2023體外受精胚胎培養(yǎng)過程中的微生物污染

體夕卜受精-胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer,

IVF-ET)過程中,所有技術操作都要求在無菌條件下進行，然而這并不能

杜絕微生物污染的發(fā)生。人類泌尿生殖系統(tǒng)并不是完全無菌的，已知人類

配子及其伴隨的液體攜帶大量微生物，從而有可能通過培養(yǎng)系統(tǒng)傳播到胚

胎期。盡管實驗室執(zhí)行嚴格的質量控制與管理，包括實驗室儀器設備、培

養(yǎng)用耗材與培養(yǎng)液、技術人員、培養(yǎng)環(huán)境等，但源于操作或環(huán)境導致的胚

胎污染還是偶有發(fā)生。幾乎所有的實驗室都制定了避免胚胎培養(yǎng)過程中微

生物污染的方案或措施，但沒有標準或是共識性的方案用于檢測和監(jiān)測微

生物污染［1L關于培養(yǎng)過程中胚胎污染的發(fā)生率報道的數(shù)據(jù)并不多，

Kastrop等［2］報道13977個周期中共檢出污染95例(0.68%);國內

杜鳳嬌等［3］報道了29583個周期中70例(0.24%)微生物污染周期；

Zheng等［4］報道2490個體外受精周期中15例(0.60%)發(fā)生微生物

污染。胚胎污染是小概率偶發(fā)事件，很多中心并沒有詳實的記錄、分析與

污染發(fā)生相關的數(shù)據(jù)，生殖中心的年度報告也很少包括微生物污染發(fā)生的

信息；而且關于這「訶題的出版物和案例報告數(shù)量有限，導致許多生殖中

心認為這是一個可以忽略不計的風險。本文就IVF周期中微生物污染的可

能來源、種類以及處理措施進行探討，以便為應對胚胎污染事情的發(fā)生和

管理提供參考，旨在將胚胎污染事件的發(fā)生率和對生殖醫(yī)學中心以及患者

的影響降至最低。

1污染來源

相比陰道微生物，男性生殖道微生物更容易被忽視。精液的污染率

高于卵泡液，精液及其處理過的樣本被認為是最主要的污染來源［5-6L

在IVF-ET過程中，體外受精胚胎的細菌污染主要由精液引起，精液細菌

培養(yǎng)陽性率為63%~100%［7］,而手淫方式取精是造成精液污染的主要

原因。幾乎所有精液樣本中都存在細菌DNA,盡管這些樣本使用常規(guī)方

法進行的微生物學調查顯示無細菌。最近一項系統(tǒng)性綜述顯示，采用二代

測序技術鑒定并定量精液中存在的細菌種類，種屬包括需氧菌屬、兼性厭

氧菌屬和嚴格厭氧菌等多種類型的機會致病菌［8L精液本身不是無菌的，

在離心洗滌后可能仍然存在［9-10L

卵泡液是第二常見的污染物細菌培養(yǎng)的陽性率為9%?27%111

源于陰道的微生物可能通過卵母細胞采集針從陰道進入卵泡，導致卵泡液

污染。研究發(fā)現(xiàn),在IVF-ET過程中，女性共生菌可能會污染培養(yǎng)系統(tǒng)，

從而對受精和早期胚胎發(fā)育產生不利影響，經含有青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)

基可以有效去除污染微生物［12］然而，體外受精實際發(fā)生污染的微生

物種類比已發(fā)現(xiàn)的微生物可能還要多［13LRicci等［14］報道在855

份陰道樣本中共發(fā)現(xiàn)糞腸球菌率最高，其次為鏈球菌和大腸埃希菌。也有

研究發(fā)現(xiàn)，卵泡液中的大腸埃希菌及糞腸球菌是引起污染的主要因素，同

時也有真菌的污染［3L

第三個潛在來源來自IVF-ET每一步操作環(huán)節(jié)，培養(yǎng)環(huán)境、儀器、玻

璃器皿、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)液、培養(yǎng)箱或操作員。Cottell等［15］對治療前

后的精液樣本進行了細菌培養(yǎng)，在處理后的精液中檢測到少量的表皮葡萄

球菌和綠色鏈球菌，而在未經處理的原始精液中未檢測到此類細菌。這表

明這2種細菌的污染可能源于胚胎實驗室的培養(yǎng)和操作過程。

2污染種類及特點

胚胎培養(yǎng)中最常見的為細菌污染，其特點為污染速度快，易被發(fā)現(xiàn)。

污染較輕時，培養(yǎng)液中可見小菌體，細菌污染1~2d后培養(yǎng)基就會變渾

濁，pH值改變，明顯影響胚胎生長。同樣在體外受精培養(yǎng)中，胚胎培養(yǎng)

第2天的污染發(fā)現(xiàn)率最高，其次是第3天和第4天。推測這可能與培養(yǎng)液

中微生物的來源、生長方式和抗生素的半衰期有關［16］在通過聚合酶

鏈反應（PCR）發(fā)現(xiàn),微生物污染包括乳桿菌、陰道加德納菌、糞腸球菌、

大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌在內的幾種細菌［17］最近研究也顯示，

胚胎培養(yǎng)液中觀察到腸球菌屬的概率較高，其他相對豐富的菌屬包括葡萄

球菌、厭氧球菌、棒狀桿菌、嗜胃腸桿菌和丙酸桿菌等［18］細菌性陰

道?。╞acterialvaginosis,BV戚發(fā)現(xiàn)是不孕不育的主要風險因素［191

霉菌污染特點為短期內不會引起培養(yǎng)液的渾濁，可在培養(yǎng)液中形成白

色或黃色漂浮物。污染后其特點為：低倍鏡下可見乳白色的團狀漂浮物,

高倍鏡下可見明顯的菌絲，細胞活力變差，生長速度明顯變慢。

支原體污染的特點為短期無變化，具有隱蔽性。它們可以與細胞長

培養(yǎng)液對污染胚胎進行反復洗滌，做到一個胚胎一根吸管，每個胚胎洗滌

所用培養(yǎng)液不混用［3］;污染嚴重時采用在洗滌液中添加抗生素、胚胎透

明帶削薄或去透明帶等特殊方法處理。有文獻采用培養(yǎng)液中添加青、鏈霉

素處理［25］:將污染的胚胎在含有濃度為0.15mg/mL青、鏈霉素的培

養(yǎng)基中洗滌數(shù)次,后移入培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng),并在次日，按上述操作對污

染胚胎再次進行清洗。被污染的胚胎在處理后一般均選擇囊胚培養(yǎng)，以鑒

別后續(xù)是否繼續(xù)存在污染，最終選擇處理成功不繼續(xù)帶菌的胚胎進行移植

或冷凍。

關于抗生素的選擇，有學者認為與含有青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)液相

比，慶大霉素更安全［6L然而也有學者認為即使經過反復清洗可能也無

法完全消除污染微生物，因為細菌可能附著在透明帶上引起胚胎培養(yǎng)和移

植過程中進一步污染，因此去除透明帶可將進一步的細菌污染降至最低。

此外,有研究表明，囊胚透明帶去除并不會影響其發(fā)育潛力［26L2016

年Shu等［27］報道對受污染的囊胚進行了激光輔助去除透明帶后移植

并成功獲得活產。

4避免微生物污染的實驗室策略

如何降低和處理在IVF培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)的微生物污染，目前并沒

有共識性方案。為避免胚胎培養(yǎng)過程中發(fā)生污染，實驗室需要從技術操作

程序、環(huán)境、人員以及胚胎培養(yǎng)所需的試劑、耗材等進行全面的管理和質

量控制。

4.1精液采集過程及精源污染的處理在采取手淫法收集精液過程中，

為了避免精液污染，首先，采集精液前徹底清洗手部，保證手部清潔；其

次，保證采集容器的清潔；再次，在采集精液后，及時蓋上容器蓋子，盡

量減少精液與空氣接觸的時間，以防止細菌的污染。

對于精源污染的樣本，受精方式選擇上卵胞漿內單精子注射

(intracytoplasmicsperminjection,ICSI)相比于常規(guī)體外受精避免了

卵母細胞和精液之間的接觸，從而降低了精液污染胚胎的可能性［21這

可能是由于在ICSI過程中使用單個精子，污染的可能性進一步降低。

4.2卵母細胞采集過程及卵泡液污染的處理有研究提出優(yōu)化卵丘

卵母細胞復合物采集程序可以減少常規(guī)體外受精周期中的微生物污染發(fā)

生率［28L該研究認為，在倒出卵泡液時，液體可能會在培養(yǎng)皿的外壁

積聚，并在從另一側倒出時流回培養(yǎng)皿中，增加了微生物進入培養(yǎng)系統(tǒng)的

風險。為了降低污染的風險，研究人員進行了一些改進，包括在培養(yǎng)皿的

外壁上做標記，只從標記的位置倒出液體，并改變卵母細胞采集過程中的

操作方法。這些改進措施顯著降低了卵母細胞和胚胎的污染率。此外，使

用新的培養(yǎng)皿或特殊設計的雙層培養(yǎng)皿也可有效避免殘留液體的回流，從

而降低污染的風險。因為總體污染率較低，且這些方法耗時，所以可能不

適用于大多數(shù)患者。為了避免污染的再次發(fā)生，研究人員對操作方法進行

了改進，通過調整吸液管的設計和操作方式，成功降低了污染的風險C其

次采取ICSI受精方式時卵冠丘復合體被酶消化并反復洗滌去除顆粒細胞,

可有效降低污染的風險。

4.3實驗室環(huán)境管理由于輔助生殖胚胎培養(yǎng)室對環(huán)境的艮好控制，

因此由環(huán)境造成的污染報道極少。然而，一旦培養(yǎng)環(huán)境受到污染，污染就

會迅速蔓延。有實驗室環(huán)境污染的案例報道，2d內3例患者的胚胎被相

同的細菌污染，通過對培養(yǎng)基、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、層流單元過濾器和超凈

臺過濾器進行快速檢查和采樣進行細菌培養(yǎng)。最后認為污染源是梅雨季節(jié)

的反復降雨，導致水從頂層滲入培養(yǎng)室天花板和頂層之間的夾層，導致積

水和細菌繁殖。對培養(yǎng)室進行全面消毒和天花板的防水處理后沒有再發(fā)生

實驗室環(huán)境污染事件［29L

實驗室環(huán)境引起的污染極少發(fā)生，但也應給予足夠的重視。IVF實驗

室必須設置有效的層流系統(tǒng)以維持室內環(huán)境的潔凈度，室內采用移動式空

氣凈化設備也可局部改善室內空氣質量；層流和凈化設備需要定期更換濾

膜；實驗室環(huán)境必須維持適宜的濕度，過高的濕度更容易發(fā)生霉菌的滋生；

每曰空內地面、墻面、設備的清潔也至關重要，如有臺面污染應及時消毒

處理。

4.4實驗室技術操作管理首先JVF實驗室必須制定合理的操作程

序和完善的管理制度。其次，實驗室人員需進行系統(tǒng)的培訓，包括理論知

識、專業(yè)操作技能和醫(yī)學無菌操作等。最后，配子、胚胎的體外操作必須

在百級潔凈度環(huán)境下進行，同時培養(yǎng)基、耗材