1T/QAS***-2025T/QHNX***－2025木霉屬DK菌劑生產應用技術規(guī)范本文件規(guī)定了Trichodermasp.DK菌劑術語和定義、生產場地及環(huán)境、培養(yǎng)基質及配方、菌種發(fā)酵液生產、發(fā)酵液施用方法、種植環(huán)境、應用植物、禾本科作物田間管理、牧草地管理、采收、菌劑生產質量要求、生產記錄與存檔等要求。本文件適用于促進部分禾本科植物（同德短芒披堿草Elymusbreviaristatuscv.Tongde、青海中華羊茅FestucasinensisKengcv.Qinghai、青海冷地早熟禾PoacrymophilaKengcv.Qinghai、青海草地早熟禾PoapratensisL.cvQinghai、燕麥AvenasativaL.、小麥TriticumaestivumL、青稞Hordeumvulgarevar.coelesteL.）生長與增強抗逆性。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，標注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；未標注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB150.1壓力容器第1部分：通用要求GB2715食品安全標準糧食GB5084農田灌溉水質標準GB5749生活飲用水衛(wèi)生標準GB/T8321（所有部分）農藥合理使用標準GB15618土壤環(huán)境質量農用地土壤污染風險管控標準（試行）GB20287農用微生物菌劑GB50073潔凈廠房設計規(guī)范NY/T883農用微生物菌劑生產技術規(guī)程3術語和定義GB20287-2006界定的術語和定義適用于本文件。3.1Trichodermasp.DK純化后的菌株菌落整體白色，圓形、菌絲呈干燥絨狀邊緣不規(guī)則，有隔菌絲，無孢子。菌落背面背面整體顏色一致，為淡粉色。菌絲直徑為：5.65±0.132(μm），符合木霉屬特征，將菌株編號為DK。ITSDNA序列信息>KR995112.1TrichodermarossicumisolateBK0618SribosomalRNAgene,partialsequence;internaltranscribedspacer1,5.8SribosomalRNAgene,andinternaltranscribedspacer2,completesequence;and28SribosomalRNAgene,partialsequenceT/QAS***-2025T/QHNX***－20252GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTACTTCTGAGAATTTCTCGGCGCCCCTAGTGGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTTTCACCGGGTGCCGGCCCCTAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCATGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGANCBI登錄號：KR995112.1。CGMCCNo.409324生產場地及環(huán)境4.1廠房從布局結構功能上應滿足液體品種生產的基本需求，主要分區(qū)之間應相互獨立隔離。4.2主要分區(qū)應包括化驗室、菌種室、接種間、培養(yǎng)間、配料間、發(fā)酵間和其他配套功能間。4.3廠房周圍交通便利，無污水和其他污染源，衛(wèi)生環(huán)境應符合NY/T883和GB50073相關要求。5培養(yǎng)基質及配方5.1原料5.1.1菌株：Trichodermasp.DK。5.1.2菌種培養(yǎng)基質包括固體和液體培養(yǎng)基：馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂，蒸餾水。5.1.3一級種子培養(yǎng)基質：馬鈴薯、葡萄糖、蒸餾水。5.1.4二級種子培養(yǎng)基質：馬鈴薯、葡萄糖、蒸餾水。5.1.5三級種子培養(yǎng)基質：馬鈴薯、葡萄糖、蒸餾水。5.1.6發(fā)酵液培養(yǎng)基質：馬鈴薯、葡萄糖、水。5.2原料要求菌株要求無其他雜菌污染；馬鈴薯質量要求符合GB2715，葡萄糖符合NY/T883的相關要求。5.3配方PDA固體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。PDA液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL。6菌種發(fā)酵液生產6.1培養(yǎng)液制備T/QAS***-2025T/QHNX***－202536.1.1一級和二級種子培養(yǎng)基配制方法如下：先洗凈去皮切碎，稱取馬鈴薯并煮爛（煮沸半個小時左右，能被玻璃棒戳破即可），用八層紗布過濾，紗布的孔徑為60μm，分裝到1000mL三角瓶中，裝量為200mL/1000mL。6.1.2種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)基配制方法如下：先洗凈馬鈴薯，在清洗過程中盡量去除掉皮，切碎后稱取馬鈴薯并煮爛（煮沸半個小時左右，能被玻璃棒戳破即可），用八層紗布過濾，加入到罐中定容。6.2滅菌高壓蒸汽滅菌鍋應符合GB150.1要求，115°C滅菌20min，冷卻后等待備用。6.3一級種子的制備在無菌室的超凈工作臺中，用滅菌的接種環(huán)刮一環(huán)帶有菌絲的DK菌株斜面轉接至PDB培養(yǎng)基中，25℃靜置培養(yǎng)3d左右（黑暗）。6.4二級種子的制備種子為一級種子，接種量為5%，在170r·min-1的搖床上25℃培養(yǎng)大約在48h時，pH達到3.3-3.4、菌絲干重達到0.35g/100mL。6.5三級種子制備把培養(yǎng)好的二級種子按5%接種量接入到種子罐中，pH調到4左右，通風比（每min每單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積）為0.5L/(L·min)，罐壓為0.05MPa，溶氧≥30%，25℃培養(yǎng)33h左右，菌絲干重達到0.35g/100ml發(fā)酵液，pH為3.67（濾液）作為種子備用。6.6發(fā)酵液生產將培養(yǎng)好的三級種子液按5%接種量接入到發(fā)酵罐中，pH調到4左右，通風比（每分鐘每單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積）為0.7L/(L·min)，罐壓為0.05MPa，溶氧≥30%，25℃培養(yǎng)40h左右，菌絲干重達到0.45g/100ml發(fā)酵液，pH為3.45左右（濾液），發(fā)酵結束。6.7放罐準備終止發(fā)酵后需運輸則在培養(yǎng)器內通入無菌二氧化碳，2h，清除發(fā)酵液中氧氣，減少運輸過程中的DK菌的二次生長，裝儲液罐運輸，長途運輸需要透氣蓋，以防運輸過程脹罐，菌液溢流。7發(fā)酵液施用方式7.1浸種7.1.1菌株發(fā)酵液首先利用干凈水（生活飲用水衛(wèi)生標準）進行5~10倍稀釋。7.1.2按稀釋液（L）與燕麥種子（kg）為1：1(v/m)充分混合，并浸泡6h，去除菌液，自然陰干種子后種植。7.1.3根據(jù)地方高產標準，種子用量為15kg/畝。7.2拌種按發(fā)酵液（L）與燕麥種子（kg）為1：4(v/m)的比例進行充分混合。具體的操作方法如下：T/QAS***-2025T/QHNX***－20254a)根據(jù)燕麥種子的重量確定菌株發(fā)酵液的用量；b)將發(fā)酵液均勻地澆灑燕麥種子，翻轉均勻，使得種子表面充分浸濕后堆放6h，曬干種子后種植；c)種子用量為15kg/畝。7.3拌料7.3.1將羊板糞：發(fā)酵液按1m3:1L比例充分混勻后，均勻施用于地表，經機械翻耕（深度20cm）使得肥土混合均勻。7.3.2采用機械撒播的方式播種禾本科牧草：同德短芒披堿草、青海中華羊茅、青海冷地早熟禾和青海草地早熟禾，牧草種子用量為6kg/畝。7.4堆肥7.4.1按羊板糞重量加入5~10%DK發(fā)酵液(m/v)，攪拌混勻后堆積發(fā)酵液，用直徑5cm的木棒在發(fā)酵堆頂部垂直向下打2排透氣孔，孔間距約為5cm，在羊板糞堆肥表面覆蓋塑料薄膜，在塑料薄膜側面開4個通風口，以防止堆肥過程中的水分大量蒸發(fā)和降雨天氣。7.4.2控制羊板糞堆肥中水分保持在60%左右，發(fā)酵過程中菌渣堆肥每15d翻一次。7.4.3發(fā)酵堆肥時長為30d。7.4.4發(fā)酵結束后均勻施用于地表，經機械翻耕（深度20cm）使得肥土混合均勻。7.4.5采用機械撒播的方式播種禾本科牧草：同德短芒披堿草、青海中華羊茅、青海冷地早熟禾和青海草地早熟禾，牧草種子用量為6kg/畝。8種植環(huán)境8.1土壤要求以沙土、沙壤土為主的土壤，土壤pH值8~9，呈中性或弱堿性為宜。土壤環(huán)境質量符合GB15618的要求。8.2種植場處理在早春進行種植場翻耕，翻耕時清除雜草、灌木。8.3種植季節(jié)不同產區(qū)栽培季節(jié)存在差異，4~6月可種植。9應用植物采用機械播種，用量如下：a)牧草種子用量為6kg/畝；b)燕麥種子為15kg/畝；c)小麥種子為15kg/畝；d)青稞種子15kg/畝。T/QAS***-2025T/QHNX***－2025510禾本科作物田間管理10.1灌溉、施肥和除蟲等均按地方高產標準對田間進行管理。10.2田間灌溉應符合GB5084。10.3農藥使用應符合GB/T8321。11牧草地管理11.1種植后無紡布覆蓋。11.2種植場周圍建圍欄防治人、畜踩踏危害。11.3灌溉、追肥和除蟲等均不進行人為干預。12采收12.1采收時間按植物用途適時安排采收，選擇晴天或陰天進行，忌雨天采收。12.2采收標準12.2.1牧草：抽穗期至開花期采收較為適宜。12.2.2燕麥：籽粒由綠色變?yōu)辄S色或淺褐色，且大部分籽粒顏色均勻一致；燕麥穗部的小穗軸由綠色變?yōu)辄S色，且小穗上的穎殼張開；乳線消失；出現(xiàn)黑層。12.2.3小麥：麥粒由綠色逐漸變?yōu)樯顪\不同的黃色或橘黃色，麥粒顏色均勻一致；麥穗整體變黃，麥芒干枯，小穗基部的節(jié)片呈淺黃色；用手擠壓麥粒，感覺堅硬，不易變形；莖桿變黃，葉片大部分枯黃。12.2.4青稞：青稞穗部由綠色轉為黃色或淡黃色，且顏色均勻一致；用手擠壓籽粒，感覺堅硬，不易變形；乳線消失；黑層形成。13菌劑生產質量要求13.1菌劑質量檢測方法取100mL發(fā)酵液，利用濾紙過濾菌劑，使得發(fā)酵液內的濾液和菌體分離。然后測量濾液的pH，于恒溫烘箱內60℃烘干菌體，恒重時用電子天