ICS65.020.30CCSB441509DB1509/T0001—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由烏蘭察布市農(nóng)牧局提提出。本文件由烏蘭察布市農(nóng)牧局提歸口。本文件起草單位：烏蘭察布市畜牧工作站、內(nèi)蒙古大學(xué)、蒙天然牧業(yè)科技發(fā)展有限公司、烏蘭察布市市場監(jiān)督管理局、內(nèi)蒙古豐東知盈牧業(yè)科技有限公司、察右中旗市場監(jiān)督管理局。本文件主要起草人：張立果、張立、王申元、蘇小虎、魏潤元、李光鵬、寇慧娟、朱怡靜、鄭重、劉建寧、于濤、劉權(quán)、蘇廣華、楊磊、薩仁格勒、楊柳、閆鑫鵬、侯仕農(nóng)、王景龍、郝佳惠、劉信、賈俊欣、米布農(nóng)、鄭少華、張莉、竇英杰、趙躍芳。I1本文件規(guī)定了奶綿羊冷凍精液生產(chǎn)的基本要求、精液處理、精液冷凍、標(biāo)志、包裝僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本GB4789.2食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定GB/T5458液氮生物容器經(jīng)特殊方法處理超低溫冷凍后在液氮中(-196℃)保存的精液。2適量40℃~45℃的水。吹氣使其外口呈三角形，假陰道上端均勻涂抹凡士林。時，利用假陰道迅速采集精液并將其置于38℃水浴鍋中，記錄采精量。a)色澤呈乳白色或淺黃色，肉眼可見云霧狀運動；b)精子活力≥65%;燒杯、量筒、磁力攪拌器、天平。所有化學(xué)試劑(化學(xué)純以上):Tris、檸檬酸、果糖、M199、大豆卵磷脂、青霉素、鏈霉素、甘B液：取A液90mL,甘油10mL。36.2.1將稀釋液在38℃水浴鍋中預(yù)熱30min,通過測定鮮精密度和采精量，計算出稀釋后總體積；6.2.2選用合適容積的器皿用A液先對其進(jìn)行1:1(鮮精：A液)稀釋；靜置10min后1:4稀釋(鮮精：A液);靜置10min后1:8(鮮精：A液)稀釋，靜置10min;6.2.3加A液至總體積的一半；6.2.5將其放置4℃冰箱中平衡2h后加稀釋液B液至總體積，置于4℃冰箱中平衡1h。7.2.1按照程控冷凍儀的操作步驟對精液進(jìn)行冷凍。冷凍程序為：4℃~-10℃(降溫速率5℃/min);-10℃~-100℃(降溫速率60℃/min);-100℃~-140℃(降溫速率20℃/min)。7.2.2精液冷凍前30min,將液氮閥和排氣閥打開以平衡液氮罐和冷凍箱內(nèi)的壓力，待冷凍箱內(nèi)溫度降至4℃時，維持30s;7.2.3打開冷凍箱蓋，將放有細(xì)管精液的托7.2.4當(dāng)溫度下降至-140℃時冷凍結(jié)束，保持30s后取出分裝。貯存凍精的低溫容器應(yīng)符合GB/T5458的要求；及時補充液氮，每年補充液氮；取放凍精時，凍精離開水浴鍋38℃~40℃預(yù)熱30min以上，待水浴鍋溫度穩(wěn)定后，迅速從貯存罐中取出預(yù)留凍精，在空氣中放置15s～20s,然后放入38℃~40℃水浴鍋中15s～20s并輕輕搖晃；取出細(xì)管用無菌吸水紙擦DB1509/T0001—20239凍精質(zhì)量檢測細(xì)管外觀細(xì)管無裂痕，兩端封口嚴(yán)密，標(biāo)識清晰。凍精解凍后的要求9.2.1活力≥35%，應(yīng)符合GB20557的要求。9.2.2精子畸形率≤25%，應(yīng)符合GB20557的要求。9.2.3細(xì)菌數(shù)≤800個/0.25mL，檢測方法見GB4789.29.2.4頂體完整性≥45%，檢測方法見附錄A。9.2.5質(zhì)膜完整性≥35%，檢測方法見附錄B。4DB1509/T0001—2023（資料性）奶綿羊冷凍精液精子頂體完整性檢測方法A.1器材、試劑熒光顯微鏡、烘片機、多聚賴氨酸粘附性的載玻片、PBS、4%多聚甲醛、FITC-PSA、DAPI、甘油。A.2操作步驟A.2.1凍精準(zhǔn)備解凍3管冷精于1.5mL離心管中，加入1mL洗精液并混勻；1500rpm離心5min，棄上清，留約20A.2.2固定加入適量的PBS重懸精子沉淀，并向其中加入4%多聚甲醛對精子進(jìn)行固定，固定約30min。A.2.3洗滌向精液中加入PBS1mL，1500rpm離心5min洗滌2次以除去精漿，多聚甲醛等，洗滌后加入1mLPBS重懸精子沉淀。A.2.4涂片染色取10μL精液均勻涂于多聚賴氨酸粘附性的載玻片上，并將其放于烘片機上干燥；加10μLFITC-PSA對精子進(jìn)行避光染色15min；用超純水緩慢洗滌玻片并干燥；加5μLDAPI染色液避光染色5min。A.2.5洗滌干燥用超純水緩慢洗滌玻片，放烘片機上干燥，并用PBS與甘油的混合物封片。A.2.6鏡檢熒光顯微鏡下觀察，共計數(shù)至少200個精子來統(tǒng)計凍后精子頂體完整性，若精子頭部均染成明亮的綠色熒光且均勻即頂體完整（AI）；已發(fā)生頂體反應(yīng)（AR）的精子僅在赤道帶出現(xiàn)熒光染色，或者頭部無綠色熒光。A.2.7計算所檢凍精的頂體完整率按照公式A.1計算：C=C1/S×100%................................（A.1）式中：C——頂體完整率，%；C1——頂體完整，單位為個；S——總精子數(shù)，單位為個。5DB1509/T0001—2023（資料性）奶綿羊冷凍精液質(zhì)膜完整性檢測方法B.1器材、試劑熒光顯微鏡、恒溫水浴鍋、洗精液、低滲溶液、PBS。B.2操作步驟B.2.1凍精準(zhǔn)備B.2.2低滲溶液處理吸取200μL精液加到1mL低滲溶液中。放入恒溫水浴鍋里38℃,30min。B.2.3封片取10μL精液滴到載玻片上并蓋上蓋玻片。B.2.4鏡檢自