得，用于提供醫(yī)療用途的活器官或生物材料制備的低免疫原性豬及其群體“

3.2

基因修飾geneticmodification

利用生物化學(xué)方法修改生物遺傳物質(zhì)，使生物產(chǎn)生新性狀，修飾方式主要包括轉(zhuǎn)基因、基因編輯介

導(dǎo)的基因定點(diǎn)插入和基因敲除3種。

注：醫(yī)用供體豬常見基因修飾名稱及種類見附錄，

3.3

基因整合geneintegration

將特定基因片段導(dǎo)入宿主基因組內(nèi)的基因修飾方法，包括轉(zhuǎn)基因和基因定點(diǎn)插入。

3.4

基因敲除geneknockout

將特定基因片段從基因組中去除的基因修飾方式。

3.5

遺傳穩(wěn)定性geneticstabiIity

通過連續(xù)檢測(cè)不同代數(shù)基因修飾動(dòng)物基因型、基因表達(dá)情況來評(píng)估基因修飾在動(dòng)物群體中遺傳穩(wěn)定

及表達(dá)穩(wěn)定的手段。

基因組結(jié)構(gòu)變異genomestructuraIvariants

在醫(yī)用供體豬獲得過程中,基因組上發(fā)生長片段（＞50bp）的序列變化和位置關(guān)系變化。

注：基因組結(jié)構(gòu)變異包括長片段序列插入或刪除、串聯(lián)重復(fù)、染色體倒位、染色體內(nèi)部或染色體之間的序列易位、

基因拷貝數(shù)變異以及嵌合性變異等。

3.7

脫靶off-target

與靶標(biāo)不同的基因組位置和/或核酸序列。

示例：結(jié)合脫靶、切割脫靶、編輯脫靶、序列改變脫靶，

注：編輯脫靶屬于非預(yù)期編輯。

[來源:ISO5058:1-2021,3.1,4]

3.8

高通量測(cè)序high-throughputsequencing

以一次并行幾十萬到幾百萬條核酸分子序列測(cè)定和一般讀長較短等為標(biāo)志，適用于DNA的測(cè)序技術(shù)。

[來源：GB/T35890-2018,3.1]

4總體原則

基因鑒定是醫(yī)用供體豬制備過程中重要組成環(huán)節(jié)，醫(yī)用供體豬制備、篩選、交付等過程應(yīng)對(duì)其進(jìn)行

基因鑒定。因其用途的特殊性，醫(yī)用供體豬基因鑒定應(yīng)同時(shí)考慮安全性和有效性，降低因基因修飾技術(shù)

引入的不可控因素。安全性和有效性評(píng)價(jià)應(yīng)結(jié)合設(shè)計(jì)預(yù)期、基因修飾類型進(jìn)行綜合評(píng)估，鑒定項(xiàng)目可參

考表1。

表1醫(yī)用供體豬基因鑒定評(píng)價(jià)項(xiàng)目

序號(hào)鑒定/檢測(cè)項(xiàng)目評(píng)價(jià)類型

1基因型

有效性評(píng)價(jià)

2基因表達(dá)

3遺傳穩(wěn)定性遺傳穩(wěn)定檢測(cè)

4基因組結(jié)構(gòu)變異

安全性評(píng)價(jià)

5脫靶

5鑒定項(xiàng)目及方法

5.1有效性評(píng)價(jià)

5.1.1基因型鑒定

5.1.1.1鑒定方法

樣本DNA提取可選用符合要求的市售試劑盒進(jìn)行提取，也可由實(shí)驗(yàn)室自配試劑進(jìn)行提取，引物設(shè)

il應(yīng)在日標(biāo)基囚（擬整合基囚做除基囚靶位）J_下游設(shè)〃引物。樣本DNA提取后，符合質(zhì)量要求的DNA

進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，觀察目標(biāo)條帶判定是否符合預(yù)期。判定基因整合見a）。

判定目標(biāo)基因的是否敲除，應(yīng)將符合預(yù)期的條帶回收.進(jìn)行測(cè)序（見b））。

注：基因整合鑒定示例見附錄B,基因敲除鑒定示例見附錄C。

5.1.1.2結(jié)果判定

a）出現(xiàn)目標(biāo)條帶，則判定基因整合有效。

b）目標(biāo)片段測(cè)序結(jié)果和參考序列比對(duì)，靶位產(chǎn)生不為3的倍數(shù)堿基的插入和缺失,則判定基氏敲

除有效。

5.1.2基因表達(dá)

5.1.2.1檢測(cè)方法

選取與目標(biāo)蛋白相結(jié)合的特異抗體對(duì)醫(yī)用供體豬組織、細(xì)胞水平進(jìn)行蛋白檢測(cè)?？刹捎玫鞍酌庖哂?/p>

跡法、免疫組化/免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等方法進(jìn)行檢測(cè)。建議根據(jù)不同生產(chǎn)工藝

選擇合適的檢測(cè)方法，蛋白免疫跡法可作為基礎(chǔ)方法選用，蛋白免疫印跡法檢測(cè)及判定方法可參考

GB/T384770蛋白免疫印跡、免疫組化（熒光）、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測(cè)示例見附錄B。流式細(xì)胞術(shù)技

術(shù)檢測(cè)示例見附錄C。

5.1.2.2蛋白免疫印跡法結(jié)果判定

a）成像圖片本底干凈，能觀察到轉(zhuǎn)印膜均勻的輕微背景輪廓，目標(biāo)條帶清晰且不過曝，即可判

定目標(biāo)蛋白表達(dá)。

b）基因整合類應(yīng)有目標(biāo)基因蛋白表達(dá)，敲除類應(yīng)無目標(biāo)基因蛋白表達(dá)。

5.2遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

，2.1通用要求

醫(yī)用供體豬自然繁育進(jìn)行擴(kuò)大化培養(yǎng)時(shí)應(yīng)符合封閉群或近交系的育種方式，同時(shí)應(yīng)檢測(cè)基因遺傳穩(wěn)

定性。

5.2.2檢測(cè)方法

醫(yī)用供體豬群體每代個(gè)體均應(yīng)進(jìn)行基因型鑒定和基因表達(dá)檢測(cè)，方法見5.1,應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)3代以上。

5.2.3結(jié)果分析

醫(yī)用供休豬基因型鑒定及基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果符合基因分離定律卻自由組合定律，則認(rèn)為具有遺傳穩(wěn)

定性。

5.3安全性評(píng)價(jià)

5.3.1染色體結(jié)構(gòu)變異和脫靶檢測(cè)

在基因修飾過程中，存在染色體結(jié)構(gòu)變異和基因修飾脫靶的風(fēng)瞼，應(yīng)對(duì)原代個(gè)體進(jìn)行染色體結(jié)構(gòu)變

異和脫靶檢測(cè)，評(píng)價(jià)安全性。

采集醫(yī)用供體豬基因修飾前后的血液或組織進(jìn)行高通量測(cè)序，獲取醫(yī)用供體豬基因組序列信息，進(jìn)

行生物信息學(xué)分析。樣本處理參照GB/T3368I.1的要求執(zhí)行，測(cè)序方法參照GB/T30989進(jìn)行，測(cè)序質(zhì)量

捽制參照GB/T35537執(zhí)行。

5.3.2結(jié)果分析

￡3.2.1染色體結(jié)構(gòu)變異

基因修飾前后，除基因修飾位點(diǎn)外，染色體其他區(qū)域基因序列無差異，醫(yī)用供體豬基因組未發(fā)生非

預(yù)期基因片段插入、序列缺失、倒置、異位，則認(rèn)為在醫(yī)用供體豬制備過程中未引入基因安全風(fēng)險(xiǎn)。

5.3.2.2脫靶檢測(cè)

使用Cas-OFFinder(CRISPRRGENTools(rgenom))或類似算法模型工具.在豬基因組參考序

列內(nèi)匹配脫靶風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)，允許sgRNA的靶標(biāo)序列存在I個(gè)?4個(gè)錯(cuò)配，醫(yī)用供體豬脫靶各風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)序列信

息和基因組參考序列一致，則認(rèn)為沒有脫靶，反之則存在脫靶風(fēng)險(xiǎn)。

附錄A

（資料性）

醫(yī)用供體豬常見基因名及修飾類型

醫(yī)用供體豬常見基因名及修飾類型見表A.1。

表A.1醫(yī)用供體豬常見基因名及修飾類型

GGTAI

B4GALNT2/B4GALNT2L

基因敲除CMAH

PERV

SLAclassIorB2M

humanmembranecofactorproteintransgenic(hCD46-tg)

humandecay-acceleratingfactortransgenic(hCD55-tg)

humanmembraneinhibtorofreactivelysistransgenic(hCD59-tg)

humanconiplement-iegjlatorj,proteinClinhibitortransgenic(hCl-INH-tg)

HLA-Mnimanbeta2-microglobulintransgenic(HLA-E^BZM-tg)

humansignalregulatoryproteinalphatransgenic(hCD47-tg)

humanLEA29Ytransgenic(LEA29Y-tg)

humanCTLA4-Igtransgenic(hCTLA4-lg-tg)

porcineCTLA4-lgtransgenic(pCTLA4-Ig-tg)

年因整合

humandominant-negativemutantclass11transactivatortransgenic(CHTA-DN-tg)

humanthromboniodulintransgenic(hTBM-tg)

humanendothelialproteinCreceptortransgenic(hEPCR-lg)

humantissuefactorpathwayinhibitortransgenic(hTFPI-tg)

humanectonucleosidetriphosphatediphosphohydrolase-1transgenic(hCD39-tg)

humanecto-5-nucleotidasetransgenic(hCD73-tg)

humantumournecrosis(aclora-inducedprolcin3(TNFAIP3)transgenic(A20-lg)

humanhacmeoxygenase1transgenic(hHMOXI-tg)

solublehumanTNFRI-Fctransgenic(shTNFRI-Fc-tg)

附錄B

(資料性)

LEA29Y基因整合有效性檢測(cè)方法

E.1LEA29Y基因型鑒定

E.1.1原理

以LEA29丫基因?yàn)榘形稽c(diǎn)，設(shè)計(jì)上下游引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)。

E.1.2樣品準(zhǔn)備

E.1.2.1樣品種類

豬耳組織、血液等。

E.1.2.2樣品采集

耳樣采集：采樣前對(duì)采樣工具及采樣部位進(jìn)行消毒，用耳標(biāo)鉗剪下豬耳組織，放入1.5mL離心管中

用于基因組提取。

血液采集：使用紫色采血管，采集豬全血3mL-5mLo

E.1.2.3基因組DNA提取

采用市售基因組DNA提取試劑盒，提取基因組DNA。

E.1.3PCR反應(yīng)

E.1.3.1引物序列

LEA29丫上游引物：5'-GTACCCACCGCCATACTACG-3,；

LEA29丫下游引物：5^GCGATGTCGCTGGGATAGAA-356

E.1.3.2PCR反應(yīng)體系和程序

按照表B.1配置PCR反應(yīng)體系。

表B.1PCR反應(yīng)體系

試劑名稱終濃度組分用量(ML)

2x隨緩沖液KODBufferIX10

上游引物(lOpmol/L)250nmol/L0.5

下游引物(lOpmol/L)250nmol/L0.5

的KOD0.0125uniVpL0.25

模板100ng-500ng2

ddHaO補(bǔ)足至20pL6.75

注：反應(yīng)體系中的各組分可根據(jù)1N同最終反應(yīng)體系進(jìn)行區(qū)分，，旦是需保持所有組分終濃度一致。

PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性2min；98℃變性IOs,60℃退火30s,68℃延伸30s,32個(gè)循環(huán)；

最后68c延伸5min；反應(yīng)完成后在4c保存。PCR反應(yīng)條件隨不同的PCR儀略有改變。

E.1.3.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

制備1%的瓊脂糖凝膠并加入染色劑，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。將10

>LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2pL上樣緩沖液混合，點(diǎn)樣，同時(shí)加入合適的DNAMarker,電壓120V,電泳15min?

20min,電泳至溟酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠2/3以后，但不能跑過膠”凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。

E.1.4實(shí)驗(yàn)對(duì)照

檢驗(yàn)過程中分別設(shè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照。采用含有LEA29Y基因的質(zhì)粒作為陽性對(duì)照，

WT豬的DNA作為陰性對(duì)照，采用與模板等體積的無菌去離子水作為空白對(duì)照。

E.1.5質(zhì)量控制

以下條件有一條不滿足時(shí),試驗(yàn)視為無效：

a）空白對(duì)照：無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶；

b）陰性對(duì)照：在573bp大小處未見PCR擴(kuò)增條帶；

c）陽性對(duì)照：在573bp大小處可見PCR擴(kuò)增條帶。

E.1.6結(jié)果判定

在符合B.1.5的情況下，被檢樣品在573bp大小處可見PCR擴(kuò)增條帶則判為陽性，LEA29Y基因整合

至豬基因組上；在573bp大小處木見PCR擴(kuò)增條帶則判為陰性。

E.2LEA29Y基因型表達(dá)鑒定

B.2.1原理

利用LEA29Y蛋白與LEA29丫抗體的特異性結(jié)合，檢測(cè)抗體酶標(biāo)物或標(biāo)記熒光來間接鑒定LEA29丫

的表達(dá)。

E.2.2WesternBlot基因表達(dá)鑒定。

E.2.2.1樣品準(zhǔn)備

取適量豬胰腺組織，加入10（）11RIPA裂解液，冰上裂解30min,獲得胰腺組織蛋白液，取少量細(xì)

胞裂解液測(cè)定蛋白濃度（可用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)）。

E.2.2.2WesternBlot實(shí)驗(yàn)步驟

E.2.2.2.1SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

使用商品化預(yù)制膠進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，組裝電泳槽，使用4x上樣緩沖液稀釋蛋白樣品，

使稀釋后緩沖液終濃度為lx,將蛋白樣品和Maker上樣后進(jìn)行電泳，電泳完成后取出SDS-凝膠用于轉(zhuǎn)膜。

E.2.2.2.2蛋白轉(zhuǎn)膜

將PVDF膜浸泡到甲馨中進(jìn)行活化Imin；將3張轉(zhuǎn)膜用流紙十轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5min；將轉(zhuǎn)膜夾放

干盛有l(wèi)x轉(zhuǎn)膜緩沖液的盤中，白板（陽極）在上，黑板（陰極）在下，由下向上依次放置1塊海綿、2

層濾紙、SDS-凝膠、PVDF膜、I層濾紙，注意PVDF膜和SDS-凝膠之間不應(yīng)有氣泡，最后合上轉(zhuǎn)膜夾,

將其放置于轉(zhuǎn)膜槽中。轉(zhuǎn)膜槽中加入4c冰箱預(yù)冷30min的lx轉(zhuǎn)膜液，加入冰袋，蓋上轉(zhuǎn)膜蓋。然后將

轉(zhuǎn)膜槽放置于泡沫箱中，加入冰水混合物，以防止轉(zhuǎn)膜過程中產(chǎn)生的熱量，檢查電極方向并接通電源。

在180mA恒流(或90V恒壓)條件下，轉(zhuǎn)移時(shí)間為1.5h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，若Marker清晰可見，證明轉(zhuǎn)膜

成功。

E.2.2.2.3封閉

將PVDF膜浸入封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)于平板搖床上搖動(dòng)封閉II】。

B.2.2.2.4第一抗體結(jié)合

將PVDF膜浸入含適當(dāng)比例一抗的稀釋液中，在室溫下孵育I%

取出PVDF膜，浸入TBST在搖床上洗滌4次，每次5min。

E.2.2.2.5第二抗體結(jié)合

將PVDF膜浸入含適當(dāng)比例二抗的稀釋液中，在室溫下孵育Ihe

孵育完成后取出PVDF膜，浸入TBST在搖床上洗滌4次，每次5min。

E.2.2.2.6顯色

使用市售ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒進(jìn)行顯色。

使用化學(xué)發(fā)光成像儀獲取顯色結(jié)果。

E.2.2.3結(jié)果判定

若實(shí)驗(yàn)組在預(yù)期蛋白大小的位置出現(xiàn)了明顯條帶，而野生型對(duì)照組在該位置無條帶，則說明蛋白表

達(dá)；若實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均無目的條帶，則蛋白未表達(dá)。

E.2.3免疫組化和免疫熒光方法基因表達(dá)鑒定

B-2.3.1樣品準(zhǔn)備

將采集的轉(zhuǎn)基因豬的胰腺組織在OCT(ElectronMicroscopySciences,Hatfield,PA,USA)中包埋

并冷凍，并儲(chǔ)存在-70°C。用冰凍切片機(jī)作冷凍切片(6Fim)用于免疫組化和免疫熒光染色。

02.3.2免疫組化實(shí)險(xiǎn)步驟

E.2.3.2.1固定

冰凍切片風(fēng)干后用丙酮固定10min?15min。

E.2.3.2.2去內(nèi)源酶

用0.3%過氧化氫甲醇溶液或1%鹽酸酒精37C作用30min。

E.2.3.2.3胰蛋白酶消化

需要時(shí)用胰蛋白酶消化處理，以便充分暴露抗原。

B.2.3.2.4漂洗

PBS漂洗3次，每次5min。

E.2.3.2.5封閉

5%小牛血清或I：10稀釋的正常馬血清，37。。濕盒中作用30min。

E.2.3.2.6孵育一體

加適當(dāng)稀釋的已知單抗或抗血清，37c濕盒中作用1h后4c過夜。

E.2.3.2.7漂洗

PBS洗3次，每次5min。

E.2.3.2.8孵育二抗

加適當(dāng)稀釋的第二抗體酶結(jié)合物，37°C盒作用lh。

E.2.3.2.9漂洗

PBS洗3次，每次5min。

E.2.3.2.10底物顯色

新鮮配制的DAB溶液顯色5min-10min后用PBS漂洗3次，每次5min。

E.2.3.2.11襯染

蘇木素或甲基綠襯染細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)。

E.2.3.2.12觀察

常規(guī)脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。

E.2.3.2.13結(jié)果判定

對(duì)照片本底清晰,背景無非特異著染，被檢物呈黃至棕褐色著染即可判為陽性。

B.2.3.3免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟

E.2.3.3.1固定

冰凍切片取出，室溫放置使其干燥后，用冷丙酮于49固定10min。

E.2.3.3.2去非特異著色

切片用0.01m。1/1^1^清洗后加入1.2%雙氯水作用3011］而，以除去非特異染色。

B.2.3.3.3漂洗

0.01mol/LPBS清洗，洗3次每次10min。

E.2.3.3.4透膜

0.3%TritonX-100作用30min。

E.2.3.3.5孵育一抗

加入以抗體稀釋液（含l%BSA的0.01mol/LPBS,pH7.4）稀釋至作濃度的一抗，4c過夜。

B.2.3.3.6漂洗

OOImol/LPBS清洗,洗3次，每次lOmin。

E.2.3.3.7孵育二抗

加入熒光抗體IgG,室溫育2h。

E.2.3.3.8漂洗

0.01mol/LPBS清洗，洗3次，每次lOmin。

E.2.3.3.9封片

緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

E.2.3.4結(jié)果判定

如果實(shí)驗(yàn)組視野中出現(xiàn)目的熒光而對(duì)照組未見目的熒光，則判斷該基因表達(dá)免疫熒光鑒定陽性；若

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均未見目的熒光，則判斷該基因表達(dá)免疫熒光鑒定陰性；若對(duì)照組出現(xiàn)目的熒光，點(diǎn)照

不成立，結(jié)果無意義。

E.2.4ELISA方法鑒定基因表達(dá)

E.2,4.1樣品準(zhǔn)備

用10mL注射器從豬的前腔靜脈采集8mL全血。取6mL保存在促凝采血管內(nèi)，3000rpm離心10min,

分離血清，用于ELISA實(shí)驗(yàn)。

E.2.4.2ELISA實(shí)驗(yàn)步驟

E.2.4.2.1測(cè)定

按照酶聯(lián)免疫試劑盒所述操作步驟對(duì)待測(cè)試樣(液)進(jìn)行定量檢測(cè)。

E.2.4.2.2平行試驗(yàn)

按B.2.421所述步驟，對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)溶液、同一樣品溶液均應(yīng)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)測(cè)定。

0.2.4.2.3空白試驗(yàn)

除不稱取試樣外，均按B24.2.I所述步驟進(jìn)行。

E.2.4.2.4陽性質(zhì)控

根據(jù)待測(cè)樣本中目的蛋白的含量,選擇一個(gè)合適的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，以確定試驗(yàn)過程的操作準(zhǔn)確性。

E.2.4.3試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

E.2.4.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照試劑盒說明書提供的計(jì)算方法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與吸注度變化關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

E.2.4.3.2待測(cè)液質(zhì)量濃度計(jì)算

按照試劑盒說明書提供的計(jì)篁方法，將待測(cè)樣品吸光度代入B24.3.1所獲得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算待測(cè)

液質(zhì)量濃度(p)。

附錄C

（資料性）

GGTA1基因敲除及表達(dá)有效性檢測(cè)

C.1GGTA1基因型鑒定

C.1.1原理

以GGTA1基因?yàn)榘行蛄?，建立PCR檢測(cè)方法，并結(jié)合PCR產(chǎn)物sangcr測(cè)序結(jié)果，判斷GGTA1基因敲

除類型。

C-1.2樣品準(zhǔn)備

C.1.2.1樣品種類

豬耳組織、血液等

C.1.2.2樣品采集

耳樣采集：采樣前對(duì)采樣工具及采樣部位進(jìn)行消毒，用耳標(biāo)鉗剪下豬耳組織，放入L5mL離心管中

用于基因組提取。

血液采集：使用紫色采血管，采集豬全血3mL~5mL0

C.1.2.3基因組DNA提取

采用市售基因組DNA提取試劑盒,提取基因組DNA。

C.1.3PCR反應(yīng)

C.1.3.1引物序列

GGTAI上游引物：5'-AGGGACAGTAGACCTAGGAAAC-3,；

,,

GGTAI下游弓|物：5-GATCCTAATTGGGTTTGCTGCC-3o

C.1.3.2PCR反應(yīng)體系和程序

按照表C.1配置PCR反應(yīng)體系。

表C.1PCR反應(yīng)體系

組分名稱終濃度組分用量SU

2x酶緩沖液KODBufferIX10

上游引物(10pmol/L)250nmol/L0.5

下游引物（10卜imol/L）250nmol/L0.5

誨KOD0.0125unit/jiL0.25

模板100ng-500ng2

ddHzO補(bǔ)足至20gL6.75

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min；98C變性10s,60℃退火30s,68C延伸30s,32個(gè)循環(huán)；

最后68c延伸5min；反應(yīng)完成后在4℃保存。PCR反應(yīng)條件隨不同的PCR儀略有改變。

C.1.3.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

制備1%的瓊脂糖凝膠并加入染色劑，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。將