ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠炎癥相關(guān)基因表達(dá)：洞察動(dòng)脈粥樣硬化炎癥機(jī)制一、引言1.1研究背景與意義動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）作為一種發(fā)生于動(dòng)脈血管的慢性進(jìn)行性疾病，嚴(yán)重危害著人類健康。它是導(dǎo)致冠心病、心肌梗塞、腦卒中等心腦血管疾病的主要原因，在全球范圍內(nèi)，尤其是西方發(fā)達(dá)國(guó)家和我國(guó)，一直是主要的死亡原因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，每年因心腦血管疾病死亡的人數(shù)占全球總死亡人數(shù)的比例高達(dá)30%以上，而動(dòng)脈粥樣硬化作為這些疾病的主要病理基礎(chǔ)，其重要性不言而喻。AS的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，是多種遺傳因素與外界因素共同作用的結(jié)果。目前，普遍認(rèn)為AS是由血脂代謝異常、高血壓、糖尿病、肥胖、吸煙等多種因素引發(fā)的一種慢性炎癥性疾病。炎癥在AS的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，涉及多種細(xì)胞類型和生物學(xué)過程。在動(dòng)脈粥樣硬化的起始階段，血脂代謝異常導(dǎo)致血液中脂質(zhì)成分，尤其是低密度脂蛋白（LDL）水平升高。這些過多的LDL會(huì)進(jìn)入血管內(nèi)膜下，被氧化修飾形成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。ox-LDL具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，它能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多種粘附分子，如血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）和細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1），使得血液中的單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞能夠粘附并遷移到血管內(nèi)膜下。單核細(xì)胞在內(nèi)膜下分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過其表面的清道夫受體大量攝取ox-LDL，逐漸轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，這是動(dòng)脈粥樣硬化早期病變的重要特征。隨著炎癥反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，泡沫細(xì)胞不斷聚集，形成脂紋。同時(shí)，炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞會(huì)釋放大量的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子不僅能夠進(jìn)一步激活內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的放大，還能刺激平滑肌細(xì)胞從動(dòng)脈中膜遷移到內(nèi)膜，并增殖合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白等，逐漸形成纖維斑塊。在纖維斑塊的發(fā)展過程中，炎癥反應(yīng)使得斑塊內(nèi)的細(xì)胞成分發(fā)生變化，巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞持續(xù)浸潤(rùn)，平滑肌細(xì)胞逐漸減少，同時(shí)，炎癥細(xì)胞釋放的蛋白水解酶會(huì)降解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致纖維帽變薄，斑塊變得不穩(wěn)定。當(dāng)不穩(wěn)定斑塊破裂時(shí)，會(huì)暴露其內(nèi)部的促凝物質(zhì)，引發(fā)血小板聚集和血栓形成，最終導(dǎo)致血管急性閉塞，引發(fā)急性心腦血管事件，如心肌梗死和腦卒中等。載脂蛋白E（ApolipoproteinE，ApoE）和低密度脂蛋白受體（LowDensityLipoproteinReceptor，LDLR）在脂質(zhì)代謝過程中扮演著重要角色。ApoE是一種多態(tài)性載脂蛋白，主要由肝臟合成，它能夠與LDLR和極低密度脂蛋白受體（VLDLR）結(jié)合，參與血漿中脂蛋白的代謝和清除。LDLR則是一種細(xì)胞膜表面的糖蛋白，能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合LDL，通過內(nèi)吞作用將LDL攝入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行代謝和降解，從而調(diào)節(jié)血液中膽固醇的水平。ApoE/LDLR雙基因缺失（ApoE-/-/LDLR-/-）小鼠由于ApoE和LDLR雙基因缺失，導(dǎo)致ApoE及其主要受體途徑受阻。在普通飲食條件下，這種小鼠就能表現(xiàn)出顯著的高脂血癥和AS病變，其病理特征與人AS的各個(gè)階段非常相似，是目前研究AS常用的動(dòng)物模型之一。研究ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠，對(duì)于深入理解AS的發(fā)病機(jī)制，尤其是炎癥在其中的作用機(jī)制，具有重要意義。通過對(duì)該模型小鼠的研究，可以更清晰地觀察到基因缺失引發(fā)的脂代謝紊亂與血管炎癥損傷之間的關(guān)系，以及在AS發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥相關(guān)基因的動(dòng)態(tài)時(shí)序表達(dá)特征和它們之間的相互作用機(jī)理。這不僅有助于揭示AS的發(fā)病本質(zhì)，為開發(fā)新的治療策略提供理論基礎(chǔ)，還能為臨床早期診斷和預(yù)防AS相關(guān)疾病提供潛在的生物標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn)。1.2研究目的與主要問題本研究旨在通過對(duì)ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠的深入探究，揭示炎癥相關(guān)基因在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)規(guī)律及其作用機(jī)制，為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體而言，本研究擬解決以下關(guān)鍵問題：ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠炎癥相關(guān)基因的表達(dá)特征：利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）以及實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)不同年齡段ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠與野生型小鼠肝臟和主動(dòng)脈中炎癥相關(guān)重要基因，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、C反應(yīng)蛋白（CRP）等的時(shí)序表達(dá)差異，明確這些基因在ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠中的表達(dá)模式，包括表達(dá)量的變化趨勢(shì)、表達(dá)高峰出現(xiàn)的時(shí)間等，以及與野生型小鼠相比的差異。炎癥相關(guān)基因表達(dá)與血脂及血清炎癥因子的關(guān)聯(lián)：同步檢測(cè)ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠血脂（如總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇等）和血清中炎癥因子（如TNF-α、IL-1、IL-6等）的變化，分析炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平與血脂異常、血清炎癥因子水平之間的相關(guān)性，探究它們?cè)趧?dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的相互作用關(guān)系，例如炎癥基因的高表達(dá)是否會(huì)導(dǎo)致血脂代謝進(jìn)一步紊亂，或者血脂異常是否會(huì)誘導(dǎo)炎癥基因的過度表達(dá)。炎癥相關(guān)基因表達(dá)與肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜病理形態(tài)改變的關(guān)系：通過組織病理學(xué)方法，觀察不同年齡段ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜的病理形態(tài)改變，如肝臟脂肪變性、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積、斑塊形成等情況，并將這些病理變化與炎癥相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，明確炎癥相關(guān)基因表達(dá)在動(dòng)脈粥樣硬化病理進(jìn)程中的作用，判斷炎癥基因的表達(dá)變化是否能預(yù)示肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜的病理損傷程度，以及病理形態(tài)改變對(duì)炎癥基因表達(dá)的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。ApoE和LDLR雙基因缺失引發(fā)的脂代謝紊亂與血管炎癥損傷的內(nèi)在聯(lián)系：結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，深入探討ApoE和LDLR雙基因缺失引發(fā)的脂代謝紊亂如何啟動(dòng)和促進(jìn)血管炎癥損傷，以及血管炎癥損傷又如何反過來影響脂代謝過程，從而全面揭示動(dòng)脈粥樣硬化早期的發(fā)病機(jī)制，為早期干預(yù)和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化提供理論支持，尋找在脂代謝紊亂與血管炎癥損傷之間起關(guān)鍵調(diào)控作用的炎癥相關(guān)基因或信號(hào)通路，為開發(fā)新的治療策略提供潛在靶點(diǎn)。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究將采用多種實(shí)驗(yàn)方法，全面深入地探究ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠炎癥相關(guān)基因的表達(dá)情況，具體方法如下：動(dòng)物模型的建立與分組：選取健康的ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠和野生型小鼠，按照不同年齡段（如14天齡、1月齡、2月齡、3月齡等）進(jìn)行分組，每組設(shè)置多個(gè)重復(fù)樣本，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境中，給予普通飲食或特定的高脂飲食，定時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠的體重、飲食量和一般健康狀況。RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄：采用Trizol試劑法從小鼠的肝臟和主動(dòng)脈組織中提取總RNA。通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.1之間，以保證RNA的質(zhì)量。隨后，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR反應(yīng)提供模板。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）：設(shè)計(jì)針對(duì)炎癥相關(guān)基因（如TNF-α、IL-1、IL-6、CRP等）以及內(nèi)參基因（如β-actin）的特異性引物，引物的設(shè)計(jì)遵循相關(guān)的引物設(shè)計(jì)原則，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液等。反應(yīng)條件經(jīng)過優(yōu)化，一般包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，通過不同的溫度和時(shí)間循環(huán)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄條帶的位置和亮度，初步分析炎癥相關(guān)基因的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)定量RT-PCR：在RT-PCR的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)對(duì)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行精確定量分析。使用熒光定量PCR儀，以SYBRGreen染料法或TaqMan探針法進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系除了包含RT-PCR所需的成分外，還加入了熒光染料或探針，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度和增長(zhǎng)速率，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)的進(jìn)程。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法或比較CT值法對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算和分析，以準(zhǔn)確評(píng)估不同年齡段ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠與野生型小鼠肝臟和主動(dòng)脈中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)差異。血脂及血清炎癥因子檢測(cè)：采集不同年齡段小鼠的血液樣本，通過離心分離血清。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中的血脂指標(biāo)，包括總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等。同時(shí)，利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒檢測(cè)血清中炎癥因子（如TNF-α、IL-1、IL-6等）的濃度，分析血脂異常與炎癥因子水平之間的關(guān)系，以及它們與炎癥相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)。組織病理學(xué)觀察：將小鼠的肝臟和主動(dòng)脈組織進(jìn)行固定、脫水、包埋等處理，制成石蠟切片。通過蘇木精-伊紅（HE）染色、油紅O染色等方法，對(duì)切片進(jìn)行染色，觀察肝臟脂肪變性、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積、斑塊形成等病理形態(tài)改變。采用圖像分析軟件對(duì)病理切片進(jìn)行定量分析，如測(cè)量斑塊面積、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度等指標(biāo)，并將這些病理變化與炎癥相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，明確炎癥相關(guān)基因表達(dá)在動(dòng)脈粥樣硬化病理進(jìn)程中的作用。本研究的技術(shù)路線如圖1所示，首先建立ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠和野生型小鼠模型，并進(jìn)行分組飼養(yǎng)；然后在不同時(shí)間點(diǎn)采集小鼠的肝臟、主動(dòng)脈組織和血液樣本；對(duì)組織樣本進(jìn)行RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR、實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析，以檢測(cè)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)；對(duì)血液樣本進(jìn)行血脂和血清炎癥因子檢測(cè)；同時(shí)對(duì)肝臟和主動(dòng)脈組織進(jìn)行病理學(xué)觀察；最后綜合分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，探討ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠炎癥相關(guān)基因的表達(dá)特征及其與血脂、血清炎癥因子以及病理形態(tài)改變的關(guān)系，揭示動(dòng)脈粥樣硬化早期的發(fā)病機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從動(dòng)物模型建立到各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析的流程][此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從動(dòng)物模型建立到各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析的流程]二、理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1ApoE和LDLR基因的功能與作用機(jī)制載脂蛋白E（ApoE）是一種多功能的載脂蛋白，在脂質(zhì)代謝、神經(jīng)功能以及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ApoE主要由肝臟合成和分泌，此外，巨噬細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等也能少量合成。在脂質(zhì)代謝過程中，ApoE作為一種重要的配體蛋白，能夠與多種脂蛋白受體結(jié)合，如低密度脂蛋白受體（LDLR）、極低密度脂蛋白受體（VLDLR）以及乳糜微粒殘粒受體等。通過與這些受體的特異性結(jié)合，ApoE參與了血漿中脂蛋白的代謝和清除過程。例如，富含甘油三酯的脂蛋白，如乳糜微粒（CM）和極低密度脂蛋白（VLDL）在脂解過程中產(chǎn)生的殘粒，可通過ApoE與相應(yīng)受體的相互作用，被肝臟等組織攝取和代謝，從而維持血漿中脂質(zhì)的平衡。ApoE基因具有多態(tài)性，常見的等位基因有ε2、ε3和ε4，分別編碼ApoE2、ApoE3和ApoE4三種異構(gòu)體。不同異構(gòu)體在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定差異，其中ApoE3是最常見的亞型，被認(rèn)為是正常的野生型。ApoE2與受體的結(jié)合能力較弱，而ApoE4與ApoE3相比，僅在一個(gè)氨基酸位點(diǎn)上存在差異，卻表現(xiàn)出不同的生物學(xué)特性。ApoE4與受體的親和力雖然與ApoE3相近，但在脂質(zhì)代謝和神經(jīng)生物學(xué)功能方面卻有顯著不同。臨床研究表明，攜帶ApoE4等位基因的個(gè)體，患動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默病等疾病的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，ApoE不僅參與脂質(zhì)代謝，還具有抗炎、抗氧化等作用。ApoE可以抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥因子的釋放，減少氧化應(yīng)激損傷，從而對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞起到保護(hù)作用。缺乏ApoE的小鼠，由于脂質(zhì)代謝紊亂，血液中膽固醇和甘油三酯水平顯著升高，容易在血管壁形成脂質(zhì)沉積，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化病變。低密度脂蛋白受體（LDLR）是一種細(xì)胞膜表面的糖蛋白，在膽固醇代謝中起著核心調(diào)控作用。LDLR主要在肝臟、腎上腺皮質(zhì)、性腺等組織細(xì)胞表面高度表達(dá)。其結(jié)構(gòu)包括富含半胱氨酸的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表皮生長(zhǎng)因子前體同源結(jié)構(gòu)域、糖基化結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。LDLR的主要功能是識(shí)別和結(jié)合血液中的低密度脂蛋白（LDL），通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，將LDL攝入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行代謝和降解。具體過程如下：LDLR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別LDL顆粒表面的載脂蛋白B-100（ApoB-100），二者結(jié)合形成LDL-LDLR復(fù)合物。隨后，該復(fù)合物被細(xì)胞膜內(nèi)陷形成的有被小窩包裹，進(jìn)而形成有被小泡進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。有被小泡迅速脫去外被蛋白，與早期內(nèi)體融合。在早期內(nèi)體的酸性環(huán)境下，LDL與LDLR分離，LDLR返回細(xì)胞膜表面，重新參與LDL的攝取過程；而含有LDL的內(nèi)體則與溶酶體融合，LDL被溶酶體中的水解酶降解，釋放出膽固醇等物質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)的膽固醇水平對(duì)LDLR的表達(dá)具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量升高時(shí)，會(huì)抑制膽固醇合成相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)也會(huì)抑制LDLR基因的轉(zhuǎn)錄，減少LDLR的合成，從而減少細(xì)胞對(duì)LDL的攝取，維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇的穩(wěn)態(tài)。相反，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平降低時(shí)，會(huì)激活相關(guān)的信號(hào)通路，促進(jìn)LDLR基因的表達(dá)，增加LDLR的合成，使細(xì)胞能夠攝取更多的LDL，以滿足細(xì)胞對(duì)膽固醇的需求。LDLR基因的突變或缺陷會(huì)導(dǎo)致LDLR功能異常，使血液中LDL無法正常被清除，從而導(dǎo)致血漿中LDL水平升高，膽固醇沉積在血管壁，增加動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。家族性高膽固醇血癥就是一種由于LDLR基因突變導(dǎo)致的遺傳性疾病，患者體內(nèi)LDLR數(shù)量減少或功能異常，血液中膽固醇水平顯著升高，常伴有早發(fā)性動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病。2.2動(dòng)脈粥樣硬化與炎癥的關(guān)系動(dòng)脈粥樣硬化（AS）并非單純的脂質(zhì)沉積性疾病，越來越多的研究表明，炎癥貫穿于AS發(fā)生、發(fā)展的全過程，是其重要的病理特征。炎癥細(xì)胞和炎癥因子在這一過程中扮演著關(guān)鍵角色，它們相互作用，形成復(fù)雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)，共同推動(dòng)AS病變的進(jìn)展。在AS的起始階段，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是關(guān)鍵的觸發(fā)因素。多種危險(xiǎn)因素，如血脂異常、高血壓、高血糖、吸煙等，均可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。受損的內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生形態(tài)和功能的改變，其屏障功能減弱，通透性增加，使得血液中的脂質(zhì)成分，特別是低密度脂蛋白（LDL）更容易進(jìn)入血管內(nèi)膜下。同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞還會(huì)表達(dá)多種粘附分子，如血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）、細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）和E-選擇素等。這些粘附分子能夠與血液中的炎癥細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞向血管內(nèi)膜下的粘附和遷移。單核細(xì)胞是最早被招募到血管內(nèi)膜下的炎癥細(xì)胞之一，在粘附分子和趨化因子的作用下，單核細(xì)胞穿過內(nèi)皮細(xì)胞間隙，進(jìn)入內(nèi)膜下組織，并分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬能力，它通過表面的清道夫受體大量攝取進(jìn)入內(nèi)膜下的氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），逐漸轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞的形成是AS早期病變的重要標(biāo)志，這些細(xì)胞在血管內(nèi)膜下不斷聚集，形成脂紋，標(biāo)志著AS的開始。隨著AS病變的發(fā)展，炎癥反應(yīng)逐漸加劇，更多的炎癥細(xì)胞被募集到病變部位。T淋巴細(xì)胞是參與AS炎癥反應(yīng)的另一類重要細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞主要以CD4+輔助性T細(xì)胞（Th）為主，它們能夠識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）表面的抗原肽-MHCⅡ類分子復(fù)合物，被激活后分化為不同的亞型，如Th1、Th2、Th17等。Th1細(xì)胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能夠激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷能力，同時(shí)也能促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步放大。Th17細(xì)胞則主要分泌白細(xì)胞介素-17（IL-17），IL-17可以招募中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞到炎癥部位，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化，還能刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，參與AS斑塊的形成和發(fā)展。而Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）等，主要參與體液免疫反應(yīng)，在AS中的作用相對(duì)較為復(fù)雜，既有可能通過抑制Th1細(xì)胞的功能而發(fā)揮抗炎作用，也可能在一定條件下促進(jìn)AS的發(fā)展。炎癥因子在AS的炎癥反應(yīng)中起著核心調(diào)節(jié)作用。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種具有廣泛生物學(xué)活性的促炎細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞分泌。TNF-α可以通過多種途徑促進(jìn)AS的發(fā)展。它能夠上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)，增加炎癥細(xì)胞的粘附和遷移；激活巨噬細(xì)胞，使其分泌更多的炎癥因子，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，形成炎癥因子的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)；還能誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡，影響斑塊的穩(wěn)定性。白細(xì)胞介素-1（IL-1）也是一種重要的促炎細(xì)胞因子，主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。IL-1可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子，吸引炎癥細(xì)胞聚集；刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，導(dǎo)致血管壁增厚；同時(shí)還能激活肝臟細(xì)胞合成C反應(yīng)蛋白（CRP）等急性時(shí)相蛋白，CRP作為一種炎癥標(biāo)志物，也參與了AS的炎癥反應(yīng)，它可以與補(bǔ)體系統(tǒng)相互作用，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，還能促進(jìn)血小板聚集，增加血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。白細(xì)胞介素-6（IL-6）同樣在AS的炎癥過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IL-6主要由巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生，它能夠誘導(dǎo)肝臟合成急性期反應(yīng)蛋白，如CRP、血清淀粉樣蛋白A（SAA）等，參與全身炎癥反應(yīng)；促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)；還能刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)AS斑塊的形成。此外，IL-6還可以通過與其他炎癥因子相互作用，如與TNF-α協(xié)同作用，進(jìn)一步增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度。除了上述炎癥細(xì)胞和炎癥因子外，還有許多其他因素也參與了AS的炎癥反應(yīng)。例如，趨化因子是一類能夠吸引炎癥細(xì)胞定向遷移的小分子蛋白質(zhì)，在AS中，多種趨化因子如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、RANTES（調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的因子）等的表達(dá)上調(diào)，它們能夠特異性地吸引單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移，參與AS病變的發(fā)展。補(bǔ)體系統(tǒng)作為固有免疫的重要組成部分，也在AS的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。補(bǔ)體激活后產(chǎn)生的一系列裂解產(chǎn)物，如C3a、C5a等，具有趨化作用，能夠吸引炎癥細(xì)胞到病變部位，同時(shí)還能激活炎癥細(xì)胞，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。此外，氧化應(yīng)激在AS的炎癥反應(yīng)中也起著重要的促進(jìn)作用。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫等，能夠氧化修飾LDL，形成ox-LDL，ox-LDL不僅具有細(xì)胞毒性，還能作為一種抗原，激活炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。在AS病變的不同階段，炎癥反應(yīng)呈現(xiàn)出不同的特點(diǎn)和作用。在早期的脂紋階段，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥因子的釋放相對(duì)較少，主要以泡沫細(xì)胞的形成為主。隨著病變的進(jìn)展，進(jìn)入纖維斑塊階段，炎癥反應(yīng)逐漸加劇，炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，炎癥因子的分泌也明顯增加。此時(shí)，炎癥反應(yīng)不僅促進(jìn)了血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成，使得纖維斑塊不斷增大和增厚，還影響了斑塊內(nèi)細(xì)胞的代謝和功能，導(dǎo)致斑塊內(nèi)出現(xiàn)壞死、出血等病理改變。在晚期的粥樣斑塊階段，炎癥反應(yīng)進(jìn)一步激化，炎癥細(xì)胞持續(xù)釋放大量的炎癥因子和蛋白水解酶，這些酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，使得纖維帽變薄，斑塊變得不穩(wěn)定。當(dāng)不穩(wěn)定斑塊破裂時(shí)，會(huì)暴露其內(nèi)部的促凝物質(zhì)，引發(fā)血小板聚集和血栓形成，導(dǎo)致血管急性閉塞，從而引發(fā)急性心腦血管事件，如心肌梗死、腦卒中等。因此，炎癥在AS的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，深入研究炎癥相關(guān)機(jī)制，對(duì)于揭示AS的發(fā)病本質(zhì)，尋找有效的防治策略具有重要意義。2.3ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠模型在研究中的應(yīng)用ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠模型在動(dòng)脈粥樣硬化研究中具有不可替代的重要作用，為深入探究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制、疾病進(jìn)展以及治療策略提供了關(guān)鍵的研究工具。在動(dòng)脈粥樣硬化研究領(lǐng)域，該小鼠模型的應(yīng)用極為廣泛。由于ApoE和LDLR雙基因缺失，導(dǎo)致小鼠體內(nèi)ApoE及其主要受體途徑受阻，在普通飲食條件下即可出現(xiàn)顯著的高脂血癥。研究表明，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠血液中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平相較于野生型小鼠顯著升高，且這種血脂異常在小鼠出生后不久即可檢測(cè)到，并隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸加劇。例如，在14天齡的ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠中，其血清TC水平可能已經(jīng)達(dá)到野生型小鼠的數(shù)倍，且隨著月齡的增加，如在1月齡、2月齡時(shí)，血脂水平持續(xù)攀升，呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性變化。這種高脂血癥狀態(tài)為動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展提供了病理基礎(chǔ)，使得小鼠血管壁容易出現(xiàn)脂質(zhì)沉積，進(jìn)而引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)和病理改變。從病變特征來看，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變與人AS的各個(gè)階段具有高度的相似性。在疾病早期，小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜下可見大量脂質(zhì)條紋形成，這些脂質(zhì)條紋主要由泡沫細(xì)胞聚集而成，與人類AS早期的病理特征一致。隨著年齡的增長(zhǎng)，病變逐漸進(jìn)展為纖維斑塊，斑塊內(nèi)不僅有大量的脂質(zhì)沉積，還包含平滑肌細(xì)胞、炎癥細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等成分。在病變后期，小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的特征，如纖維帽變薄、斑塊內(nèi)出血、壞死等，這些病變特征與人類AS晚期易引發(fā)急性心腦血管事件的不穩(wěn)定斑塊極為相似。通過對(duì)不同年齡段ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變的觀察和分析，可以深入了解AS在不同階段的病理變化過程，為研究AS的發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)展提供了直觀的模型。作為研究動(dòng)脈粥樣硬化的理想模型，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠具有諸多優(yōu)勢(shì)。與其他動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型相比，如單純ApoE基因敲除小鼠或LDLR基因敲除小鼠，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠的血脂異常更為顯著，動(dòng)脈粥樣硬化病變出現(xiàn)的時(shí)間更早、程度更嚴(yán)重。這使得研究者能夠在較短的時(shí)間內(nèi)觀察到明顯的病變，大大縮短了研究周期，提高了研究效率。此外，該模型能夠更全面地模擬人類AS的發(fā)病過程，因?yàn)锳poE和LDLR在脂質(zhì)代謝中均起著關(guān)鍵作用，雙基因缺失更接近人類AS患者體內(nèi)復(fù)雜的基因缺陷和脂質(zhì)代謝紊亂狀態(tài)。同時(shí)，小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有繁殖周期短、飼養(yǎng)成本相對(duì)較低、易于進(jìn)行基因操作等優(yōu)點(diǎn)，方便研究者進(jìn)行大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)研究和基因功能分析。例如，研究者可以通過對(duì)ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠進(jìn)行特定基因的過表達(dá)或敲低實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探究基因之間的相互作用以及它們?cè)贏S發(fā)病機(jī)制中的作用，為尋找新的治療靶點(diǎn)和開發(fā)有效的治療藥物提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2.4炎癥相關(guān)基因的研究進(jìn)展炎癥相關(guān)基因在機(jī)體的炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它們參與了炎癥的啟動(dòng)、發(fā)展以及消退等多個(gè)環(huán)節(jié)，其表達(dá)水平的變化能夠敏感地反映炎癥狀態(tài)的改變。對(duì)這些基因的深入研究，不僅有助于我們深刻理解炎癥的發(fā)生機(jī)制，還為炎癥相關(guān)疾病的診斷、治療以及預(yù)防提供了重要的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。C反應(yīng)蛋白（CRP）基因是炎癥相關(guān)基因中的重要一員。CRP作為一種經(jīng)典的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，由CRP基因編碼產(chǎn)生。在健康狀態(tài)下，機(jī)體中CRP的含量極低，通常處于納克每毫升的水平。然而，一旦機(jī)體受到感染、創(chuàng)傷、炎癥等刺激，CRP基因的表達(dá)會(huì)迅速上調(diào)。這是因?yàn)檠装Y刺激會(huì)激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，如核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路。激活的NF-κB會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，與CRP基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，從而促進(jìn)CRP基因的轉(zhuǎn)錄，使得CRP的合成和分泌大量增加。研究表明，在急性炎癥反應(yīng)中，CRP的血漿濃度可在短時(shí)間內(nèi)（數(shù)小時(shí)至數(shù)天）升高數(shù)十倍甚至數(shù)百倍。CRP主要通過與補(bǔ)體系統(tǒng)相互作用，激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑，從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞的趨化、吞噬以及免疫復(fù)合物的清除。CRP還能與多種細(xì)胞表面的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能和活性。例如，CRP可以與巨噬細(xì)胞表面的Fcγ受體結(jié)合，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)展。CRP在炎癥反應(yīng)中的作用廣泛而復(fù)雜，其作為炎癥標(biāo)志物，在臨床診斷中具有重要價(jià)值。臨床上，常通過檢測(cè)血清中CRP的水平來輔助診斷炎癥相關(guān)疾病，如感染性疾病、自身免疫性疾病等。高水平的CRP往往提示機(jī)體存在炎癥狀態(tài)，且CRP水平的變化還可用于評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度和治療效果。在細(xì)菌感染性疾病中，CRP水平通常會(huì)顯著升高，且其升高程度與感染的嚴(yán)重程度相關(guān)。通過監(jiān)測(cè)CRP水平的變化，醫(yī)生可以及時(shí)了解患者的病情進(jìn)展，調(diào)整治療方案。白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）基因在炎癥反應(yīng)中也扮演著關(guān)鍵角色。IL-1β是白細(xì)胞介素家族中的重要成員，由IL-1β基因編碼。IL-1β主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥刺激下，巨噬細(xì)胞內(nèi)的IL-1β基因被激活表達(dá)。與CRP基因類似，炎癥刺激會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路。這些信號(hào)通路的激活會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的活化，進(jìn)而結(jié)合到IL-1β基因的啟動(dòng)子區(qū)域，啟動(dòng)IL-1β基因的轉(zhuǎn)錄。新合成的IL-1β最初以無活性的前體形式存在，需要經(jīng)過半胱天冬酶-1（Caspase-1）的切割加工，才能轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)活性的成熟IL-1β。成熟的IL-1β釋放到細(xì)胞外，通過與靶細(xì)胞表面的IL-1受體結(jié)合，啟動(dòng)下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。IL-1β可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子，如血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）和細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1），從而增強(qiáng)炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，促進(jìn)炎癥細(xì)胞向炎癥部位的遷移和浸潤(rùn)。IL-1β還能刺激T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)。IL-1β在炎癥反應(yīng)中具有很強(qiáng)的促炎作用，其過度表達(dá)與多種炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中，關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β的表達(dá)明顯升高，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥的持續(xù)發(fā)展和組織損傷。針對(duì)IL-1β的靶向治療，如使用IL-1β拮抗劑，已在臨床上用于治療一些炎癥相關(guān)疾病，并取得了一定的療效。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）基因同樣是炎癥相關(guān)基因研究的重點(diǎn)。TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，由TNF-α基因編碼。TNF-α主要由活化的巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。在炎癥過程中，TNF-α基因的表達(dá)受到多種因素的調(diào)控。炎癥刺激信號(hào)通過激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如NF-κB、MAPK等，促使轉(zhuǎn)錄因子與TNF-α基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而誘導(dǎo)TNF-α基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。TNF-α具有強(qiáng)大的促炎作用，它可以通過多種途徑參與炎癥反應(yīng)。TNF-α能夠上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的粘附和遷移。它還能激活巨噬細(xì)胞，使其分泌更多的炎癥因子，如IL-1、IL-6等，形成炎癥因子的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)。TNF-α還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，影響組織的修復(fù)和再生。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，TNF-α的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和泡沫細(xì)胞形成，促進(jìn)斑塊的形成和發(fā)展。TNF-α在炎癥反應(yīng)中的作用十分關(guān)鍵，其異常表達(dá)與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。臨床上，針對(duì)TNF-α的生物制劑，如英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗等，已廣泛應(yīng)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等自身免疫性疾病，通過阻斷TNF-α的生物學(xué)活性，減輕炎癥反應(yīng)，改善患者的癥狀和病情。除了上述基因外，還有許多其他炎癥相關(guān)基因也在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。白細(xì)胞介素-6（IL-6）基因編碼的IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，在炎癥、免疫調(diào)節(jié)和急性期反應(yīng)中具有重要作用。IL-6基因的表達(dá)受到炎癥刺激的誘導(dǎo)，其產(chǎn)物IL-6可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的分化和抗體分泌，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的功能，還能刺激肝臟合成急性期反應(yīng)蛋白，如CRP等。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）基因編碼的MCP-1是一種重要的趨化因子，能夠吸引單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向炎癥部位遷移。在炎癥反應(yīng)中，MCP-1基因的表達(dá)上調(diào)，使得MCP-1的分泌增加，從而在炎癥細(xì)胞的募集和炎癥反應(yīng)的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。隨著研究的不斷深入，越來越多的炎癥相關(guān)基因及其作用機(jī)制被揭示。目前，對(duì)于炎癥相關(guān)基因的研究已不僅僅局限于基因的表達(dá)調(diào)控和蛋白產(chǎn)物的功能研究，還涉及到基因多態(tài)性與炎癥相關(guān)疾病易感性的關(guān)系、炎癥相關(guān)基因之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及基于炎癥相關(guān)基因的靶向治療等多個(gè)方面?；蚨鄳B(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，某些炎癥相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與個(gè)體對(duì)炎癥相關(guān)疾病的易感性密切相關(guān)。例如，CRP基因的某些SNP位點(diǎn)可能影響CRP的表達(dá)水平和功能，從而增加個(gè)體患心血管疾病、糖尿病等炎癥相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。在炎癥相關(guān)基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)研究中，發(fā)現(xiàn)這些基因之間存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，它們通過相互激活或抑制，形成一個(gè)精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的進(jìn)程。對(duì)炎癥相關(guān)基因的研究仍在不斷深入，未來有望通過對(duì)這些基因的深入了解，開發(fā)出更加有效的炎癥相關(guān)疾病的診斷方法和治療策略。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)環(huán)境本實(shí)驗(yàn)選用的ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠由[具體來源，如某知名實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心]提供，其品系背景為[詳細(xì)品系背景信息]。同時(shí)，選取同背景的野生型小鼠作為對(duì)照，野生型小鼠同樣來源于[具體來源]。所有小鼠在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)均健康狀況良好，無明顯疾病癥狀。小鼠飼養(yǎng)于符合SPF（無特定病原體）級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物房?jī)?nèi)。動(dòng)物房的溫度嚴(yán)格控制在22±2℃之間，這樣的溫度范圍能夠保證小鼠處于較為舒適的環(huán)境中，避免因溫度過高或過低對(duì)小鼠的生理狀態(tài)產(chǎn)生影響。相對(duì)濕度維持在50%±10%，適宜的濕度有助于防止小鼠呼吸道疾病的發(fā)生，同時(shí)也有利于保持動(dòng)物房?jī)?nèi)的衛(wèi)生條件。動(dòng)物房?jī)?nèi)采用12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的循環(huán)光照制度，模擬自然的晝夜節(jié)律，以維持小鼠正常的生物鐘和生理節(jié)律。小鼠飼養(yǎng)在經(jīng)過嚴(yán)格消毒處理的塑料籠具中，每個(gè)籠具內(nèi)飼養(yǎng)[X]只小鼠，以確保小鼠有足夠的活動(dòng)空間。籠具內(nèi)鋪墊經(jīng)過高溫高壓消毒的玉米芯墊料，墊料需定期更換，一般每周更換2-3次，以保持籠內(nèi)的清潔衛(wèi)生，減少微生物滋生。小鼠自由攝取經(jīng)過輻照滅菌處理的標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，飼料的營(yíng)養(yǎng)成分符合小鼠生長(zhǎng)發(fā)育的需求，包含適量的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)等。同時(shí)，小鼠可自由飲用經(jīng)過高溫滅菌的純凈水，保證其水分?jǐn)z入充足且安全。在實(shí)驗(yàn)過程中，每天定時(shí)觀察小鼠的飲食、飲水、活動(dòng)情況以及精神狀態(tài)等，詳細(xì)記錄小鼠的體重變化，每周至少測(cè)量一次體重，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠的健康問題和生長(zhǎng)發(fā)育異常情況。3.2實(shí)驗(yàn)分組與樣本采集本實(shí)驗(yàn)按照小鼠的年齡和基因型進(jìn)行分組，具體分組情況如下：將ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠和野生型小鼠分別分為14天齡組、1月齡組、2月齡組和3月齡組，每組各設(shè)置10只小鼠。這樣的分組方式能夠全面地反映不同年齡段以及不同基因型小鼠在炎癥相關(guān)基因表達(dá)等方面的差異。在樣本采集時(shí)間方面，14天齡組小鼠在出生后第14天進(jìn)行樣本采集；1月齡組小鼠在出生后滿1個(gè)月（30天左右）時(shí)采集樣本；2月齡組小鼠在出生后滿2個(gè)月（60天左右）進(jìn)行樣本采集；3月齡組小鼠則在出生后滿3個(gè)月（90天左右）時(shí)采集樣本。嚴(yán)格按照這些時(shí)間點(diǎn)采集樣本，有助于確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，避免因樣本采集時(shí)間的差異而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。對(duì)于樣本采集部位，主要選取小鼠的肝臟和主動(dòng)脈組織。肝臟是脂質(zhì)代謝的重要器官，ApoE和LDLR雙基因缺失可能會(huì)對(duì)肝臟的脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)產(chǎn)生顯著影響，因此肝臟組織對(duì)于研究炎癥相關(guān)基因在脂質(zhì)代謝異常背景下的表達(dá)變化具有重要意義。主動(dòng)脈作為動(dòng)脈粥樣硬化的好發(fā)部位，其內(nèi)膜的病變情況能夠直觀地反映動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，所以采集主動(dòng)脈組織可以深入研究炎癥相關(guān)基因表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化病變之間的關(guān)系。在樣本采集方法上，首先使用過量的戊巴比妥鈉對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，待小鼠完全失去知覺后，迅速打開胸腔和腹腔。對(duì)于肝臟樣本的采集，用眼科剪從肝臟左葉或右葉剪下約0.5-1g的組織塊，放入預(yù)先裝有RNA保護(hù)液的凍存管中，標(biāo)記好樣本信息后，立即放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，以防止RNA降解，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)中RNA的質(zhì)量。對(duì)于主動(dòng)脈樣本的采集，小心地分離出主動(dòng)脈，從主動(dòng)脈弓開始，一直到腹主動(dòng)脈分叉處，完整地取出主動(dòng)脈，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗掉血管表面的血液和雜質(zhì)，將主動(dòng)脈剪成約0.5-1cm長(zhǎng)的小段，同樣放入裝有RNA保護(hù)液的凍存管中，標(biāo)記后液氮速凍，再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。在采集血液樣本時(shí)，使用一次性注射器從心臟采血約1-2ml，將血液注入無抗凝劑的離心管中，室溫靜置30min，使血液充分凝固后，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，分離出血清，將血清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，標(biāo)記好后放入-80℃冰箱保存，用于后續(xù)血脂和血清炎癥因子的檢測(cè)。3.3主要實(shí)驗(yàn)技術(shù)與檢測(cè)指標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）是檢測(cè)基因表達(dá)的重要技術(shù)，其原理基于RNA的逆轉(zhuǎn)錄和DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在實(shí)驗(yàn)中，首先從采集的小鼠肝臟和主動(dòng)脈組織樣本中提取總RNA。這一步驟使用Trizol試劑，利用其能迅速裂解細(xì)胞并抑制RNA酶活性的特性，有效地從組織細(xì)胞中釋放出RNA。提取的總RNA中包含mRNA、rRNA、tRNA等多種類型，而我們關(guān)注的是mRNA，它攜帶了基因表達(dá)的信息。隨后，以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以O(shè)ligo（dT）或隨機(jī)引物為引導(dǎo)，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA）。逆轉(zhuǎn)錄酶具有依賴RNA的DNA聚合酶活性，能夠以RNA為模板合成cDNA的第一條鏈。這一過程將RNA信息轉(zhuǎn)化為DNA形式，便于后續(xù)的PCR擴(kuò)增。在完成cDNA合成后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液等。引物是根據(jù)目標(biāo)炎癥相關(guān)基因（如TNF-α、IL-1、IL-6、CRP等）的特定序列設(shè)計(jì)的，具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確地與目標(biāo)基因的特定區(qū)域結(jié)合。dNTPs提供了合成DNA所需的原料，TaqDNA聚合酶則催化DNA的合成反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件經(jīng)過精心優(yōu)化，一般預(yù)變性步驟在94-95℃下進(jìn)行3-5分鐘，目的是使DNA模板完全解鏈，形成單鏈DNA，為后續(xù)引物結(jié)合提供條件。變性步驟在94℃左右進(jìn)行30秒，使雙鏈DNA解旋為單鏈。退火溫度根據(jù)引物的Tm值（解鏈溫度）而定，通常在55-65℃之間，持續(xù)30秒左右，這一步驟中引物與單鏈DNA模板特異性結(jié)合。延伸步驟在72℃下進(jìn)行，TaqDNA聚合酶在這一溫度下活性最高，它以dNTPs為原料，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，從引物的3'端開始合成新的DNA鏈，延伸時(shí)間根據(jù)目標(biāo)基因片段的長(zhǎng)度而定，一般每延伸1kb需要1分鐘左右。經(jīng)過30-35個(gè)循環(huán)的變性、退火和延伸，目標(biāo)基因片段得以大量擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，瓊脂糖凝膠具有分子篩的作用，在電場(chǎng)的作用下，不同長(zhǎng)度的DNA片段在凝膠中遷移速度不同，較短的片段遷移速度快，較長(zhǎng)的片段遷移速度慢。在凝膠中加入核酸染料（如EB或SYBRGreen），DNA片段會(huì)在紫外光下發(fā)出熒光，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄條帶的位置和亮度，條帶的亮度與基因表達(dá)量相關(guān)，亮度越高，說明該基因在樣本中的表達(dá)量相對(duì)越高，從而初步分析炎癥相關(guān)基因的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)則是在RT-PCR基礎(chǔ)上，能夠?qū)虮磉_(dá)進(jìn)行精確定量分析的先進(jìn)技術(shù)。其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比。在本實(shí)驗(yàn)中，采用SYBRGreen染料法，SYBRGreen能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合，當(dāng)DNA擴(kuò)增時(shí)，結(jié)合的SYBRGreen染料數(shù)量增加，熒光信號(hào)增強(qiáng)。反應(yīng)體系除了包含RT-PCR所需的成分外，還加入了SYBRGreen染料。反應(yīng)在熒光定量PCR儀中進(jìn)行，儀器能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，首先制備一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)，得到不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值（Cyclethreshold，即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），以Ct值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于未知樣本，通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR得到其Ct值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中目的基因的相對(duì)含量。采用比較CT值法，即ΔΔCt法，首先計(jì)算目的基因與內(nèi)參基因（如β-actin）的Ct值之差（ΔCt），然后計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的ΔCt之差（ΔΔCt），最后根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算出目的基因在實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)變化。這樣可以準(zhǔn)確評(píng)估不同年齡段ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠與野生型小鼠肝臟和主動(dòng)脈中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)差異。在血脂檢測(cè)方面，采用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)采集的小鼠血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。血清樣本在檢測(cè)前需在室溫下解凍，并輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。全自動(dòng)生化分析儀利用特定的化學(xué)反應(yīng)和光學(xué)檢測(cè)原理，能夠準(zhǔn)確測(cè)定血清中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等指標(biāo)。對(duì)于TC的檢測(cè)，通常采用酶法，即膽固醇氧化酶將膽固醇氧化為膽甾烯酮和過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶的作用下與4-氨基安替比林和酚反應(yīng)，生成紅色醌亞胺染料，通過比色法測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血清中TC的含量。TG的檢測(cè)同樣采用酶法，甘油三酯脂肪酶將甘油三酯水解為甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶的作用下磷酸化生成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油在磷酸甘油氧化酶的作用下氧化為磷酸二羥丙酮和過氧化氫，后續(xù)反應(yīng)與TC檢測(cè)類似，通過比色法測(cè)定吸光度并計(jì)算TG含量。LDL-C和HDL-C的檢測(cè)則利用特殊的試劑和反應(yīng)體系，通過選擇性沉淀或表面活性劑作用，將LDL和HDL與其他脂蛋白分離，然后采用與TC檢測(cè)類似的酶法測(cè)定其膽固醇含量。對(duì)于血清炎癥因子的檢測(cè)，利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒。ELISA試劑盒的原理基于抗原抗體特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)。以檢測(cè)TNF-α為例，首先將抗TNF-α抗體包被在酶標(biāo)板的微孔表面，形成固相抗體。加入待檢測(cè)的血清樣本后，樣本中的TNF-α?xí)c固相抗體特異性結(jié)合。然后加入酶標(biāo)記的抗TNF-α抗體，形成固相抗體-TNF-α-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入酶底物，酶標(biāo)抗體上的酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物。通過酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，吸光度與樣本中TNF-α的濃度成正比，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出血清中TNF-α的濃度。同樣的方法用于檢測(cè)IL-1、IL-6等其他炎癥因子，通過準(zhǔn)確測(cè)定血清中這些炎癥因子的濃度，分析它們與炎癥相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)。在肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜病理形態(tài)觀察方面，將采集的肝臟和主動(dòng)脈組織進(jìn)行固定、脫水、包埋等處理。固定采用4%多聚甲醛溶液，組織在固定液中浸泡24-48小時(shí)，以保持組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。脫水過程使用梯度酒精溶液，依次經(jīng)過70%、80%、90%、95%和100%的酒精浸泡，每個(gè)梯度浸泡時(shí)間根據(jù)組織大小而定，一般為1-3小時(shí)，目的是去除組織中的水分。包埋使用石蠟，將脫水后的組織放入融化的石蠟中，經(jīng)過浸蠟處理后，將組織包埋在石蠟塊中，制成石蠟切片。切片厚度一般為4-6μm，通過切片機(jī)切成薄片。對(duì)切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，蘇木精能夠使細(xì)胞核染成藍(lán)色，伊紅使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)染成紅色。染色步驟包括脫蠟、水化、蘇木精染色、水洗、分化、返藍(lán)、伊紅染色、脫水、透明和封片。脫蠟使用二甲苯，將石蠟切片浸泡在二甲苯中10-15分鐘，使石蠟溶解。水化則通過梯度酒精溶液從高濃度到低濃度依次浸泡切片，使組織重新吸收水分。蘇木精染色時(shí)間一般為5-10分鐘，染色后水洗去除多余的蘇木精。分化使用1%鹽酸酒精溶液，時(shí)間約為3-5秒，目的是去除細(xì)胞核中過多的蘇木精，使染色更加清晰。返藍(lán)使用自來水或弱堿性溶液，使細(xì)胞核重新變?yōu)樗{(lán)色。伊紅染色時(shí)間為3-5分鐘，染色后依次經(jīng)過95%酒精、100%酒精脫水，再用二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。通過HE染色，觀察肝臟脂肪變性情況，如肝細(xì)胞內(nèi)是否出現(xiàn)脂肪空泡，以及脂肪空泡的大小和數(shù)量；觀察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，判斷炎癥細(xì)胞的類型（如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等）和浸潤(rùn)程度。對(duì)于主動(dòng)脈內(nèi)膜，觀察脂質(zhì)沉積情況，如是否有脂質(zhì)條紋、粥樣斑塊形成，以及斑塊的大小、形態(tài)和位置；觀察內(nèi)膜增厚程度、平滑肌細(xì)胞的增生情況等。采用油紅O染色檢測(cè)組織中的脂質(zhì)，油紅O是一種脂溶性染料，能夠特異性地使脂質(zhì)染成紅色。染色前需將冰凍切片固定在4%多聚甲醛溶液中10-15分鐘，然后用60%異丙醇溶液漂洗。將切片浸入油紅O染液中染色10-15分鐘，染色后用60%異丙醇溶液分化，去除多余的染料，直至背景清晰。最后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，水洗后用甘油明膠封片。通過油紅O染色，能夠更直觀地觀察主動(dòng)脈內(nèi)膜和肝臟組織中的脂質(zhì)沉積情況，準(zhǔn)確判斷脂質(zhì)在組織中的分布和含量。采用圖像分析軟件對(duì)病理切片進(jìn)行定量分析，如Image-ProPlus軟件，通過設(shè)定閾值、選擇分析區(qū)域等操作，測(cè)量斑塊面積、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度等指標(biāo)。對(duì)于斑塊面積的測(cè)量，首先在軟件中打開病理切片圖像，選擇合適的顏色通道（如紅色通道用于油紅O染色圖像），通過調(diào)整閾值，使斑塊區(qū)域與背景分離，然后利用軟件的測(cè)量工具計(jì)算斑塊面積，并與整個(gè)切片面積進(jìn)行比較，得出斑塊面積占比。對(duì)于炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度的分析，選擇合適的染色圖像（如HE染色圖像），通過設(shè)定顏色閾值和形態(tài)學(xué)參數(shù)，識(shí)別炎癥細(xì)胞，軟件能夠自動(dòng)計(jì)算炎癥細(xì)胞的數(shù)量、面積等參數(shù)，從而評(píng)估炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度。將這些病理變化與炎癥相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，明確炎癥相關(guān)基因表達(dá)在動(dòng)脈粥樣硬化病理進(jìn)程中的作用。3.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析方法本研究選用GraphPadPrism8.0軟件和SPSS25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。GraphPadPrism8.0軟件在數(shù)據(jù)可視化方面功能強(qiáng)大，能夠生成高質(zhì)量、直觀的圖表，如柱狀圖、折線圖、散點(diǎn)圖等，便于直觀展示數(shù)據(jù)的分布和變化趨勢(shì)；SPSS25.0軟件則具有全面且深入的統(tǒng)計(jì)分析功能，涵蓋了多種統(tǒng)計(jì)方法，能滿足本研究對(duì)數(shù)據(jù)深入分析的需求。對(duì)于實(shí)驗(yàn)中獲得的多組數(shù)據(jù)，如不同年齡段ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠與野生型小鼠肝臟和主動(dòng)脈中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)量、血脂指標(biāo)以及血清炎癥因子濃度等，首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，使用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)方法判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較多組數(shù)據(jù)之間的差異。以不同年齡段ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠肝臟中TNF-α基因表達(dá)量為例，將14天齡、1月齡、2月齡和3月齡的ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠以及對(duì)應(yīng)年齡段的野生型小鼠的TNF-α基因表達(dá)量數(shù)據(jù)輸入SPSS25.0軟件，選擇單因素方差分析，軟件會(huì)計(jì)算組間和組內(nèi)的方差，得出F值和P值。若P值小于0.05，則認(rèn)為不同組之間存在顯著差異。當(dāng)發(fā)現(xiàn)組間存在顯著差異后，進(jìn)一步使用Tukey's多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，以明確具體哪些組之間存在差異。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(yàn)，如Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。例如，在檢測(cè)小鼠血清中某炎癥因子濃度時(shí)，若數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)不符合正態(tài)分布，將數(shù)據(jù)進(jìn)行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，軟件會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行秩轉(zhuǎn)換，計(jì)算H值和P值，判斷多組數(shù)據(jù)之間是否存在差異，若存在差異，再使用Dunn's檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。在分析炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平與血脂、血清炎癥因子之間的相關(guān)性時(shí)，采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析。當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時(shí)，選用Pearson相關(guān)分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r和P值。例如，分析ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠肝臟中IL-6基因表達(dá)量與血清中甘油三酯水平的相關(guān)性，將兩組數(shù)據(jù)輸入SPSS25.0軟件，選擇Pearson相關(guān)分析，若r值大于0且P值小于0.05，則表明兩者呈正相關(guān)；若r值小于0且P值小于0.05，則表明兩者呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布時(shí)，采用Spearman相關(guān)分析，同樣計(jì)算相關(guān)系數(shù)和P值，以確定變量之間的相關(guān)性。在組織病理學(xué)觀察中，對(duì)于圖像分析軟件測(cè)量得到的斑塊面積、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度等指標(biāo)數(shù)據(jù)，也按照上述正態(tài)性檢驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行處理。將不同組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊面積數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)分布，使用單因素方差分析比較不同組之間的差異，判斷ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠與野生型小鼠在不同年齡段主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊面積是否存在顯著差異，從而分析炎癥相關(guān)基因表達(dá)與病理形態(tài)改變之間的關(guān)系。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，確保本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為深入探究ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠炎癥相關(guān)基因的表達(dá)及其與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的關(guān)系提供有力的支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1血脂和血清炎癥因子檢測(cè)結(jié)果對(duì)不同年齡段ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠和野生型小鼠的血脂指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。從表中可以清晰地看出，在14天齡時(shí)，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠的總膽固醇（TC）水平就已顯著高于野生型小鼠，達(dá)到了[X1]mmol/L，約為野生型小鼠的[X2]倍。甘油三酯（TG）水平為[X3]mmol/L，同樣明顯高于野生型小鼠。低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平在14天齡的ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠中高達(dá)[X4]mmol/L，與野生型小鼠相比差異極為顯著。隨著年齡的增長(zhǎng)，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠的各項(xiàng)血脂指標(biāo)持續(xù)攀升。1月齡時(shí)，TC水平升高至[X5]mmol/L，2月齡時(shí)進(jìn)一步上升到[X6]mmol/L，3月齡時(shí)達(dá)到了[X7]mmol/L。TG和LDL-C水平也呈現(xiàn)出類似的增長(zhǎng)趨勢(shì)。而野生型小鼠在不同年齡段的血脂指標(biāo)相對(duì)穩(wěn)定，波動(dòng)較小。[此處插入表1：不同年齡段小鼠血脂指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果，表頭包含年齡、小鼠類型（ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠、野生型小鼠）、TC、TG、LDL-C、HDL-C等項(xiàng)目，表中對(duì)應(yīng)填入各年齡段小鼠的檢測(cè)數(shù)據(jù)]在血清炎癥因子檢測(cè)方面，結(jié)果如圖1所示。14天齡時(shí)，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠血清中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）濃度為[X8]pg/mL，顯著高于野生型小鼠的[X9]pg/mL。白細(xì)胞介素-1（IL-1）濃度為[X10]pg/mL，白細(xì)胞介素-6（IL-6）濃度為[X11]pg/mL，均明顯高于野生型小鼠。隨著年齡的增加，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠血清中的炎癥因子水平持續(xù)升高。TNF-α濃度在1月齡時(shí)達(dá)到[X12]pg/mL，2月齡時(shí)升高到[X13]pg/mL，3月齡時(shí)進(jìn)一步上升至[X14]pg/mL。IL-1和IL-6濃度也呈現(xiàn)出相似的上升趨勢(shì)。野生型小鼠血清中的炎癥因子水平在各年齡段相對(duì)較低，且變化不明顯。[此處插入圖1：不同年齡段小鼠血清炎癥因子水平柱狀圖，橫坐標(biāo)為年齡（14天齡、1月齡、2月齡、3月齡），縱坐標(biāo)為炎癥因子濃度（pg/mL），不同顏色柱狀分別代表ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠和野生型小鼠的TNF-α、IL-1、IL-6水平]綜合血脂和血清炎癥因子檢測(cè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠從14天齡開始就表現(xiàn)出明顯的血脂異常和炎癥因子水平升高，且隨著年齡的增長(zhǎng)，這種異常和升高的趨勢(shì)愈發(fā)明顯。這表明ApoE和LDLR雙基因缺失導(dǎo)致小鼠體內(nèi)脂代謝紊亂，進(jìn)而引發(fā)了炎癥反應(yīng)的激活和加劇。血脂異常與炎癥因子水平升高之間可能存在密切的關(guān)聯(lián)，脂代謝紊亂可能是誘發(fā)炎癥反應(yīng)的重要因素之一。隨著炎癥反應(yīng)的持續(xù)發(fā)展，又可能進(jìn)一步影響血脂代謝，形成惡性循環(huán)，共同促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。4.2肝臟和主動(dòng)脈中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)差異利用RT-PCR和實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)，對(duì)不同年齡段ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠和野生型小鼠肝臟和主動(dòng)脈中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2和圖2所示。在肝臟組織中，14天齡時(shí)，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠肝臟中的C反應(yīng)蛋白（CRP）基因表達(dá)量顯著高于野生型小鼠，其相對(duì)表達(dá)量達(dá)到了野生型小鼠的[X15]倍。1月齡時(shí)，CRP基因表達(dá)量雖仍高于野生型小鼠，但增長(zhǎng)趨勢(shì)有所減緩。隨著年齡的進(jìn)一步增長(zhǎng)，CRP基因表達(dá)量逐漸下降，至3月齡時(shí)，與野生型小鼠的表達(dá)量差異已不顯著。白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）基因在14天齡的ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠肝臟中表達(dá)量顯著升高，為野生型小鼠的[X16]倍。隨后，其表達(dá)量隨著年齡的增長(zhǎng)持續(xù)上升，在3月齡時(shí)達(dá)到峰值，為野生型小鼠的[X17]倍。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）基因在1月齡的ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠肝臟中表達(dá)量顯著高于野生型小鼠，是野生型小鼠的[X18]倍。之后，TNF-α基因表達(dá)量繼續(xù)升高，在2月齡時(shí)達(dá)到峰值，為野生型小鼠的[X19]倍，隨后略有下降，但在3月齡時(shí)仍顯著高于野生型小鼠。[此處插入表2：不同年齡段小鼠肝臟和主動(dòng)脈中炎癥相關(guān)基因表達(dá)量，表頭包含年齡、小鼠類型（ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠、野生型小鼠）、肝臟CRP、肝臟IL-1β、肝臟TNF-α、主動(dòng)脈IL-1β、主動(dòng)脈TLR2、主動(dòng)脈MCP-1等項(xiàng)目，表中對(duì)應(yīng)填入各年齡段小鼠的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)]在主動(dòng)脈組織中，1月齡時(shí)，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠主動(dòng)脈中的IL-1β基因表達(dá)量顯著高于野生型小鼠，達(dá)到野生型小鼠的[X20]倍。TLR2基因表達(dá)量也明顯升高，是野生型小鼠的[X21]倍。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）基因表達(dá)量同樣顯著高于野生型小鼠，為野生型小鼠的[X22]倍。隨著年齡的增長(zhǎng)，除了TLR2基因表達(dá)量在3月齡時(shí)降至與野生型小鼠相近水平外，IL-1β和MCP-1基因表達(dá)量持續(xù)升高。IL-1β基因在3月齡時(shí)表達(dá)量為野生型小鼠的[X23]倍，MCP-1基因在2月齡時(shí)達(dá)到峰值，為野生型小鼠的[X24]倍，3月齡時(shí)雖有所下降，但仍顯著高于野生型小鼠。[此處插入圖2：不同年齡段小鼠肝臟和主動(dòng)脈中炎癥相關(guān)基因表達(dá)量柱狀圖，橫坐標(biāo)為年齡（14天齡、1月齡、2月齡、3月齡），縱坐標(biāo)為基因相對(duì)表達(dá)量，不同顏色柱狀分別代表ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠和野生型小鼠在肝臟和主動(dòng)脈中CRP、IL-1β、TNF-α、TLR2、MCP-1等基因的表達(dá)量]從上述結(jié)果可以看出，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠肝臟和主動(dòng)脈中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)與野生型小鼠存在顯著差異。在肝臟中，CRP基因表達(dá)先升高后降低，IL-1β和TNF-α基因表達(dá)則呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢(shì)。在主動(dòng)脈中，IL-1β、TLR2和MCP-1基因在1月齡時(shí)就顯著升高，且IL-1β和MCP-1基因表達(dá)隨著年齡增長(zhǎng)持續(xù)上升。這些炎癥相關(guān)基因表達(dá)的變化與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CRP作為一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，其基因表達(dá)的早期升高可能是對(duì)ApoE/LDLR雙基因缺失導(dǎo)致的脂代謝紊亂的一種應(yīng)激反應(yīng)，隨著機(jī)體的適應(yīng)或其他調(diào)節(jié)機(jī)制的作用，其表達(dá)量逐漸下降。而IL-1β和TNF-α等炎癥因子基因表達(dá)的持續(xù)升高，表明炎癥反應(yīng)在ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠體內(nèi)不斷加劇，可能通過激活炎癥細(xì)胞、促進(jìn)炎癥因子的釋放以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種途徑，加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。在主動(dòng)脈中，IL-1β、TLR2和MCP-1基因表達(dá)的顯著升高，尤其是MCP-1作為一種重要的趨化因子，能夠吸引單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成和炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大，從而在動(dòng)脈粥樣硬化的起始和發(fā)展階段發(fā)揮重要作用。4.3肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜的病理形態(tài)改變對(duì)不同年齡段ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠和野生型小鼠的肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果如圖3和圖4所示。在14天齡時(shí)，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠肝臟的肝細(xì)胞出現(xiàn)輕度脂肪變性，部分肝細(xì)胞內(nèi)可見小的脂肪空泡。油紅O染色顯示肝臟組織中有少量脂質(zhì)沉積，呈紅色點(diǎn)狀分布。此時(shí)，肝臟內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，主要為散在分布的巨噬細(xì)胞。隨著年齡增長(zhǎng)，1月齡時(shí)，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠肝臟的脂肪變性進(jìn)一步加重，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡增多、增大，部分肝細(xì)胞呈現(xiàn)出大泡性脂肪變性。油紅O染色可見肝臟組織中脂質(zhì)沉積明顯增加，脂質(zhì)分布范圍擴(kuò)大。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)也有所增加，除巨噬細(xì)胞外，還可見少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。2月齡時(shí)，肝臟脂肪變性更為顯著，肝細(xì)胞排列紊亂，大量肝細(xì)胞被脂肪空泡占據(jù)，細(xì)胞核被擠壓至細(xì)胞邊緣。油紅O染色顯示肝臟組織中脂質(zhì)沉積廣泛，形成大片狀的紅色區(qū)域。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)一步加劇，炎癥細(xì)胞聚集形成炎癥灶。3月齡時(shí)，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠肝臟出現(xiàn)了肝細(xì)胞壞死，壞死區(qū)域可見細(xì)胞核固縮、碎裂。炎癥反應(yīng)持續(xù)增強(qiáng)，炎癥細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)整個(gè)肝臟組織。而野生型小鼠在各年齡段肝臟形態(tài)基本正常，肝細(xì)胞排列整齊，無明顯脂肪變性和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，油紅O染色顯示肝臟組織中幾乎無脂質(zhì)沉積。[此處插入圖3：不同年齡段小鼠肝臟病理切片圖，包括HE染色和油紅O染色，圖片清晰展示各年齡段ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠和野生型小鼠肝臟的病理變化，如脂肪變性、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、脂質(zhì)沉積等情況]在主動(dòng)脈內(nèi)膜方面，1月齡時(shí)，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜可見少量散在的脂質(zhì)沉積，內(nèi)膜輕度增厚。HE染色顯示內(nèi)膜下有少量泡沫細(xì)胞聚集。隨著年齡增長(zhǎng)，2月齡時(shí)，主動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積增多，形成明顯的脂質(zhì)條紋，內(nèi)膜增厚更為明顯。泡沫細(xì)胞大量聚集，形成較大的泡沫細(xì)胞團(tuán)。3月齡時(shí)，主動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)典型的粥樣斑塊，斑塊內(nèi)含有大量脂質(zhì)、泡沫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)。斑塊表面的纖維帽變薄，部分區(qū)域出現(xiàn)破裂。而野生型小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜在各年齡段均光滑平整，無明顯脂質(zhì)沉積和內(nèi)膜增厚現(xiàn)象，無泡沫細(xì)胞和粥樣斑塊形成。[此處插入圖4：不同年齡段小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜病理切片圖，包括HE染色和油紅O染色，圖片清晰展示各年齡段ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠和野生型小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜的病理變化，如脂質(zhì)沉積、內(nèi)膜增厚、泡沫細(xì)胞形成、粥樣斑塊形成等情況]綜合肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜的病理形態(tài)改變以及之前的血脂、血清炎癥因子檢測(cè)和炎癥相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果分析，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜的病理變化與血脂異常、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。ApoE和LDLR雙基因缺失導(dǎo)致小鼠血脂代謝紊亂，血液中膽固醇和甘油三酯等脂質(zhì)成分升高。這些過多的脂質(zhì)在肝臟中沉積，引發(fā)肝臟脂肪變性，隨著年齡增長(zhǎng)，脂肪變性逐漸加重，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死。同時(shí)，脂質(zhì)沉積還激活了肝臟內(nèi)的炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸增多，炎癥相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，如IL-1β、TNF-α等基因表達(dá)的升高，進(jìn)一步加劇了肝臟的炎癥損傷。在主動(dòng)脈內(nèi)膜，血脂異常使得脂質(zhì)在血管內(nèi)膜下沉積，形成脂質(zhì)條紋和粥樣斑塊。炎癥反應(yīng)在這一過程中起到了重要的促進(jìn)作用，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥因子的釋放，如IL-1β、MCP-1等，吸引更多的炎癥細(xì)胞聚集，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成和斑塊的發(fā)展，導(dǎo)致主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、斑塊不穩(wěn)定，最終增加了動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。4.4結(jié)果綜合分析與討論本研究通過對(duì)ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠的血脂、血清炎癥因子、肝臟和主動(dòng)脈中炎癥相關(guān)基因表達(dá)以及肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜病理形態(tài)改變的檢測(cè)與分析，深入探討了ApoE和LDLR雙基因缺失對(duì)小鼠的影響及其與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。從血脂檢測(cè)結(jié)果來看，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠從14天齡起就表現(xiàn)出顯著的血脂異常，TC、TG和LDL-C水平明顯高于野生型小鼠，且隨著年齡增長(zhǎng)，血脂異常愈發(fā)嚴(yán)重。這是因?yàn)锳poE和LDLR雙基因缺失導(dǎo)致ApoE及其主要受體途徑受阻，使得脂蛋白的代謝和清除功能嚴(yán)重受損。脂蛋白無法正常被代謝和清除，大量積聚在血液中，從而導(dǎo)致血脂水平升高。這種血脂異常為動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，過多的脂質(zhì)容易在血管壁沉積，引發(fā)后續(xù)的病理變化。血清炎癥因子檢測(cè)結(jié)果顯示，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠血清中的TNF-α、IL-1和IL-6等炎癥因子水平在14天齡時(shí)就顯著高于野生型小鼠，并隨年齡增長(zhǎng)持續(xù)升高。這表明ApoE/LDLR雙基因缺失引發(fā)的脂代謝紊亂激活了炎癥反應(yīng)。血脂異常導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙使其表達(dá)粘附分子，吸引炎癥細(xì)胞如單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞粘附并遷移到血管內(nèi)膜下。這些炎癥細(xì)胞被激活后，分泌大量的炎癥因子，從而導(dǎo)致血清炎癥因子水平升高。炎癥因子的持續(xù)升高又會(huì)進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。在炎癥相關(guān)基因表達(dá)方面，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠肝臟和主動(dòng)脈中多個(gè)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)與野生型小鼠存在顯著差異。在肝臟中，CRP基因表達(dá)先升高后降低，可能是機(jī)體對(duì)脂代謝紊亂的早期應(yīng)激反應(yīng)，隨著其他調(diào)節(jié)機(jī)制的啟動(dòng)，其表達(dá)量逐漸下降。而IL-1β和TNF-α基因表達(dá)持續(xù)升高，表明肝臟內(nèi)的炎癥反應(yīng)不斷加劇。在主動(dòng)脈中，IL-1β、TLR2和MCP-1基因表達(dá)顯著升高，且IL-1β和MCP-1基因表達(dá)隨年齡增長(zhǎng)持續(xù)上升。這些基因的表達(dá)變化與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。IL-1β和TNF-α等炎癥因子基因的高表達(dá)，可激活炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥因子的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。MCP-1作為趨化因子，能吸引單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成和炎癥反應(yīng)擴(kuò)大。肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜的病理形態(tài)改變進(jìn)一步證實(shí)了ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠存在嚴(yán)重的病理變化。肝臟從14天齡的輕度脂肪變性逐漸發(fā)展到3月齡的肝細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)，主動(dòng)脈內(nèi)膜從1月齡的少量脂質(zhì)沉積和內(nèi)膜輕度增厚發(fā)展到3月齡的典型粥樣斑塊形成，且斑塊不穩(wěn)定。這些病理變化與血脂異常、炎癥反應(yīng)以及炎癥相關(guān)基因表達(dá)的變化密切相關(guān)。血脂異常導(dǎo)致脂質(zhì)在肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜沉積，引發(fā)脂肪變性和動(dòng)脈粥樣硬化病變。炎癥反應(yīng)在這一過程中起到了促進(jìn)作用，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子釋放加劇了肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜的損傷。綜上所述，ApoE/LDLR雙基因缺失導(dǎo)致小鼠脂代謝紊亂，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)病理變化，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。脂代謝紊亂、炎癥反應(yīng)和炎癥相關(guān)基因表達(dá)之間相互作用、相互影響，形成一個(gè)復(fù)雜的病理網(wǎng)絡(luò)。深入了解這一過程，對(duì)于揭示動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，也為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供了新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。后續(xù)研究可進(jìn)一步探討這些炎癥相關(guān)基因之間的相互作用機(jī)制，以及針對(duì)這些關(guān)鍵基因或信號(hào)通路的干預(yù)措施對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治效果。五、研究結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論本研究通過對(duì)ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠的深入研究，全面揭示了炎癥相關(guān)基因在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)規(guī)律及其與血脂、血清炎癥因子以及病理形態(tài)改變之間的關(guān)系，得出以下主要結(jié)論：血脂和血清炎癥因子變化顯著：ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠自14天齡起，血脂水平即出現(xiàn)顯著異常，總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平大幅高于野生型小鼠，且隨年齡增長(zhǎng)持續(xù)攀升。同時(shí)，血清中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子水平在14天齡時(shí)也顯著高于野生型小鼠，并呈隨年齡增長(zhǎng)而持續(xù)升高的趨勢(shì)。這表明ApoE和LDLR雙基因缺失導(dǎo)致小鼠脂代謝紊亂，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)的激活和加劇，血脂異常與炎癥因子水平升高之間存在密切關(guān)聯(lián)，可能形成惡性循環(huán)，共同促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。炎癥相關(guān)基因表達(dá)差異明顯：在肝臟組織中，C反應(yīng)蛋白（CRP）基因在14天齡和1月齡時(shí)，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠的表達(dá)量顯著高于野生型小鼠，但隨后逐漸降至野生型水平；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）基因在14天齡時(shí)表達(dá)量顯著升高，并隨年齡增長(zhǎng)持續(xù)上升，3月齡時(shí)達(dá)到峰值；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）基因在1月齡時(shí)表達(dá)量顯著高于野生型小鼠，2月齡時(shí)達(dá)到峰值，隨后略有下降，但3月齡時(shí)仍顯著高于野生型小鼠。在主動(dòng)脈組織中，IL-1β、Toll樣受體2（TLR2）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）基因在1月齡時(shí)，ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠的表達(dá)量顯著高于野生型小鼠，除TLR2基因表達(dá)量在3月齡時(shí)降至與野生型小鼠相近水平外，IL-1β和MCP-1基因表達(dá)量持續(xù)升高。這些炎癥相關(guān)基因表達(dá)的變化與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，不同基因在不同組織和年齡段呈現(xiàn)出獨(dú)特的表達(dá)模式，反映了炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中的動(dòng)態(tài)變化。肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜病理變化顯著：ApoE/LDLR雙基因缺失小鼠肝臟從14天齡的輕度脂肪變性，逐漸發(fā)展為3月齡的肝細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)；主動(dòng)脈內(nèi)膜從1月齡的少量脂質(zhì)沉積和內(nèi)膜輕度增厚，發(fā)展為3月齡的典型粥樣斑塊形成，且斑塊不穩(wěn)定。這些病理變化與血脂異常、炎癥反應(yīng)以及炎癥相關(guān)基因表達(dá)的變化密切相關(guān)。血脂異常導(dǎo)致脂質(zhì)在肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜沉積，引發(fā)脂肪變性和動(dòng)脈粥樣硬化病變，炎癥反應(yīng)在這一過程中起到了促進(jìn)作用，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子釋放加劇了肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜的損傷。脂代謝紊亂與血管炎癥損傷相互作用：綜合上述結(jié)果，ApoE/LDLR雙基因缺失導(dǎo)致小鼠脂代謝紊亂，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致肝臟和主動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)病理變化，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。脂代謝紊亂、炎癥反應(yīng)和炎癥相關(guān)基因表達(dá)之間相互作用、相互影響，形成一個(gè)復(fù)雜的病理網(wǎng)絡(luò)。5.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與貢獻(xiàn)本研究在動(dòng)脈粥樣硬化炎癥機(jī)制研究領(lǐng)域具有多方面的創(chuàng)新點(diǎn)，為該領(lǐng)域的發(fā)展做出了獨(dú)特貢獻(xiàn)。在研究方法上，本研究實(shí)現(xiàn)了多技術(shù)、多指標(biāo)的綜合運(yùn)用。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)，精準(zhǔn)檢測(cè)不同年齡段ApoE/LDL