動物細胞工程

動物細胞培養(yǎng)動物細胞融合單克隆抗體技術(shù)

核移植動物細胞工程常用技術(shù)一、動物細胞培養(yǎng)1.概念：從動物有機體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個細胞,然后放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細胞生長和增殖。2.動物細胞的培養(yǎng)過程

幼齡動物剪碎組織胰蛋白酶處理細胞培養(yǎng)分散成單個細胞取幼齡動物組織塊細胞貼壁：培養(yǎng)貼附性細胞時候，細胞要能夠貼附于底物上才能生長繁殖。接觸抑制：貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖。原代培養(yǎng)：動物組織消化后的初次培養(yǎng)。包括培養(yǎng)的第1代細胞與傳了10代以內(nèi)的細胞。傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。細胞株：原代細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數(shù)細胞存活到40~50代，這種傳代細胞為細胞株。細胞系：細胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細胞懸浮液胰蛋白酶10代細胞原代培養(yǎng)50代細胞細胞株無限傳代細胞系傳代培養(yǎng)單個細胞加培養(yǎng)液遺傳物質(zhì)未改變遺傳物質(zhì)已改變（分裝前）3.動物細胞培養(yǎng)的條件①無菌、無毒的環(huán)境。無菌操作、加抗生素定期更換培養(yǎng)液②營養(yǎng)：糖、氨基酸、無機鹽、微量元素、動物血清③溫度和pH：哺乳動物的體溫、PH為7.2-7.4④氣體環(huán)境：氧氣、二氧化碳比較項目植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基性質(zhì)培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)目的植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較細胞的全能性細胞增殖固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基蔗糖植物激素葡萄糖動物血清植物體細胞株、細胞系快速繁殖、培育無病毒植株獲得細胞或細胞分泌蛋白5.動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用:1.蛋白質(zhì)生物制品的生產(chǎn)

如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體2.應(yīng)用于基因工程

主要用于作為受體細胞3.檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性

4.細胞的生理、藥理、病理研究

如用于篩選抗癌藥物二、動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物

核移植：是將動物的一個細胞的細胞核,移如入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎,這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體。克隆動物：用核移植的方法得到的動物。

克?。╟lone）：是指通過無性生殖而產(chǎn)生的具有完全相同的遺傳組成的一群細胞或者生物的個體?？寺≡谙ＥD語中是“小樹枝葉”的意思，用以指無性增殖物?，F(xiàn)在則指個體、細胞、基因等不同水平上的無性增殖物。二、動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物1、定義：動物核移植是將動物的一個細胞的細胞核,移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中.使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎,這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體.3、分類：胚胎核移植、體細胞核移植。胚胎細胞分化程度低，恢復(fù)其全能性相對容易。動物體細胞分化程度高，恢復(fù)其全能性十分困難2、原理：動物細胞核具有全能性

◆取供體細胞傳代培養(yǎng)10代以內(nèi)的細胞.為什么？◆用的是去核的減數(shù)第二次分裂中期細胞（MⅡ中期）為什么？◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：電刺激◆胚胎移植至代孕受體內(nèi)

妊娠、分娩2.）核移植流程供體：優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛受體：普通奶牛（卵母細胞的采集與培養(yǎng)）

1.體積大，易操作。2.含有促使細胞核表達全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件。有人說它三個母親，對嗎？１、核移植之前，為何要去掉受體卵母細胞的核？

為使核移植動物的核遺傳物質(zhì)全部來自有利用價值的動物提供的細胞。２、用于核移植的供體細胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細胞，為什么？10代以內(nèi)的細胞保持一般保持正常二倍體的核型3、細胞核移植生產(chǎn)的克隆動物是對體細胞供體動物進行了100%的復(fù)制嗎？為什么？

不是，克隆動物絕大部分DNA來自供體細胞核，但核外還有少部分DNA（如線粒體DNA）來自受體卵母細胞。在體細胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎細胞核移植技術(shù)已經(jīng)有了很大的發(fā)展。實際上，“多莉”的克隆在核移植技術(shù)上沿襲了胚胎細胞核移植的全部過程，但這并不能減低“多莉”的重大意義，因為它是世界上第一例經(jīng)體細胞核移植出生的動物，是克隆技術(shù)領(lǐng)域研究的巨大突破。這一巨大進展意味著：在理論上證明了，同植物細胞一樣，分化了的動物細胞核也具有全能性．

4.動物克隆實例很多，為何多莉就舉世聞名呢？2.體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景

你還在為身體有殘疾而苦惱嗎？你還在為器官移植找不到合適的供體而焦慮嗎？不能在這樣下去了，看看我們的體細胞核移植技術(shù)吧，只需要從你身上取一個小小的體細胞，通過核移植培養(yǎng)出胚胎干細胞，再用胚胎干細胞誘導(dǎo)分化出各種組織器官，這樣的器官的組織相容性抗原跟你的一摸一樣，用這樣的器官進行器官移植，根本就不會發(fā)生免疫排斥。不夸張的說，如果這項技術(shù)研究成熟了，以后大家換條胳膊換條腿就跟給汽車換個輪胎一樣。你聽明白了嗎？這不是天方夜譚，巨大的前景就在眼前，你還在等什么？現(xiàn)在，對，就是現(xiàn)在，趕緊加入到生命科學(xué)的研究中來吧！廣而告之：二、動物細胞融合

病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞相互凝集，細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。

滅活：是指用物理或化學(xué)手段使病毒失去感染細胞的能力，但是并不破壞病毒的抗原結(jié)構(gòu)。二、動物細胞融合概念：指兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的過程。結(jié)果：形成單核的雜交細胞原理：細胞膜的流動性誘導(dǎo)方法：物理法：離心、振動、電激化學(xué)法：聚乙二醇（PEG)生物法：滅活的病毒

注意：動物細胞的融合也需要把多個兩種細胞放在一起，讓它們隨機融合后，再從中篩選雜交細胞。

意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交（種間、屬間、科間、動植物之間）成為可能。三、單克隆抗體

長期以來，為了獲得抗體，采用的是把某種抗原反復(fù)注射到動物體內(nèi)，然后從動物血清中分離出所需抗體的方法。用這種方法獲得的抗體，不僅產(chǎn)量低，而且抗體的特異性差，純度低，反應(yīng)不夠靈敏。1、傳統(tǒng)抗體的獲得方法

在動物發(fā)生免疫反應(yīng)的過程中，體內(nèi)的多種B細胞可以產(chǎn)生多達百萬種以上的特異性抗體，但是每個B細胞只分泌一種抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須用單個B細胞進行無性繁殖，即克隆。2、一個美麗的發(fā)現(xiàn)3、一個大膽的猜想

將能夠產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞和具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞融合在一起，形成雜交瘤細胞。注射抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞融合專一抗體檢驗陽性選擇性培養(yǎng)基篩選克隆化單克隆抗體專一抗體檢驗陽性用有限稀釋法進行單克隆，再專一抗體檢驗陽性克隆化5、單克隆抗體的概念：

由單個B淋巴細胞進行無性繁殖形成的細胞群，產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體。6、單克隆抗體的優(yōu)點：特異性強、靈敏度高、產(chǎn)量大四、單克隆抗體的應(yīng)用1、診斷試劑2、運載藥物—“生物導(dǎo)彈”準(zhǔn)確、高效、簡易、快速抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體

在受精后不久，胎盤滋養(yǎng)層細胞就會分泌人絨毛膜促性腺激素(HCG)，是由受孕婦女體內(nèi)胎盤產(chǎn)生的一種糖蛋白類激素，在孕婦的尿液中大量存在。而在非妊娠婦女尿液中幾乎不含有。

早孕試紙其實是利用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做為配體，固定在層析柱上，以膠體金為指示標(biāo)記，檢測尿液中的HCG濃度，來確診婦女是否懷孕。陽性：出現(xiàn)兩條紅色條帶。一條位于對照區(qū)C,另一條位于檢測區(qū)T，表示已懷孕。陰性：僅在對照區(qū)C出現(xiàn)一條紅色條帶，在檢測區(qū)T無紅色條帶出現(xiàn)，表示未懷孕。無效：5分鐘在對照區(qū)C無紅色條帶出現(xiàn)，則測試失敗或試紙已失效。

甲胎蛋白（AFP）是一種特異性較強的腫瘤標(biāo)志物，用甲胎蛋白作為抗原免疫小鼠，制備抗AFP單克隆抗體，并與含有放射性同位素的標(biāo)記物連接，單克隆抗體攜帶放射性標(biāo)記物通過全身血液滲透到所有組織。由于腫瘤細胞表面的AFP會和單克隆抗體特異性的結(jié)合，所以放射性同位素標(biāo)記物就不斷積累在腫瘤上。通過一定的顯影技術(shù)就可以發(fā)現(xiàn)腫瘤所在。生物導(dǎo)彈”：

用癌細胞作為抗原，免疫小鼠，制備抗癌細胞單克隆抗體，并與抗癌藥物連接，便制成了生物導(dǎo)彈，注入患者體內(nèi)，借助單克隆抗體的導(dǎo)向作用，將藥物定向帶到癌細胞所在位置，在原位殺死癌細胞。這樣既不損傷正常細胞，又減少了藥劑的用量。1．(2009年浙江理綜)用動、植物成體的體細胞進行離體培養(yǎng)，下列敘述正確的是(

)A．都需用CO2培養(yǎng)箱B．都需用液體培養(yǎng)基C．都要在無菌條件下進行D．都可體現(xiàn)細胞的全能性解析：用動、植物成體的體細胞進行離體培養(yǎng)都必須在無菌條件下進行。用植物成體的體細胞進行離體培養(yǎng)獲得新個體體現(xiàn)的是細胞的全能性，而動物體細胞離體培養(yǎng)主要是獲得細胞的代謝產(chǎn)物。答案：C2．(2008年全國理綜Ⅰ)下列關(guān)于細胞工程的敘述，錯誤的是(

)A．電刺激可誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體融合或動物細胞融合B．去除植物細胞的細胞壁和將動物組織分散成單個細胞均需酶處理C．小鼠骨髓瘤細胞和經(jīng)抗原免疫小鼠的B淋巴細胞融合可制備單克隆抗體D．某種植物甲乙兩品種的體細胞雜種與甲乙兩品種雜交后代的染色體數(shù)目相同答案：D3．(2008年上海生物)制備單克隆抗體所采用的細胞工程技術(shù)包括(

)①細胞培養(yǎng)②細胞融合③胚胎移植④細胞核移植A．①②B．①③C．②③D．③④解析：單克隆抗體的制備流程：人工誘導(dǎo)經(jīng)過免疫的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，再經(jīng)篩選獲得能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞，通過培養(yǎng)獲得的雜交瘤細胞得到單克隆抗體，整個過程不涉及胚胎移植和細胞核移植這兩項技術(shù)。答案：A4．(天津理綜)利用細胞工程方法，以SARS病毒核衣殼蛋白為抗原制備出單克隆抗體。下列敘述正確的是(

)A．用純化的核衣殼蛋白反復(fù)注射到小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生的血清抗體為單克隆抗體B．體外培養(yǎng)單個效應(yīng)B細胞(漿細胞)可以獲得大量針對SARS病毒的單克隆抗體C．將等量效應(yīng)B細胞(漿細胞)和骨髓瘤細胞混合，經(jīng)PEG誘導(dǎo)融合后的細胞均為雜交瘤細胞D．利用該單克隆抗體與SARS病毒核衣殼蛋白特異性結(jié)合的方法可診斷出病毒感染者D5．用動物細胞工程技術(shù)獲取單克隆抗體，下列實驗步驟中錯誤的是(

)A．將抗原注入小鼠體內(nèi)，獲得能產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞B．用纖維素酶處理B淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞C．用聚乙二醇作誘導(dǎo)劑，促使能產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合D．篩選雜交瘤細胞，并從中選出能產(chǎn)生所需抗體的細胞群，培養(yǎng)后提取單克隆抗體解析：用纖維素酶處理植物細胞是植物細胞工程中常用來除去細胞壁獲得原生質(zhì)體的方法，與動物細胞工程無關(guān)。答案：B6．(海南高考)某研究小組進行藥物試驗時，以動物肝細胞為材料，測定藥物對體外培養(yǎng)細胞的毒性。供培養(yǎng)的細胞有甲、乙兩種，甲細胞為肝腫瘤細胞，乙細胞為正常肝細胞。請回答下列有關(guān)動物細胞培養(yǎng)的問題：(1)將數(shù)量相等的甲細胞和乙細胞分別置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)液及其他培養(yǎng)條件均相同。一段時間后，觀察到甲細胞數(shù)量比乙細胞數(shù)量________。(2)在動物細胞培養(yǎng)時，通常在合成培養(yǎng)基中加入適量血清，其原因是____________________________________，細胞培養(yǎng)應(yīng)在含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行，CO2的作用是_____________________。血清可以補充合成培養(yǎng)基中缺乏的物質(zhì)維持培養(yǎng)液pH多(3)在兩種細胞生長過程中，當(dāng)乙細胞鋪滿瓶壁時，其生長________。藥物試驗需要大量細胞，兩種細胞頻繁傳代，甲細胞比乙細胞可以傳代的次數(shù)更______。若用動物的肝臟組織塊制備肝細胞懸液，需用____________消化處理。(4)為了防止細胞培養(yǎng)過程中細菌的污染，可向培養(yǎng)液中加入適量的________。(5)已知癌基因X過量表達與肝腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，要試驗一種抗腫瘤藥物Y對甲細胞生長的影響，可將甲細胞分為A、B兩組，A組細胞培養(yǎng)液中加入________，B組細胞培養(yǎng)液中加入無菌生理鹽水，經(jīng)培養(yǎng)后，從A、B兩組收集等量細胞，通過分別檢測X基因在A、B兩組細胞中的________或________合成水平的差異，確定Y的藥效。胰蛋白酶多抗生素停止mRNA蛋白質(zhì)藥物Y7、(2008年寧夏高考)回答下列有關(guān)動物細胞培養(yǎng)的問題：(1)在動物細胞培養(yǎng)過程中，當(dāng)貼壁細胞分裂生長到細胞表面___________時，細胞會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的___________。此時，瓶壁上形成的細胞層數(shù)是________。要使貼壁的細胞從瓶壁上分離下來，需要用酶處理，可用的酶是________________。(2)隨著細胞傳代次數(shù)的增多，絕大部分細胞分裂停止，進而出現(xiàn)_______________的現(xiàn)象；但極少數(shù)細胞可以連續(xù)增殖，其中有些細胞會因遺傳物質(zhì)發(fā)生改變而變成________細胞，該種細胞的黏著性________，細胞膜表面蛋白質(zhì)(糖蛋白)的量___________。相互接觸接觸抑制胰島蛋白酶單層減少不死性降低衰老甚至死亡(3)現(xiàn)用某種大分子染料，對細胞進行染色時，觀察到死細胞被染色，而活細胞不染色，原因是______________________________________________(4)檢查某種毒物是否能改變細胞染色體的數(shù)目，最好選用細胞分裂到________期的細胞用顯微鏡進行觀察。(5)在細胞培養(yǎng)過程中，通常在________條件下保存細胞。因為在這種條件下，細胞中________的活性降低，細胞______________的速率降低。(6)給患者移植經(jīng)細胞培養(yǎng)形成的皮膚組織后，發(fā)生了排斥現(xiàn)象，這是因為機體把移植的皮膚組織當(dāng)作________進行攻擊。酶

由于死細胞的膜喪失了選擇透過性，大分子染料能夠進入死細胞內(nèi)而著色中超低溫新陳代謝抗原8．單克隆抗體的制備過程如下圖所示：(1)淋巴細胞能與骨髓瘤細胞融合成一個細胞，兩種細胞膜也能“融合”在一起，說明細胞膜______________。此過程，常用_________作為誘導(dǎo)劑。(2)已知細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基嘌呤阻斷。人淋巴細胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤細胞中盡管沒有S途徑，但能不斷分裂增殖，將這兩種細胞在試管中混合，加聚乙二醇促融，獲得雜種細胞。請設(shè)計一種方法(不考慮機械方法)，從培養(yǎng)液中分離出雜交瘤細胞。方法：_______________________________________。聚乙二醇培養(yǎng)液中加入氨基嘌吟，收集增殖的細胞具有一定的流動性(3)雜交瘤細胞繁殖進行的是________分裂，其遺傳性狀_____________________________________。(4)雜交瘤細胞的體外培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基相比有何主要不同？_____________________________________。(5)單克隆抗體注入體內(nèi)后可以自動追蹤抗原(病原體或癌變細胞等)并與之結(jié)合，而絕不攻擊任何正常細胞，故稱為“生物導(dǎo)彈”，這是利用了___________________________________。(6)在單克隆抗體制備過程中，還應(yīng)用了細胞工程中的_____________和______________兩大技術(shù)。具有無限增殖能力，能產(chǎn)生特異性抗體動物細胞培養(yǎng)用的是液體培養(yǎng)基，且其中含有動物血清動物細胞培養(yǎng)抗原與抗體之間結(jié)合的高度特異性有絲動物細胞融合9.現(xiàn)有甲、乙兩種可能有一定毒性的化學(xué)物質(zhì)，實驗室研究人員欲通過動物細胞培養(yǎng)的方法來鑒定它們是否有毒性并比較二者毒性的強弱。請你以一個研究人員的身份參與此項研究，完成下列實驗報告并回答有關(guān)問題。Ⅰ.實驗原理：_________________________________。根據(jù)這種變異細胞占全部培養(yǎng)細胞的百分?jǐn)?shù)（以下稱Q值），可判斷該化學(xué)物質(zhì)的毒性。Ⅱ.實驗材料：活的小白鼠胚胎。Ⅲ.藥品用具：略。有毒物質(zhì)能誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生變異Ⅳ.實驗步驟（1）制備細胞懸浮液。（2）進行細胞培養(yǎng)①取A、B、C三個潔凈的培養(yǎng)瓶，___________________。②向A培養(yǎng)瓶中加入一定量的化學(xué)物質(zhì)甲，向B培養(yǎng)瓶中加入等量的化學(xué)物質(zhì)乙，并將培養(yǎng)瓶搖勻。③向C瓶內(nèi)___________________。（3）制作臨時裝片①取培養(yǎng)細胞，再加入動物細胞固定液以迅速殺死細胞并固定細胞。②靜置一段時間后，分別從各培養(yǎng)瓶底部吸取適量的細胞懸浮液，滴在與培養(yǎng)瓶有相同編號的載玻片的中央，_______________________，3min～5min后，蓋上蓋玻片。用適宜濃度龍膽紫溶液染色加入等量蒸餾水消毒滅菌，加入等量的細胞懸浮液

（4）鏡檢和統(tǒng)計把臨時裝片放在顯微鏡下，先用低倍鏡后用高倍鏡，尋找處于__________期的細胞