免疫學(xué)檢測技術(shù)

生物技術(shù)學(xué)院抗體工程研究所

2010年3月7日

1

分子診斷學(xué)

0分子診斷學(xué)是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)

,利用基因和蛋白質(zhì)分析技術(shù)和方法來

研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子體

系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化，為

疾病的監(jiān)測、診斷、療效判斷和預(yù)后評

估、個體化治療等提供信息和決策依據(jù)

的一門科學(xué)。

0隨著分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，分子診

斷已從傳統(tǒng)的DNA診斷概念發(fā)展到更全面

的核酸和蛋白質(zhì)診斷的新概念；分子診

斷的內(nèi)容也從早期的單一遺傳性疾病的

診斷發(fā)展成為覆蓋臨床醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)

等眾多領(lǐng)域的重要技術(shù)。

1

2008年國內(nèi)臨床診斷試劑市場

生化產(chǎn)品30%

v免疫產(chǎn)品25%

基因產(chǎn)品8%

v血液分析產(chǎn)品8%?10%

v尿液分析產(chǎn)品3%~5%

微生物產(chǎn)品2%?3%

占全球市場的1/14

1

免疫學(xué)檢驗(yàn)項(xiàng)目分布情況

Source:UBSWarburgLLCestimates

Infectiousdiseases

Tumormarkers

主要內(nèi)容

(1)酶免疫分析

(2)放射免疫分析

(3)免疫熒光分析

(4)時間分辨熒光免疫分析

(5)化學(xué)發(fā)光免疫分析

(6)金標(biāo)和磁性免疫層析分析

(7)蛋白印跡

(8)AlphaScreen分析技術(shù)1

抗原抗體反應(yīng)的特性

1、特異性

2、可見性

3、可逆性

+

AgAb

1

影響抗原抗體反應(yīng)的因素

⑴抗原抗體的性質(zhì)

⑵溫度

⑶酸堿度（PH）

（4）電解質(zhì)（離子強(qiáng)度

）

1

抗原和抗體的類別

抗原抗體

1

標(biāo)記免疫學(xué)分析技術(shù)發(fā)展歷程

0免疫熒光分析(Coons,1941)

0放射免疫分析(Berson和Yalow,I960)

0酶聯(lián)免疫吸附分析(Engvall,1971)

0金標(biāo)免疫分析(Faulk和Taylor,1971)

0化學(xué)發(fā)光免疫分析(Arakawa,1977)

0時間分辨熒光免疫分析(Soini和Hemmila,1979)

0電化學(xué)發(fā)光免疫分析(Leland,1990)

1

標(biāo)記免疫學(xué)分析技術(shù)發(fā)展歷程

⑥電化學(xué)發(fā)光

⑤時間分辨熒光

④化學(xué)發(fā)光

③酶聯(lián)免疫

②放射免疫

①免疫熒光

1

丁酶免疫分析技術(shù)

酶免疫組織化學(xué)

酶免疫技術(shù)均相

酶免疫測定固相⑥聞

異相

液相

1

（一）ELISA技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附測定(EnzymeLinkedImmuno

SorbentAssay,ELISA)基礎(chǔ)是抗原或抗體

的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記，反應(yīng)完成后

加入酶反應(yīng)底物，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物

,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，

由此進(jìn)行定性或定量分析。

1

標(biāo)記用酶的要求

①來源方便，易于純化；

②比活性高，性質(zhì)穩(wěn)定；

③與抗體或抗原交聯(lián)后仍保持酶的活性；

④待測物中不存在該酶及其底物、抑制劑和其它干

擾因素；

⑤酶活性和量能用簡單、快速、敏感的方法測定。

辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶

1

辣根過氧化物酶

0底物為鄰苯二胺(OPD),橙紅色，檢測

波長492nll1；

0四甲基聯(lián)苯胺(TMB),藍(lán)綠色，檢測波

長450nm

1

堿性磷酸酶

底物為PNP（對硝基磷酸苯酯），檢測波長

405nm。

1

ELISA的必要試劑

0固相的抗原或抗體

0酶標(biāo)記的抗原或抗體

0酶作用的底物

4根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具

備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。

1

技術(shù)類型

0雙抗體夾心法測抗原

0雙抗原夾心法測抗體

0間接法測抗體

0競爭法測抗體

0競爭法測抗原

0捕獲包被法測抗體

0B心比建法

1

⑴雙抗體夾心法測抗原

底物

酶標(biāo)抗體樣品

酶標(biāo)儀測定0D值終止液

此法適用于檢驗(yàn)各種大分子抗原，例如

、、等。

HBsAgHBeAgAFP1

⑴雙抗體夾心法測抗體

n在一步法測定中，如標(biāo)本中受檢抗原的含量很高

時，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而

不再形成“夾心復(fù)合物'。所得結(jié)果將低于實(shí)際的含

量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)(hookeffect)o

n類風(fēng)濕因子(RF)的干擾。RF是一種自身抗體

，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合。表

現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。

⑵雙抗原夾心法測抗體

反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。

用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)

合物，以檢測相應(yīng)的抗體?？拐N

、抗十乂抗邨的檢測常采用本

法。

1

⑶間接法測抗體

樣品稀釋液樣品酶標(biāo)抗體

終止液底物

一些傳染病的診斷(Torch)。包被抗原利用

酶標(biāo)二抗建立檢測相應(yīng)抗體的方法。

1

⑷競爭法測抗體

樣品酶標(biāo)抗體

終止液底物

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到

足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。如

抗-HBc等常用該方法。1

⑸競爭法測抗原

其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)

抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含

量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最

后的顯色也愈淺。小分子激素（T3、T4）、藥

物等ELISA測定多用此法。

1

⑹捕獲包被法測抗體

樣品特異性抗原酶標(biāo)抗體

終止液底物

13M的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人igM抗

體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括

針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。

此法常用于病毒性感染的早期診斷。

1

⑺的田樓法

①：固相支持物；

②：樣品；

③：特異性IgG；

④：生物素化抗小鼠IgG(Biotin)；

⑤：辣根過氧化物酶HRP-酶標(biāo)鏈親和素(Avidin)；

@：DAB顯色液；

⑦：顯色；1

酶標(biāo)記抗原或抗體的方法

1.戊二醛法

一步法：將HRP和抗體與戊二醛同時反應(yīng)連接

而成。一步法操作簡單，但所得產(chǎn)物質(zhì)量不均

一，抗體活性損失大，結(jié)合物的產(chǎn)率低。

二步法：將HRP按一定比例與戊二醛反應(yīng)，形

成HRP-戊二醛結(jié)合物，透析除去未結(jié)合的戊二

醛后，再加入抗體。二步法制備的結(jié)合物產(chǎn)量

雖無提高，但質(zhì)量均一，活性高。

1

酶標(biāo)記抗原或抗體的方法

2.過碘酸鈉法

過碘酸鈉將酶分子上的糖羥基氧化成醛基,

醛基與抗體（或抗原）中的游離氨基結(jié)合形成

Schiffs堿，經(jīng)NaBH4還原生成穩(wěn)定的酶結(jié)合

物。

該法快速簡便、安全，酶結(jié)合物的產(chǎn)率高、

活性好，已成為目前最常用的酶標(biāo)記方法。

1

酶標(biāo)記物的純化

0硫酸錢鹽析法

OS^hafeG-200凝膠過濾

0SBV親和層析

1

酶標(biāo)記物的鑒定

評價(jià)最好好一般

酶含量(mg/ml)>1.0>0.50.4

酶結(jié)合率(%)>309-107

克分子比(酶/igG)>1.51.00.7

0酶含量(mg/mI)=OD403x0.42

0IgG#i(mg/ml)=(OD28O-OD4O3xO.3O)xO.62

0酶的結(jié)合率=結(jié)合物中酶量(mg/ml)/標(biāo)記時加入酶量(mg/ml)xlOO%j

最適工作濃度的選擇（間接法）

酶標(biāo)抗體工作濃度包被抗原工作濃度

1

間接ELISA法包被抗原工作濃度的選擇

各抗原稀度的吸光度

參考血清1:80

1:501:1001:2001:400

0

強(qiáng)陽性1.261.080.860.680.42

弱陽性0.680.410.300.220.18

性0.250.130.050.040.03

稀液0.090.020.020.020.04

1

雙抗體夾心法工作濃度的選擇（棋盤法）

酶抗體各抗原度的吸光度

包被抗體度稀

度25n^/ml1.5ng/ml性

1:2000

5pg/ml1:4000

1:8000

1:2000

3|Lig/ml1:4000

1:8000

lRg/ml1:2000

1:4000

CL，1：迎。

425ng/ml的抗原OD值約加8-陰性O(shè)D值小于0.1；

ELISA技術(shù)操作要點(diǎn)

0固相載體的選擇

0包被

0封閉

0加樣

0保溫

0洗滌

。顯色

1

試劑盒試劑操作前的注意事項(xiàng)

n不同批號的試劑盒不要混用。

n整個實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)盡量建立在干凈無

塵的環(huán)境下進(jìn)行。

n試劑盒與待檢樣本使用前必須平衡

至室溫。

1

酶標(biāo)板

0酶標(biāo)板最常用的材料是聚苯乙烯。聚苯

乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體

或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免

疫學(xué)活性。

0良好的酶標(biāo)板應(yīng)該是吸附性

能好，空白值低，孔底透明

度高，各板之間、同一板各

孔之間性能相近。

1

酶標(biāo)板的檢定

以一定濃度的人IgG（一般為10ng/mI）

包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀

釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底

物顯色，終止酶反應(yīng)后，分別測每孔溶液的

吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各孔讀數(shù)在吸光

度0.8左右。計(jì)算全部讀數(shù)的平均值。所有單

個讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應(yīng)小于10%

1

O

包被

n包被液：碳酸鹽緩沖溶液殖由此

西4),Tnsffl.距8)

n包被濃度：lOOng/ml-20ug/ml

n溫度和時間：在4-8C過夜或37c4、時

1

封閉

封閉（blocking）是繼包被之后用高濃度的

無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。

u0.05%-0.5%的牛血清白蛋白

ulO%的小牛血清

ul%明膠

u5%脫脂奶粉

1

加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即

加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。

r:吸頭應(yīng)懸空，避免因吸頭碰到小孔邊緣或其中

試劑而造成污染

n每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染；

n酶結(jié)合物工作液和底物可用多道加液器，使加

液過程迅速完成。

1

孵育

037c是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多

數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度；

0室溫較37c可避免蒸發(fā)，為加速反應(yīng)，可輔

以搖床振蕩；

0抗原抗體反應(yīng)在4c過夜反應(yīng)更為徹底。

1

洗滌

決定著實(shí)驗(yàn)的成敗

0ELSIA靠洗滌來分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物。

通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗

體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附

于固相載體的干擾物質(zhì)。常用洗滌液為pH7.4

PBS-Tween-20。

0手工洗板時要注意防止氣泡產(chǎn)生。

0洗板機(jī)在使用前應(yīng)進(jìn)行校正注液量和殘留量，注

意管道是否通暢。洗滌時，確認(rèn)每孔中的洗滌液都

注滿微孔，洗滌后，每個孔必須是干的，如果仍有

水可倒扣在無塵吸水紙上拍干。

顯色

HRP-TMB顯色系統(tǒng)受光照的影響不大

,可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)觀察結(jié)

果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定

的適當(dāng)時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，

約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小

時后即可完全消退至無色。各類酸性終止液

(2mol/LH2so4)則會使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此

時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。

1

ELISA試劑盒

(1)已包被抗原或抗體的固相載體；

(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體(結(jié)合物)；

(3)酶的底物；

(4)陰性對照品和陽性對照品(定性測定中)，參考

標(biāo)準(zhǔn)品(定量測定中)；

(5)標(biāo)本稀釋液；

(6)洗滌液；

(7)終止液。

1

實(shí)驗(yàn)儀器：ELISA操作的標(biāo)準(zhǔn)化

BIORAD550酶標(biāo)儀BIORAD1575洗板儀

變頻振蕩器全自動酶聯(lián)免疫分析儀1

ELISA技術(shù)的應(yīng)用

⑴在醫(yī)學(xué)檢測中的應(yīng)用

0病原體及其抗體的檢測

0蛋白質(zhì)的檢測

0非肽類激素的檢測

。藥物的檢測

0毒品檢測

1

ELISA技術(shù)的應(yīng)用

⑵在食品檢測中的應(yīng)用

。食品微生物的檢測

0食品毒素的檢測

0食品中殘留農(nóng)藥的檢測

0食品中殘留抗生素的檢測

0轉(zhuǎn)基因食品的檢測

1

ELISA技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

V與放射免疫測定相比，標(biāo)記物比較穩(wěn)定，無

放射性的危害。

V與免疫熒光技術(shù)相比，結(jié)果判定更加客觀。

V操作簡單，易自動化。

V酶標(biāo)儀普及、價(jià)格低廉。

1

ELISA技術(shù)的缺點(diǎn)

vO.D值僅在低濃度范圍與酶活性呈線性

關(guān)系，出±效應(yīng)嚴(yán)重。

酶的活性容易失活，使即業(yè)的靈敏度

不高。

血亂的大分子標(biāo)記容易影響被標(biāo)記物

的空間結(jié)構(gòu)，使得HJS的靈敏度進(jìn)一步

提高受到限制。

1

（二）酶免疫組織化學(xué)技術(shù)

免疫組化技術(shù)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，以酶

標(biāo)記抗體（或抗原）用于免疫學(xué)檢測，通過

相應(yīng)底物被酶解后的顯色反應(yīng)，對細(xì)胞和組

織標(biāo)本中的抗原一抗體復(fù)合物進(jìn)行定位、定

性分析和鑒定。它把免疫反應(yīng)的特異性、組

織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微

鏡的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平

檢測各種抗原。

1

主要類型

0直接法

0間接法

0酶橋法

0出去

0親和素一生物素方法

1

主要類型

直接法間接法酶橋法去

1

實(shí)驗(yàn)步驟

08%甲醇+Q3H202處理切片15?30min,封閉內(nèi)源

性過氧化酶的活性；

00.05%Tferr20用洗滌；

00.1?1%儂濕盒內(nèi)孵育15?25min；

0加第一抗體（50?804）,濕盒內(nèi)孵育1?2h；

00.05%1ferr2（W洗滌；

0加HP酶標(biāo)記二抗?jié)窈袃?nèi)孵育45~60min；

0的票洗欹；

00.01~0?05%四顯色10~15111111（暗處）。

1

二、放射免疫分析

v放射免疫分析(Radioimmunoassay,

RIA)1959年由Berson和Yalow倉ij建，是以放

射性核素為標(biāo)記物的標(biāo)記免疫分析法，RIA

將放射性核素分析的高靈敏度與抗原抗體反

應(yīng)的特異性相結(jié)合，

v用于測定標(biāo)本中抗原

v或抗體的量。

1

放射免疫分析岫

PriortoTest

+

Labeled

Ag

Test

+++

LabeledPatient's

Agsample

1

免疫放射分析

v1968年Mil好唯1筆應(yīng)用放射性

核素標(biāo)記的抗胰島素抗體檢測牛血清中

胰島素獲得成功。為了區(qū)別于經(jīng)典的放

射免疫測定㈣)，他們將其命名為免

疫放射分析6mmunoradiometricass^

，IM)O

i

Labeled

Ab

Agin

Patient's

sampleAg

Immobilized

Solid

Phase

1

放射性核素的選擇原則

0高比活度

0適宜的半衰期

0對抗原和抗體損害小

0容易標(biāo)記

1

放射性核素

一般實(shí)驗(yàn)室不易開展，放射性廢物處理困難，應(yīng)

用受限制。

01311/口1251:125

氨酸的蛋白質(zhì)用'王

射線，可以晶體閃爍計(jì)數(shù)儀直接測量射線;1251

半衰期長（60天）、比活度高（95%）較31

天，比活度僅20%）更為適用。1（中裝歷8

125

I標(biāo)記方法分類

0直接標(biāo)記法：標(biāo)記含酪氨酸的化合物，可將I

直接結(jié)合于蛋白質(zhì)側(cè)鏈殘基的酪氨酸上，此法

操作簡便，反應(yīng)時間短，標(biāo)記物的比活度高。

0間接標(biāo)記法：常用環(huán)核甘酸、前列腺素等小分

子化合物的標(biāo)記。先將I標(biāo)記在載體上，再與

蛋白質(zhì)結(jié)合。此法操作較復(fù)雜，標(biāo)記蛋白質(zhì)的

比活度也低于直接法。但標(biāo)記反應(yīng)較為溫和，

可以避免因蛋白質(zhì)直接加入I引起的生物活性

125

1

的喪失。

125

I標(biāo)記物的純化

0葡聚糖凝膠：S叩hadex

1500~

分子量<700<1500<5000

20000

型號G10G15G25G50

3000-4000~5000~5000~

刀廠里70000150000800000300000

型號(75G100G150G200

1

125

I標(biāo)記物的鑒定

1.放射性化學(xué)純度

是指結(jié)合于抗原上的放射性強(qiáng)度占總放

射性總強(qiáng)度的百分率。一般要求游離碘含量

占總放射性碘的5%以下。標(biāo)記抗原在貯存

過久后會出現(xiàn)標(biāo)記物的脫碘，如游離碘超過

5%則應(yīng)重新純化去除這部分游離碘。

1

125

I標(biāo)記物的鑒定

2.免疫活性

指標(biāo)記抗原結(jié)合于抗體的放射性占總放

射性的百分率。方法是用小量的標(biāo)記抗原

加過量的抗體(10倍量)，反應(yīng)后分離結(jié)合

部分(B)和游離部分(F),分別測定放射性

,算出B/T%。此值應(yīng)在80%以上，該值

越大，表示抗原損傷越少。

1

125

I標(biāo)記物的鑒定

3.比度：

指單位化學(xué)量標(biāo)記物中所含的放射性強(qiáng)度

,即每分子被標(biāo)記物平均所標(biāo)記放射性原子

數(shù)目，Ci/g、RCi/mg等單位。

1

抗原抗體反應(yīng)類型

1.平衡飽和法

指抗原和抗體反應(yīng)達(dá)到再不結(jié)合、也不解離的

平衡狀態(tài)，稱為飽和狀態(tài)。操作時在反應(yīng)管內(nèi)同

時加入標(biāo)準(zhǔn)品(或樣品)、標(biāo)記抗原和特異性抗體,

混勻后在一定溫度下孵育一定時間，使三種成分

的反應(yīng)幾率相同。一般來說，平衡法的反應(yīng)時間

需較長，低溫(4℃)或室溫為1天，但操作方便

,精密度較好。

1

抗原抗體反應(yīng)類型

2.順序加樣法

將標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）先與抗體一同溫育反應(yīng)一定

時間，使抗原與抗體充分結(jié)合，甚至達(dá)到平衡，

然后加入標(biāo)記抗原再短時溫育，與剩余的抗體結(jié)

合，最后分離B與F。此法使非標(biāo)記抗原與抗體結(jié)

合形成復(fù)合物的幾率大于標(biāo)記抗原，相當(dāng)于使非

標(biāo)記抗原具有較高的競爭能力，結(jié)果使劑量反應(yīng)

曲線的斜率增加，有利于提高分析的靈敏度。

1

RIAB、F分離方法

1.第二抗體沉淀法

在抗原與抗體反應(yīng)后加入第二抗體，形成雙抗體

復(fù)合物。但因第一抗體濃度甚低，其復(fù)合物亦極少

,無法進(jìn)行離心分離，為此在分離時加入一定量的

與一抗同種動物的血清或IgG,使之與第二抗體形

成可見的沉淀物，與上述抗原的雙抗體復(fù)合物形成

共沉淀。經(jīng)離心即可使含有結(jié)合態(tài)抗原(B)的沉

淀物沉淀，與上清液中的游離標(biāo)記抗原(F)分離。

該血清或IgG通常稱為分析試劑。

1

RIAB.F分離方法

2.聚乙二醇（PEG）沉淀法

是以PEG溶液代替第二抗體作沉淀劑。在測定不

含有血漿蛋白的樣品時，用PEG沉淀劑分離B、F,

必須加適量蛋白或正常人混合血清，以增加蛋白的

含量，便于沉淀。PEG沉淀劑的主要優(yōu)點(diǎn)是制備方

便、沉淀完全。缺點(diǎn)是非特異性結(jié)合率比用第二抗

體為高，且溫度高于30℃時沉淀物容易復(fù)溶。

1

RIAB、F分離方法

3.PR試劑法

是一種將雙抗體與PEG二法相結(jié)合的方法

O此法保持了兩者的優(yōu)點(diǎn)，節(jié)省了兩者的用

量，而且分離快速、簡便。

1

RIAB.F分離方法

4.活性炭吸附法

小分子游離抗原或半抗原被活性炭吸附，大分子

復(fù)合物留在溶液中。在抗原與特異性抗體反應(yīng)后，

加入葡聚糖一活性炭。放置5?lOmin,使游離抗原

吸附在活性炭顆粒上，離心使顆粒沉淀，上清液中

含有結(jié)合的標(biāo)記抗原。此法適用于測定類固醇激素

、強(qiáng)心糖甘和各種藥物，因?yàn)樗鼈兪窍鄬Ψ菢O性的

,又比抗原抗體復(fù)合物小，易被活性炭吸附。

1

IRMAB>F分離方法

固相分離法

利用聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯塑料試管

（小珠）作為固相載體，將特異性抗體或抗

原直接吸附于管壁（小珠），利用固相抗體

或抗原分離B和F。

1

RIA與IRMA的比較

免疫放射分析放射免疫分析

物抗體抗原

物用量量限量

直接合，反爭性合，反

反方式參數(shù)與待抗參數(shù)與待抗原

原量成正比量成反比

反速率快慢

B、'分離方固相抗體等第二抗體等

特異性高高

靈敏度高高1

放射免疫分析實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

U所有試劑最好平衡到室溫后加樣。由于血清

標(biāo)準(zhǔn)或樣品長時間保存后會出現(xiàn)上稀下濃現(xiàn)象

,分離劑更是如此，所以試劑包括樣品在內(nèi)加

樣前應(yīng)搖勻。

U不同批號的試劑最好不要混合使用。加樣或

溶解時，注意各試劑之間不要相互污染。

1

放射免疫分析實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

U同次實(shí)驗(yàn)要保證所有管中加入的標(biāo)記物、抗

體完全一致。當(dāng)一次檢測大量樣品時將兩瓶或

兩瓶以上的標(biāo)記物混合在一起后加樣，以保證

實(shí)驗(yàn)的一致性。

U抽吸上清液時，應(yīng)特別注意不要將沉淀抽走

,否則將嚴(yán)重影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

U對于藥盒（100管）中提供2瓶標(biāo)記物的多肽類

產(chǎn)品，一般標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性欠佳，要求

現(xiàn)用現(xiàn)溶，復(fù)溶后低溫冰凍保存，應(yīng)盡量減少

液體狀態(tài)放置的時間。1

放免技術(shù)的缺點(diǎn)

1、放射性（125“工丁3

危害，該方法已亞為翻腳［篥除

少

O（如整個歐洲僅尚存幾個放免試驗(yàn)室）

2、1251的半衰期短而導(dǎo)致其試劑有效期短。

3、標(biāo)記物125I的穩(wěn)定性差，導(dǎo)致試劑盒批間

、批內(nèi)的變異較大；標(biāo)準(zhǔn)曲線有效期短，必須

每次定標(biāo)，造成浪費(fèi)。

4、操作繁瑣，出報(bào)告時間長。

5、無法保存?zhèn)溆谩?/p>

1

二免疫熒光技術(shù)（FIA）

U以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體進(jìn)行抗原定位稱為熒光

抗體法；

U用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗

體的方法稱為熒光抗原法。

U用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗

原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或

組織）化學(xué)技術(shù)。

1

熒光色素應(yīng)具備的條件

0能與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)鍵，結(jié)合后不易解離，未

結(jié)合及其降解產(chǎn)物易清除；

0熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合仍保持較高的效率；

0熒光的顏色與背景組織的顏色對比鮮明

0結(jié)合蛋白質(zhì)后，不影響其活性

。標(biāo)記方法簡單、結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存；

0安全無毒，不具有附加的抗原性。

1

常用熒光色素

U異硫氧酸熒光素（黃），F(xiàn)ITC,應(yīng)用最廣泛，

呈黃綠色熒光，分子量為3894。

u四乙基羅丹明，RB200,熒光效率低，多用于

FITC的襯比染色或雙標(biāo)記，橙色熒光

四甲基異硫氟酸羅丹明，TRITC,發(fā)橙紅色熒

光。

U藻紅蛋白，PE,發(fā)橙色熒光，熒光強(qiáng)度比

FITC強(qiáng)19倍。

1

熒光的標(biāo)記

W衣?lián)麡?biāo)記的蛋白總量（溶于生理鹽水或碳酸鹽

緩沖液），按每毫克蛋白加O.OlmgFITC。

u邊攪拌邊將稱取的FITC粉末逐漸加入球蛋白溶液

中（5?lOmin內(nèi)加完），加完后4℃持續(xù)攪拌

12-18ho

u結(jié)合完畢后，將球蛋白溶液2500r/min離心

20min,取上清裝入透析袋中，用pH8.0緩沖鹽水

透析（0?4℃）過夜。

u取透析過夜的標(biāo)記物，過葡聚糖凝膠G-25或G-

50柱,分離游離FITC,o

1

熒光的標(biāo)記

2.Chadwick方法

u用0?4℃pH8.0PBS溶液將球蛋白溶液稀釋至濃

度為30?40mg/ml,后冰浴。

u按每毫克蛋白加入FITCO.Olmg,用3%重碳酸

鈉水溶液溶解。

u將準(zhǔn)備的抗體與FITC等量混合，充分?jǐn)噭蚝?，?/p>

0?4℃冰浴結(jié)合18?24h。

u透析和層析同Marshall方法。

1

1

直接法

①滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗

體溶液，保溫30min。

Fluorochrome

②取出玻片，先用PBS沖洗后，LabeledAb

再按順序過PBS溶液三缸浸泡

，每缸3-5min,不時振蕩。

③取出玻片，用濾紙吸去多余水

Ag

分，但不使標(biāo)本干燥，緩沖甘

TissueSection

油封固，熒光顯微鏡觀察。

1

直接法需設(shè)置的對照

①標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本加1?2滴

O.Olmol/LpH7.4的PBS。

②特異性對照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未

標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的

特異性抗體。

③陽性對照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)

記的特異性抗體。

1

間接法

①滴加適當(dāng)稀釋的抗體，37℃保溫

30min。Fluorochrome

②取出玻片，先用PBS沖洗1?2次，然LabeledAnti-Ig

后按順序過PBS三缸浸泡，每缸5min

,不時振蕩。

③取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴

加一滴一定稀釋度熒光標(biāo)記的抗人球

蛋白抗體。37℃保溫30min。

Ag

④重復(fù)操作2。

⑤取出玻片，用濾紙吸去多余水分，緩TissueSection

沖甘油封固，熒光顯微鏡觀察。

1

間接法需設(shè)置的對照

①陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物。

②陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物。

③熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物。

陽性陰性

對照對照

1

補(bǔ)體法

①吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清及補(bǔ)體等量混

合液滴于切片上，37c作用30min。

②用緩沖鹽水洗2次，每次5min,吸干標(biāo)本

周圍水液。

③滴加經(jīng)過適當(dāng)稀釋的抗補(bǔ)體熒光抗體，

37c作用30min,水洗同上。

④蒸儲水洗Imin,緩沖甘油封固，熒光顯微

鏡視野下觀察。1

補(bǔ)體法需設(shè)置的對照

①陽性血清對照

②正常陰性血清對照

③滅活補(bǔ)體對照：將補(bǔ)體經(jīng)56℃處

理30min后，進(jìn)行補(bǔ)體法染色。

雙重染色法

U一步法雙染色

先將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合（

A+B）,按直接法進(jìn)行染色。

u二步法雙染色

先用RB200標(biāo)記的B抗體染色，不必

洗去，再用FITC標(biāo)記的A抗體染色，按

間接法進(jìn)行。

1

結(jié)果判定

0"》:無或可見微弱熒光；

0伴：僅能見明確可見的熒光;

0^:可見有明亮的熒光；

0^:可見耀眼的熒光。

免疫熒光技術(shù)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

U應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，點(diǎn)燃超

高壓汞燈5?15min,待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，

眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。

u防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時應(yīng)

戴上防護(hù)眼鏡。

u檢查時間每次以1?2h為宜，超過90min超高

壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱。

1

免疫熒光技術(shù)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

0熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)

集中檢查，以節(jié)省時間，保護(hù)光源，

避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。

。標(biāo)本染色后應(yīng)立即觀察，標(biāo)本受紫

外線照射3?5min后，熒光也明顯減

弱，若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中

4c保存，可延緩熒光減弱時間。

1

免疫熒光技術(shù)應(yīng)用

0細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)方面

0病毒學(xué)檢驗(yàn)方面

0寄生蟲學(xué)檢驗(yàn)方面

0自身抗體的檢測

0細(xì)胞免疫學(xué)方面

1

免疫熒光技術(shù)的缺點(diǎn)

0標(biāo)本不能永久保存，熒光有自然消退現(xiàn)象

,需及時觀察及照相；

0有非特異性熒光的干擾；

0對組織細(xì)胞進(jìn)行微細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察做不到；

0用熒光顯微鏡觀察；

0需用經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員。

1

流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)

流式細(xì)胞術(shù)是將免

OneParameterHistogram

疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式

細(xì)胞儀，對單個細(xì)胞的Unstainedcells

表面標(biāo)志（抗原或受體

）進(jìn)行快速、精確的分FITC-labeledcells

析和自動檢測，并可將

不同類型的細(xì)胞分選收GreenFluorescenceIntensity

集。

1

四、時間分辨熒光免疫分析

(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)

是用錮系稀土元素螯合物標(biāo)記抗體或抗原

,檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原或抗體，用時間分辨熒光免

疫分析檢測儀測定反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光強(qiáng)度。根據(jù)產(chǎn)物

熒光強(qiáng)度和相對熒光強(qiáng)度的比值，判斷反應(yīng)體系中分

析物的濃度，從而達(dá)到定量分析。

1

TRFIA：

標(biāo)記物為稀土金屬-錮系元素

nlRRA中使用的鍍［系元素包括：鑄?、

彩(Sm)、得?、鎘(Dy)等。

n鋪面最為常用。

1

偶I系元素?zé)晒馓攸c(diǎn)：

U熒光壽命極長

0錮系元素螯合物（600-900us）[It：714us]

0普通熒光免疫中熒光團(tuán)：1-lOOus

樣本中蛋白質(zhì)熒光：1-lOus,易猝滅。

uStokes位移大（大約290nm）

u鋪：發(fā)射光613nm、激發(fā)光340nm,

u熒光素的Stokes位移為28nm。

u熒光特異性強(qiáng)。（發(fā)射光譜帶很窄：613±5nm）

u解離-增強(qiáng)技術(shù)可使其熒光性提高100萬倍。

1

TRFIA的技術(shù)特點(diǎn)（一）：時間分辨

時間分辨：利用鐲系元素?zé)晒馕锢硖匦?，熒光激發(fā)后在固定時間段檢

測特異性熒光，而在此時間之前，非特異性熒光已完全衰減為0。1

TRFIA的技術(shù)特點(diǎn)（二）：波長分辨

波長分辨：發(fā)射光譜與激發(fā)光譜間存在的巨大

Stokds位移。可以通過干涉濾光片將發(fā)射光譜

與激發(fā)光譜完全分離。

1

TRFIA的技術(shù)特點(diǎn)（三）：多標(biāo)記

1

TRFIA的技術(shù)特點(diǎn)（四）：

解離增強(qiáng)技術(shù)

增強(qiáng)液作用機(jī)理：加入增強(qiáng)液后，可以使Eu3+從反應(yīng)復(fù)合物中解離下來，

游離的Eu3+同增強(qiáng)液中的另一種螯合劑形成一種膠態(tài)分子團(tuán)，這種分子團(tuán)

在激發(fā)光的激發(fā)下能夠發(fā)出強(qiáng)烈熒光，信號可以增強(qiáng)100萬倍。

增強(qiáng)液是提高檢測靈敏度的一個關(guān)鍵因素。

1

WallacAutoDELFIA

1235

DR-M6601

1

五、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)

0化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)

。化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析(CLIA)

0電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)

1

化學(xué)發(fā)光酶免疫分析

(chemiluminescenceenzymeimmunoassay,CLE

0步驟與酶免疫測定相同，僅最后一步酶

反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過化學(xué)反應(yīng)

所發(fā)出的光在特定的儀器上進(jìn)行測定。

0標(biāo)記酶：HRP、AP

0發(fā)光劑：魯米諾及衍生物、螺旋金剛烷

環(huán)氧化物苯磷酸酯等

1

EH2O2

AgH2O2

Ab

魯米諾光信號檢測器

CLEIA原理

1

化學(xué)發(fā)光酶免疫分析

0AO1系統(tǒng)：美國雅培公司

0XS系統(tǒng)：德國拜耳公司

0UAISON系統(tǒng)：德國W&ngtec公司

1

化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析

(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)

0用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的一類免疫

測定。

。發(fā)光劑：三價(jià)鐵一魯米諾、口丫咤酯

0口丫咤酯/H2O2系統(tǒng)：即用口丫咤酯標(biāo)記抗體或抗

原，用H2O2和NaOH作發(fā)光啟動試劑，固相載

體為極細(xì)小的磁性顆粒。

1

++

Ag

發(fā)光物標(biāo)記Ag

固相抗體

CLIA原理

1

化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析

0VitaKI系統(tǒng)：美國強(qiáng)生公司

QAooess系統(tǒng)：美國貝克曼公司

01mmuLite系統(tǒng)：美國DPC公司

1

電化學(xué)發(fā)光免疫分析

(electrochemiluminescenceimmunoassay,ECLIA

0限1皿)42+為標(biāo)記物：

三聯(lián)毗咤釘為水溶性，高穩(wěn)定性的小分

子，可以確保電化學(xué)發(fā)光的高效性及穩(wěn)定

性，并且無噪音干擾。

唾：類似EIA中底物，是01中的電子供

體，氧化后生成的中間產(chǎn)物是形成激發(fā)態(tài)

的如^的化學(xué)能來源

1

2+

電化學(xué)發(fā)光免疫測定原理

反應(yīng)在陽電極表面進(jìn)行，三聯(lián)毗嗟釘和TPA可

同時失去電子發(fā)生氧化反應(yīng)。二價(jià)的Ru(bpy)32+

被氧化成Ru(bpy)3,3+TPA被氧化成陽離子自由

基TPA;后者失去一個質(zhì)子，成為自由基TPA?

,這是一個強(qiáng)還原劑，可將一個電子遞給

Ru(bpy)3,使其成為激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)3,

而TPA自身被氧化成TPA氧化產(chǎn)物，激發(fā)態(tài)的

Ru(bpy)3荏衰減時發(fā)射一個波長為620nm的

光字，重新生成基態(tài)的Ru(bpy)32+、寺一、計(jì)產(chǎn)人

電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多兜子？便光

信號得以增強(qiáng)。1

電化學(xué)發(fā)光的發(fā)光及檢測系統(tǒng)

Ru

acid

TPAi

H+

2+

RuRuTPA

alkalinestate3+TPA+i

Platinumelectrode

Magnet

獨(dú)特的磁性微粒子

。微珠以及表面的凸凹使

包被面積極聯(lián)式放大。

0載體懸浮于反應(yīng)體系中

，使異相反應(yīng)成類似均相

反應(yīng)，大大加快反應(yīng)速度

磁性微珠方便吸引分離

01

電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析系統(tǒng)

ElecsyslOlOElecsys2010

Elecsys2010E170

1

六、金標(biāo)和磁珠免疫層析技術(shù)

原理：以微孔濾膜為載體，包被已知抗原

或抗體，加入待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細(xì)

管作用使標(biāo)本中的抗體或抗原與膜上包被

的抗原或抗體結(jié)合，再通過膠體金或超順

磁性納米微粒結(jié)合物達(dá)到檢測目的。

0斑點(diǎn)金免疫滲濾技術(shù)（DIGFA或GIFA）

0金標(biāo)免疫層析技術(shù)（GICA）

0磁性免疫層析技術(shù)（MICT）

1

斑點(diǎn)金免疫滲濾

(Dotimmunogoldfiltration,DIGFA)

蓋

微孔膜

吸水墊料

底

1

金標(biāo)免疫層析法

(GoldImmunochromatographyAassay,

GICA)

1

膠體金免疫層析試紙條的檢測原理及結(jié)果判定

質(zhì)控線

檢測線

陽性陰性失效

標(biāo)記單抗及樣品流動方向

1

磁性免疫層析技術(shù)

(MagneticImmuneChromatographicTest

，MICT)

ConventionalMARMagnetic

ImmunoassayImmunoassay

Antibody?GoldColloid

conjugate?Enzyme

?FluorophoresSuperparamagnetic

?LuminescentParticles60-380nm

Molecules

ExcitationEnzymesubstrateOscillating

LaserorvisiblelightMagneticField

Detection

VisualMeasures

AbsorptionMagnetizationof