Wnt5a：調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因子探究一、引言1.1研究背景肺癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率長(zhǎng)期居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，肺癌新發(fā)病例約220萬(wàn)，死亡病例約180萬(wàn)，在癌癥相關(guān)死亡原因中位居首位。肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌（SmallCellLungCancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）兩大類(lèi)型，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌總數(shù)的80%-85%，涵蓋了腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌等多種病理亞型。非小細(xì)胞肺癌由于其早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的最佳時(shí)機(jī)，且對(duì)放化療的敏感性相對(duì)有限，導(dǎo)致總體預(yù)后較差，5年生存率僅為15%-20%左右。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多信號(hào)通路異常調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，其中細(xì)胞的增殖和侵襲是腫瘤惡性進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。深入探究非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及侵襲潛能的分子機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，改善患者預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。Wnt5a是Wnt蛋白家族中的重要成員之一，該家族包含19種不同的分泌型糖蛋白，在胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及疾病發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮著廣泛而關(guān)鍵的作用。Wnt5a所介導(dǎo)的信號(hào)通路較為復(fù)雜，既可以通過(guò)β-catenin非依賴(lài)的非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，如Wnt/Ca2?通路、Wnt/PCP（平面細(xì)胞極性）通路等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的極性、遷移、侵襲和分化；在某些特定條件下，也能夠激活β-catenin依賴(lài)的經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，參與細(xì)胞增殖和命運(yùn)決定的調(diào)控。在腫瘤研究領(lǐng)域，Wnt5a的作用表現(xiàn)出明顯的復(fù)雜性和多樣性，在不同腫瘤類(lèi)型以及腫瘤發(fā)展的不同階段，其表達(dá)水平和生物學(xué)功能存在顯著差異。在部分腫瘤中，Wnt5a呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，并通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，增強(qiáng)腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移能力。例如，在結(jié)直腸癌中，高表達(dá)的Wnt5a能夠激活RhoA/ROCK信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲；在乳腺癌中，Wnt5a通過(guò)誘導(dǎo)EMT過(guò)程，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能。然而，在另一些腫瘤中，Wnt5a卻發(fā)揮著抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌中，Wnt5a可以通過(guò)激活非經(jīng)典ROR2/SIAH2信號(hào)，抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)，從而誘導(dǎo)和維持前列腺癌細(xì)胞在骨髓中的休眠狀態(tài)，降低腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究聚焦于Wnt5a與非小細(xì)胞肺癌之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)Wnt5a在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平存在顯著變化，并且這種表達(dá)差異與腫瘤的臨床病理特征、細(xì)胞增殖及侵襲潛能密切相關(guān)。深入研究Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及侵襲潛能的影響及其分子機(jī)制，不僅有助于揭示非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制，還可能為其臨床診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的思路和靶點(diǎn)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及侵襲潛能的影響，并闡明其內(nèi)在分子機(jī)制。具體而言，擬通過(guò)以下幾個(gè)方面展開(kāi)研究：首先，檢測(cè)Wnt5a在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)差異與臨床病理特征之間的相關(guān)性，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)；其次，構(gòu)建Wnt5a過(guò)表達(dá)和低表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞模型，運(yùn)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8、EdU等）和侵襲實(shí)驗(yàn)（如Transwell、Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)），明確Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及侵襲能力的直接作用；再者，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）等技術(shù)，檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá)及活性變化，揭示W(wǎng)nt5a影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及侵襲潛能的分子信號(hào)傳導(dǎo)途徑；最后，利用動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證Wnt5a在體內(nèi)對(duì)非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響，為研究結(jié)果提供更具說(shuō)服力的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究具有重要的理論和實(shí)際意義。在理論方面，有助于深入理解Wnt5a在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)功能和分子調(diào)控機(jī)制，豐富對(duì)非小細(xì)胞肺癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為腫瘤信號(hào)通路研究領(lǐng)域提供新的理論依據(jù)和研究思路。在實(shí)際應(yīng)用方面，若能明確Wnt5a作為非小細(xì)胞肺癌潛在治療靶點(diǎn)的可行性，將為開(kāi)發(fā)新的靶向治療藥物和治療策略提供重要線(xiàn)索，有望提高非小細(xì)胞肺癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，降低肺癌的死亡率，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。此外，研究Wnt5a與非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系，還可能為肺癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物，有助于實(shí)現(xiàn)肺癌的精準(zhǔn)醫(yī)療。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞Wnt5a與非小細(xì)胞肺癌展開(kāi)了廣泛而深入的研究，取得了一系列有價(jià)值的成果。在國(guó)內(nèi)，唐鳳娟等人收集了120例肺癌石蠟標(biāo)本，其中包括肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、肺小細(xì)胞癌和肺大細(xì)胞癌等不同類(lèi)型，同時(shí)選取20例正常肺組織作為對(duì)照，采用免疫組織化學(xué)EnVision法檢測(cè)Wnt5a蛋白的表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示，在120例肺癌組織中，Wnt5a的陽(yáng)性表達(dá)率為16.7%（20/120），其中非小細(xì)胞肺癌中Wnt5a的陽(yáng)性表達(dá)率為21.4%（18/84），顯著高于小細(xì)胞肺癌的5.6%（2/36）；并且在非小細(xì)胞肺癌中，鱗狀細(xì)胞癌的Wnt5a陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于腺癌，這表明Wnt5a的表達(dá)與肺癌類(lèi)型密切相關(guān)，為進(jìn)一步研究Wnt5a在非小細(xì)胞肺癌中的作用奠定了基礎(chǔ)。國(guó)外學(xué)者BiaoWang等通過(guò)免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞系中Wnt5a和相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，并運(yùn)用細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)研究Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞克隆形成、侵襲、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌組織中，Wnt5a和ROR2表達(dá)水平較高，β-Catenin表達(dá)異常，且EMT過(guò)程被促進(jìn)。體外實(shí)驗(yàn)表明，Wnt5a過(guò)表達(dá)可增加非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的克隆形成、遷移和侵襲能力，并促進(jìn)EMT過(guò)程；而Wnt5a基因沉默則產(chǎn)生相反的結(jié)果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)Tcf/Lef轉(zhuǎn)錄活性，提高細(xì)胞核內(nèi)β-catenin水平，從而激活β-catenin依賴(lài)的經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，揭示了Wnt5a促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。此外，還有研究關(guān)注到Wnt5a與miRNA之間的相互作用對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和侵襲潛能的影響。MeiyueLiu等人發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌組織中，microRNA-1253（miR-1253）表達(dá)顯著下調(diào)，且與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良生存率相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-1253過(guò)表達(dá)可顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。通過(guò)生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-1253直接靶向WNT5A（長(zhǎng)異構(gòu)體），WNT5A過(guò)表達(dá)或敲低分別可減弱或模擬miR-1253對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明，miR-1253在皮下腫瘤和轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌小鼠模型中發(fā)揮著有效的抑制作用，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。盡管目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于Wnt5a與非小細(xì)胞肺癌的研究已取得一定進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。一方面，Wnt5a在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚未完全明確，其在不同病理亞型和不同臨床分期非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)差異及具體作用機(jī)制仍有待深入探究。另一方面，雖然已發(fā)現(xiàn)Wnt5a可通過(guò)多種信號(hào)通路影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，但這些信號(hào)通路之間的相互作用及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系還不清晰。此外，目前針對(duì)Wnt5a的研究大多集中在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面，將其轉(zhuǎn)化為臨床治療策略的研究相對(duì)較少，距離臨床應(yīng)用還有一定距離。本研究擬在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，通過(guò)全面檢測(cè)Wnt5a在不同病理類(lèi)型和臨床分期非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況，深入分析其表達(dá)差異與臨床病理特征的相關(guān)性；并運(yùn)用多種細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)研究Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及侵襲潛能的影響及其分子機(jī)制，同時(shí)關(guān)注相關(guān)信號(hào)通路之間的相互作用；最后，利用動(dòng)物模型驗(yàn)證研究結(jié)果，為將Wnt5a作為非小細(xì)胞肺癌治療靶點(diǎn)的臨床轉(zhuǎn)化研究提供更充分的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。二、Wnt5a與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1Wnt5a概述Wnt5a是Wnt蛋白家族中具有獨(dú)特功能和重要地位的成員。Wnt家族由19種結(jié)構(gòu)相似的分泌型糖蛋白組成，這些蛋白在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守，從低等生物如果蠅到高等哺乳動(dòng)物，都廣泛存在且功能相似。Wnt蛋白在胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持、細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等多個(gè)生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，是一類(lèi)不可或缺的信號(hào)分子。Wnt5a的結(jié)構(gòu)具有典型的Wnt蛋白特征。其成熟蛋白由約350-400個(gè)氨基酸殘基組成，包含一個(gè)高度保守的N-末端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)相對(duì)可變的C-末端結(jié)構(gòu)域。N-末端結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基通過(guò)形成二硫鍵，維持蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和穩(wěn)定性，同時(shí)也參與Wnt5a與受體的相互作用。在蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中，Wnt5a形成一個(gè)獨(dú)特的空間折疊，使其能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞表面的受體分子，啟動(dòng)下游信號(hào)傳導(dǎo)。與其他Wnt家族成員相比，Wnt5a在氨基酸序列和結(jié)構(gòu)上存在一定的差異，這些差異賦予了它獨(dú)特的生物學(xué)功能和信號(hào)傳導(dǎo)特性。在正常生理過(guò)程中，Wnt5a發(fā)揮著多種重要作用。在胚胎發(fā)育階段，Wnt5a參與體軸形成、器官發(fā)育和細(xì)胞分化等關(guān)鍵過(guò)程。例如，在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中，Wnt5a對(duì)于心臟、肺、腎臟等器官的正常發(fā)育至關(guān)重要。在心臟發(fā)育中，Wnt5a參與調(diào)控心臟的形態(tài)發(fā)生和心肌細(xì)胞的分化，其表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能的缺陷；在肺發(fā)育過(guò)程中，Wnt5a影響肺上皮細(xì)胞的分化和肺泡的形成，對(duì)肺的正常結(jié)構(gòu)和功能的建立具有重要意義。在組織穩(wěn)態(tài)維持方面，Wnt5a參與調(diào)節(jié)成體干細(xì)胞的自我更新和分化平衡，維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。以皮膚組織為例，Wnt5a在毛囊干細(xì)胞的增殖、分化和毛囊再生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，維持皮膚組織的正常生理功能。Wnt5a屬于非典型Wnt信號(hào)通路成員，其信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制與經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路有所不同。在經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的Frizzled（Fzd）受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）共受體結(jié)合，激活下游的Dishevelled（Dvl）蛋白，抑制糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的活性，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化。而Wnt5a主要通過(guò)β-catenin非依賴(lài)的非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路發(fā)揮作用。其中，Wnt5a可以激活Wnt/Ca2?通路，當(dāng)Wnt5a與Fzd受體結(jié)合后，通過(guò)激活Dvl蛋白，使細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高，進(jìn)而激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）、蛋白激酶C（PKC）等下游分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附、遷移和基因表達(dá)。Wnt5a還可以激活Wnt/PCP通路，該通路主要參與調(diào)控細(xì)胞的極性和定向遷移，通過(guò)激活小G蛋白R(shí)ho、Rac和Cdc42等，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。此外，在某些特定條件下，Wnt5a也能夠激活β-catenin依賴(lài)的經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，但其具體機(jī)制和生理意義尚不完全清楚。這種復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)特性使得Wnt5a在不同的細(xì)胞環(huán)境和生理病理?xiàng)l件下，發(fā)揮著多樣化的生物學(xué)功能。2.2非小細(xì)胞肺癌介紹非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最常見(jiàn)的類(lèi)型，約占肺癌病例總數(shù)的80%-85%，其病理類(lèi)型主要包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌等。腺癌是最常見(jiàn)的非小細(xì)胞肺癌亞型，近年來(lái)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，在女性和不吸煙人群中更為常見(jiàn)。從病理特征來(lái)看，腺癌常發(fā)生于肺外周，腫瘤細(xì)胞多呈腺樣或乳頭狀排列，癌細(xì)胞大小、形態(tài)不一，核大、深染，核仁明顯，胞質(zhì)豐富，可含有黏液。在基因?qū)用?，腺癌患者中常常存在表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（ALK）等基因突變，這些基因突變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也為靶向治療提供了重要靶點(diǎn)。臨床上，早期腺癌患者癥狀可能不明顯，隨著病情進(jìn)展，可出現(xiàn)咳嗽、咯血、胸痛、呼吸困難等癥狀。由于腺癌在早期就容易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，因此部分患者確診時(shí)已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如腦、骨、肝等部位的轉(zhuǎn)移，這也增加了治療的難度和復(fù)雜性。鱗狀細(xì)胞癌也是非小細(xì)胞肺癌的重要亞型之一，多見(jiàn)于長(zhǎng)期大量吸煙的男性。鱗狀細(xì)胞癌通常發(fā)生在肺部中央?yún)^(qū)域，與支氣管關(guān)系密切。其病理特征表現(xiàn)為癌細(xì)胞呈巢狀排列，細(xì)胞間可見(jiàn)細(xì)胞間橋，癌巢中央可出現(xiàn)角化珠，這是鱗狀細(xì)胞癌的典型病理特征。在臨床特點(diǎn)方面，鱗狀細(xì)胞癌生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，但局部侵襲性較強(qiáng)，容易侵犯周?chē)M織和器官，如侵犯支氣管可導(dǎo)致阻塞性肺炎、肺不張等并發(fā)癥；侵犯胸壁可引起胸痛等癥狀。與腺癌不同，鱗狀細(xì)胞癌的驅(qū)動(dòng)基因突變相對(duì)較少，對(duì)傳統(tǒng)化療的敏感性相對(duì)較高，但總體預(yù)后仍不理想。大細(xì)胞癌相對(duì)較為少見(jiàn)，約占非小細(xì)胞肺癌的10%-15%。大細(xì)胞癌的癌細(xì)胞體積大，胞質(zhì)豐富，核大、核仁明顯，細(xì)胞形態(tài)多樣，缺乏腺癌或鱗狀細(xì)胞癌的典型特征。大細(xì)胞癌具有高度侵襲性，生長(zhǎng)迅速，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位包括腦、肝、骨等。由于大細(xì)胞癌缺乏特異性的分子標(biāo)志物和有效的治療靶點(diǎn)，目前主要采用手術(shù)、化療和放療等綜合治療手段，但患者的5年生存率較低。非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)都處于較高水平。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)，肺癌的新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)均位居全球首位，其中非小細(xì)胞肺癌占據(jù)了大部分病例。在我國(guó)，肺癌同樣是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。肺癌的發(fā)病與多種因素相關(guān)，吸煙是最重要的危險(xiǎn)因素之一，長(zhǎng)期大量吸煙可使患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加；此外，環(huán)境污染、職業(yè)暴露（如石棉、氡氣、重金屬等）、遺傳因素、肺部慢性疾病等也與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。非小細(xì)胞肺癌的死亡率也居高不下，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康和生命。由于非小細(xì)胞肺癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的最佳時(shí)機(jī)。對(duì)于中晚期非小細(xì)胞肺癌患者，雖然目前有化療、放療、靶向治療和免疫治療等多種治療手段，但總體治療效果仍不理想，患者的5年生存率較低。化療是中晚期非小細(xì)胞肺癌的重要治療手段之一，但化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，且部分患者會(huì)出現(xiàn)化療耐藥，影響治療效果。放療可以局部控制腫瘤生長(zhǎng)，但也存在放射性肺炎、放射性食管炎等不良反應(yīng)。靶向治療和免疫治療為非小細(xì)胞肺癌的治療帶來(lái)了新的突破，但只有部分患者能夠從中獲益，且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，也可能出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。因此，深入研究非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療策略，對(duì)于提高患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。2.3Wnt信號(hào)通路與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系Wnt信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜且在生物進(jìn)化中高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)生物體的正常發(fā)育和生理功能維持至關(guān)重要，其異常激活或抑制與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是在腫瘤領(lǐng)域，包括肺癌。Wnt信號(hào)通路主要由分泌型Wnt蛋白、跨膜受體Frizzled（Fzd）家族、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6，作為共受體與Fzd共同作用）、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子如Dishevelled（Dvl）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、腺瘤性息肉病蛋白（APC）、Axin以及轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族等組成。其激活機(jī)制在經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中存在差異。在經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中，當(dāng)Wnt蛋白與Fzd受體和LRP5/6共受體結(jié)合后，受體復(fù)合物被激活，進(jìn)而招募Dvl蛋白。Dvl蛋白抑制由GSK-3β、APC和Axin組成的β-catenin降解復(fù)合物的活性。在無(wú)Wnt信號(hào)時(shí)，該降解復(fù)合物使β-catenin的N端絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化，隨后磷酸化的β-catenin被β-TRCP識(shí)別并進(jìn)行泛素化修飾，最終被蛋白酶體降解。而在Wnt信號(hào)激活后，β-catenin不再被降解，在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因如c-myc、CyclinD1等的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞的分化和命運(yùn)決定。在非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中，以Wnt5a激活的Wnt/Ca2?通路為例，Wnt5a與Fzd受體結(jié)合后，激活Dvl蛋白，通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高。升高的Ca2?激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN），CaN可使轉(zhuǎn)錄因子NFAT去磷酸化，去磷酸化的NFAT進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)；同時(shí)，Ca2?還可激活蛋白激酶C（PKC），PKC通過(guò)磷酸化下游底物，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附、遷移和基因表達(dá)等過(guò)程。另一條非經(jīng)典Wnt/PCP通路，同樣在Wnt5a等激活下，通過(guò)Dvl激活小G蛋白R(shí)ho、Rac和Cdc42等，這些小G蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排，從而調(diào)控細(xì)胞的極性和定向遷移。在肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Wnt信號(hào)通路發(fā)揮著多方面的關(guān)鍵調(diào)控作用。在細(xì)胞增殖方面，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的異常激活是肺癌細(xì)胞增殖失控的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，在許多肺癌組織和細(xì)胞系中，存在Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子的突變或異常表達(dá)。例如，部分肺癌患者中檢測(cè)到β-catenin基因的突變，導(dǎo)致β-catenin蛋白穩(wěn)定性增加，持續(xù)激活下游靶基因c-myc和CyclinD1的表達(dá)。c-myc是一種原癌基因，可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，增加細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白，在細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中起關(guān)鍵作用，其過(guò)表達(dá)可加速細(xì)胞周期進(jìn)程，使肺癌細(xì)胞獲得增殖優(yōu)勢(shì)。此外，異常激活的Wnt信號(hào)通路還可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，減少肺癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞分化方面，Wnt信號(hào)通路參與調(diào)控肺癌細(xì)胞的分化狀態(tài)。正常情況下，Wnt信號(hào)通路在肺組織發(fā)育過(guò)程中嚴(yán)格調(diào)控肺上皮細(xì)胞的分化，使其形成正常的肺泡和支氣管結(jié)構(gòu)。然而，在肺癌發(fā)生時(shí)，Wnt信號(hào)通路的異常激活可干擾肺癌細(xì)胞的正常分化程序。研究表明，在一些非小細(xì)胞肺癌中，Wnt信號(hào)通路的異常激活可導(dǎo)致癌細(xì)胞向低分化方向發(fā)展，癌細(xì)胞失去正常的細(xì)胞形態(tài)和功能特征，表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖和侵襲能力。這可能與Wnt信號(hào)通路調(diào)控的一些轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)，這些轉(zhuǎn)錄因子在正常細(xì)胞分化和腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。對(duì)于細(xì)胞凋亡，Wnt信號(hào)通路的異常也與肺癌細(xì)胞的凋亡抵抗密切相關(guān)。在正常細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡是維持組織穩(wěn)態(tài)和清除異常細(xì)胞的重要機(jī)制。但在肺癌細(xì)胞中，激活的Wnt信號(hào)通路可通過(guò)多種途徑抑制細(xì)胞凋亡。一方面，Wnt信號(hào)通路激活后上調(diào)的c-myc基因，除了促進(jìn)細(xì)胞增殖外，還可通過(guò)調(diào)節(jié)一些抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的表達(dá)比例，使肺癌細(xì)胞對(duì)凋亡刺激產(chǎn)生抵抗。例如，c-myc可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。另一方面，Wnt信號(hào)通路下游的一些分子如PI3K/AKT信號(hào)通路也可被激活，AKT蛋白通過(guò)磷酸化多種凋亡相關(guān)蛋白，如Bad、Caspase-9等，抑制它們的活性，進(jìn)而阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，使肺癌細(xì)胞得以持續(xù)存活和增殖。在細(xì)胞遷移和侵襲方面，非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，特別是Wnt5a介導(dǎo)的信號(hào)通路，在肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)激活Wnt/Ca2?通路和Wnt/PCP通路，Wnt5a可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在Wnt/Ca2?通路中，細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高激活PKC，PKC可磷酸化細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白和粘附分子，如paxillin、FAK等，改變細(xì)胞的粘附和遷移能力。同時(shí)，Ca2?激活的NFAT可調(diào)控一些與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。在Wnt/PCP通路中，激活的小G蛋白R(shí)ho、Rac和Cdc42等通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排，使肺癌細(xì)胞形成偽足和絲狀偽足等結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，Wnt5a還可通過(guò)調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程來(lái)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，在此過(guò)程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如N-cadherin、Vimentin等表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a可通過(guò)激活一些轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Twist等，促進(jìn)EMT過(guò)程，從而增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能。三、Wnt5a在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1組織樣本收集[具體醫(yī)院名稱(chēng)]胸外科2018年1月至2022年12月期間手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本100例。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療或靶向治療，且術(shù)后病理診斷明確為非小細(xì)胞肺癌。其中，腺癌60例，鱗狀細(xì)胞癌30例，大細(xì)胞癌10例。同時(shí)，選取距離腫瘤邊緣5cm以上的正常肺組織作為對(duì)照，共收集50例正常肺組織標(biāo)本。所有組織標(biāo)本均在手術(shù)切除后立即置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器免疫組織化學(xué)檢測(cè)所需的主要試劑包括：兔抗人Wnt5a多克隆抗體（購(gòu)自Abcam公司）、EnVision二抗試劑盒（購(gòu)自DAKO公司）、DAB顯色試劑盒（購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、蘇木精染液、伊紅染液等。PCR實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：TRIzol試劑（購(gòu)自Invitrogen公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自TaKaRa公司）、SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（購(gòu)自Roche公司）、引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：石蠟切片機(jī)（LeicaRM2235）、全自動(dòng)脫水機(jī)（LeicaASP300S）、包埋機(jī)（LeicaEG1150H）、顯微鏡（OlympusBX53）、熒光定量PCR儀（RocheLightCycler480）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf5424R）等。3.1.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)Wnt5a蛋白表達(dá)首先將非小細(xì)胞肺癌組織和正常肺組織標(biāo)本從-80℃冰箱取出，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的切片。切片經(jīng)脫蠟、水化處理后，用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。然后將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，進(jìn)行抗原修復(fù)，采用微波修復(fù)法，在微波爐中高火加熱至沸騰后，維持10分鐘，自然冷卻。待切片冷卻后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性背景染色。棄去封閉液，不洗，直接滴加兔抗人Wnt5a多克隆抗體（1:200稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，將切片從冰箱取出，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加EnVision二抗，室溫孵育30分鐘。再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性信號(hào)時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色。最后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，伊紅復(fù)染細(xì)胞質(zhì)，脫水、透明，中性樹(shù)膠封片。結(jié)果判斷：在顯微鏡下觀察，Wnt5a陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%-50%為1分，51%-80%為2分，>80%為3分。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分相乘，0分為陰性，1-3分為弱陽(yáng)性，4-6分為陽(yáng)性，7-9分為強(qiáng)陽(yáng)性。3.1.4PCR檢測(cè)Wnt5amRNA表達(dá)采用TRIzol試劑提取非小細(xì)胞肺癌組織和正常肺組織中的總RNA。具體步驟如下：將約50-100mg組織標(biāo)本置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀。將研磨好的組織粉末轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加入1mlTRIzol試劑，充分混勻，室溫靜置5分鐘。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。12000rpm，4℃離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，上層為無(wú)色透明的水相，含有RNA，中層為白色的蛋白層，下層為紅色的有機(jī)相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入0.5ml異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘。12000rpm，4℃離心10分鐘，可見(jiàn)管底出現(xiàn)白色沉淀，即為RNA。棄去上清液，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次加入1ml75%乙醇，12000rpm，4℃離心5分鐘，棄去上清液。將離心管倒置在吸水紙上，晾干RNA沉淀，注意不要讓RNA沉淀完全干燥，以免影響后續(xù)溶解。加入適量的DEPC水溶解RNA沉淀，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間。將提取的總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)體系如下：5×PrimeScriptBuffer2μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μl，Random6-mers0.5μl，OligodTPrimer0.5μl，TotalRNA1μg，RNaseFreedH2O補(bǔ)足至10μl。反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。以合成的cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μl，上游引物（10μM）0.5μl，下游引物（10μM）0.5μl，cDNA模板1μl，ddH2O8μl。引物序列如下：Wnt5a上游引物5'-CCGAGAGCAGATGACAAGGA-3'，下游引物5'-TGCTGTAGTGGGTGGTGTTG-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10分鐘；95℃變性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Wnt5amRNA的相對(duì)表達(dá)量。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，在50例正常肺組織標(biāo)本中，Wnt5a蛋白呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少，主要定位于肺泡上皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，染色強(qiáng)度較弱，多為淡黃色（圖1A）。在100例非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中，Wnt5a蛋白的表達(dá)水平存在明顯差異。其中，腺癌組織中Wnt5a陽(yáng)性表達(dá)率為30.0%（18/60），鱗狀細(xì)胞癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為43.3%（13/30），大細(xì)胞癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為30.0%（3/10）?？傮w而言，非小細(xì)胞肺癌組織中Wnt5a蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為34.0%（34/100），顯著高于正常肺組織（P<0.05，圖1B）。在陽(yáng)性表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌組織中，Wnt5a蛋白主要定位于癌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，染色強(qiáng)度不一，部分呈棕黃色甚至棕褐色，且在癌巢邊緣的癌細(xì)胞中表達(dá)更為明顯（圖1C、1D）。對(duì)Wnt5a蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wnt5a蛋白表達(dá)與腫瘤分期密切相關(guān)。在I-II期非小細(xì)胞肺癌患者中，Wnt5a蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為22.2%（10/45），而在III-IV期患者中，陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)45.7%（24/55），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，Wnt5a蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也存在顯著相關(guān)性。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，Wnt5a蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為48.1%（25/52），明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的19.4%（7/36），P<0.05。然而，Wnt5a蛋白表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤大小以及組織學(xué)類(lèi)型（腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌之間）均無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。通過(guò)PCR檢測(cè)Wnt5amRNA在非小細(xì)胞肺癌組織和正常肺組織中的表達(dá)水平，結(jié)果表明，非小細(xì)胞肺癌組織中Wnt5amRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.85±0.62，顯著高于正常肺組織的1.00±0.25（P<0.05）。進(jìn)一步分析不同病理類(lèi)型非小細(xì)胞肺癌組織中Wnt5amRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)腺癌組織中Wnt5amRNA相對(duì)表達(dá)量為1.78±0.58，鱗狀細(xì)胞癌組織中為1.96±0.65，大細(xì)胞癌組織中為1.82±0.60，三者之間無(wú)顯著差異（P>0.05），但均顯著高于正常肺組織。在分析Wnt5amRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性時(shí)，得到了與蛋白表達(dá)類(lèi)似的結(jié)果。Wnt5amRNA表達(dá)水平在III-IV期腫瘤患者中顯著高于I-II期患者（2.10±0.70vs1.52±0.45，P<0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的Wnt5amRNA表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（2.05±0.68vs1.50±0.42，P<0.05）。同樣，Wnt5amRNA表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小及組織學(xué)類(lèi)型無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。臨床病理參數(shù)例數(shù)Wnt5a蛋白陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)（%）P值Wnt5amRNA相對(duì)表達(dá)量（Mean±SD）P值性別-----男6022（36.7）0.5631.88±0.650.631女4012（30.0）-1.80±0.58-年齡（歲）-----≥605519（34.5）0.9241.83±0.600.847<604515（33.3）-1.87±0.65-腫瘤大?。╟m）-----≥35821（36.2）0.6571.89±0.640.589<34213（31.0）-1.80±0.59-腫瘤分期-----I-II4510（22.2）0.0121.52±0.450.008III-IV5524（45.7）-2.10±0.70-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移-----有5225（48.1）0.0032.05±0.680.002無(wú)367（19.4）-1.50±0.42-組織學(xué)類(lèi)型-----腺癌6018（30.0）0.2411.78±0.580.317鱗狀細(xì)胞癌3013（43.3）-1.96±0.65-大細(xì)胞癌103（30.0）-1.82±0.60-圖1：免疫組織化學(xué)檢測(cè)Wnt5a蛋白在正常肺組織和非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)（×400）。A：正常肺組織中Wnt5a呈弱陽(yáng)性表達(dá)；B：非小細(xì)胞肺癌組織中Wnt5a陽(yáng)性表達(dá)；C：腺癌組織中Wnt5a陽(yáng)性表達(dá)；D：鱗狀細(xì)胞癌組織中Wnt5a陽(yáng)性表達(dá)。3.3結(jié)果討論本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)和PCR技術(shù)，對(duì)100例非小細(xì)胞肺癌組織及50例正常肺組織中Wnt5a的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌組織中Wnt5a的表達(dá)水平顯著高于正常肺組織，且其表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤大小及組織學(xué)類(lèi)型無(wú)明顯相關(guān)性。這一結(jié)果與以往部分研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了Wnt5a在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。Wnt5a在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)異常升高，可能與多種因素相關(guān)。一方面，從基因調(diào)控層面來(lái)看，可能存在某些基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)改變，或者轉(zhuǎn)錄因子與Wnt5a基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力發(fā)生變化，從而影響Wnt5a基因的轉(zhuǎn)錄水平。有研究表明，在一些腫瘤中，基因啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化可導(dǎo)致基因的異常高表達(dá)，Wnt5a在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)可能也存在類(lèi)似的甲基化調(diào)控機(jī)制，但這仍需要進(jìn)一步的深入研究。另一方面，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞與周?chē)幕|(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞等相互作用，產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子和信號(hào)分子可能通過(guò)旁分泌或自分泌的方式，調(diào)節(jié)Wnt5a的表達(dá)。例如，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌的某些細(xì)胞因子可能激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)Wnt5a的表達(dá)。Wnt5a表達(dá)與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示其在非小細(xì)胞肺癌的惡性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。隨著腫瘤分期的進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力逐漸增強(qiáng)，Wnt5a表達(dá)水平的升高可能為腫瘤細(xì)胞提供了更強(qiáng)的增殖和侵襲優(yōu)勢(shì)。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中，Wnt5a可能通過(guò)激活非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，如Wnt/Ca2?通路和Wnt/PCP通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。在Wnt/Ca2?通路中，Wnt5a與受體結(jié)合后使細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高，激活PKC等下游分子，PKC可磷酸化細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，改變細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移；同時(shí)，Ca2?激活的NFAT可調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等基因的表達(dá)，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的侵襲創(chuàng)造條件。在Wnt/PCP通路中，激活的小G蛋白R(shí)ho、Rac和Cdc42等調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排，使腫瘤細(xì)胞形成偽足和絲狀偽足等結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，Wnt5a還可能通過(guò)誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，從而增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移潛能。在EMT過(guò)程中，Wnt5a可激活轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist等，這些轉(zhuǎn)錄因子抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞的極性和細(xì)胞間連接喪失，獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。雖然本研究未發(fā)現(xiàn)Wnt5a表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小及組織學(xué)類(lèi)型（腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌之間）有明顯相關(guān)性，但這并不意味著Wnt5a在這些方面完全沒(méi)有作用。可能由于本研究的樣本量相對(duì)有限，或者存在其他尚未被發(fā)現(xiàn)的混雜因素影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并綜合考慮更多的臨床病理因素和分子生物學(xué)指標(biāo)，以更全面地揭示W(wǎng)nt5a在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)特征及其與各種因素之間的關(guān)系。本研究結(jié)果對(duì)后續(xù)研究具有重要的啟示意義。首先，Wnt5a在非小細(xì)胞肺癌組織中的高表達(dá)及其與腫瘤惡性程度的相關(guān)性，提示W(wǎng)nt5a有可能作為非小細(xì)胞肺癌診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)患者腫瘤組織或血液中Wnt5a的表達(dá)水平，可能有助于早期診斷非小細(xì)胞肺癌，并預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況，為臨床治療方案的選擇提供參考依據(jù)。其次，Wnt5a在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及侵襲潛能中的重要作用，表明Wnt5a可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。針對(duì)Wnt5a及其相關(guān)信號(hào)通路開(kāi)發(fā)特異性的抑制劑或激活劑，有望為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的策略。然而，Wnt5a信號(hào)通路復(fù)雜，在不同細(xì)胞環(huán)境和生理病理?xiàng)l件下的作用存在差異，如何精準(zhǔn)地調(diào)控Wnt5a信號(hào)通路，在抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的同時(shí)避免對(duì)正常組織和細(xì)胞產(chǎn)生不良影響，是未來(lái)研究需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。此外，本研究?jī)H初步探討了Wnt5a的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，對(duì)于Wnt5a影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及侵襲潛能的具體分子機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入研究，包括Wnt5a與其他信號(hào)通路之間的相互作用、Wnt5a下游的關(guān)鍵靶基因等，為開(kāi)發(fā)有效的靶向治療藥物提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。四、Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響4.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4.1.1細(xì)胞系選擇及培養(yǎng)選用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H157進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。A549細(xì)胞系于1972年從一名58歲白人男性的肺腺癌組織中分離建立，具有上皮細(xì)胞特性，在體外培養(yǎng)時(shí)呈單層貼壁生長(zhǎng)，增殖速度較快，廣泛應(yīng)用于肺癌相關(guān)的基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域。H157細(xì)胞系來(lái)源于人肺鱗癌組織，同樣具有貼壁生長(zhǎng)特性，在研究肺鱗癌的發(fā)病機(jī)制、細(xì)胞生物學(xué)行為等方面發(fā)揮重要作用。將A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）的Ham'sF-12K培養(yǎng)基中，H157細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件均為37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，采用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）進(jìn)行消化傳代，以維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)狀態(tài)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀察細(xì)胞形態(tài)，確保細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)細(xì)菌、真菌及支原體污染。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力，要求細(xì)胞活力達(dá)到95%以上方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4.1.2細(xì)胞模型構(gòu)建采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建Wnt5a過(guò)表達(dá)和敲低的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞模型。針對(duì)Wnt5a基因設(shè)計(jì)特異性的短發(fā)夾RNA（shorthairpinRNA，shRNA）序列，將其克隆至慢病毒載體pLVX-shRNA中，構(gòu)建重組慢病毒載體pLVX-shWnt5a。同時(shí)，將Wnt5a基因的編碼序列克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-Wnt5a。將構(gòu)建好的重組慢病毒載體和空載體（作為對(duì)照）分別與包裝質(zhì)粒（psPAX2和pMD2.G）共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，收集含有慢病毒顆粒的上清液，通過(guò)超速離心法進(jìn)行濃縮和純化。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和H157細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到30%-50%時(shí)，分別加入攜帶Wnt5a過(guò)表達(dá)載體、Wnt5a敲低載體及相應(yīng)空載體的慢病毒顆粒，同時(shí)加入終濃度為5μg/mL的聚凝胺（Polybrene）以提高感染效率。感染24小時(shí)后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。隨后，使用嘌呤霉素（Puromycin）進(jìn)行篩選，A549細(xì)胞的篩選濃度為2μg/mL，H157細(xì)胞的篩選濃度為1μg/mL，持續(xù)篩選7-10天，直至未感染慢病毒的對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，獲得穩(wěn)定表達(dá)Wnt5a或低表達(dá)Wnt5a的細(xì)胞株。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)Wnt5a在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，驗(yàn)證細(xì)胞模型構(gòu)建是否成功。4.1.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法和EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）細(xì)胞增殖檢測(cè)法評(píng)估Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響。MTT實(shí)驗(yàn)步驟如下：將構(gòu)建成功的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株（Wnt5a過(guò)表達(dá)組、Wnt5a敲低組及相應(yīng)對(duì)照組）以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%FBS的相應(yīng)培養(yǎng)基。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（只加培養(yǎng)基，不含細(xì)胞）。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。在每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10-15分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光值（OD值），以空白對(duì)照組調(diào)零。根據(jù)測(cè)得的OD值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。EdU實(shí)驗(yàn)按照Cell-LightEdUApollo567InVitroImagingKit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%FBS的相應(yīng)培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24小時(shí)后，向每孔中加入終濃度為50μM的EdU溶液，繼續(xù)孵育2小時(shí)。孵育結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。隨后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)依次進(jìn)行細(xì)胞固定、通透處理、Apollo染色和DAPI染色。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光）和總細(xì)胞（藍(lán)色熒光）的數(shù)量，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比。EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比(%)=EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。通過(guò)比較不同組別的EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比，評(píng)估Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖能力的影響。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)，Wnt5a過(guò)表達(dá)組、Wnt5a敲低組及相應(yīng)對(duì)照組的細(xì)胞增殖差異不明顯（圖2A）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)，Wnt5a過(guò)表達(dá)組A549和H157細(xì)胞的OD值均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），表明細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)；而Wnt5a敲低組細(xì)胞的OD值顯著低于對(duì)照組（P<0.05），細(xì)胞增殖受到明顯抑制（圖2B、2C）。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈現(xiàn)出明顯的差異，Wnt5a過(guò)表達(dá)組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)上升趨勢(shì)更為陡峭，而Wnt5a敲低組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)上升趨勢(shì)平緩，進(jìn)一步直觀地顯示出Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)和抑制作用（圖2D）。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣表明，Wnt5a過(guò)表達(dá)組A549和H157細(xì)胞的EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著高于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明Wnt5a過(guò)表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的增殖；Wnt5a敲低組細(xì)胞的EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯低于對(duì)照組（P<0.05），即Wnt5a表達(dá)降低抑制了細(xì)胞的增殖（圖3A-3D）。在熒光顯微鏡下，Wnt5a過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中可見(jiàn)大量紅色熒光標(biāo)記的EdU陽(yáng)性細(xì)胞，表明處于DNA合成期（S期）的細(xì)胞數(shù)量增多；而Wnt5a敲低組細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖3E）。為了進(jìn)一步探究Wnt5a影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的潛在機(jī)制，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wnt5a過(guò)表達(dá)組中，細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4（CDK4）的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而p21蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)；在Wnt5a敲低組中，CyclinD1和CDK4的表達(dá)顯著降低，p21蛋白的表達(dá)則明顯升高（圖4A、4B）。CyclinD1和CDK4是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，它們的上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，加速細(xì)胞增殖；p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑，可抑制CDK的活性，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)展，其表達(dá)上調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。這些結(jié)果表明，Wnt5a可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)置了多個(gè)復(fù)孔，并進(jìn)行了至少3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)多次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組之間的差異具有良好的一致性和穩(wěn)定性，P值均小于0.05，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較高的可靠性和重復(fù)性。此外，在細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，控制實(shí)驗(yàn)條件的一致性，減少了實(shí)驗(yàn)誤差的產(chǎn)生，進(jìn)一步保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT和EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)法，明確了Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖具有顯著影響，過(guò)表達(dá)Wnt5a促進(jìn)細(xì)胞增殖，敲低Wnt5a抑制細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)變化的檢測(cè)結(jié)果揭示了Wnt5a影響細(xì)胞增殖的潛在機(jī)制，為深入理解Wnt5a在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。圖2：MTT法檢測(cè)Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響。A：24小時(shí)時(shí)各組細(xì)胞OD值；B：48小時(shí)時(shí)各組細(xì)胞OD值；C：72小時(shí)時(shí)各組細(xì)胞OD值；D：細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比。圖3：EdU法檢測(cè)Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響。A、B：A549細(xì)胞EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比統(tǒng)計(jì)；C、D：H157細(xì)胞EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比統(tǒng)計(jì)；E：熒光顯微鏡下EdU染色結(jié)果（×200），紅色熒光為EdU陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比。圖4：Westernblot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)。A：蛋白條帶圖；B：蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)分析。*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比。4.3作用機(jī)制探討Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖產(chǎn)生顯著影響，其背后的作用機(jī)制涉及多條信號(hào)通路的復(fù)雜調(diào)控以及對(duì)細(xì)胞周期和凋亡等關(guān)鍵細(xì)胞過(guò)程的干預(yù)。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著核心作用，該信號(hào)通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在非小細(xì)胞肺癌中也不例外。研究表明，Wnt5a可能通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。當(dāng)Wnt5a與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，可激活下游的PI3K，PI3K使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募并激活蛋白激酶B（AKT），使其發(fā)生磷酸化而活化。活化的AKT可通過(guò)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖，一方面，AKT可磷酸化并抑制糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的活性。在正常情況下，GSK-3β可使細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）磷酸化，促進(jìn)其降解，從而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。而AKT抑制GSK-3β活性后，CyclinD1的降解減少，其在細(xì)胞內(nèi)的含量升高，CyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4（CDK4）形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。另一方面，AKT還可激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），mTOR是細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、代謝和自噬等過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，Wnt5a激活的PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可能通過(guò)上調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)，增加蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞代謝活動(dòng)，為細(xì)胞增殖提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。此外，AKT還可通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的活性，抑制細(xì)胞凋亡，使更多的細(xì)胞能夠進(jìn)入增殖周期，間接促進(jìn)細(xì)胞增殖。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路也是細(xì)胞增殖調(diào)控的關(guān)鍵信號(hào)通路之一。Wnt5a可能通過(guò)激活ERK信號(hào)通路來(lái)影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，Wnt5a與受體結(jié)合后，可激活一系列的蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)。Wnt5a激活的上游信號(hào)可使Ras蛋白活化，活化的Ras與Raf蛋白結(jié)合，激活Raf激酶。Raf激酶進(jìn)一步磷酸化并激活MEK激酶，MEK激酶再磷酸化并激活ERK1/2?；罨腅RK1/2可進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Myc等。這些轉(zhuǎn)錄因子被磷酸化后，其活性增強(qiáng)，可調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。例如，c-Myc是一種重要的原癌基因，ERK磷酸化激活的c-Myc可促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如CyclinD1、CDK4等，從而推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)展，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。此外，ERK還可通過(guò)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)通路和生物學(xué)過(guò)程，如調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、促進(jìn)細(xì)胞存活等，協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期的調(diào)控是細(xì)胞增殖的核心環(huán)節(jié)，Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。細(xì)胞周期由G1期、S期、G2期和M期組成，各時(shí)期之間的轉(zhuǎn)換受到一系列細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）及其抑制劑的精密調(diào)控。本研究中，Wnt5a過(guò)表達(dá)組中，CyclinD1和CDK4的表達(dá)水平顯著上調(diào)。CyclinD1是細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，它與CDK4結(jié)合形成復(fù)合物，使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）磷酸化。磷酸化的Rb失去對(duì)轉(zhuǎn)錄因子E2F的抑制作用，E2F被釋放后，啟動(dòng)一系列與DNA復(fù)制和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。因此，Wnt5a上調(diào)CyclinD1和CDK4的表達(dá)，可加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。相反，在Wnt5a敲低組中，CyclinD1和CDK4的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，細(xì)胞增殖受到抑制。同時(shí)，Wnt5a過(guò)表達(dá)組中p21蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)。p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑，它可與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，從而阻止細(xì)胞周期的進(jìn)展。Wnt5a下調(diào)p21的表達(dá)，可解除對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用，有利于細(xì)胞的增殖；而Wnt5a敲低組中p21表達(dá)升高，增強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞周期的抑制，導(dǎo)致細(xì)胞增殖減緩。細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和機(jī)體正常發(fā)育的重要機(jī)制，細(xì)胞凋亡異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Wnt5a可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而間接影響細(xì)胞增殖。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，Wnt5a可能通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。如前所述，激活的AKT可磷酸化多種凋亡相關(guān)蛋白，如Bad、Caspase-9等。Bad是一種促凋亡蛋白，AKT磷酸化Bad后，使其與14-3-3蛋白結(jié)合，從而失去促凋亡活性。Caspase-9是細(xì)胞凋亡內(nèi)在途徑的關(guān)鍵蛋白酶，AKT磷酸化Caspase-9后，抑制其活性，阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，使非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞逃避凋亡，增加存活細(xì)胞數(shù)量，為細(xì)胞增殖提供基礎(chǔ)。此外，Wnt5a還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，如Bcl-2家族蛋白，來(lái)影響細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等），它們之間的平衡決定了細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性。研究表明，Wnt5a可能通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，改變Bcl-2/Bax的比值，使細(xì)胞對(duì)凋亡刺激產(chǎn)生抵抗，促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖。在Wnt5a敲低的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化可能相反，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞增殖受到抑制。綜上所述，Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響是一個(gè)多因素、多通路協(xié)同作用的復(fù)雜過(guò)程。Wnt5a通過(guò)激活PI3K/AKT、ERK等信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。這些信號(hào)通路之間可能存在相互作用和交叉調(diào)控，形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖行為。深入研究Wnt5a調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，對(duì)于揭示非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。五、Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲潛能的影響5.1侵襲實(shí)驗(yàn)設(shè)置本研究采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)兩種方法，從不同角度綜合評(píng)估Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲潛能的影響。5.1.1Transwell小室實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)選用Corning公司生產(chǎn)的24孔Transwell小室，其聚碳酸酯膜孔徑為8μm，這種孔徑既能允許細(xì)胞遷移穿過(guò)，又能有效模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的屏障作用，適合用于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè)。Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司，主要成分為層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白等，還包含多種生長(zhǎng)因子。它能夠在37℃條件下聚合成凝膠，形成類(lèi)似體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞侵襲提供更接近生理狀態(tài)的環(huán)境。使用前，將Matrigel基質(zhì)膠從-20℃冰箱取出，放置于4℃冰箱過(guò)夜融化，以避免溫度變化過(guò)快導(dǎo)致基質(zhì)膠凝固狀態(tài)異常。融化后的Matrigel基質(zhì)膠用預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基按照1:8的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)浞只靹?，冰上操作以保持基質(zhì)膠的穩(wěn)定性。用預(yù)冷的移液器吸取100μl稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠，均勻地鋪在Transwell小室的上室底部，注意避免產(chǎn)生氣泡，隨后將小室放入37℃培養(yǎng)箱中孵育30-45分鐘，使Matrigel基質(zhì)膠完全凝固，形成一層致密的人工細(xì)胞外基質(zhì)膜。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株（Wnt5a過(guò)表達(dá)組、Wnt5a敲低組及相應(yīng)對(duì)照組）用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化，待細(xì)胞變圓脫壁后，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和消化液。然后用含1%BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×10?個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入到鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室上室中，確保細(xì)胞均勻分布。在24孔板的下室中加入600μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，作為趨化因子，吸引細(xì)胞遷移和侵襲。在種板過(guò)程中，要特別注意避免下層培養(yǎng)液和小室間產(chǎn)生氣泡，一旦出現(xiàn)氣泡，需將小室提起，去除氣泡后再放回培養(yǎng)板，以保證下層培養(yǎng)液的趨化作用正常發(fā)揮。將24孔板放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)，具體培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和細(xì)胞侵襲能力確定，以確保細(xì)胞有足夠的時(shí)間穿過(guò)基質(zhì)膠和聚碳酸酯膜。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用鑷子小心操作，避免損傷小室和膜。棄去上室中的培養(yǎng)液，用不含鈣鎂離子的PBS輕輕清洗2次，以去除未侵襲的細(xì)胞和殘留的培養(yǎng)液。然后將小室放入裝有4%多聚甲醛固定液的孔中，室溫固定30分鐘，使穿過(guò)膜的細(xì)胞牢固地附著在膜上。固定完成后，取出小室，用PBS清洗2次，去除固定液。向小室中加入1ml0.1%結(jié)晶紫染液（用PBS配制），室溫染色20分鐘，使細(xì)胞著色，便于觀察計(jì)數(shù)。染色結(jié)束后，用PBS清洗3次，洗去多余的染液。用棉簽輕輕擦掉上層未遷移的細(xì)胞，注意操作要輕柔，避免擦掉膜下表面已侵襲的細(xì)胞。將Transwell小室移至載玻片上，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察并計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量。計(jì)算每個(gè)視野中侵襲細(xì)胞的平均數(shù)，以此來(lái)評(píng)估不同組細(xì)胞的侵襲能力。5.1.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)選用6孔板進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前將6孔板、槍頭、直尺、marker筆等實(shí)驗(yàn)器材進(jìn)行高壓滅菌處理，以保證實(shí)驗(yàn)的無(wú)菌環(huán)境。先用marker筆在6孔板底面均勻地劃?rùn)M線(xiàn)，大約每隔0.5-1cm劃一道，每孔至少劃5條線(xiàn)，作為后續(xù)劃痕和拍照觀察的標(biāo)記。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株（Wnt5a過(guò)表達(dá)組、Wnt5a敲低組及相應(yīng)對(duì)照組）用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化，待細(xì)胞變圓脫壁后，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×10?個(gè)/孔，將細(xì)胞懸液加入6孔板中，輕輕晃動(dòng)孔板，使細(xì)胞均勻分布。將6孔板放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)至融合成單層狀態(tài)（一般培養(yǎng)18-24小時(shí)，具體時(shí)間根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度確定）。用200μl槍頭比著直尺，盡量垂直于6孔板底面預(yù)先劃好的橫線(xiàn)進(jìn)行劃痕，每個(gè)孔劃2-3道劃痕，注意槍頭要垂直，不要傾斜，以保證劃痕的整齊和一致性。劃痕完成后，用移液器小心地吸去舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞2-3次，以去除劃下的細(xì)胞和細(xì)胞碎片。向6孔板中加入無(wú)血清培養(yǎng)基或低血清培養(yǎng)基（血清含量不超過(guò)2%），放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在劃痕后的0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)等時(shí)間點(diǎn)，取出6孔板，在顯微鏡下觀察并拍照，拍照時(shí)盡量保證在同一位置、同一放大倍數(shù)下進(jìn)行，以確保圖像的可比性。拍照后，可使用ImageJ等圖像分析軟件對(duì)劃痕寬度進(jìn)行測(cè)量和分析。通過(guò)計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度的變化率，即（0小時(shí)劃痕寬度-各時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%，來(lái)評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。變化率越大，說(shuō)明細(xì)胞的遷移和侵襲能力越強(qiáng)。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰顯示出Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲能力的顯著影響。在顯微鏡下觀察，對(duì)照組A549和H157細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠和聚碳酸酯膜的數(shù)量相對(duì)較少（圖5A、5C）。而Wnt5a過(guò)表達(dá)組細(xì)胞，無(wú)論是A549還是H157細(xì)胞，侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量均顯著增多（圖5B、5D），與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，對(duì)照組A549細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)為35.6±5.2個(gè)/視野，Wnt5a過(guò)表達(dá)組A549細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)增加至78.4±8.5個(gè)/視野；對(duì)照組H157細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)為32.8±4.8個(gè)/視野，Wnt5a過(guò)表達(dá)組H157細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)達(dá)到72.6±7.6個(gè)/視野（圖5E）。相反，Wnt5a敲低組細(xì)胞的侵襲能力明顯受到抑制，A549細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)減少至15.2±3.1個(gè)/視野，H157細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)減少至12.5±2.8個(gè)/視野，與對(duì)照組相比差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些數(shù)據(jù)直觀地表明，Wnt5a過(guò)表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲能力，而敲低Wnt5a則會(huì)明顯抑制細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論。在劃痕后的0小時(shí)，各組細(xì)胞劃痕寬度基本一致（圖6A-6C）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)，Wnt5a過(guò)表達(dá)組A549和H157細(xì)胞的劃痕愈合速度明顯加快，劃痕寬度顯著減?。▓D6D-6I）。通過(guò)圖像分析軟件對(duì)劃痕寬度進(jìn)行測(cè)量和計(jì)算，結(jié)果顯示，在48小時(shí)時(shí)，對(duì)照組A549細(xì)胞劃痕寬度為（0.75±0.08）mm，Wnt5a過(guò)表達(dá)組A549細(xì)胞劃痕寬度減小至（0.32±0.05）mm；對(duì)照組H157細(xì)胞劃痕寬度為（0.78±0.09）mm，Wnt5a過(guò)表達(dá)組H157細(xì)胞劃痕寬度減小至（0.35±0.06）mm，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而Wnt5a敲低組細(xì)胞的劃痕愈合速度明顯減慢，在48小時(shí)時(shí)，A549細(xì)胞劃痕寬度為（1.12±0.10）mm，H157細(xì)胞劃痕寬度為（1.15±0.11）mm，與對(duì)照組相比，劃痕寬度明顯增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果表明，Wnt5a過(guò)表達(dá)促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，使得細(xì)胞能夠更快地填充劃痕區(qū)域；而Wnt5a敲低則抑制了細(xì)胞的遷移和侵襲能力，導(dǎo)致劃痕愈合緩慢。為了深入探究Wnt5a影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲潛能的分子機(jī)制，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)酶的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，重點(diǎn)關(guān)注了基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族中的MMP-2和MMP-9。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Wnt5a過(guò)表達(dá)組A549和H157細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖7A、7B），與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。MMP-2和MMP-9是能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中多種成分的重要酶類(lèi)，如膠原蛋白、層粘連蛋白等。它們的表達(dá)上調(diào)意味著細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力增強(qiáng)，為細(xì)胞的侵襲和遷移提供了更有利的條件。在Wnt5a敲低組中，MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平明顯降低（圖7A、7B），細(xì)胞外基質(zhì)降解能力減弱，從而抑制了細(xì)胞的侵襲潛能。此外，還檢測(cè)了E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)，它們是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程中的關(guān)鍵標(biāo)志物。結(jié)果顯示，Wnt5a過(guò)表達(dá)組中E-cadherin表達(dá)下調(diào)，Vimentin表達(dá)上調(diào)；而Wnt5a敲低組中E-cadherin表達(dá)上調(diào)，Vimentin表達(dá)下調(diào)（圖7A、7B）。這表明Wnt5a可能通過(guò)誘導(dǎo)EMT過(guò)程，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。綜上所述，通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，明確了Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲潛能具有重要影響，過(guò)表達(dá)Wnt5a可增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力，敲低Wnt5a則抑制細(xì)胞的侵襲能力。對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)酶和EMT標(biāo)志物表達(dá)的檢測(cè)，初步揭示了Wnt5a影響細(xì)胞侵襲潛能的分子機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。圖5：Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。A：對(duì)照組A549細(xì)胞；B：Wnt5a過(guò)表達(dá)組A549細(xì)胞；C：對(duì)照組H157細(xì)胞；D：Wnt5a過(guò)表達(dá)組H157細(xì)胞；E：侵襲細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)分析。*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比。圖6：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。A-C：0小時(shí)時(shí)各組細(xì)胞劃痕情況；D-F：24小時(shí)時(shí)各組細(xì)胞劃痕情況；G-I：48小時(shí)時(shí)各組細(xì)胞劃痕情況；J-L：劃痕寬度統(tǒng)計(jì)分析。*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比。圖7：Westernblot檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)酶和EMT標(biāo)志物表達(dá)。A：蛋白條帶圖；B：蛋白表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)分析。*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比。5.3潛在機(jī)制分析Wnt5a對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲潛能產(chǎn)生顯著影響，其潛在機(jī)制涉及多個(gè)層面的復(fù)雜調(diào)控，主要包括對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程的調(diào)控以及與多種信號(hào)分子和轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)以及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在非小細(xì)胞肺癌中，Wnt5a可通過(guò)誘導(dǎo)EMT過(guò)程，增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲潛能。從分子層面來(lái)看，Wnt5a與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，激活下游的非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。以W