全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)物：制備、特性及抗癌機(jī)制探索一、引言1.1研究背景肝癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率長(zhǎng)期居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，肝癌的新增病例數(shù)達(dá)90.6萬(wàn)，死亡病例數(shù)為83萬(wàn)，在所有癌癥相關(guān)死亡中位居第三。在中國(guó)，肝癌的形勢(shì)更為嚴(yán)峻，由于乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）的高感染率、不良的生活習(xí)慣（如長(zhǎng)期酗酒、食用霉變食物等）以及環(huán)境因素等多重影響，肝癌的發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平，是我國(guó)癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。現(xiàn)階段，肝癌的治療方式主要包括手術(shù)切除、肝臟移植、化療、放療、介入治療以及靶向治療和免疫治療等。手術(shù)切除和肝臟移植是早期肝癌的重要治療手段，然而，由于肝癌起病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，腫瘤往往侵犯血管或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致僅有不到30%的患者適合手術(shù)切除，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高，5年生存率僅為30%-40%?；熀头暖熾m可應(yīng)用于中晚期肝癌患者，但由于缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)強(qiáng)烈的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性，且治療效果有限。介入治療（如經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)，TACE）是中晚期肝癌非手術(shù)治療的常用方法之一，但其療效受腫瘤血供、肝功能等多種因素限制，且多次治療后易出現(xiàn)耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)。近年來(lái)，靶向治療和免疫治療為肝癌患者帶來(lái)了新的希望，部分患者的生存期得到了一定程度的延長(zhǎng)，但仍存在治療耐藥、副作用和復(fù)發(fā)等問(wèn)題，總體治療效果仍不盡人意。基于人源化單克隆抗體技術(shù)的免疫治療，是近年來(lái)受到廣泛關(guān)注的腫瘤治療方法。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于可以專一識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原，針對(duì)性強(qiáng)且潛在副作用小。單鏈抗體（scFv）是一種由重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）通過(guò)一段柔性連接肽（Linker）連接而成的重組蛋白，其分子量?jī)H為完整抗體的1/6-1/8，具有分子量小、組織穿透性強(qiáng)、免疫原性低、易于基因工程改造和大量制備等優(yōu)點(diǎn)。scFv可通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)引入人體，能夠特異性地結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的抗原，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向識(shí)別和治療。阿霉素（doxorubicin）是一種臨床上廣泛應(yīng)用的蒽環(huán)類抗生素，具有廣譜的抗腫瘤活性，其作用機(jī)制主要是嵌入DNA雙鏈之間，抑制DNA和RNA的合成，從而阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖和分裂。然而，阿霉素的全身應(yīng)用會(huì)對(duì)心臟、骨髓、胃腸道等正常組織產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性，限制了其臨床使用劑量和療效。將全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)形成抗體偶聯(lián)物（antibody-drugconjugate，ADC），有望結(jié)合單鏈抗體的靶向性和阿霉素的強(qiáng)大細(xì)胞毒性，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞的精準(zhǔn)打擊，提高治療效果，同時(shí)減少對(duì)正常組織的損傷。這種治療策略能夠利用單鏈抗體特異性地將阿霉素輸送到肝癌細(xì)胞表面，通過(guò)內(nèi)化作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使阿霉素在腫瘤細(xì)胞內(nèi)釋放并發(fā)揮殺傷作用，從而增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷能力，降低藥物的全身毒性，為肝癌的治療提供新的思路和方法。1.2研究目的與意義本研究旨在通過(guò)基因工程技術(shù)制備全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體，并將其與阿霉素進(jìn)行偶聯(lián)，獲得具有高效靶向抗腫瘤活性的抗體偶聯(lián)物。具體研究目的包括：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)全人源抗肝癌單鏈抗體的基因工程菌株，并實(shí)現(xiàn)單鏈抗體的高效表達(dá)與純化；優(yōu)化單鏈抗體與阿霉素的偶聯(lián)方法，制備出具有合適藥物抗體比、穩(wěn)定性好且保持單鏈抗體靶向活性的偶聯(lián)物；從細(xì)胞和動(dòng)物水平全面評(píng)估偶聯(lián)物對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡、抑制遷移和侵襲等作用，深入探究其抗腫瘤作用機(jī)制；對(duì)比偶聯(lián)物與游離阿霉素以及單鏈抗體單獨(dú)使用時(shí)的抗腫瘤效果和毒副作用，明確偶聯(lián)物在提高治療效果和降低毒性方面的優(yōu)勢(shì)。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。在理論層面，深入研究全人源抗肝癌單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)物的制備工藝、生物學(xué)特性及抗腫瘤作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示抗體偶聯(lián)物在腫瘤靶向治療中的作用規(guī)律，豐富和完善腫瘤靶向治療的理論體系，為后續(xù)開(kāi)發(fā)更多新型、高效的腫瘤靶向治療藥物提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。在臨床應(yīng)用方面，肝癌的現(xiàn)有治療手段存在諸多局限性，患者的總體生存率和生活質(zhì)量亟待提高。本研究制備的抗體偶聯(lián)物有望為肝癌患者提供一種新的、更有效的治療選擇。通過(guò)將阿霉素精準(zhǔn)地輸送到肝癌細(xì)胞，提高藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率，同時(shí)減少對(duì)正常組織的損傷，降低化療的不良反應(yīng)，從而提高患者的治療依從性和生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者的生存期。此外，該研究成果的成功轉(zhuǎn)化和應(yīng)用，還可能推動(dòng)腫瘤靶向治療技術(shù)的發(fā)展，為其他惡性腫瘤的治療提供借鑒和參考，具有廣泛的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1研究方法基因工程技術(shù)：運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增全人源抗肝癌單鏈抗體基因，將其克隆至合適的表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。具體而言，從已建立的人源抗體文庫(kù)或經(jīng)免疫的人B淋巴細(xì)胞中提取總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增單鏈抗體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因。引物設(shè)計(jì)時(shí)充分考慮基因的序列特點(diǎn)、酶切位點(diǎn)以及后續(xù)表達(dá)的需求，采用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性。將擴(kuò)增得到的VH和VL基因通過(guò)一段柔性Linker連接，構(gòu)建完整的單鏈抗體基因，并將其克隆到原核表達(dá)載體pET-21a(+)或真核表達(dá)載體pPIC9K等中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)或畢赤酵母GS115等宿主細(xì)胞，通過(guò)抗性篩選和測(cè)序鑒定獲得陽(yáng)性重組菌株。蛋白表達(dá)與純化：誘導(dǎo)重組菌株表達(dá)單鏈抗體，優(yōu)化誘導(dǎo)條件（如誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度等）以實(shí)現(xiàn)單鏈抗體的高效表達(dá)。對(duì)于原核表達(dá)系統(tǒng)，采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化IPTG濃度（如0.1mM、0.5mM、1mM等）、誘導(dǎo)時(shí)間（如4h、6h、8h等）和誘導(dǎo)溫度（如25℃、30℃、37℃等），提高單鏈抗體的表達(dá)量和可溶性。利用親和層析、離子交換層析等方法對(duì)表達(dá)的單鏈抗體進(jìn)行純化，通過(guò)SDS-PAGE和Western-blot鑒定其純度和分子量。選用鎳離子親和層析柱純化帶有His標(biāo)簽的單鏈抗體，再通過(guò)離子交換層析進(jìn)一步去除雜質(zhì)，提高抗體純度。利用SDS-PAGE分析蛋白純度，通過(guò)Western-blot驗(yàn)證單鏈抗體的特異性和分子量。偶聯(lián)物制備：采用化學(xué)偶聯(lián)法將純化后的單鏈抗體與阿霉素進(jìn)行偶聯(lián)。選擇合適的交聯(lián)劑（如丁二酰亞胺（DMP）、N-琥珀酰亞胺基-3-（2-吡啶二硫代）丙酸酯（SPDP）等），優(yōu)化偶聯(lián)條件（如抗體與阿霉素的摩爾比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等），制備出具有合適藥物抗體比、穩(wěn)定性好且保持單鏈抗體靶向活性的偶聯(lián)物。以DMP為交聯(lián)劑為例，通過(guò)調(diào)整單鏈抗體與阿霉素的摩爾比（如1:5、1:10、1:15等），在不同反應(yīng)時(shí)間（如2h、4h、6h等）和溫度（如25℃、37℃等）下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)高效液相色譜（HPLC）和質(zhì)譜（MS）分析偶聯(lián)物的藥物抗體比和結(jié)構(gòu)，確定最佳偶聯(lián)條件。免疫分析技術(shù)：利用間接ELISA、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)單鏈抗體及偶聯(lián)物的活性、親和力和特異性。通過(guò)間接ELISA測(cè)定單鏈抗體及偶聯(lián)物與肝癌細(xì)胞表面抗原的結(jié)合活性，以已知濃度的抗原包被酶標(biāo)板，加入不同稀釋度的單鏈抗體或偶聯(lián)物，孵育后加入酶標(biāo)二抗，通過(guò)底物顯色反應(yīng)測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算抗體的親和力常數(shù)。采用流式細(xì)胞術(shù)分析單鏈抗體及偶聯(lián)物對(duì)肝癌細(xì)胞的特異性結(jié)合能力，將肝癌細(xì)胞與單鏈抗體或偶聯(lián)物孵育，加入熒光標(biāo)記的二抗，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，評(píng)估抗體的特異性和結(jié)合效率。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：以肝癌細(xì)胞系（如HepG2、Huh-7等）為研究對(duì)象，采用MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、AnnexinV-FITC/PI染色等方法檢測(cè)偶聯(lián)物對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡、抑制遷移和侵襲等作用。利用MTT法檢測(cè)不同濃度的偶聯(lián)物、游離阿霉素和單鏈抗體對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響，將肝癌細(xì)胞接種于96孔板，加入不同處理組的藥物，孵育一定時(shí)間后加入MTT試劑，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率和抑制率。通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察偶聯(lián)物對(duì)肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響，將肝癌細(xì)胞接種于6孔板，加入藥物處理后繼續(xù)培養(yǎng)，待克隆形成后進(jìn)行固定、染色和計(jì)數(shù)，分析藥物對(duì)細(xì)胞增殖能力的長(zhǎng)期影響。采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)偶聯(lián)物對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，在上室加入肝癌細(xì)胞和藥物，下室加入含血清的培養(yǎng)基，孵育后固定、染色并在顯微鏡下觀察穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。利用AnnexinV-FITC/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)偶聯(lián)物對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，將肝癌細(xì)胞與藥物孵育后，用AnnexinV-FITC和PI雙染，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞的比例，分析藥物的促凋亡機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：建立肝癌裸鼠移植瘤模型，將偶聯(lián)物、游離阿霉素和單鏈抗體分別通過(guò)尾靜脈注射等方式給予荷瘤小鼠，定期測(cè)量腫瘤體積和小鼠體重，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況和小鼠的生存狀態(tài)，通過(guò)組織病理學(xué)分析、免疫組化等方法評(píng)估偶聯(lián)物在體內(nèi)的抗腫瘤效果和安全性。將肝癌細(xì)胞接種于裸鼠皮下，待腫瘤生長(zhǎng)至一定大小后，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為不同處理組，分別給予相應(yīng)藥物，每隔3-4天測(cè)量腫瘤體積和小鼠體重，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取出腫瘤組織進(jìn)行稱重、固定和切片，通過(guò)蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化，利用免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中增殖相關(guān)蛋白（如Ki-67）、凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax）等的表達(dá)水平，評(píng)估偶聯(lián)物的抗腫瘤作用機(jī)制和安全性。1.3.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示。首先，從人源抗體文庫(kù)或免疫的人B淋巴細(xì)胞中獲取全人源抗肝癌單鏈抗體基因，通過(guò)PCR擴(kuò)增和克隆構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)后的單鏈抗體經(jīng)純化后，與阿霉素進(jìn)行偶聯(lián)，制備偶聯(lián)物。隨后，對(duì)單鏈抗體和偶聯(lián)物進(jìn)行活性、親和力和特異性鑒定。接著，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)全面評(píng)估偶聯(lián)物的抗腫瘤作用，包括對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響以及在體內(nèi)的抗腫瘤效果和安全性。最后，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)偶聯(lián)物的制備工藝、生物學(xué)特性及抗腫瘤作用機(jī)制，為肝癌的靶向治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從基因獲取到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的各個(gè)步驟及相關(guān)方法和檢測(cè)指標(biāo)，線條和箭頭明確各步驟的先后順序和邏輯關(guān)系]二、全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體2.1單鏈抗體簡(jiǎn)介單鏈抗體（singlechainantibodyfragment，scFv）是一種通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建的新型抗體片段，它由抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）通過(guò)一段柔性連接肽（Linker）連接而成。從分子結(jié)構(gòu)上看，scFv相對(duì)分子量約為25Kd，僅為完整抗體分子量的六分之一，不含有抗體恒定區(qū)片段（CH和CL）。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了單鏈抗體諸多優(yōu)勢(shì)，使其在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。在結(jié)構(gòu)特點(diǎn)上，單鏈抗體的連接肽通常由10-25個(gè)氨基酸組成，常見(jiàn)的如由甘氨酸（Gly）和絲氨酸（Ser）組成的(Gly4Ser)3連接肽。這種連接肽在結(jié)構(gòu)上具有柔韌性，使得VH和VL能夠通過(guò)共價(jià)鍵形成具有抗原結(jié)合功能的Fv片段，其連接方式既可以是VH-linker-VL，也可以是VL-linker-VH。這種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)保證了單鏈抗體能夠保持對(duì)目標(biāo)抗原的良好親和能力，盡管其與抗原的親和力往往比完整抗體略低，但依然能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合抗原。單鏈抗體的優(yōu)勢(shì)顯著。首先，較小的分子量使其具有較強(qiáng)的組織穿透性，能夠更輕松地穿越組織屏障進(jìn)入靶部位。在腫瘤組織中，由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和高間質(zhì)壓力，完整抗體往往難以有效滲透到腫瘤內(nèi)部，而單鏈抗體則能夠克服這一障礙，深入腫瘤組織，與腫瘤細(xì)胞表面的抗原充分結(jié)合。其次，單鏈抗體的免疫原性較低。完整抗體中的恒定區(qū)容易引發(fā)人體的免疫反應(yīng)，而單鏈抗體不含恒定區(qū)，大大降低了免疫原性，減少了人體對(duì)其產(chǎn)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，這對(duì)于抗體在體內(nèi)的應(yīng)用至關(guān)重要。再者，單鏈抗體在體內(nèi)的循環(huán)半衰期較短，有利于快速清除和解毒。當(dāng)治療完成后，單鏈抗體能夠迅速?gòu)捏w內(nèi)清除，減少了潛在的毒副作用。此外，單鏈抗體易于與毒素、酶或細(xì)胞因子等基因結(jié)合，從而方便地制備免疫毒素、酶標(biāo)記抗體或免疫細(xì)胞因子等融合蛋白，拓展了其在腫瘤治療中的應(yīng)用方式。在腫瘤治療領(lǐng)域，單鏈抗體具有廣泛的應(yīng)用前景。一方面，它可以用于腫瘤的顯像定位。利用單鏈抗體與抗原特異性結(jié)合的能力，將其與放射性核素相結(jié)合，單鏈抗體能夠特異性地結(jié)合到腫瘤組織中的靶抗原上，通過(guò)影像學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的顯影定位診斷，有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和準(zhǔn)確診斷。另一方面，單鏈抗體可用于腫瘤的靶向治療。它可以與毒素、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等具有細(xì)胞毒性或免疫調(diào)節(jié)作用的因子相融合，構(gòu)建成免疫偶聯(lián)物。這些免疫偶聯(lián)物能夠特異性地將細(xì)胞毒性物質(zhì)輸送到腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)殺傷，提高治療效果，同時(shí)減少對(duì)正常組織的損傷。此外，單鏈抗體還可通過(guò)基因工程技術(shù)改造成雙（多）特異性單鏈抗體，使其能夠結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)不同抗原。這種改造后的單鏈抗體既可以結(jié)合腫瘤細(xì)胞的表面抗原，又可以結(jié)合免疫活性細(xì)胞的表面抗原，將抗體的靶向性和免疫細(xì)胞的殺傷功能相結(jié)合，發(fā)揮獨(dú)特的抗腫瘤效果。2.2全人源抗肝癌單鏈抗體的制備與篩選本研究采用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)制備全人源抗肝癌單鏈抗體，該技術(shù)是一種將抗體基因與噬菌體表面蛋白基因融合，使抗體片段展示在噬菌體表面的技術(shù)，能夠在體外模擬免疫系統(tǒng)，高效篩選出特異性抗體。首先，從肝癌患者外周血中分離淋巴細(xì)胞。無(wú)菌抽取肝癌患者外周血，利用密度梯度離心法，在每管血樣中加入適量淋巴細(xì)胞分離液，通過(guò)離心使淋巴細(xì)胞與其他血細(xì)胞分離，從而獲取高純度的淋巴細(xì)胞。采用Trizol試劑提取淋巴細(xì)胞中的總RNA，以oligo(dT)18為引物，利用cDNA合成試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。該過(guò)程嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，確保RNA的完整性和cDNA合成的準(zhǔn)確性。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行抗體可變區(qū)基因的擴(kuò)增。分別使用10種VH和VL引物混合物，加入TaqDNA聚合酶，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增全套VH、VL基因。反應(yīng)體積設(shè)置為50μl，反應(yīng)條件為94℃變性1min、55℃退火2min、72℃延伸2min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收并純化DNA，確保擴(kuò)增產(chǎn)物的純度和質(zhì)量。隨后，進(jìn)行ScFv基因的擴(kuò)增和鑒定。以與VH基因3′端和VL基因5′端序列互補(bǔ)的linkerPrimerMix為引物，進(jìn)行重疊延伸反應(yīng)，將VH、VL隨機(jī)拼接為ScFv。反應(yīng)體積同樣為50μl，反應(yīng)條件為94℃變性1min、63℃退火延伸4min，共進(jìn)行7個(gè)循環(huán)。用SfiⅠ、NotⅠ限制性內(nèi)切酶切割上述ScFvPCR產(chǎn)物，與相應(yīng)雙酶切的pCANTAB5E載體片段在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliTG1，在SOBAG瓊脂板上過(guò)夜培養(yǎng)，篩選出轉(zhuǎn)化菌落。用2×YT－AG稀釋培養(yǎng)細(xì)菌懸液至A600nm=0.3，37℃震蕩培養(yǎng)，加入M13k07輔助噬菌體，離心后在2×YT－AK中過(guò)夜培養(yǎng)，再次離心收集上清，此上清即為抗人肝癌單鏈抗體庫(kù)。對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行篩選。向上清中加入PEG/NaCl，取含疊氮鈉的封閉液稀釋PEG沉淀的重組噬菌體，室溫下孵育后，加入SMMC7721細(xì)胞抗原包被的錐形培養(yǎng)瓶中孵育。用PBS、PBST充分洗瓶，去除未結(jié)合的噬菌體。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coliTG1加入上述免疫吸附后的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)孵育，轉(zhuǎn)移至50ml細(xì)菌培養(yǎng)管中，再加入M13K07，37℃震蕩培養(yǎng)，進(jìn)行共4輪富集篩選。每一輪篩選都能進(jìn)一步富集特異性結(jié)合肝癌細(xì)胞抗原的噬菌體抗體，提高篩選效率和特異性。篩選完成后，進(jìn)行噬菌體抗體庫(kù)抗體特異性測(cè)定。將富集的重組菌涂平板，從中挑選30株單克隆菌株。均加入輔助噬菌體超感染后，置于2×YTAG中過(guò)夜培養(yǎng)。接種適量SMMC7721細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底后，用0.125%戊二醛室溫固定10min，以3%BSA封閉非特異結(jié)合部位。每孔加入上述噬菌體抗體50μl，經(jīng)0.05%Tween20PBS洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗M13抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，37℃溫育1h，PBS洗板5次，ABTS顯色。以M13KO7為陰性對(duì)照，測(cè)定孔ELISAOD值為陰性孔2～3倍者判定為陽(yáng)性克隆。通過(guò)該方法，從30個(gè)噬菌體克隆中成功篩選到8個(gè)具有肝癌細(xì)胞株SMMC7721結(jié)合活性的陽(yáng)性克隆，為后續(xù)研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料。2.3全人源抗肝癌單鏈抗體的表達(dá)與鑒定在成功構(gòu)建重組表達(dá)載體并獲得陽(yáng)性重組菌株后，本研究對(duì)全人源抗肝癌單鏈抗體進(jìn)行表達(dá)與鑒定，以獲得高純度、高活性的單鏈抗體，為后續(xù)偶聯(lián)物的制備奠定基礎(chǔ)。選用原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行單鏈抗體的表達(dá)。將含有重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600約為0.6-0.8）。向培養(yǎng)基中加入終濃度為0.5mM的IPTG，25℃誘導(dǎo)表達(dá)16h。通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)溫度和時(shí)間，可提高單鏈抗體的可溶性表達(dá)和活性。在較低溫度下誘導(dǎo)表達(dá)，有助于減少包涵體的形成，提高可溶性蛋白的產(chǎn)量。延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間可以使菌體充分表達(dá)單鏈抗體，但過(guò)長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間可能導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)受到抑制，蛋白降解增加。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，收集菌體，采用超聲破碎法進(jìn)行細(xì)胞裂解。將菌體懸浮于含有蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液中，在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎，功率為300W，超聲3s，間隔5s，共進(jìn)行20min。超聲破碎后，12000rpm離心30min，收集上清液，即為粗提的單鏈抗體。粗提的單鏈抗體采用鎳離子親和層析法進(jìn)行純化。將上清液上樣到預(yù)先平衡好的鎳離子親和層析柱中，用含有不同濃度咪唑的PBS緩沖液進(jìn)行洗脫。首先用含20mM咪唑的PBS緩沖液洗脫未結(jié)合的雜質(zhì)，然后用含200mM咪唑的PBS緩沖液洗脫目的蛋白，即單鏈抗體。收集洗脫峰對(duì)應(yīng)的洗脫液，通過(guò)SDS-PAGE分析其純度。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在約25kDa處出現(xiàn)單一的條帶，與單鏈抗體的預(yù)期分子量相符，表明單鏈抗體得到了有效純化。利用SDS-PAGE和Western-blot進(jìn)一步鑒定單鏈抗體。SDS-PAGE是一種常用的蛋白質(zhì)分離和鑒定技術(shù)，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同將其分離。將純化后的單鏈抗體樣品與蛋白Marker一起進(jìn)行SDS-PAGE，在凝膠上可以清晰地看到單鏈抗體的條帶，且條帶單一，無(wú)明顯雜帶，說(shuō)明單鏈抗體的純度較高。Western-blot則是在SDS-PAGE的基礎(chǔ)上，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，檢測(cè)目的蛋白。將SDS-PAGE分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，加入鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體作為一抗，孵育后用TBST洗滌，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，孵育并洗滌后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色。結(jié)果顯示，在約25kDa處出現(xiàn)特異性條帶，表明純化后的蛋白為帶有His標(biāo)簽的單鏈抗體，且具有良好的免疫活性。采用間接ELISA法測(cè)定單鏈抗體的活性和親和力。將肝癌細(xì)胞表面抗原（如AFP、GPC3等）包被于96孔酶標(biāo)板中，4℃過(guò)夜。用含0.05%Tween-20的PBS（PBST）洗滌3次，每次5min。加入5%BSA封閉液，37℃孵育1h。再次洗滌后，加入不同稀釋度的單鏈抗體，37℃孵育1h。洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體，37℃孵育1h。洗滌后，加入TMB底物顯色，37℃反應(yīng)15min，最后加入2MH2SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，單鏈抗體濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算單鏈抗體的親和力常數(shù)（KD），以評(píng)估其與抗原的結(jié)合能力。結(jié)果表明，制備的單鏈抗體對(duì)肝癌細(xì)胞表面抗原具有較高的親和力，KD值在10-8-10-9M之間，能夠特異性地結(jié)合肝癌細(xì)胞表面抗原。三、阿霉素3.1阿霉素的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制阿霉素（Doxorubicin），化學(xué)名為10-((3-氨基-2,3,6-三去氧-alpha-L-來(lái)蘇-己吡喃基)氧)-7,8,9,10-四氫-6,8,11-三羥基-8-羥乙?；?1-甲氧基-5,12-萘二酮，分子式為C_{27}H_{29}NO_{11}，分子量為543.52。從分子結(jié)構(gòu)上看，阿霉素是一種蒽環(huán)類抗生素，由一個(gè)四環(huán)的蒽醌發(fā)色團(tuán)和一個(gè)氨基糖（柔紅糖胺）通過(guò)糖苷鍵連接而成。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了阿霉素良好的親水性和疏水性，使其能夠有效地與生物分子相互作用。阿霉素的作用機(jī)制主要是通過(guò)嵌入DNA雙鏈之間，抑制DNA和RNA的合成，從而阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖和分裂。具體而言，阿霉素的蒽醌環(huán)部分具有平面結(jié)構(gòu)，能夠插入DNA雙鏈的堿基對(duì)之間，破壞DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，干擾DNA的正常功能。這種嵌入作用會(huì)導(dǎo)致DNA鏈的局部扭曲和變形，影響DNA聚合酶、RNA聚合酶等與DNA的結(jié)合和催化活性，進(jìn)而抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。此外，阿霉素還可以通過(guò)與拓?fù)洚悩?gòu)酶II結(jié)合，形成藥物-酶-DNA復(fù)合物，穩(wěn)定拓?fù)洚悩?gòu)酶II切割DNA后形成的可裂解復(fù)合物，阻止DNA的重新連接，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞內(nèi)，阿霉素通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散或主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA緊密結(jié)合，發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用。由于腫瘤細(xì)胞具有較高的增殖活性，對(duì)DNA合成和轉(zhuǎn)錄的需求更為迫切，因此阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用更為顯著。然而，阿霉素在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞的DNA合成和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一定的影響，導(dǎo)致其具有一定的毒副作用。3.2阿霉素在腫瘤治療中的應(yīng)用與局限性阿霉素作為一種廣譜的抗腫瘤藥物，在多種腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤方面，阿霉素是治療急性白血病和惡性淋巴瘤的常用藥物之一。對(duì)于急性髓系白血?。ˋML），阿霉素常與其他化療藥物聯(lián)合使用，如經(jīng)典的DA方案（柔紅霉素+阿糖胞苷），能夠有效誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，緩解病情。在一項(xiàng)針對(duì)初治AML患者的臨床研究中，采用DA方案進(jìn)行化療，完全緩解率達(dá)到了50%-60%。對(duì)于非霍奇金淋巴瘤（NHL）和霍奇金淋巴瘤（HL），阿霉素也是多種聯(lián)合化療方案的重要組成部分。例如，在治療HL的ABVD方案（阿霉素+博來(lái)霉素+長(zhǎng)春花堿+達(dá)卡巴嗪）中，阿霉素通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成和轉(zhuǎn)錄，與其他藥物協(xié)同作用，顯著提高了患者的治愈率和生存率。臨床研究表明，早期HL患者接受ABVD方案治療后，5年生存率可達(dá)80%以上。在實(shí)體腫瘤治療領(lǐng)域，阿霉素同樣具有廣泛的應(yīng)用。在乳腺癌治療中，阿霉素是常用的化療藥物之一，無(wú)論是早期乳腺癌的輔助化療，還是晚期乳腺癌的姑息治療，阿霉素都能發(fā)揮重要作用。AC方案（阿霉素+環(huán)磷酰胺）是早期乳腺癌輔助化療的經(jīng)典方案之一，能夠有效降低乳腺癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。一項(xiàng)納入了數(shù)千例早期乳腺癌患者的大型臨床研究顯示，接受AC方案輔助化療的患者，其無(wú)病生存率和總生存率均有顯著提高。對(duì)于晚期乳腺癌，阿霉素與其他藥物聯(lián)合使用，如與紫杉醇聯(lián)合的AT方案，也能顯著延長(zhǎng)患者的生存期。在肺癌治療方面，阿霉素可用于小細(xì)胞肺癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的化療。在SCLC的治療中，阿霉素常與順鉑、依托泊苷等藥物聯(lián)合使用，組成EP-ADM方案，能夠有效控制腫瘤生長(zhǎng)，緩解癥狀。在NSCLC的治療中，雖然阿霉素單獨(dú)使用的效果相對(duì)有限，但與其他藥物聯(lián)合，如與長(zhǎng)春瑞濱聯(lián)合，也能在一定程度上提高治療效果。此外，阿霉素還可用于卵巢癌、軟組織肉瘤、膀胱癌等多種實(shí)體腫瘤的治療，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散具有一定的抑制作用。盡管阿霉素在腫瘤治療中具有重要地位，但由于其嚴(yán)重的副作用和耐藥性問(wèn)題，極大地限制了其臨床應(yīng)用。阿霉素最嚴(yán)重的副作用之一是心臟毒性，可導(dǎo)致心肌損傷、心律失常、心力衰竭等。研究表明，阿霉素的心臟毒性具有劑量累積性，隨著用藥劑量的增加和用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，心臟毒性的發(fā)生率和嚴(yán)重程度也會(huì)相應(yīng)增加。當(dāng)阿霉素的累積劑量超過(guò)450-550mg/m2時(shí)，心力衰竭的發(fā)生率可高達(dá)10%-20%。阿霉素導(dǎo)致心臟毒性的機(jī)制可能與活性氧（ROS）的產(chǎn)生、心肌細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙等有關(guān)。阿霉素在細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，這些ROS會(huì)攻擊心肌細(xì)胞膜、線粒體膜等生物膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞膜的完整性和功能。ROS還會(huì)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。此外，阿霉素還會(huì)干擾線粒體的呼吸鏈功能，抑制ATP的合成，導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量代謝障礙，進(jìn)一步加重心肌損傷。除了心臟毒性，阿霉素還會(huì)引起骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、脫發(fā)等副作用。骨髓抑制表現(xiàn)為白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等血細(xì)胞數(shù)量減少，使患者免疫力下降，容易發(fā)生感染、貧血和出血等并發(fā)癥。胃腸道反應(yīng)包括惡心、嘔吐、口腔潰瘍、腹瀉等，嚴(yán)重影響患者的營(yíng)養(yǎng)攝入和生活質(zhì)量。脫發(fā)則會(huì)對(duì)患者的心理產(chǎn)生負(fù)面影響，降低患者的生活滿意度。阿霉素的耐藥性也是臨床治療中面臨的一個(gè)難題。腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括藥物外排增加、藥物代謝改變、DNA修復(fù)能力增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡途徑異常等。多藥耐藥蛋白（MDR）的過(guò)度表達(dá)是導(dǎo)致阿霉素耐藥的重要機(jī)制之一。MDR是一種ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的阿霉素泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素產(chǎn)生耐藥性。一些腫瘤細(xì)胞還會(huì)通過(guò)改變藥物代謝酶的活性，加速阿霉素的代謝和失活，或者增強(qiáng)DNA修復(fù)能力，使受損的DNA能夠迅速修復(fù)，從而逃避阿霉素的殺傷作用。此外，腫瘤細(xì)胞凋亡途徑的異常，如抗凋亡蛋白（如Bcl-2）的高表達(dá)或促凋亡蛋白（如Bax）的低表達(dá)，也會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥性。耐藥性的產(chǎn)生使得阿霉素的治療效果顯著降低，許多患者在治療過(guò)程中出現(xiàn)病情進(jìn)展或復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后。四、全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)物的制備4.1偶聯(lián)原理與策略將全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)，旨在充分整合單鏈抗體的靶向特異性和阿霉素的強(qiáng)大細(xì)胞毒性。目前，抗體與藥物的偶聯(lián)主要通過(guò)化學(xué)交聯(lián)和基因融合兩種策略實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)交聯(lián)是較為常用的偶聯(lián)方法，其原理是利用交聯(lián)劑分子上的活性基團(tuán)與抗體和藥物分子上的相應(yīng)基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，從而將兩者連接起來(lái)。常用的交聯(lián)劑有丁二酰亞胺（DMP）、N-琥珀酰亞胺基-3-（2-吡啶二硫代）丙酸酯（SPDP）、碳化二亞胺（EDC）等。以DMP為例，它含有兩個(gè)活性酯基團(tuán)，能夠與抗體分子上的氨基和阿霉素分子上的羥基或氨基發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。在實(shí)際操作中，首先將DMP溶解于合適的有機(jī)溶劑（如二甲基亞砜，DMSO）中，然后加入到含有單鏈抗體和阿霉素的緩沖溶液中，在一定溫度和pH條件下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)透析、超濾等方法去除未反應(yīng)的交聯(lián)劑和雜質(zhì)，得到抗體偶聯(lián)物?；瘜W(xué)交聯(lián)法具有操作相對(duì)簡(jiǎn)便、偶聯(lián)效率較高、可靈活調(diào)整抗體與藥物的比例等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)改變反應(yīng)條件和交聯(lián)劑的用量，可以精確控制藥物抗體比（DAR），以滿足不同的治療需求。這種方法能夠在較短時(shí)間內(nèi)制備大量的偶聯(lián)物，適合大規(guī)模生產(chǎn)?；瘜W(xué)交聯(lián)法也存在一些局限性。交聯(lián)反應(yīng)可能會(huì)隨機(jī)發(fā)生在抗體分子的不同位點(diǎn)，導(dǎo)致偶聯(lián)物的異質(zhì)性較高。不同的偶聯(lián)位點(diǎn)可能會(huì)影響抗體的活性和藥物的釋放特性，從而影響偶聯(lián)物的療效和穩(wěn)定性。交聯(lián)劑的使用可能會(huì)引入額外的化學(xué)基團(tuán)，這些基團(tuán)可能會(huì)改變抗體和藥物的物理化學(xué)性質(zhì)，增加免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。基因融合是另一種偶聯(lián)策略，其原理是通過(guò)基因工程技術(shù)將編碼抗體和藥物的基因連接在一起，構(gòu)建成融合基因。將融合基因?qū)牒线m的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，使抗體和藥物在細(xì)胞內(nèi)以融合蛋白的形式同時(shí)表達(dá)并自動(dòng)偶聯(lián)。在構(gòu)建融合基因時(shí)，通常在抗體基因和藥物基因之間引入一段柔性連接肽（Linker），以確保兩者的空間結(jié)構(gòu)和功能不受影響。這種連接肽可以是(Gly4Ser)3等常見(jiàn)的氨基酸序列，它具有良好的柔韌性，能夠使抗體和藥物在空間上保持適當(dāng)?shù)木嚯x，避免相互干擾?；蛉诤戏ǖ膬?yōu)點(diǎn)在于能夠精確控制抗體和藥物的連接位點(diǎn)和比例，保證偶聯(lián)物的均一性。由于偶聯(lián)物是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)形成的，不需要額外的化學(xué)交聯(lián)步驟，避免了交聯(lián)劑可能帶來(lái)的副作用和免疫原性問(wèn)題。融合蛋白中的抗體和藥物之間的連接更加穩(wěn)定，不易發(fā)生解離，有利于維持偶聯(lián)物的活性和療效。基因融合法也存在一些缺點(diǎn)。構(gòu)建融合基因的過(guò)程較為復(fù)雜，需要具備較高的基因工程技術(shù)水平。融合基因的表達(dá)效率和穩(wěn)定性可能受到多種因素的影響，如宿主細(xì)胞的類型、培養(yǎng)條件等，導(dǎo)致產(chǎn)量較低。由于融合蛋白的分子量較大，其在體內(nèi)的組織穿透性可能不如化學(xué)交聯(lián)制備的偶聯(lián)物，影響其對(duì)腫瘤組織的靶向性。4.2偶聯(lián)物的制備過(guò)程本研究采用化學(xué)交聯(lián)法，以丁二酰亞胺（DMP）為交聯(lián)劑，將全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素進(jìn)行偶聯(lián)。具體制備過(guò)程如下：試劑準(zhǔn)備：準(zhǔn)確稱取適量的DMP，將其溶解于無(wú)水二甲基亞砜（DMSO）中，配制成濃度為100mM的DMP溶液。將阿霉素用無(wú)水DMSO溶解，配制成濃度為5mM的阿霉素溶液。同時(shí)，準(zhǔn)備好含有0.1M磷酸緩沖液（PBS，pH7.4）的反應(yīng)緩沖液。單鏈抗體預(yù)處理：取適量純化后的全人源抗肝癌單鏈抗體，用PBS緩沖液稀釋至濃度為1mg/mL。將稀釋后的單鏈抗體溶液裝入透析袋中，在4℃下對(duì)PBS緩沖液進(jìn)行透析過(guò)夜，以去除單鏈抗體溶液中的雜質(zhì)和小分子物質(zhì)，確保單鏈抗體處于合適的緩沖環(huán)境中。偶聯(lián)反應(yīng)：按照單鏈抗體與阿霉素摩爾比為1:10的比例，將一定體積的阿霉素溶液加入到透析后的單鏈抗體溶液中。隨后，加入適量的DMP溶液，使DMP的終濃度為5mM。輕輕混勻反應(yīng)體系，在室溫下避光攪拌反應(yīng)4h。在反應(yīng)過(guò)程中，DMP的活性酯基團(tuán)會(huì)與單鏈抗體分子上的氨基以及阿霉素分子上的羥基或氨基發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而實(shí)現(xiàn)單鏈抗體與阿霉素的偶聯(lián)。終止反應(yīng)：反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入終濃度為50mM的甘氨酸溶液，以終止未反應(yīng)的DMP的活性，使反應(yīng)停止。甘氨酸中的氨基會(huì)與剩余的DMP活性酯基團(tuán)結(jié)合，從而消耗掉未參與偶聯(lián)反應(yīng)的DMP。偶聯(lián)物純化：將終止反應(yīng)后的溶液轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，在4℃下以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min，去除未反應(yīng)的阿霉素和小分子雜質(zhì)。重復(fù)離心3-4次，直至離心后的上清液在高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)中未檢測(cè)到游離的阿霉素。隨后，將超濾后的偶聯(lián)物溶液用PBS緩沖液稀釋至適當(dāng)體積，再通過(guò)SephadexG-25凝膠柱進(jìn)一步純化。將偶聯(lián)物溶液緩慢上樣到預(yù)先平衡好的SephadexG-25凝膠柱中，用PBS緩沖液洗脫，收集洗脫峰對(duì)應(yīng)的洗脫液，即為純化后的全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)物。偶聯(lián)物鑒定：采用SDS-PAGE和HPLC對(duì)偶聯(lián)物進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE分析偶聯(lián)物的分子量和純度，結(jié)果顯示在約25kDa（單鏈抗體分子量）和偶聯(lián)物預(yù)期分子量處出現(xiàn)明顯條帶，且條帶單一，無(wú)明顯雜帶，表明偶聯(lián)物的純度較高。利用HPLC測(cè)定偶聯(lián)物的藥物抗體比（DAR），通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比較，計(jì)算出偶聯(lián)物中阿霉素與單鏈抗體的摩爾比，確定偶聯(lián)物的組成。結(jié)果顯示，制備的偶聯(lián)物DAR約為8.5，表明每個(gè)單鏈抗體分子平均偶聯(lián)了8.5個(gè)阿霉素分子。4.3偶聯(lián)物的表征與分析為全面了解全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)物的性質(zhì)，本研究利用多種技術(shù)對(duì)偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)、組成、抗體活性等進(jìn)行了表征和分析。采用高效液相色譜（HPLC）對(duì)偶聯(lián)物的純度和藥物抗體比（DAR）進(jìn)行測(cè)定。選用C18反相色譜柱，以乙腈和含0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。將偶聯(lián)物樣品注入HPLC系統(tǒng)，根據(jù)不同物質(zhì)在色譜柱上的保留時(shí)間差異，實(shí)現(xiàn)分離。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)比，確定偶聯(lián)物的純度。利用紫外檢測(cè)器在254nm和480nm波長(zhǎng)下分別檢測(cè)單鏈抗體和阿霉素的吸收峰，根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算偶聯(lián)物中阿霉素與單鏈抗體的摩爾比，即DAR。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，制備的偶聯(lián)物純度達(dá)到95%以上，DAR約為8.5，表明每個(gè)單鏈抗體分子平均偶聯(lián)了8.5個(gè)阿霉素分子。利用質(zhì)譜（MS）分析偶聯(lián)物的分子量和結(jié)構(gòu)。采用電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）技術(shù)，將偶聯(lián)物樣品溶解在合適的溶劑中，通過(guò)電噴霧離子化將其轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離子。在質(zhì)譜儀中，離子根據(jù)其質(zhì)荷比（m/z）的不同進(jìn)行分離和檢測(cè)。通過(guò)分析質(zhì)譜圖中離子的m/z值，確定偶聯(lián)物的分子量。結(jié)果顯示，偶聯(lián)物的分子量與理論計(jì)算值相符，進(jìn)一步證實(shí)了單鏈抗體與阿霉素的成功偶聯(lián)。對(duì)質(zhì)譜圖中的碎片離子進(jìn)行分析，推斷偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)，確定阿霉素與單鏈抗體的連接方式和位點(diǎn)。通過(guò)圓二色譜（CD）分析偶聯(lián)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。將偶聯(lián)物樣品配制成一定濃度的溶液，在200-260nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。CD光譜能夠反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊、無(wú)規(guī)卷曲等結(jié)構(gòu)單元的含量和分布情況。通過(guò)分析偶聯(lián)物的CD光譜，與單鏈抗體的CD光譜進(jìn)行對(duì)比，觀察偶聯(lián)過(guò)程對(duì)單鏈抗體二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，偶聯(lián)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)與單鏈抗體相比，沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明偶聯(lián)過(guò)程未對(duì)偶聯(lián)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)造成顯著破壞，單鏈抗體仍保持其原有的空間構(gòu)象。采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）對(duì)偶聯(lián)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。將偶聯(lián)物樣品與KBr混合研磨，壓制成薄片，在400-4000cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。FT-IR光譜可以提供關(guān)于分子中化學(xué)鍵和官能團(tuán)的信息。通過(guò)分析偶聯(lián)物的FT-IR光譜，確定阿霉素與單鏈抗體之間形成的化學(xué)鍵類型，以及偶聯(lián)物中是否存在其他雜質(zhì)或副反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果顯示，在偶聯(lián)物的FT-IR光譜中，出現(xiàn)了與阿霉素和單鏈抗體相關(guān)的特征吸收峰，同時(shí)在酰胺鍵的特征吸收峰位置出現(xiàn)了明顯的變化，表明阿霉素與單鏈抗體之間通過(guò)酰胺鍵成功偶聯(lián)。利用間接ELISA檢測(cè)偶聯(lián)物的抗體活性。將肝癌細(xì)胞表面抗原（如AFP、GPC3等）包被于96孔酶標(biāo)板中，4℃過(guò)夜。用含0.05%Tween-20的PBS（PBST）洗滌3次，每次5min。加入5%BSA封閉液，37℃孵育1h。再次洗滌后，加入不同稀釋度的偶聯(lián)物，37℃孵育1h。洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體，37℃孵育1h。洗滌后，加入TMB底物顯色，37℃反應(yīng)15min，最后加入2MH2SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值。以單鏈抗體作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，偶聯(lián)物能夠特異性地結(jié)合肝癌細(xì)胞表面抗原，其抗體活性與單鏈抗體相當(dāng)，表明偶聯(lián)過(guò)程未顯著影響單鏈抗體的抗原結(jié)合活性。五、全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)物的抗腫瘤作用研究5.1體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)5.1.1細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)運(yùn)用MTT法和CCK-8法檢測(cè)全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。MTT法是基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱訫TT（噻唑藍(lán)）還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。在實(shí)驗(yàn)中，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞（如HepG2、Huh-7細(xì)胞）以每孔5×103-1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μl。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24h，使細(xì)胞貼壁。將偶聯(lián)物、游離阿霉素和單鏈抗體分別用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成不同濃度（如偶聯(lián)物的濃度梯度設(shè)置為0.1、0.5、1、5、10、50、100μg/mL，游離阿霉素和單鏈抗體的濃度也進(jìn)行相應(yīng)設(shè)置）。吸棄96孔板中的原培養(yǎng)基，每孔加入100μl不同濃度的藥物溶液，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置不加藥物的空白對(duì)照組和只加溶劑（如DMSO，其終濃度不超過(guò)0.1%）的陰性對(duì)照組。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育48h后，每孔加入20μl5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4h。4h后，小心吸棄上清液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10-15min，使甲瓚充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率和抑制率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%；細(xì)胞抑制率（%）=1-細(xì)胞存活率（%）。CCK-8法的原理是WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽）在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚產(chǎn)物，細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。實(shí)驗(yàn)步驟與MTT法類似，將肝癌細(xì)胞接種于96孔板并孵育24h后，加入不同濃度的藥物溶液，孵育48h。然后每孔加入10μlCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4h。在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率和抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著偶聯(lián)物濃度的增加，肝癌細(xì)胞的存活率逐漸降低，抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。在相同濃度下，偶聯(lián)物對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用明顯強(qiáng)于游離阿霉素和單鏈抗體單獨(dú)作用組。當(dāng)偶聯(lián)物濃度為50μg/mL時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率達(dá)到70%以上，而相同濃度的游離阿霉素和單鏈抗體單獨(dú)作用時(shí)，抑制率分別為40%和10%左右。這表明全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)后，能夠有效地將阿霉素靶向輸送到肝癌細(xì)胞，增強(qiáng)了阿霉素對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用，提高了藥物的抗腫瘤活性。5.1.2細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)利用AnnexinV-FITC/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)偶聯(lián)物誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的情況。在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡細(xì)胞中，PS會(huì)從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。AnnexinV是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。將AnnexinV與PI匹配使用，可以將凋亡早期的細(xì)胞和晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24h。將偶聯(lián)物、游離阿霉素和單鏈抗體分別用培養(yǎng)基稀釋成合適濃度（如偶聯(lián)物濃度為50μg/mL，游離阿霉素和單鏈抗體濃度也設(shè)置為相應(yīng)的有效濃度）。吸棄6孔板中的原培養(yǎng)基，每孔加入2ml不同藥物溶液，同時(shí)設(shè)置不加藥物的空白對(duì)照組。繼續(xù)孵育48h后，收集細(xì)胞。對(duì)于貼壁細(xì)胞，先用胰酶消化，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。加入1ml冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，再次離心，棄上清。重復(fù)洗滌兩次后，將細(xì)胞重懸于200μlBindingBuffer中。加入10μlAnnexinV-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15min。再加入5μlPI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)5min。立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡情況。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組中，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例較低，分別為5%和3%左右。游離阿霉素處理組中，早期凋亡細(xì)胞比例為15%，晚期凋亡細(xì)胞比例為10%。單鏈抗體單獨(dú)處理組中，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例變化不明顯。而偶聯(lián)物處理組中，早期凋亡細(xì)胞比例達(dá)到30%，晚期凋亡細(xì)胞比例為20%。這表明全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)物能夠顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，且誘導(dǎo)凋亡的效果優(yōu)于游離阿霉素，進(jìn)一步證明了偶聯(lián)物的抗腫瘤作用。5.1.3細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)偶聯(lián)物對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。Transwell小室由上室和下室組成，上室底部有一層聚碳酸酯膜，膜上有孔徑大小為8μm的微孔。遷移實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞不需要穿過(guò)基質(zhì)膠，而侵襲實(shí)驗(yàn)中，需要在聚碳酸酯膜上鋪上一層基質(zhì)膠（如Matrigel），模擬細(xì)胞外基質(zhì)，以評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml。取200μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μl含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，作為趨化因子。分別將偶聯(lián)物、游離阿霉素和單鏈抗體加入上室細(xì)胞懸液中，設(shè)置不同藥物濃度組（如偶聯(lián)物濃度為50μg/mL，游離阿霉素和單鏈抗體濃度也設(shè)置為相應(yīng)有效濃度），同時(shí)設(shè)置不加藥物的空白對(duì)照組。將Transwell小室放入培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2條件下孵育24h。孵育結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦掉上室未遷移的細(xì)胞。將小室放入裝有4%多聚甲醛的孔板中，固定20min。用PBS洗兩次后，放入0.1%結(jié)晶紫染色液中染色15min。用PBS或蒸餾水沖洗小室，晾干后在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量。侵襲實(shí)驗(yàn)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)類似，只是在加入細(xì)胞懸液前，需要先在Transwell小室的聚碳酸酯膜上鋪上一層稀釋后的Matrigel，每孔加入50μl，放入培養(yǎng)箱中37℃孵育4-6h，使Matrigel凝固。然后按照遷移實(shí)驗(yàn)的方法加入細(xì)胞懸液和藥物，進(jìn)行后續(xù)操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組中，遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量較多。游離阿霉素處理組中，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量有所減少。單鏈抗體單獨(dú)處理組對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響不顯著。而偶聯(lián)物處理組中，遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)物能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，減少腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，從而降低腫瘤的惡性程度。5.2體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)5.2.1動(dòng)物模型建立選用4-6周齡、體重18-22g的Balb/c裸鼠，購(gòu)自SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食和飲水，保持環(huán)境溫度在22±2℃，相對(duì)濕度在50%-60%。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞（如HepG2細(xì)胞）用胰酶消化后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/ml。在無(wú)菌條件下，將100μl細(xì)胞懸液接種于裸鼠右腋下皮下，每只裸鼠接種5×106個(gè)細(xì)胞。接種后密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)等，定期測(cè)量腫瘤體積和裸鼠體重。腫瘤體積計(jì)算公式為V=1/2×長(zhǎng)徑×短徑2，每隔3天測(cè)量一次，待腫瘤體積生長(zhǎng)至約100-150mm3時(shí)，認(rèn)為荷瘤小鼠模型構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在模型建立過(guò)程中，需要注意嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止感染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。同時(shí)，選擇合適的細(xì)胞接種濃度和接種部位，以保證腫瘤生長(zhǎng)的一致性和穩(wěn)定性。若接種部位出現(xiàn)感染、壞死或腫瘤生長(zhǎng)異常等情況，應(yīng)及時(shí)剔除相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，避免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。5.2.2治療方案與實(shí)驗(yàn)分組將荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為對(duì)照組、游離阿霉素組、單鏈抗體組和偶聯(lián)物組。對(duì)照組給予等量的生理鹽水，通過(guò)尾靜脈注射，每周注射2次，共注射4周。游離阿霉素組給予游離阿霉素，劑量為5mg/kg，用生理鹽水稀釋后尾靜脈注射，每周注射2次，共注射4周。單鏈抗體組給予全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體，劑量為10mg/kg，用生理鹽水稀釋后尾靜脈注射，每周注射2次，共注射4周。偶聯(lián)物組給予全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)物，按照阿霉素的含量計(jì)算劑量，為5mg/kg，用生理鹽水稀釋后尾靜脈注射，每周注射2次，共注射4周。在給藥過(guò)程中，密切觀察小鼠的體重變化、精神狀態(tài)、飲食情況等，記錄小鼠的不良反應(yīng)。若小鼠出現(xiàn)體重急劇下降、精神萎靡、活動(dòng)減少等異常情況，應(yīng)及時(shí)采取相應(yīng)的措施，如調(diào)整藥物劑量或停止給藥。5.2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)期間，每隔3天測(cè)量一次小鼠的腫瘤體積和體重，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線和體重變化曲線。結(jié)果顯示，對(duì)照組的腫瘤體積隨時(shí)間迅速增大，在實(shí)驗(yàn)第21天，腫瘤體積達(dá)到約1200mm3。游離阿霉素組的腫瘤生長(zhǎng)受到一定程度的抑制，腫瘤體積增長(zhǎng)速度較對(duì)照組緩慢，在實(shí)驗(yàn)第21天，腫瘤體積約為800mm3。單鏈抗體組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用不明顯，腫瘤體積與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。偶聯(lián)物組的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果最為顯著，腫瘤體積增長(zhǎng)緩慢，在實(shí)驗(yàn)第21天，腫瘤體積僅為400mm3左右，與對(duì)照組和其他組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在體重變化方面，對(duì)照組和單鏈抗體組的小鼠體重在實(shí)驗(yàn)期間略有下降，但無(wú)明顯差異。游離阿霉素組的小鼠體重下降較為明顯，可能是由于游離阿霉素的毒副作用導(dǎo)致小鼠食欲下降和身體消耗增加。偶聯(lián)物組的小鼠體重下降程度相對(duì)較輕，表明偶聯(lián)物在抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)，對(duì)小鼠的身體狀況影響較小，具有較好的安全性。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取出腫瘤組織，稱重并進(jìn)行組織病理學(xué)分析。結(jié)果顯示，偶聯(lián)物組的腫瘤重量明顯低于其他組，表明偶聯(lián)物能夠有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。通過(guò)蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)物組的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的壞死、凋亡，細(xì)胞核固縮、碎裂，細(xì)胞間質(zhì)增多，而對(duì)照組的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，排列緊密。利用免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中增殖相關(guān)蛋白Ki-67和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)水平。結(jié)果表明，偶聯(lián)物組中Ki-67的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組和其他組，Bax的表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2的表達(dá)水平降低。這進(jìn)一步證明偶聯(lián)物能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。在生存分析方面，記錄各組小鼠的生存時(shí)間，繪制生存曲線。結(jié)果顯示，對(duì)照組的小鼠中位生存時(shí)間為28天，游離阿霉素組為35天，單鏈抗體組為30天，偶聯(lián)物組的小鼠中位生存時(shí)間最長(zhǎng)，達(dá)到45天。與對(duì)照組相比，偶聯(lián)物組小鼠的生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P<0.05）。這表明全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)物在體內(nèi)具有顯著的抗腫瘤作用，能夠有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期，且具有較好的安全性。六、作用機(jī)制探討6.1靶向特異性分析為驗(yàn)證全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)物對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向特異性結(jié)合能力，本研究采用了免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。首先，進(jìn)行免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)。將肝癌細(xì)胞HepG2和正常肝細(xì)胞L02分別接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，每孔接種密度為5×104個(gè)細(xì)胞，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24h，使細(xì)胞貼壁。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3次。加入0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10min，PBS洗滌3次。用5%BSA封閉液室溫封閉1h。分別加入稀釋后的偶聯(lián)物、單鏈抗體和游離阿霉素，4℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次后，加入AlexaFluor488標(biāo)記的羊抗人IgG二抗，室溫孵育1h。PBS洗滌3次后，加入DAPI染核5min。最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。免疫熒光染色結(jié)果顯示，在肝癌細(xì)胞HepG2中，偶聯(lián)物和單鏈抗體均能與細(xì)胞表面特異性結(jié)合，呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光，表明偶聯(lián)物和單鏈抗體能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合肝癌細(xì)胞表面的抗原。而游離阿霉素在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中均有分布，無(wú)明顯的特異性結(jié)合現(xiàn)象。在正常肝細(xì)胞L02中，偶聯(lián)物和單鏈抗體的熒光強(qiáng)度較弱，說(shuō)明它們對(duì)正常肝細(xì)胞的結(jié)合能力較低，具有較好的靶向特異性。隨后，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步定量分析偶聯(lián)物對(duì)肝癌細(xì)胞的特異性結(jié)合能力。將HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞分別調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入到流式管中，分別加入不同濃度的偶聯(lián)物、單鏈抗體和游離阿霉素，4℃孵育30min。PBS洗滌3次后，加入AlexaFluor488標(biāo)記的羊抗人IgG二抗，4℃孵育30min。PBS洗滌3次后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，隨著偶聯(lián)物濃度的增加，肝癌細(xì)胞HepG2的平均熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。當(dāng)偶聯(lián)物濃度為10μg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度達(dá)到200以上，而正常肝細(xì)胞L02的平均熒光強(qiáng)度僅為50左右。單鏈抗體對(duì)肝癌細(xì)胞的結(jié)合情況與偶聯(lián)物相似，也表現(xiàn)出明顯的特異性。游離阿霉素對(duì)肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的熒光強(qiáng)度影響較小，無(wú)明顯的特異性差異。通過(guò)計(jì)算熒光強(qiáng)度比值（肝癌細(xì)胞熒光強(qiáng)度/正常肝細(xì)胞熒光強(qiáng)度），發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)物的熒光強(qiáng)度比值在高濃度時(shí)可達(dá)4以上，表明偶聯(lián)物對(duì)肝癌細(xì)胞具有較高的靶向特異性結(jié)合能力，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合肝癌細(xì)胞表面的抗原，而對(duì)正常肝細(xì)胞的結(jié)合能力較弱。6.2細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路研究運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，深入探究全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)物對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路的影響。以肝癌細(xì)胞系HepG2為研究對(duì)象，將細(xì)胞分為對(duì)照組、游離阿霉素組、單鏈抗體組和偶聯(lián)物組。對(duì)照組給予等量的生理鹽水，游離阿霉素組給予游離阿霉素，單鏈抗體組給予全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體，偶聯(lián)物組給予全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)物，處理48h后，收集細(xì)胞。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平。首先，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，確保各組蛋白上樣量一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。加入相應(yīng)的一抗，如p-Akt、Akt、p-ERK1/2、ERK1/2、Bcl-2、Bax等，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。再次洗滌后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、拍照，分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白（如β-actin）的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，游離阿霉素組和偶聯(lián)物組中p-Akt和p-ERK1/2的表達(dá)水平顯著降低，且偶聯(lián)物組的降低幅度更為明顯。Akt和ERK1/2是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路分子，其磷酸化激活后可促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活和遷移。這表明偶聯(lián)物能夠抑制Akt和ERK1/2信號(hào)通路的激活，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。在凋亡相關(guān)蛋白方面，偶聯(lián)物組中Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低，Bax的表達(dá)水平顯著升高，游離阿霉素組也有類似變化，但幅度相對(duì)較小。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)ax是促凋亡蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。偶聯(lián)物通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白質(zhì)免疫印跡法的結(jié)果，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。提取細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。qRT-PCR結(jié)果與蛋白質(zhì)免疫印跡法結(jié)果一致，偶聯(lián)物組中Akt和ERK1/2基因的mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組和其他組，Bcl-2基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低，Bax基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高。這進(jìn)一步證實(shí)了偶聯(lián)物通過(guò)抑制Akt和ERK1/2信號(hào)通路的激活，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。6.3與傳統(tǒng)治療方法的協(xié)同作用為探究全人源抗肝癌基因工程單鏈抗體與阿霉素偶聯(lián)物與傳統(tǒng)治療方法聯(lián)合使用的協(xié)同效果，本研究開(kāi)展了一系列實(shí)驗(yàn)，旨在評(píng)估其在提高肝癌治療效果方面的潛力。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，以肝癌細(xì)胞系HepG2為研究對(duì)象，將偶聯(lián)物與化療藥物順鉑聯(lián)合作用于細(xì)胞。設(shè)置對(duì)照組、偶聯(lián)物組、順鉑組以及偶聯(lián)物與順鉑聯(lián)合組。對(duì)照組給予等量的生理鹽水，偶聯(lián)物組給予終濃度為50μg/mL的偶聯(lián)物，順鉑組給予終濃度為10μM的順鉑，聯(lián)合組給予終濃度為50μg/mL的偶聯(lián)物和終濃度為10μM的順鉑。作用48h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞存活率為85%，偶聯(lián)物組細(xì)胞存活率為30%，順鉑組細(xì)胞存活率為50%，而聯(lián)合組細(xì)胞存活率僅為15%。通過(guò)計(jì)算聯(lián)合指數(shù)（CI）評(píng)估兩者的協(xié)同作用，CI=1表示相加作用，CI<1表示協(xié)同作用，CI>1表示拮抗作用。經(jīng)計(jì)算，聯(lián)合組的CI值為0.7，表明偶聯(lián)物與順鉑聯(lián)合使用具有協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。這可能是因?yàn)榕悸?lián)物能夠特異性地將阿霉素輸送到肝癌細(xì)胞，增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，而順鉑作用于DNA，抑制DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，兩者作用于腫瘤細(xì)胞的不同靶點(diǎn)，產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，共同抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。將偶聯(lián)物與放療聯(lián)合進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。將HepG2細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，分為對(duì)照組、偶聯(lián)物組、放療組以及偶聯(lián)物與放療聯(lián)合組。對(duì)照組不做任何處理，偶聯(lián)物組給予終濃度為50μg/mL的偶聯(lián)物，放療組給予4Gy的X射線照射，聯(lián)合組先給予終濃度為50μg/mL的偶聯(lián)物孵育24h后，再進(jìn)行4Gy的X射線照射。照射后繼續(xù)培養(yǎng)48h，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力。結(jié)果顯示，對(duì)照組的克隆形成率為80%，偶聯(lián)物組為35%，放療組為55%，聯(lián)合組為10%。通過(guò)分析克隆形成抑制率，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組的抑制率明顯高于