剛地弓形蟲(chóng)表面抗原糖蛋白相關(guān)序列SRS47D生物學(xué)特性深度剖析一、引言1.1弓形蟲(chóng)及弓形蟲(chóng)病概述弓形蟲(chóng)（Toxoplasmagondii），又稱(chēng)剛地弓形蟲(chóng)，是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生的真核生物，屬于球蟲(chóng)亞綱真球蟲(chóng)目等孢子球蟲(chóng)科弓形體屬，是該屬下唯一的寄生蟲(chóng)。它在自然界中廣泛分布，呈世界性流行，能感染幾乎所有的溫血?jiǎng)游铮ㄈ祟?lèi)和眾多家畜、家禽等，是一種危害嚴(yán)重的人獸共患病病原。從生物學(xué)特性來(lái)看，弓形蟲(chóng)在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)5種不同形態(tài)，即滋養(yǎng)體（速殖子）、包囊、裂殖體、配子體和卵囊。滋養(yǎng)體呈弓形、月牙形或香蕉形，一端尖，一端鈍，大小為4-7μm×2-4μm，核位于蟲(chóng)體中央稍偏后，多出現(xiàn)在發(fā)病急性期，在中間宿主的有核細(xì)胞內(nèi)以二分裂、內(nèi)二芽殖及裂體增殖等方式快速繁殖，多個(gè)速殖子聚集被宿主細(xì)胞膜包繞形成“假包囊”。包囊呈圓形或橢圓形，直徑10-200μm，囊壁由蟲(chóng)體分泌，富有彈性，可長(zhǎng)期存活于組織內(nèi)，一般出現(xiàn)在慢性病例，常見(jiàn)于腦、肌肉等組織，囊內(nèi)蟲(chóng)體為緩殖子。裂殖體見(jiàn)于終末宿主貓科動(dòng)物的小腸絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)，呈長(zhǎng)橢圓形，直徑12-15μm，內(nèi)有4-20個(gè)裂殖子，裂殖子前端尖，后端鈍圓。配子體也見(jiàn)于終末宿主，分大配子體、小配子體兩種，大配子體發(fā)育成熟為雌配子，小配子體成熟后形成多個(gè)雄配子。卵囊呈圓形或橢圓形，大小12μm×10μm，有兩層光滑透明的囊壁，隨終末宿主糞便排出，在適宜環(huán)境中發(fā)育成熟，含有2個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊有4個(gè)子孢子，具有傳染性。弓形蟲(chóng)具有獨(dú)特的生活史，需在兩個(gè)宿主中完成發(fā)育，涉及無(wú)性生殖和有性生殖兩個(gè)世代的交替。貓科動(dòng)物既是弓形蟲(chóng)的終宿主，也是中間宿主，在其小腸上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有性生殖，同時(shí)也可在腸外有核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無(wú)性生殖。當(dāng)貓吞食含有弓形蟲(chóng)不同發(fā)育階段蟲(chóng)體（如卵囊、包囊、假包囊）的食物后，子孢子、緩殖子或速殖子在小腸內(nèi)孵出，侵入小腸上皮細(xì)胞發(fā)育為裂殖體，裂殖體成熟破裂釋放裂殖子，再侵入新的腸上皮細(xì)胞重復(fù)裂體增殖。經(jīng)過(guò)數(shù)代裂體增殖后，部分裂殖子發(fā)育為雌雄配子體，進(jìn)行配子增殖，雌雄配子結(jié)合形成合子，最終發(fā)育成卵囊隨糞便排出。卵囊在適宜條件下發(fā)育成熟，具有感染性。而人和其他動(dòng)物作為中間宿主，主要通過(guò)攝入被卵囊污染的食物、水，或食用含有包囊、假包囊的生肉或未煮熟的肉類(lèi)而感染。蟲(chóng)體進(jìn)入中間宿主體內(nèi)后，經(jīng)淋巴和血液擴(kuò)散到全身各組織器官，主動(dòng)侵入有核細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無(wú)性生殖，以速殖子形式快速繁殖，當(dāng)宿主免疫功能正常時(shí)，部分速殖子可轉(zhuǎn)化為緩殖子并形成包囊，長(zhǎng)期潛伏在組織中；當(dāng)宿主免疫功能下降時(shí)，包囊破裂，緩殖子又可轉(zhuǎn)化為速殖子，引發(fā)疾病發(fā)作。弓形蟲(chóng)?。═oxoplasmosis）是由弓形蟲(chóng)感染引起的一種人獸共患寄生蟲(chóng)病。其傳播途徑主要包括先天性傳播和獲得性傳播。先天性傳播是指母體感染弓形蟲(chóng)后，通過(guò)胎盤(pán)將病原體傳播給胎兒，可導(dǎo)致胎兒畸形、流產(chǎn)、死胎或新生兒先天性弓形蟲(chóng)病，嚴(yán)重影響胎兒的健康和發(fā)育。獲得性傳播途徑多樣，其中經(jīng)口傳播最為常見(jiàn)，如食用被弓形蟲(chóng)卵囊污染的食物、水，或攝入未煮熟的含有弓形蟲(chóng)包囊、假包囊的肉類(lèi)；接觸傳播主要是通過(guò)接觸感染弓形蟲(chóng)的貓及其糞便、被污染的土壤、水源等而感染；輸血或器官移植傳播則是由于輸入含有弓形蟲(chóng)的血液或移植被感染的器官而導(dǎo)致受者感染。此外，節(jié)肢動(dòng)物攜帶卵囊也可能具有一定的傳播意義。弓形蟲(chóng)病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，與宿主的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。在免疫功能正常的人群中，感染弓形蟲(chóng)后多呈隱性感染，一般無(wú)明顯臨床癥狀，這是因?yàn)樗拗鞯拿庖呦到y(tǒng)能夠有效控制蟲(chóng)體的增殖和擴(kuò)散。然而，當(dāng)宿主免疫功能受損或缺陷時(shí)，如艾滋病患者、器官移植受者、長(zhǎng)期使用免疫抑制劑者以及胎兒和嬰幼兒等，弓形蟲(chóng)可在體內(nèi)大量繁殖，突破宿主的免疫防線(xiàn)，導(dǎo)致顯性感染，引起嚴(yán)重的臨床癥狀。弓形蟲(chóng)幾乎可以感染所有類(lèi)型的有核細(xì)胞，蟲(chóng)體在細(xì)胞內(nèi)寄生和繁殖，一方面通過(guò)直接破壞宿主細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡；另一方面，蟲(chóng)體的代謝產(chǎn)物、分泌物以及死亡蟲(chóng)體的分解產(chǎn)物等可作為抗原，引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，造成免疫病理?yè)p傷。在感染過(guò)程中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)會(huì)啟動(dòng)一系列免疫應(yīng)答機(jī)制來(lái)對(duì)抗弓形蟲(chóng)感染。細(xì)胞免疫在抗弓形蟲(chóng)感染中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，T淋巴細(xì)胞尤其是CD4+和CD8+T細(xì)胞可識(shí)別弓形蟲(chóng)抗原，分泌細(xì)胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等，激活巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)它們對(duì)弓形蟲(chóng)的殺傷能力。同時(shí)，體液免疫也參與其中，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的特異性抗體可與弓形蟲(chóng)結(jié)合，發(fā)揮調(diào)理吞噬、中和毒素等作用，但抗體在抗弓形蟲(chóng)感染中的作用相對(duì)有限。弓形蟲(chóng)病對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康都造成了嚴(yán)重危害。在人類(lèi)方面，先天性弓形蟲(chóng)病可導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)多種嚴(yán)重的先天性畸形，如腦積水、小頭畸形、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、智力發(fā)育障礙等，嚴(yán)重影響新生兒的生存質(zhì)量和預(yù)后。獲得性弓形蟲(chóng)病在免疫功能正常者中雖多為隱性感染，但部分患者可出現(xiàn)發(fā)熱、乏力、淋巴結(jié)腫大、肌肉疼痛等非特異性癥狀，容易被忽視或誤診。而對(duì)于免疫功能低下者，弓形蟲(chóng)感染往往會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的臨床癥狀，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，表現(xiàn)為腦炎、腦膜炎、癲癇發(fā)作等，還可導(dǎo)致全身性播散感染，累及多個(gè)器官系統(tǒng)，如心臟、肺、肝臟等，甚至危及生命。在動(dòng)物方面，弓形蟲(chóng)病在家畜中廣泛流行，尤其是豬、羊等，可引起高熱、呼吸困難、神經(jīng)癥狀以及繁殖障礙等，給畜牧業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。例如，母豬感染弓形蟲(chóng)可導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等，嚴(yán)重影響母豬的繁殖性能和養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。此外，弓形蟲(chóng)感染還可能影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)性能，降低肉類(lèi)、奶類(lèi)等畜產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。弓形蟲(chóng)及弓形蟲(chóng)病因其廣泛的宿主范圍、復(fù)雜的生活史、多樣的傳播途徑以及對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康的嚴(yán)重危害，成為全球公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)領(lǐng)域關(guān)注的重要問(wèn)題。深入研究弓形蟲(chóng)的生物學(xué)特性、致病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)有效的防控措施，對(duì)于保障人類(lèi)健康和促進(jìn)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。1.2弓形蟲(chóng)的分泌蛋白弓形蟲(chóng)作為一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng)，其成功感染宿主并在宿主體內(nèi)生存和繁殖，離不開(kāi)一系列分泌蛋白的參與。這些分泌蛋白主要包括棒狀體蛋白（ROPs）、微線(xiàn)體蛋白（MICs）和致密顆粒蛋白（GRAs），它們?cè)诠蜗x(chóng)的入侵、增殖、免疫逃避以及與宿主細(xì)胞的相互作用等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。棒狀體蛋白是弓形蟲(chóng)在侵入宿主細(xì)胞過(guò)程中由棒狀體細(xì)胞器分泌的一類(lèi)蛋白質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，棒狀體蛋白可分為多個(gè)亞類(lèi)，如ROP1-ROP18等。其中，ROP1在弓形蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程中起到了促進(jìn)侵入因子（PEF）的作用，某些蛋白質(zhì)因子或介質(zhì)作為PEF能增加侵入的有效性，而單克隆抗體Tg49既能抑制PEF，也能識(shí)別ROP1，所以認(rèn)為ROP1就是PEF。ROP2是研究較為深入的一種棒狀體蛋白，它能夠磷酸化宿主細(xì)胞的多種蛋白，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的信號(hào)通路，影響宿主細(xì)胞的代謝和功能，為弓形蟲(chóng)的生存和繁殖創(chuàng)造有利條件。例如，ROP2可以磷酸化宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，改變宿主細(xì)胞的基因表達(dá)譜，抑制宿主細(xì)胞的免疫相關(guān)基因表達(dá)，從而幫助弓形蟲(chóng)逃避宿主的免疫攻擊。ROP16也是一種重要的棒狀體蛋白，它可以通過(guò)激活宿主細(xì)胞內(nèi)的STAT3和STAT6信號(hào)通路，抑制宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答，促進(jìn)弓形蟲(chóng)在細(xì)胞內(nèi)的存活和增殖。研究發(fā)現(xiàn)，感染表達(dá)ROP16的弓形蟲(chóng)的宿主細(xì)胞，其細(xì)胞因子的分泌和免疫細(xì)胞的活化受到明顯抑制，導(dǎo)致宿主對(duì)弓形蟲(chóng)的清除能力下降。微線(xiàn)體蛋白是弓形蟲(chóng)微線(xiàn)體分泌的一類(lèi)蛋白，在弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的起始階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。常見(jiàn)的微線(xiàn)體蛋白有MIC1、MIC2、MIC3等。MIC2是最早被發(fā)現(xiàn)的微線(xiàn)體蛋白之一，它含有一個(gè)黏附素結(jié)構(gòu)域，能夠與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，介導(dǎo)弓形蟲(chóng)與宿主細(xì)胞的初始黏附。研究表明，MIC2與宿主細(xì)胞表面的纖維連接蛋白受體結(jié)合，通過(guò)一系列分子間相互作用，使弓形蟲(chóng)能夠緊密附著在宿主細(xì)胞表面，為后續(xù)的入侵過(guò)程奠定基礎(chǔ)。MIC3則參與了弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，它可以激活宿主細(xì)胞內(nèi)的某些信號(hào)通路，促進(jìn)宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的重排，形成有利于弓形蟲(chóng)入侵的結(jié)構(gòu)。當(dāng)MIC3與宿主細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合后，會(huì)引發(fā)宿主細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白聚集在弓形蟲(chóng)附著部位，形成一個(gè)富含肌動(dòng)蛋白的“入侵焦點(diǎn)”，弓形蟲(chóng)借此突破宿主細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此外，MICs之間還存在相互作用，它們可以形成復(fù)合物，協(xié)同發(fā)揮作用，增強(qiáng)弓形蟲(chóng)對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和入侵能力。致密顆粒蛋白是弓形蟲(chóng)在侵入宿主細(xì)胞后由致密顆粒分泌的蛋白質(zhì)，在弓形蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞后的生存、增殖以及與宿主細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)多種致密顆粒蛋白，如GRA1-GRA24等。GRA1是最早被鑒定的致密顆粒蛋白之一，它參與了弓形蟲(chóng)納蟲(chóng)空泡（PV）的形成和維持。在弓形蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞后，GRA1會(huì)分泌到宿主細(xì)胞內(nèi)，并聚集在納蟲(chóng)空泡膜上，與其他蛋白一起構(gòu)建和穩(wěn)定納蟲(chóng)空泡的結(jié)構(gòu)，為弓形蟲(chóng)提供一個(gè)適宜的生存環(huán)境。GRA2可以與宿主細(xì)胞的微管相互作用，調(diào)節(jié)納蟲(chóng)空泡在宿主細(xì)胞內(nèi)的定位和運(yùn)動(dòng)，使納蟲(chóng)空泡能夠更好地獲取宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)弓形蟲(chóng)的生長(zhǎng)和繁殖。研究發(fā)現(xiàn)，敲除GRA2基因的弓形蟲(chóng)，其納蟲(chóng)空泡在宿主細(xì)胞內(nèi)的分布和運(yùn)動(dòng)出現(xiàn)異常，弓形蟲(chóng)的增殖速度明顯減慢。此外，一些致密顆粒蛋白還具有免疫調(diào)節(jié)功能，如GRA7可以刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答，幫助弓形蟲(chóng)在宿主體內(nèi)建立慢性感染。棒狀體蛋白、微線(xiàn)體蛋白和致密顆粒蛋白在弓形蟲(chóng)的感染過(guò)程中各自發(fā)揮獨(dú)特的作用，它們相互協(xié)作，共同促進(jìn)弓形蟲(chóng)對(duì)宿主細(xì)胞的入侵、生存和繁殖。深入研究這些分泌蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，不僅有助于揭示弓形蟲(chóng)的致病機(jī)制，也為開(kāi)發(fā)針對(duì)弓形蟲(chóng)病的新型診斷方法、治療藥物和疫苗提供了重要的理論依據(jù)。1.3弓形蟲(chóng)表面抗原研究進(jìn)展弓形蟲(chóng)表面抗原在其感染宿主及與宿主免疫系統(tǒng)相互作用過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對(duì)其深入研究有助于揭示弓形蟲(chóng)的致病機(jī)制、開(kāi)發(fā)有效的診斷方法和疫苗。目前，研究較多的弓形蟲(chóng)表面抗原包括SAG1（P30）、SAG2（P22）、SAG3（P43）以及SAG1相關(guān)序列蛋白家族（SRS蛋白家族）。SAG1（P30）是研究最為廣泛和深入的弓形蟲(chóng)表面抗原之一。它是弓形蟲(chóng)速殖子的主要表面抗原，約占蟲(chóng)體總蛋白的3%-5%，但卻可抑制病人血清中抗體活性的50%以上，具有高度的免疫原性，是誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的主要靶抗原。SAG1基因是單拷貝基因，不含內(nèi)含子，其編碼的蛋白質(zhì)序列包含319個(gè)氨基酸。在弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中，SAG1起著重要的配體作用，它能與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，介導(dǎo)弓形蟲(chóng)對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和入侵。研究表明，抗SAG1單克隆抗體6A8能夠抑制速殖子與宿主細(xì)胞的粘附作用，且這種抑制作用具有劑量依賴(lài)性，說(shuō)明SAG1分子構(gòu)象的變化會(huì)影響蟲(chóng)體對(duì)宿主細(xì)胞的粘附。由于SAG1具有良好的免疫原性和在弓形蟲(chóng)感染過(guò)程中的關(guān)鍵作用，它成為了弓形蟲(chóng)疫苗研究中最具潛力的候選抗原之一。許多研究致力于通過(guò)基因工程技術(shù)在體外表達(dá)SAG1，以制備高效的弓形蟲(chóng)疫苗。例如，司進(jìn)等將體外擴(kuò)增的SAG1全長(zhǎng)基因克隆到原核表達(dá)載體中，并成功誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)親和純化的重組SAG1（rSGA1）具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性；Kim等將SAG1基因在中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，獲得了大量接近天然構(gòu)型的P30蛋白；Liu等運(yùn)用重組的狂犬病病毒表達(dá)的TgSAG1蛋白制成的疫苗免疫BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠對(duì)弓形蟲(chóng)RH株和狂犬病病毒都產(chǎn)生了較好的免疫性。SAG2（P22）也是一種重要的弓形蟲(chóng)表面抗原。它是第二個(gè)被克隆和測(cè)序的弓形蟲(chóng)表面抗原，為單拷貝基因，不含內(nèi)含子。SAG2在蟲(chóng)體胞膜位置上與SAG1靠近，能協(xié)助SAG1使蟲(chóng)體迅速入侵宿主細(xì)胞。用抗SAG2單克隆抗體與速殖子和宿主細(xì)胞共同孵育時(shí)，蟲(chóng)體在宿主細(xì)胞外堆積，延緩了對(duì)宿主細(xì)胞的附著，當(dāng)抗體壓力解除后，堆積的蟲(chóng)體侵入細(xì)胞的活動(dòng)力增強(qiáng)，這表明SAG2在弓形蟲(chóng)入侵過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。此外，SAG2不僅介導(dǎo)弓形蟲(chóng)速殖子的入侵過(guò)程，還在弓形蟲(chóng)速殖子向緩殖子轉(zhuǎn)化的過(guò)程中發(fā)揮作用。趙東岳等將去掉信號(hào)肽和C-末端的SAG2基因片段插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-3后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，經(jīng)誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)，所得重組蛋白具有良好的完全抗原活性，為弓形蟲(chóng)的基因重組疫苗研究奠定了基礎(chǔ)；全娟花等將弓形蟲(chóng)SAG2基因插入pCMV-Taq2B載體，使其在真核細(xì)胞中高水平穩(wěn)定表達(dá)，構(gòu)建含pCMV-Taq2B-Surfaceantigen2成分的核酸疫苗，免疫組能產(chǎn)生特異性IgG抗體，末次免疫后28d達(dá)到峰值。SAG3（P43）是存在于弓形蟲(chóng)所有入侵階段的膜蛋白。未成熟的SAG3蛋白由385個(gè)氨基酸殘基組成，含有一個(gè)N端信號(hào)肽和GPI。它是參與弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞過(guò)程的主要分子，介導(dǎo)對(duì)宿主細(xì)胞的識(shí)別和黏附。朱剛以RH株弓形蟲(chóng)SAG3蛋白為抗原分子，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，用兔抗SAG3蛋白血清檢測(cè)到該基因所表達(dá)蛋白具有免疫原性，對(duì)小鼠肌注后，小鼠產(chǎn)生了細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，表明此DNA疫苗對(duì)小鼠感染弓形蟲(chóng)具有一定的免疫保護(hù)作用。此外，SAG3在弓形蟲(chóng)病的診斷中也具有重要價(jià)值。有研究運(yùn)用巢式PCR技術(shù)對(duì)血樣DNA進(jìn)行弓形蟲(chóng)SAG3基因的擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切和測(cè)序分析，成功鑒定出云南大理HIV陽(yáng)性者感染弓形蟲(chóng)的基因型。SAG1相關(guān)序列蛋白家族（SRS蛋白家族）是一類(lèi)與SAG1具有相似結(jié)構(gòu)和功能的蛋白家族。該家族成員眾多，它們?cè)诠蜗x(chóng)的不同發(fā)育階段和感染過(guò)程中發(fā)揮著多樣化的作用。一些SRS蛋白參與了弓形蟲(chóng)對(duì)宿主細(xì)胞的黏附、入侵和免疫逃避等過(guò)程。例如，部分SRS蛋白能夠與宿主細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，促進(jìn)弓形蟲(chóng)的入侵；還有一些SRS蛋白可能通過(guò)調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答，幫助弓形蟲(chóng)逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。雖然對(duì)SRS蛋白家族的研究相對(duì)較晚，但近年來(lái)隨著研究的不斷深入，越來(lái)越多的SRS蛋白成員被鑒定和研究，它們?cè)诠蜗x(chóng)致病機(jī)制和疫苗研發(fā)中的潛在作用也逐漸受到關(guān)注。例如，有研究發(fā)現(xiàn)某些SRS蛋白在弓形蟲(chóng)慢性感染階段高度表達(dá)，可能與弓形蟲(chóng)在宿主體內(nèi)的長(zhǎng)期存活和潛伏感染有關(guān)，這為深入了解弓形蟲(chóng)的感染機(jī)制和開(kāi)發(fā)針對(duì)慢性感染的防治策略提供了新的靶點(diǎn)。SAG1、SAG2、SAG3及SRS蛋白家族等弓形蟲(chóng)表面抗原在弓形蟲(chóng)的感染、致病以及宿主免疫應(yīng)答等過(guò)程中各自發(fā)揮著獨(dú)特而重要的作用。對(duì)這些表面抗原的深入研究，不僅有助于揭示弓形蟲(chóng)的致病機(jī)制，也為開(kāi)發(fā)更加有效的弓形蟲(chóng)病診斷方法、治療藥物和疫苗提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和豐富的研究靶點(diǎn)。1.4弓形蟲(chóng)疫苗研究現(xiàn)狀弓形蟲(chóng)病嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和畜牧業(yè)發(fā)展，研發(fā)有效的弓形蟲(chóng)疫苗至關(guān)重要。自20世紀(jì)60年代起，弓形蟲(chóng)疫苗的研制歷經(jīng)多個(gè)發(fā)展階段，包括全蟲(chóng)死疫苗、減毒活疫苗、蟲(chóng)體特異組分疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗等。全蟲(chóng)死疫苗是將弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體經(jīng)過(guò)物理或化學(xué)方法處理使其失去活性后制成的疫苗。這種疫苗的優(yōu)點(diǎn)是安全性較高，不易引發(fā)感染。然而，其抗感染能力較弱，難以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答，對(duì)人群和家畜的實(shí)際保護(hù)效果有限，實(shí)用性較差，因此在實(shí)際應(yīng)用中受到很大限制。減毒活疫苗是通過(guò)對(duì)弓形蟲(chóng)進(jìn)行處理，使其毒力降低但仍保持一定活力的疫苗。例如，Pefferkorn等分離出的弓形蟲(chóng)溫度敏感株ts-4，該突變株對(duì)小鼠無(wú)致病性，也不會(huì)使小鼠發(fā)生慢性感染，在當(dāng)時(shí)被視為較好的備選疫苗。減毒活疫苗能夠激發(fā)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，具有一定的使用價(jià)值。但它存在恢復(fù)毒力和導(dǎo)致臨床感染的風(fēng)險(xiǎn)，長(zhǎng)期保種后其遺傳穩(wěn)定性難以保證，這使得減毒活疫苗的廣泛應(yīng)用存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。蟲(chóng)體特異組分疫苗是利用免疫化學(xué)方法從蟲(chóng)體裂解物或排泄和分泌抗原（ESA）中提取特定組分制成的疫苗。沈繼龍等將弓形蟲(chóng)RH株速殖子裂解，經(jīng)SDS電泳，浸出各組分帶注射小鼠，然后用毒力株蟲(chóng)體攻擊，發(fā)現(xiàn)35kDa組分使免疫小鼠獲得抗攻擊感染的部分保護(hù)性免疫。隨著單克隆抗體（McAb）技術(shù)的發(fā)展，有研究通過(guò)將識(shí)別弓形蟲(chóng)不同分子量的McAb進(jìn)行體外或體內(nèi)保護(hù)實(shí)驗(yàn)，為純化抗原用于疫苗研制提供線(xiàn)索。如Johnson在6株抗弓形蟲(chóng)McAb中，發(fā)現(xiàn)2株（FMC19和FMC22）輸注小鼠可使之獲得對(duì)中等毒力蟲(chóng)株感染的100%的保護(hù)力，能使強(qiáng)毒力蟲(chóng)株攻擊感染平均存活時(shí)間延長(zhǎng)，這兩株McAb相應(yīng)抗原組分是35kDa和14kDa的蟲(chóng)體表面抗原。此外，蟲(chóng)體ESA可能是誘導(dǎo)抗弓形蟲(chóng)免疫應(yīng)答的重要成分之一。Darcy等報(bào)道的弓形蟲(chóng)ESA是用無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基制備的，基本上排除了蟲(chóng)體裂解成分。其免疫原性已用人、大鼠和小鼠的陽(yáng)性血清進(jìn)行了識(shí)別，發(fā)現(xiàn)慢性弓形蟲(chóng)病患者血清可識(shí)別26-108kDa之間的11條組分。用ESA做免疫原接種大鼠，可產(chǎn)生高滴度抗體。將該血清注入弓形蟲(chóng)高敏感的nu/nu幼齡大鼠，可使之獲得抗RH株的抵抗力，存活期顯著延長(zhǎng)。但目前蟲(chóng)體特異組分疫苗還未獲得免疫效果較好的免疫原。基因工程疫苗和核酸疫苗是近年來(lái)弓形蟲(chóng)疫苗研制的新方向。基因工程疫苗是用DNA重組技術(shù)將編碼病原體主要保護(hù)性抗原基因?qū)朐撕驼婧思?xì)胞，使其在受體細(xì)胞中大量表達(dá)，經(jīng)純化表達(dá)產(chǎn)物并輔以佐劑制成的疫苗，主要包括亞單位疫苗、復(fù)合多價(jià)疫苗和混合多價(jià)疫苗。亞單位疫苗由從病原中分離的一個(gè)或幾個(gè)具有免疫原性的抗原決定簇表位制成的蛋白質(zhì)疫苗。弓形蟲(chóng)亞單位疫苗的候選抗原主要有速殖子膜表面抗原、致密顆?？乖?、棒狀體蛋白和微線(xiàn)粒體蛋白等。其中，P30蛋白抗原（SAG1）是研究較多、最具發(fā)展前景的候選疫苗之一。它僅定位于弓形蟲(chóng)速殖子表面，約占蟲(chóng)體總蛋白的3%-5%，卻可抑制病人血清中抗體活性的50%以上，具有高度免疫原性，是誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的主要靶抗原。隨著基因工程技術(shù)發(fā)展，眾多研究者嘗試在體外表達(dá)SAG1以制備疫苗。司進(jìn)等將體外擴(kuò)增的SAG1全長(zhǎng)基因克隆到原核表達(dá)載體中并誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)親和純化的rSGA1具有較強(qiáng)免疫反應(yīng)性；Kim等將SAG1基因在中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞中表達(dá)，獲得大量接近天然構(gòu)型的P30蛋白；Liu等運(yùn)用重組的狂犬病病毒表達(dá)的TgSAG1蛋白制成的疫苗免疫BALB/c小鼠，小鼠對(duì)弓形蟲(chóng)RH株和狂犬病病毒都產(chǎn)生了較好免疫性。然而，由于弓形蟲(chóng)生活史復(fù)雜，抗原成分多，單一抗原成分構(gòu)成的亞單位疫苗含有的淋巴細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)少，受體MHC限制性較大，難以刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)而有效的免疫反應(yīng)，很多動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)表明其免疫效果不理想。復(fù)合多價(jià)疫苗是將不同抗原分子設(shè)計(jì)成聯(lián)合抗原或?qū)⒕幋a不同抗原分子的功能性表位氨基酸的基因片段連接起來(lái)，通過(guò)原核或真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出聯(lián)合表位肽段制成的疫苗。這種疫苗接種后能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)不同種株或不同生活史時(shí)期弓形蟲(chóng)均起作用的特異性免疫反應(yīng)，使疫苗具有多用性和可靠的保護(hù)性。楊婷婷等通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)比較P30單價(jià)抗原和P30-ROP2復(fù)合多價(jià)抗原疫苗誘導(dǎo)小鼠抗體水平的差異，發(fā)現(xiàn)來(lái)自弓形蟲(chóng)不同生活階段的復(fù)合抗原免疫效果優(yōu)于單價(jià)抗原。國(guó)外IgarashiM等將rROP2、rGRA5和rGRA7蛋白制成復(fù)合多價(jià)重組疫苗，能較好地保護(hù)BALB/c小鼠腦中弓形蟲(chóng)包囊的形成。國(guó)內(nèi)張佃波等用ROP2-P30復(fù)合重組蛋白疫苗免疫BALA/c小鼠，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量IgM、IgG抗體和IFN-γ、IL-2及IL-4細(xì)胞因子，發(fā)生高水平的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。但復(fù)合多價(jià)疫苗需要制備兩種或兩種以上抗原再聯(lián)合免疫，操作相對(duì)繁瑣，且較難得到純度高的融合蛋白，目前對(duì)其研究還較薄弱。混合多價(jià)疫苗是在復(fù)合多價(jià)疫苗基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，將弓形蟲(chóng)表面抗原與細(xì)胞因子或佐劑聯(lián)合制成，以增強(qiáng)疫苗免疫效果。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗。DNA疫苗是將編碼弓形蟲(chóng)保護(hù)性抗原的基因直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞，通過(guò)宿主細(xì)胞表達(dá)抗原激發(fā)免疫應(yīng)答。全娟花等將弓形蟲(chóng)SAG2基因插入pCMV-Taq2B載體，構(gòu)建含pCMV-Taq2B-Surfaceantigen2成分的核酸疫苗，免疫組能產(chǎn)生特異性IgG抗體，末次免疫后28d達(dá)到峰值。核酸疫苗具有易于制備、穩(wěn)定性好、可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫等優(yōu)點(diǎn)，但也存在整合到宿主基因組導(dǎo)致基因突變等潛在風(fēng)險(xiǎn)。盡管目前弓形蟲(chóng)疫苗研究取得了一定進(jìn)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。現(xiàn)有疫苗在免疫原性、保護(hù)效果、安全性和穩(wěn)定性等方面存在不足，難以滿(mǎn)足實(shí)際應(yīng)用需求。SRS47D作為弓形蟲(chóng)表面抗原糖蛋白相關(guān)序列，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，其在疫苗研發(fā)中具有潛在價(jià)值。深入研究SRS47D的結(jié)構(gòu)與功能，將其作為新的候選抗原，有望開(kāi)發(fā)出更高效、安全的弓形蟲(chóng)疫苗，為弓形蟲(chóng)病的防控提供新的策略和手段。1.5研究目的與意義弓形蟲(chóng)病作為一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)病，對(duì)人類(lèi)健康和畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成巨大威脅。先天性弓形蟲(chóng)病可導(dǎo)致胎兒畸形、流產(chǎn)、死胎等嚴(yán)重后果，嚴(yán)重影響新生兒的健康和生存質(zhì)量；獲得性弓形蟲(chóng)病在免疫功能低下人群中可引發(fā)嚴(yán)重的臨床癥狀，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害、全身性播散感染等，甚至危及生命。在家畜中，弓形蟲(chóng)感染可引起高熱、呼吸困難、神經(jīng)癥狀以及繁殖障礙等，給畜牧業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管目前在弓形蟲(chóng)病的研究方面已取得一定進(jìn)展，但現(xiàn)有疫苗在免疫原性、保護(hù)效果、安全性和穩(wěn)定性等方面仍存在不足，難以滿(mǎn)足實(shí)際應(yīng)用需求。SRS47D作為弓形蟲(chóng)表面抗原糖蛋白相關(guān)序列，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行深入研究具有多方面的重要意義。在揭示弓形蟲(chóng)致病機(jī)制方面，SRS47D可能在弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞、在宿主體內(nèi)的生存和繁殖以及免疫逃避等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。深入研究其結(jié)構(gòu)與功能，有助于進(jìn)一步明確弓形蟲(chóng)與宿主細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制，為全面理解弓形蟲(chóng)的致病過(guò)程提供新的視角。在開(kāi)發(fā)診斷方法方面，由于SRS47D具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，有望成為弓形蟲(chóng)病診斷的新靶點(diǎn)。通過(guò)對(duì)其進(jìn)行研究，可開(kāi)發(fā)基于SRS47D的新型診斷抗原或診斷技術(shù)，提高弓形蟲(chóng)病診斷的準(zhǔn)確性和敏感性，有助于弓形蟲(chóng)病的早期診斷和及時(shí)治療。在研制新型疫苗方面，SRS47D具有作為疫苗候選抗原的潛力。深入了解其免疫原性和免疫保護(hù)機(jī)制，將其作為新的候選抗原，與其他抗原聯(lián)合使用或構(gòu)建復(fù)合多價(jià)疫苗，有望開(kāi)發(fā)出更高效、安全的弓形蟲(chóng)疫苗，為弓形蟲(chóng)病的防控提供新的策略和手段。本研究旨在通過(guò)生物信息學(xué)分析、基因克隆表達(dá)、蛋白純化鑒定以及動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)等一系列研究方法，深入探究SRS47D的生物學(xué)特性，包括其基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)與功能、免疫原性等。通過(guò)本研究，期望為揭示弓形蟲(chóng)的致病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，為開(kāi)發(fā)更有效的弓形蟲(chóng)病診斷方法和新型疫苗奠定基礎(chǔ)，從而為弓形蟲(chóng)病的防控提供更有力的支持。二、SRS47D的生物信息學(xué)分析2.1材料與方法從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（/）檢索并獲取弓形蟲(chóng)SRS47D蛋白及編碼基因序列，確保所獲序列的準(zhǔn)確性和完整性，為后續(xù)分析提供可靠數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。運(yùn)用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)中的ProtParam工具（/protparam/）對(duì)SRS47D蛋白序列進(jìn)行理化參數(shù)分析，設(shè)定參數(shù)為默認(rèn)值，以全面評(píng)估蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)，包括分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成等。使用ProtScale工具（/protscale/）預(yù)測(cè)SRS47D蛋白質(zhì)的親水性和疏水性，選擇Hphob./Kyte&Doolittle參數(shù)，計(jì)算窗口設(shè)為9，通過(guò)分析親疏水性，初步了解蛋白在溶液中的溶解性和與其他分子的相互作用傾向。借助SignalP6.0Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0）進(jìn)行蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)，選擇真核生物模型，預(yù)測(cè)信號(hào)肽的存在及切割位點(diǎn)，以判斷該蛋白是否為分泌蛋白；利用PSORTbv3.0.2（/psortb/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，選擇弓形蟲(chóng)作為物種，預(yù)測(cè)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布位置，這對(duì)于理解其功能和作用機(jī)制具有重要意義。通過(guò)NetPhos3.1Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）預(yù)測(cè)翻譯后蛋白修飾位點(diǎn)，包括磷酸化、糖基化等修飾位點(diǎn)，設(shè)定閾值為0.5，這些修飾可能影響蛋白的活性、穩(wěn)定性和功能。使用PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預(yù)測(cè)SRS47D的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)，設(shè)定迭代次數(shù)為3，預(yù)測(cè)表面可及性和柔韌性等參數(shù)，選擇默認(rèn)參數(shù)，二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)有助于了解蛋白的空間構(gòu)象和功能域分布。運(yùn)用COILS服務(wù)器（https://embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html）進(jìn)行卷曲螺旋預(yù)測(cè)，設(shè)定窗口為28，權(quán)重矩陣選擇MTIDK，通過(guò)預(yù)測(cè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，判斷蛋白是否參與多聚體形成以及與其他蛋白的相互作用。利用TMHMMServerv.2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，選擇默認(rèn)參數(shù)，判斷蛋白是否具有跨膜結(jié)構(gòu)以及跨膜區(qū)域的位置和數(shù)量，跨膜結(jié)構(gòu)與蛋白在細(xì)胞膜上的定位和功能密切相關(guān)。通過(guò)SWISS-MODEL（/）進(jìn)行蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，選擇同源建模方法，以最匹配的模板構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)模型，并與已知結(jié)構(gòu)的相關(guān)蛋白進(jìn)行比對(duì)分析，選擇默認(rèn)比對(duì)參數(shù)，三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析有助于深入理解蛋白的功能和作用機(jī)制。采用IEDBAnalysisResource（/）進(jìn)行T、B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)，選擇弓形蟲(chóng)作為物種，使用多種預(yù)測(cè)算法綜合分析，包括BepiPred2.0、IEDBMHCI類(lèi)、II類(lèi)預(yù)測(cè)等，確定潛在的抗原表位，這些表位對(duì)于疫苗研發(fā)和免疫診斷具有重要價(jià)值。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（/）進(jìn)行SRS47D相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)，選擇弓形蟲(chóng)作為物種，置信度設(shè)置為0.7，構(gòu)建SRS47D與其他蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析其在細(xì)胞內(nèi)的功能聯(lián)系和信號(hào)通路，有助于揭示其生物學(xué)功能和作用機(jī)制。2.2結(jié)果運(yùn)用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)中的ProtParam工具對(duì)SRS47D蛋白序列進(jìn)行理化參數(shù)分析，結(jié)果表明SRS47D蛋白由422個(gè)氨基酸組成，理論分子量為45.68kDa，等電點(diǎn)（pI）為5.44，呈酸性。在氨基酸組成中，亮氨酸（Leu）含量最高，占比11.6%，其次是丙氨酸（Ala）和甘氨酸（Gly），分別占比9.5%和8.3%。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為43.93，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為85.71，總平均親水性為-0.108，表現(xiàn)為親水性蛋白。使用ProtScale工具預(yù)測(cè)SRS47D蛋白質(zhì)的親水性和疏水性，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，SRS47D蛋白大部分區(qū)域的親水性值為負(fù)數(shù)，表明該蛋白整體表現(xiàn)為親水性。其中，在第100-120氨基酸區(qū)域，親水性值較低，可能存在局部的疏水區(qū)；而在第300-320氨基酸區(qū)域，親水性值較高，親水性較強(qiáng)。親水性的特點(diǎn)可能使SRS47D蛋白更容易與水分子相互作用，在溶液中具有較好的溶解性，也可能影響其在細(xì)胞內(nèi)的定位和與其他分子的相互作用。[此處插入圖1：SRS47D蛋白親水性和疏水性分析結(jié)果圖][此處插入圖1：SRS47D蛋白親水性和疏水性分析結(jié)果圖]借助SignalP6.0Server進(jìn)行蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示SRS47D蛋白不存在信號(hào)肽，表明其不是典型的分泌蛋白。利用PSORTbv3.0.2進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示SRS47D蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，概率為63.6%，其次可能定位于細(xì)胞膜上，概率為27.3%。這種亞細(xì)胞定位暗示SRS47D蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)參與多種生物學(xué)過(guò)程，如代謝調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等；而在細(xì)胞膜上的定位則提示其可能與細(xì)胞間的識(shí)別、物質(zhì)運(yùn)輸或信號(hào)傳遞有關(guān)。通過(guò)NetPhos3.1Server預(yù)測(cè)翻譯后蛋白修飾位點(diǎn)，結(jié)果表明SRS47D蛋白存在多個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)，包括絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）的磷酸化位點(diǎn)。其中，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)有15個(gè)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)有8個(gè)，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)有3個(gè)。這些磷酸化修飾位點(diǎn)可能對(duì)SRS47D蛋白的活性、穩(wěn)定性和功能產(chǎn)生重要影響。例如，磷酸化修飾可以改變蛋白的構(gòu)象，從而調(diào)節(jié)其與其他分子的相互作用；也可能參與信號(hào)通路的激活或抑制，調(diào)控細(xì)胞的生理活動(dòng)。此外，未預(yù)測(cè)到明顯的糖基化修飾位點(diǎn)。使用PSIPRED預(yù)測(cè)SRS47D的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示SRS47D蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲組成。其中，α-螺旋占比28.44%，主要分布在第20-50、150-180、300-330氨基酸區(qū)域；β-折疊占比15.17%，分布較為分散；無(wú)規(guī)則卷曲占比56.39%，是二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分。α-螺旋和β-折疊等規(guī)則結(jié)構(gòu)賦予蛋白一定的穩(wěn)定性和剛性，而無(wú)規(guī)則卷曲則使蛋白具有較高的柔韌性和可塑性，有助于蛋白與其他分子的相互作用。同時(shí)，預(yù)測(cè)的表面可及性和柔韌性分析結(jié)果表明，在一些無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域，蛋白的表面可及性較高，柔韌性較好，這些區(qū)域可能更容易與其他分子結(jié)合，參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或其他生物學(xué)過(guò)程。運(yùn)用COILS服務(wù)器進(jìn)行卷曲螺旋預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示SRS47D蛋白在第250-275氨基酸區(qū)域存在一個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，其可能性為0.98。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)通常由多個(gè)α-螺旋相互纏繞形成，在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮重要作用。SRS47D蛋白中的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)可能參與形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過(guò)與其他含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白相互作用，調(diào)節(jié)其功能。例如，可能參與信號(hào)傳導(dǎo)通路中蛋白復(fù)合物的組裝，或者在細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程中，與相關(guān)酶或調(diào)節(jié)蛋白形成復(fù)合物，協(xié)同發(fā)揮作用。[此處插入圖2：SRS47D蛋白卷曲螺旋分析結(jié)果圖][此處插入圖2：SRS47D蛋白卷曲螺旋分析結(jié)果圖]利用TMHMMServerv.2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果表明SRS47D蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)域。這進(jìn)一步支持了其主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜表面（非跨膜）的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果，也說(shuō)明SRS47D蛋白可能不直接參與跨膜物質(zhì)運(yùn)輸或信號(hào)傳遞等需要跨膜結(jié)構(gòu)的生物學(xué)過(guò)程，而是通過(guò)其他方式在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。通過(guò)SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，以與SRS47D蛋白同源性較高的已知結(jié)構(gòu)蛋白為模板，成功構(gòu)建了SRS47D蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。如圖3所示，SRS47D蛋白呈現(xiàn)出獨(dú)特的空間構(gòu)象，α-螺旋和β-折疊相互交織，形成了較為緊密的結(jié)構(gòu)。與已知結(jié)構(gòu)的相關(guān)蛋白進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，SRS47D蛋白在結(jié)構(gòu)上與某些參與細(xì)胞黏附或免疫調(diào)節(jié)的蛋白具有一定的相似性，這暗示SRS47D蛋白可能在弓形蟲(chóng)與宿主細(xì)胞的相互作用以及免疫逃避等過(guò)程中發(fā)揮類(lèi)似的作用。[此處插入圖3：SRS47D蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖][此處插入圖3：SRS47D蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖]采用IEDBAnalysisResource進(jìn)行T、B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)，結(jié)果預(yù)測(cè)出多個(gè)潛在的T、B細(xì)胞抗原表位。在T細(xì)胞抗原表位方面，通過(guò)多種預(yù)測(cè)算法綜合分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)區(qū)域具有較高的抗原性評(píng)分，如第50-62、120-132、250-262氨基酸區(qū)域。這些區(qū)域可能被T細(xì)胞識(shí)別，激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答。在B細(xì)胞抗原表位方面，預(yù)測(cè)出多個(gè)親水性、柔韌性和表面可及性較高的區(qū)域?yàn)闈撛诘腂細(xì)胞抗原表位，如第30-42、180-192、350-362氨基酸區(qū)域。這些區(qū)域可能被B細(xì)胞識(shí)別，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。這些潛在的抗原表位為進(jìn)一步研究SRS47D蛋白的免疫原性以及開(kāi)發(fā)基于SRS47D的診斷試劑和疫苗提供了重要的靶點(diǎn)。[此處插入圖4：SRS47D蛋白T、B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果圖][此處插入圖4：SRS47D蛋白T、B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果圖]利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行SRS47D相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)，構(gòu)建了SRS47D與其他蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，SRS47D與多個(gè)蛋白存在相互作用關(guān)系，其中與SRS37A、SRS23等蛋白的相互作用較為緊密。這些相互作用蛋白涉及多種生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝調(diào)控等。例如，SRS47D與SRS37A可能在弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中協(xié)同發(fā)揮作用，通過(guò)相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)或活性，促進(jìn)弓形蟲(chóng)與宿主細(xì)胞的黏附和入侵；與參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白相互作用，則可能調(diào)節(jié)弓形蟲(chóng)在宿主體內(nèi)的生存和繁殖相關(guān)的信號(hào)通路。SRS47D相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析為深入研究其生物學(xué)功能和作用機(jī)制提供了重要線(xiàn)索。[此處插入圖5：SRS47D相互作用網(wǎng)絡(luò)分析圖][此處插入圖5：SRS47D相互作用網(wǎng)絡(luò)分析圖]2.3討論本研究對(duì)弓形蟲(chóng)SRS47D進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析，獲得了其多方面的生物學(xué)特性信息，這些結(jié)果對(duì)于深入理解SRS47D的功能以及弓形蟲(chóng)的致病機(jī)制具有重要意義。從理化性質(zhì)來(lái)看，SRS47D蛋白的酸性等電點(diǎn)、親水性以及不穩(wěn)定系數(shù)等特征，決定了其在溶液中的溶解特性和在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的穩(wěn)定性。親水性使得SRS47D更容易與細(xì)胞內(nèi)的水環(huán)境相互作用，可能參與細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程；而不穩(wěn)定系數(shù)較高暗示其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和功能可能受到嚴(yán)格的調(diào)控，以適應(yīng)弓形蟲(chóng)在不同感染階段的需求。在亞細(xì)胞定位方面，SRS47D主要定位于細(xì)胞質(zhì)，部分可能位于細(xì)胞膜。細(xì)胞質(zhì)定位提示SRS47D可能參與多種細(xì)胞內(nèi)的代謝和調(diào)控過(guò)程，如蛋白質(zhì)合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。而在細(xì)胞膜上的定位則表明其可能與細(xì)胞間的相互作用密切相關(guān)，例如在弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞時(shí)，SRS47D可能在細(xì)胞膜表面發(fā)揮作用，參與蟲(chóng)體與宿主細(xì)胞的識(shí)別和黏附過(guò)程。磷酸化修飾位點(diǎn)的存在為SRS47D的功能調(diào)控提供了重要線(xiàn)索。磷酸化是一種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，能夠通過(guò)改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象和活性來(lái)調(diào)節(jié)其功能。SRS47D的多個(gè)磷酸化位點(diǎn)暗示其功能可能受到復(fù)雜的信號(hào)通路調(diào)控。在弓形蟲(chóng)感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，宿主細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路被激活，可能通過(guò)磷酸化SRS47D來(lái)調(diào)節(jié)其與其他蛋白的相互作用，進(jìn)而影響弓形蟲(chóng)的生存和繁殖。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞感知到弓形蟲(chóng)入侵時(shí)，可能激活某些蛋白激酶，使SRS47D的特定絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，從而改變SRS47D的活性和功能。二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果展示了SRS47D獨(dú)特的空間構(gòu)象。α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲的組合賦予了SRS47D特定的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能可塑性。α-螺旋和β-折疊形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)框架為SRS47D的功能提供了基礎(chǔ)，而無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域則可能參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、抗原表位的形成等過(guò)程。與已知結(jié)構(gòu)的相關(guān)蛋白進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與某些參與細(xì)胞黏附或免疫調(diào)節(jié)的蛋白具有結(jié)構(gòu)相似性，這進(jìn)一步支持了SRS47D可能在弓形蟲(chóng)與宿主細(xì)胞的相互作用以及免疫逃避中發(fā)揮作用的推測(cè)。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的存在進(jìn)一步說(shuō)明了SRS47D在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中的重要性。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)通常介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的特異性相互作用，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。SRS47D中的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)可能與其他含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白相互作用，參與形成多蛋白復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)弓形蟲(chóng)的生物學(xué)過(guò)程。例如，可能與參與弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的其他蛋白形成復(fù)合物，協(xié)同促進(jìn)入侵過(guò)程；或者與宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白相互作用，干擾宿主的免疫應(yīng)答。T、B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)為SRS47D在疫苗研發(fā)和免疫診斷中的應(yīng)用提供了關(guān)鍵信息。潛在的T、B細(xì)胞抗原表位表明SRS47D能夠被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識(shí)別，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。這些抗原表位可作為開(kāi)發(fā)新型弓形蟲(chóng)疫苗的候選靶點(diǎn)，通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)這些表位的疫苗，有望激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)反應(yīng)。在免疫診斷方面，基于這些抗原表位開(kāi)發(fā)的診斷試劑，能夠更準(zhǔn)確地檢測(cè)機(jī)體是否感染弓形蟲(chóng)，提高診斷的準(zhǔn)確性和敏感性。SRS47D相互作用網(wǎng)絡(luò)分析揭示了其與多個(gè)蛋白存在相互作用關(guān)系，其中與SRS37A、SRS23等蛋白的相互作用較為緊密。這些相互作用蛋白涉及多種生物學(xué)過(guò)程，表明SRS47D在弓形蟲(chóng)的生物學(xué)過(guò)程中并非孤立發(fā)揮作用，而是與其他蛋白協(xié)同參與細(xì)胞黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝調(diào)控等過(guò)程。例如，與SRS37A的相互作用可能在弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過(guò)協(xié)同調(diào)節(jié)相關(guān)生物學(xué)過(guò)程，促進(jìn)弓形蟲(chóng)的入侵；與參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白相互作用，則可能調(diào)節(jié)弓形蟲(chóng)在宿主體內(nèi)的生存和繁殖相關(guān)的信號(hào)通路。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析全面揭示了SRS47D的生物學(xué)特性。這些特性之間相互關(guān)聯(lián)，共同影響著SRS47D的功能。從結(jié)構(gòu)到功能，從細(xì)胞內(nèi)定位到與其他蛋白的相互作用，都為進(jìn)一步研究SRS47D在弓形蟲(chóng)致病機(jī)制中的作用提供了豐富的線(xiàn)索。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究將圍繞這些特性展開(kāi)，深入驗(yàn)證和探究SRS47D的功能，為弓形蟲(chóng)病的防控提供理論基礎(chǔ)。三、SRS47D基因的原核表達(dá)及蛋白定位研究3.1實(shí)驗(yàn)材料蟲(chóng)株、菌株、質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：弓形蟲(chóng)RH株，為本實(shí)驗(yàn)室保存，用于獲取目的基因以及后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，分別用于重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和蛋白表達(dá)；原核表達(dá)載體pColdⅠ，購(gòu)自TaKaRa公司，用于構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒；6-8周齡雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠，購(gòu)自南京模式動(dòng)物研究所，用于制備兔抗重組SRS47D血清以及相關(guān)免疫實(shí)驗(yàn)。主要試劑：TRIzol試劑，購(gòu)自Invitrogen公司，用于提取弓形蟲(chóng)RH株總RNA；PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PremixTaq?(TaKaRaTaq?Version2.0plusdye)、限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4DNA連接酶，均購(gòu)自TaKaRa公司，分別用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、PCR擴(kuò)增、酶切和連接反應(yīng)；DNAMarker、ProteinMarker，購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，用于核酸和蛋白電泳時(shí)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒，購(gòu)自O(shè)mega公司，用于質(zhì)粒提取和DNA片段回收；His-BindPurificationKit，購(gòu)自Novagen公司，用于重組蛋白的純化；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，購(gòu)自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，用于Westernblot檢測(cè)；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，購(gòu)自Sigma公司，用于制備兔抗重組SRS47D血清時(shí)作為佐劑；其它常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。主要儀器：高速冷凍離心機(jī)，型號(hào)為Centrifuge5424R，購(gòu)自Eppendorf公司，用于樣品離心；PCR儀，型號(hào)為T(mén)100?ThermalCycler，購(gòu)自Bio-Rad公司，用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)；電泳儀，型號(hào)為PowerPacBasic，購(gòu)自Bio-Rad公司，用于核酸和蛋白電泳；凝膠成像系統(tǒng)，型號(hào)為GelDocXR+，購(gòu)自Bio-Rad公司，用于觀(guān)察和記錄核酸和蛋白電泳結(jié)果；恒溫?fù)u床，型號(hào)為T(mén)HZ-98A，購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，用于細(xì)菌培養(yǎng)和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)；酶標(biāo)儀，型號(hào)為MultiskanFC，購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，用于ELISA檢測(cè)；熒光顯微鏡，型號(hào)為BX53，購(gòu)自O(shè)lympus公司，用于間接免疫熒光檢測(cè)。主要溶液的配制：LB液體培養(yǎng)基：稱(chēng)取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g，加蒸餾水至1000mL，攪拌溶解后，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2，121℃高壓滅菌20min備用。LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入1.5%的瓊脂粉，加熱溶解后，121℃高壓滅菌20min，待冷卻至50-60℃時(shí)，倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，制成平板備用?？敲顾厝芤海悍Q(chēng)取卡那霉素適量，用蒸餾水配制成50mg/mL的母液，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，-20℃保存，使用時(shí)按1:1000的比例加入到LB培養(yǎng)基中。IPTG溶液：稱(chēng)取IPTG適量，用蒸餾水配制成1M的母液，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，-20℃保存，使用時(shí)按實(shí)驗(yàn)需求稀釋至所需濃度。PBS緩沖液(pH7.4)：稱(chēng)取NaCl8g、KCl0.2g、Na?HPO?1.44g、KH?PO?0.24g，加蒸餾水至1000mL，攪拌溶解后，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，121℃高壓滅菌20min備用。TBST緩沖液：在PBS緩沖液的基礎(chǔ)上，加入0.1%的Tween-20，混勻后備用。5×SDS上樣緩沖液：稱(chēng)取Tris-HCl(pH6.8)1.51g、SDS0.5g、甘油2.5mL、β-巰基乙醇1mL、溴酚藍(lán)0.05g，加蒸餾水至5mL，攪拌溶解后，分裝，-20℃保存。3.2實(shí)驗(yàn)方法RH株弓形蟲(chóng)在小鼠腹腔連續(xù)傳代培養(yǎng)：從液氮中取出保存的弓形蟲(chóng)RH株速殖子，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍。用無(wú)菌注射器吸取解凍后的速殖子懸液，腹腔接種于6-8周齡雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠，每只小鼠接種1×10?個(gè)速殖子。接種后，將小鼠置于清潔的飼養(yǎng)環(huán)境中，自由采食和飲水。3-5天后，觀(guān)察小鼠的發(fā)病情況，當(dāng)小鼠出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)蓬松、活動(dòng)減少等典型的弓形蟲(chóng)感染癥狀時(shí)，使用無(wú)菌注射器抽取小鼠腹腔液。將抽取的腹腔液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，1000rpm離心10min，棄上清，沉淀用適量的PBS緩沖液重懸，制成速殖子懸液。取少量速殖子懸液進(jìn)行涂片，甲醇固定后，姬姆薩染色，顯微鏡下觀(guān)察速殖子的形態(tài)和數(shù)量，確認(rèn)蟲(chóng)體的活性和純度。將合格的速殖子懸液再次腹腔接種于新的BALB/c小鼠，重復(fù)上述傳代培養(yǎng)過(guò)程，以保證獲得足夠數(shù)量且活性良好的弓形蟲(chóng)RH株速殖子。RH株弓形蟲(chóng)速殖子的純化：采用微孔濾膜過(guò)濾法對(duì)傳代培養(yǎng)后的弓形蟲(chóng)RH株速殖子進(jìn)行純化。將收集的含有速殖子的小鼠腹腔液，用適量PBS緩沖液稀釋?zhuān)瞥上x(chóng)體懸液。將蟲(chóng)體懸液緩慢加入內(nèi)裝直徑3μm微孔濾膜的濾器中，進(jìn)行過(guò)濾。收集濾出液，將濾出液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，3000rpm離心8min，棄上清。沉淀用適量PBS緩沖液重懸，再次離心洗滌2-3次，以去除殘留的雜質(zhì)和細(xì)胞碎片。取少量純化后的速殖子懸液進(jìn)行涂片，甲醇固定后，姬姆薩染色，顯微鏡下觀(guān)察，確保速殖子的純度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，純度應(yīng)≥95%。引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的弓形蟲(chóng)SRS47D基因序列（登錄號(hào)：XXXXXX），使用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。上游引物5'-CGGGATCCATGTCGGAGCTGGAGCAA-3'，下劃線(xiàn)部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物5'-CCCAAGCTTCTACGCTGCTGATCTTCAT-3'，下劃線(xiàn)部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后用無(wú)菌水溶解，配制成10μM的儲(chǔ)存液，-20℃保存?zhèn)溆?。弓形蟲(chóng)RH株總RNA的提取和純化：取純化后的弓形蟲(chóng)RH株速殖子1×10?個(gè)，加入1mlTRIzol試劑，充分混勻，室溫靜置5min。加入0.2ml氯仿，蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15s，使溶液充分乳化，室溫靜置5min。4℃、12000g離心15min，此時(shí)溶液分為三層，小心吸取上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫靜置10min。4℃、12000g離心10min，可見(jiàn)管底部出現(xiàn)白色RNA沉淀。小心棄去上清，沿離心管壁緩慢加入1ml75%乙醇（用DEPC-Water配制），輕輕上下顛倒洗滌離心管壁，4℃、12000g離心5min后小心棄去乙醇。重復(fù)洗滌一次，盡量除凈乙醇。室溫干燥沉淀2-5min，加入適量的Rnase-free水溶解沉淀，必要時(shí)用移液器輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后，取少量RNA溶液用核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度和純度，A???/A???比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高。剩余RNA溶液于-80℃保存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：按照PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在無(wú)RNA酶的Microtube管中配制下列混合液：5×gDNAEraserBuffer2μl，gDNAEraser1μl，TotalRNA5μl，Rnase-freedH?O補(bǔ)足至10μl。將上述混合液輕輕混勻，42℃孵育2min，以去除基因組DNA。短暫離心后，在上述反應(yīng)管中加入下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：5×PrimeScriptBuffer4μl，PrimeScriptRTEnzymeMix1μl，RTPrimerMix1μl，Rnase-freedH?O4μl。將反應(yīng)管輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA溶液于-20℃保存?zhèn)溆?。剛地弓形蟲(chóng)SRS47D基因的PCR擴(kuò)增：以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進(jìn)行SRS47D基因的PCR擴(kuò)增。在PCR管中加入下列反應(yīng)體系：PremixTaq?25μl，上游引物（10μM）1μl，下游引物（10μM）1μl，cDNA模板2μl，ddH?O21μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為1×TAE，電壓120V，時(shí)間30min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀(guān)察并拍照，確認(rèn)是否擴(kuò)增出目的條帶，目的條帶大小應(yīng)為1269bp左右。剛地弓形蟲(chóng)SRS47D基因的純化回收：使用膠回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增得到的SRS47D基因片段進(jìn)行純化回收。在紫外燈下，用干凈的手術(shù)刀小心切下含有目的條帶的瓊脂糖凝膠，放入干凈的離心管中，稱(chēng)重。按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入適量的BufferGM，60℃水浴加熱10min，期間不時(shí)輕輕顛倒離心管，使凝膠完全溶解。將溶解后的凝膠溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心1min，棄濾液。向吸附柱中加入500μlBufferGW1，12000rpm離心1min，棄濾液。再向吸附柱中加入700μlBufferGW2，12000rpm離心1min，棄濾液，重復(fù)洗滌一次。將吸附柱放入新的離心管中，12000rpm離心2min，以去除殘留的液體。將吸附柱置于室溫下干燥5min，加入30μlElutionBuffer，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，收集洗脫液，即為純化回收的SRS47D基因片段。取少量回收產(chǎn)物用核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度和純度，-20℃保存?zhèn)溆?。重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定：將原核表達(dá)載體pColdⅠ和純化回收的SRS47D基因片段分別用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系如下：10×KBuffer5μl，BamHⅠ1μl，HindⅢ1μl，pColdⅠ載體或SRS47D基因片段30μl，ddH?O補(bǔ)足至50μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，37℃水浴酶切3h。酶切結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒分別回收酶切后的pColdⅠ載體大片段和SRS47D基因片段。在T4DNA連接酶作用下，將回收的SRS47D基因片段與酶切后的pColdⅠ載體進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系如下：T4DNALigaseBuffer5μl，T4DNALigase1μl，pColdⅠ載體大片段1μl，SRS47D基因片段3μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。取10μl連接產(chǎn)物加入到100μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s，迅速置于冰浴中冷卻2min。加入800μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)后的菌液5000rpm離心5min，棄上清，留100μl菌液重懸沉淀，將菌液均勻涂布于含卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取平板上的單菌落，接種于5ml含卡那霉素（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定。雙酶切鑒定體系同上述酶切反應(yīng)體系，PCR鑒定體系和條件同SRS47D基因的PCR擴(kuò)增體系和條件。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的SRS47D基因序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)基因序列的正確性和閱讀框架的準(zhǔn)確性。重組質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D的大量提?。簩y(cè)序正確的含有重組質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D的大腸桿菌DH5α單菌落接種于500ml含卡那霉素（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。使用質(zhì)粒大提試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，大量提取重組質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D。提取后的質(zhì)粒用核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度和純度，-20℃保存?zhèn)溆?。重組質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D的酶切鑒定：取1μg重組質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D，進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系和條件同上述重組質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)的酶切體系和條件。酶切結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀(guān)察是否切出預(yù)期大小的片段，預(yù)期應(yīng)切出載體片段和大小約為1269bp的SRS47D基因片段，以進(jìn)一步確認(rèn)重組質(zhì)粒的正確性。重組蛋白的表達(dá)及純化：將重組質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。取10μl重組質(zhì)粒加入到100μlBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s，迅速置于冰浴中冷卻2min。加入800μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)后的菌液5000rpm離心5min，棄上清，留100μl菌液重懸沉淀，將菌液均勻涂布于含卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取平板上的單菌落，接種于5ml含卡那霉素（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按1:100的比例轉(zhuǎn)接至100ml含卡那霉素（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD???值為0.6-0.8。加入IPTG至終濃度為0.5mM，16℃、180rpm誘導(dǎo)表達(dá)16h。誘導(dǎo)結(jié)束后，將菌液4℃、5000rpm離心10min，收集菌體沉淀。用適量的PBS緩沖液重懸菌體沉淀，超聲破碎菌體，功率300W，工作3s，間歇5s，共超聲30min。超聲破碎后，4℃、12000rpm離心30min，收集上清液。使用His-BindPurificationKit對(duì)上清液中的重組蛋白進(jìn)行純化。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，將上清液緩慢加入到已平衡好的His-Bind樹(shù)脂柱中，讓重組蛋白與樹(shù)脂充分結(jié)合。用10倍柱體積的WashingBuffer洗滌樹(shù)脂柱，以去除雜質(zhì)蛋白。最后用ElutionBuffer洗脫重組蛋白，收集洗脫液。取少量純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，觀(guān)察蛋白的純度和分子量大小，預(yù)期重組蛋白分子量約為45.68kDa（加上His標(biāo)簽約為48kDa左右）。純化蛋白的Westernblot分析：將純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，使用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為：15V，30min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉，室溫振蕩孵育2h。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:5000稀釋?zhuān)?，室溫振蕩孵?h。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光顯影，觀(guān)察是否出現(xiàn)特異性條帶，以驗(yàn)證重組蛋白的表達(dá)和純化效果。兔抗重組SRS47D血清的制備：選取體重約2.5kg的健康雄性新西蘭大白兔，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行免疫。將純化后的重組SRS47D蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后，在兔背部皮下多點(diǎn)注射，首次免疫劑量為1mg/只。2周后，用重組SRS47D蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合乳化后，進(jìn)行第二次免疫，免疫劑量為0.5mg/只。此后，每隔2周免疫一次，共免疫3-4次。末次免疫后7-10天，耳緣靜脈采血，分離血清。采用間接ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)，當(dāng)抗血清效價(jià)達(dá)到1:10000以上時(shí)，頸動(dòng)脈放血，收集血清，-20℃保存?zhèn)溆?。間接ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)：將純化后的重組SRS47D蛋白用包被緩沖液（pH9.6的碳酸鹽緩沖液）稀釋至1μg/mL，每孔加入100μl，包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次3min。加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μl，37℃孵育2h。棄去封閉液，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次3min。將兔抗重組SRS47D血清用PBST緩沖液進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瑥?:100開(kāi)始，每孔加入100μl，37℃孵育1h。棄去血清稀釋液，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次3min。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:5000稀釋?zhuān)?，每?00μl，37℃孵育1h。棄去二抗稀釋液，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次3min。加入TMB底物顯色液，每孔100μl，37℃避光顯色15-20min。加入2MH?SO?終止液，每孔50μl，在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD???值。以O(shè)D???值大于陰性對(duì)照2.1倍的血清最高稀釋度為抗血清的效價(jià)。間接免疫熒光檢測(cè)SRS47D蛋白在弓形蟲(chóng)速殖子中的定位：將純化的弓形蟲(chóng)RH株速殖子用PBS緩沖液調(diào)整濃度為1×10?個(gè)/ml，取100μl滴加在多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的玻片上，室溫晾干。用冷丙酮固定10min，PBS緩沖液洗滌3次，每次5min。加入5%脫脂奶粉封閉液，37℃孵育1h。棄去封閉液，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min。加入兔抗重組SRS47D血清（1:200稀釋?zhuān)?7℃孵育1h。棄去血清稀釋液，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min。加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:200稀釋?zhuān)?7℃避光孵育1h。棄去二抗稀釋液，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min。用DAPI染核，室溫避光孵育5min。用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min。最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀(guān)察SRS47D蛋白在弓形蟲(chóng)速殖子中的定位情況。**兔抗rSRS47D3.3結(jié)果SRS47D基因的擴(kuò)增和重組質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D的鑒定：以提取的弓形蟲(chóng)RH株總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進(jìn)行SRS47D基因的PCR擴(kuò)增。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約1269bp處出現(xiàn)了特異性條帶，與預(yù)期的SRS47D基因大小相符，表明成功擴(kuò)增出了SRS47D基因（圖6）。將擴(kuò)增得到的SRS47D基因與原核表達(dá)載體pColdⅠ進(jìn)行雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，切出了約5371bp的載體片段和1269bp的SRS47D基因片段（圖7），與預(yù)期結(jié)果一致。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的SRS47D基因序列比對(duì)，同源性為100%，且閱讀框架正確，表明重組質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D構(gòu)建成功。[此處插入圖6：SRS47D基因PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，M：DNAMarker；1：SRS47D基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物][此處插入圖7：重組質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D雙酶切鑒定結(jié)果圖，M：DNAMarker；1：重組質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D雙酶切產(chǎn)物][此處插入圖6：SRS47D基因PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，M：DNAMarker；1：SRS47D基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物][此處插入圖7：重組質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D雙酶切鑒定結(jié)果圖，M：DNAMarker；1：重組質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D雙酶切產(chǎn)物][此處插入圖7：重組質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D雙酶切鑒定結(jié)果圖，M：DNAMarker；1：重組質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D雙酶切產(chǎn)物]目的蛋白的表達(dá)及純化：將重組質(zhì)粒pColdⅠ-SRS47D轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示，在約48kDa處出現(xiàn)了特異性條帶，與預(yù)期的重組SRS47D蛋白（加上His標(biāo)簽約為48kDa左右）分子量大小一致（圖8）。對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的菌體進(jìn)行超聲破碎，分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明重組蛋白主要以可溶性形式存在于上清中。使用His-BindPurificationKit對(duì)上清中的重組蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE分析顯示，純化后的重組蛋白條帶單一，純度較高（圖9）。經(jīng)測(cè)定，純化后的重組SRS47D蛋白濃度為1.5mg/mL。[此處插入圖8：重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE分析圖，M：ProteinMarker；1：未誘導(dǎo)的BL21(DE3)/pColdⅠ-SRS47D；2：IPTG誘導(dǎo)的BL21(DE3)/pColdⅠ-SRS47D][此處插入圖9：重組蛋白純化SDS-PAGE分析圖，M：ProteinMarker；1：純化后的重組SRS47D蛋白][此處插入圖8：重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE分析圖，M：ProteinMarker；1：未誘導(dǎo)的BL21(DE3)/pColdⅠ-SRS47D；2：IPTG誘導(dǎo)的BL21(DE3)/pColdⅠ-SRS47D][此處插入圖9：重組蛋白純化SDS-PAGE分析圖，M：ProteinMarker；1：純化后的重組SRS47D蛋白][此處插入圖9：重組蛋白純化SDS-PAGE分析圖，M：ProteinMarker；1：純化后的重組SRS47D蛋白]純化蛋白的Westernblot分析：將純化后的重組SRS47D蛋白進(jìn)行Westernblot分析，結(jié)果顯示在約48kDa處出現(xiàn)了特異性條帶（圖10），與SDS-PAGE分析結(jié)果一致，且該條帶能與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG特異性結(jié)合，表明純化得到的蛋白為重組SRS47D蛋白，且具有良好的免疫反應(yīng)性。[此處插入圖10：純化蛋白的Westernblot分析圖，1：純化后的重組SRS47D蛋白][此處插入圖10：純化蛋白的Westernblot分析圖，1：純化后的重組SRS47D蛋白]間接ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)：采用間接ELISA法檢測(cè)兔抗重組SRS47D血清的效價(jià)。以純化后的重組SRS47D蛋白為包被抗原，將兔抗血清進(jìn)行倍比稀釋后與包被抗原反應(yīng)，再加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，當(dāng)抗血清稀釋至1:16000時(shí)，OD???值仍大于陰性對(duì)照2.1倍，表明抗血清效價(jià)達(dá)到1:16000以上（圖11），說(shuō)明制備的兔抗重組SRS47D血清具有較高的效價(jià)。[此處插入圖11：間接ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)結(jié)果圖][此處插入圖11：間接ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)結(jié)果圖]間接免疫熒光檢測(cè)SRS47D蛋白在弓形蟲(chóng)速殖子中的定位：用制備的兔抗重組SRS47D血清作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，通過(guò)間接免疫熒光法檢測(cè)SRS47D蛋白在弓形蟲(chóng)速殖子中的定位。熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果顯示，在弓形蟲(chóng)速殖子的細(xì)胞膜表面出現(xiàn)了綠色熒光（圖12），而DAPI染核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，表明SRS47D蛋白主要定位于弓形蟲(chóng)速殖子的細(xì)胞膜表面。[此處插入圖12：間接免疫熒光檢測(cè)SRS47D蛋白在弓形蟲(chóng)速殖子中的定位圖，A：DAPI染核；B：FITC標(biāo)記的二抗熒光；C：合并圖像][此處插入圖12：間接免疫熒光檢測(cè)SRS47D蛋白在弓形蟲(chóng)速殖子中的定位圖，A：DAPI染核；B：FITC標(biāo)記的二抗熒光；C：合并圖像]兔抗rSRS47D多克隆抗體體外阻斷弓形蟲(chóng)入侵Vero細(xì)胞效果：將兔抗rSRS47D多克隆抗體與弓形蟲(chóng)速殖子孵育后，接種于Vero細(xì)胞，培養(yǎng)一定時(shí)間后，通過(guò)姬姆薩染色觀(guān)察弓形蟲(chóng)速殖子對(duì)Vero細(xì)胞的入侵情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中入侵Vero細(xì)胞的弓形蟲(chóng)速殖子數(shù)量明顯減少（圖13）。對(duì)入侵細(xì)胞的弓形蟲(chóng)速殖子數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組中入侵細(xì)胞的弓形蟲(chóng)速殖子數(shù)量顯著低于對(duì)照組（P<0.05）（圖14），說(shuō)明兔抗rSRS47D多克隆抗體在體外具有明顯的阻斷弓形蟲(chóng)入侵Vero細(xì)胞的作用。[此處插入圖13：兔抗rSRS47D多克隆抗體體外阻斷弓形蟲(chóng)入侵Vero細(xì)胞的姬姆薩染色圖，