協(xié)同增效：DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)探究一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下，已然成為沉重的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。在我國，肝癌的形勢尤為嚴(yán)峻，由于人口基數(shù)龐大以及乙肝病毒感染率較高等因素，肝癌的發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)在世界范圍內(nèi)均占據(jù)相當(dāng)大的比重。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國每年新增肝癌病例數(shù)眾多，且大部分患者在確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)失了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)。肝癌惡性程度極高，病情進(jìn)展迅速，患者不僅要承受巨大的生理痛苦，還面臨著高昂的醫(yī)療費(fèi)用和沉重的心理壓力，給家庭和社會(huì)帶來了難以估量的損失。目前，肝癌的治療手段主要包括手術(shù)切除、肝移植、介入治療、化療、放療以及靶向治療和免疫治療等。然而，每種治療方法都存在一定的局限性。手術(shù)切除雖然是早期肝癌的首選治療方法，但對于中晚期肝癌患者，由于腫瘤的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散以及患者肝功能儲(chǔ)備不足等原因，僅有少數(shù)患者能夠滿足手術(shù)條件，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。肝移植受供體短缺、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高、術(shù)后免疫排斥反應(yīng)等因素的制約，難以廣泛開展。介入治療對于一些無法手術(shù)切除的肝癌患者具有一定療效，但也存在局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)?；熀头暖熡捎谌狈μ禺愋裕跉[瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對正常組織和細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)諸多不良反應(yīng)，生活質(zhì)量急劇下降。靶向治療藥物如索拉菲尼，雖然能夠在一定程度上延長肝癌患者的生存期，但部分患者會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，且治療效果存在個(gè)體差異。免疫治療作為新興的治療手段，雖然展現(xiàn)出了一定的潛力，但也面臨著有效率不高、免疫相關(guān)不良反應(yīng)等問題。鑒于單一治療方法的局限性，聯(lián)合治療成為提高肝癌治療效果的重要策略。DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞治療作為一種免疫治療方法，通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來殺傷腫瘤細(xì)胞，具有特異性強(qiáng)、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。索拉菲尼作為一種多靶點(diǎn)的靶向治療藥物，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成。將DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼應(yīng)用于肝癌治療，有望發(fā)揮兩者的協(xié)同作用，提高對肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，克服單一治療的局限性，為肝癌患者提供更有效的治療方案。這不僅有助于延長患者的生存期，提高患者的生活質(zhì)量，還能為肝癌的臨床治療提供新的思路和方法，完善肝癌的綜合治療策略，具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在肝癌治療領(lǐng)域，DC-CIK細(xì)胞治療和索拉菲尼單藥治療都有著各自的研究進(jìn)展，而兩者聯(lián)合治療的研究也逐漸成為熱點(diǎn)，為肝癌治療帶來了新的思路和方向。1.2.1DC-CIK細(xì)胞治療肝癌的研究DC-CIK細(xì)胞治療是一種新興的腫瘤免疫治療方法，在國內(nèi)外都受到了廣泛關(guān)注。DC細(xì)胞作為體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞，能夠攝取、加工和呈遞抗原，激活初始T細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。CIK細(xì)胞則是一群異質(zhì)細(xì)胞，具有多種細(xì)胞毒活性，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)分泌多種細(xì)胞因子，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。當(dāng)DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，兩者可以相互作用，協(xié)同增強(qiáng)免疫活性。國外研究中，部分學(xué)者深入探究了DC-CIK細(xì)胞的作用機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)DC細(xì)胞能夠?qū)⒛[瘤抗原信息傳遞給CIK細(xì)胞，使其更精準(zhǔn)地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。在一些臨床試驗(yàn)中，將DC-CIK細(xì)胞應(yīng)用于肝癌患者的治療，結(jié)果顯示部分患者的腫瘤得到了有效控制，生存期有所延長，且患者的生活質(zhì)量也有一定程度的改善。然而，這些研究也指出，DC-CIK細(xì)胞治療的效果存在個(gè)體差異，部分患者對治療的反應(yīng)并不理想，可能與患者自身的免疫系統(tǒng)狀態(tài)、腫瘤的異質(zhì)性等因素有關(guān)。國內(nèi)對于DC-CIK細(xì)胞治療肝癌的研究也取得了不少成果。多項(xiàng)臨床研究表明，DC-CIK細(xì)胞治療可以提高肝癌患者的免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。一些研究通過檢測患者治療前后外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的變化，發(fā)現(xiàn)DC-CIK細(xì)胞治療后，患者體內(nèi)CD3+、CD4+、CD8+等免疫細(xì)胞的比例明顯升高，提示機(jī)體的免疫功能得到了增強(qiáng)。此外，DC-CIK細(xì)胞治療還可以與其他治療方法如手術(shù)、化療、放療等聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn)一步提高治療效果。例如，在肝癌患者手術(shù)后給予DC-CIK細(xì)胞治療，可以降低腫瘤的復(fù)發(fā)率，延長患者的生存期。但同樣，國內(nèi)研究也面臨著一些挑戰(zhàn)，如如何優(yōu)化DC-CIK細(xì)胞的制備工藝，提高細(xì)胞的活性和純度；如何進(jìn)一步提高治療的有效性和安全性，減少不良反應(yīng)的發(fā)生等。1.2.2索拉菲尼治療肝癌的研究索拉菲尼作為一種多靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑，自應(yīng)用于肝癌治療以來，在國內(nèi)外都開展了大量的研究。其作用機(jī)制主要是通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。索拉菲尼能夠抑制RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖信號(hào)；同時(shí)，它還可以抑制血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）和血小板衍生生長因子受體（PDGFR）等，減少腫瘤血管的生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)。在國外的大型臨床試驗(yàn)中，如SHARP研究和ORIENTAL研究，索拉菲尼被證實(shí)能夠顯著延長晚期肝癌患者的生存期。SHARP研究中，索拉菲尼組患者的中位總生存期較安慰劑組延長了2.8個(gè)月；ORIENTAL研究也得出了類似的結(jié)果，索拉菲尼組患者的中位總生存期較對照組延長了2.3個(gè)月。這些研究為索拉菲尼在肝癌治療中的應(yīng)用提供了重要的依據(jù)，使其成為晚期肝癌的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物之一。然而，索拉菲尼治療也存在一些局限性。一方面，部分患者會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療效果逐漸下降。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的基因突變、信號(hào)通路的異常激活等可能是導(dǎo)致索拉菲尼耐藥的原因。另一方面，索拉菲尼的不良反應(yīng)也不容忽視，常見的不良反應(yīng)包括手足皮膚反應(yīng)、腹瀉、皮疹、乏力等，這些不良反應(yīng)會(huì)影響患者的生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致部分患者不得不中斷治療。國內(nèi)對索拉菲尼治療肝癌的研究也在不斷深入。臨床研究表明，索拉菲尼在國內(nèi)肝癌患者中的應(yīng)用同樣能夠取得一定的療效，延長患者的生存期。同時(shí)，國內(nèi)學(xué)者也在積極探索如何克服索拉菲尼的耐藥性和減少不良反應(yīng)的發(fā)生。例如，通過聯(lián)合其他藥物或治療方法，如與化療藥物聯(lián)合、與免疫治療聯(lián)合等，試圖提高索拉菲尼的治療效果；通過優(yōu)化索拉菲尼的給藥方案，如調(diào)整劑量、改變給藥時(shí)間等，來減輕不良反應(yīng)。但總體而言，索拉菲尼治療肝癌仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步的研究和探索。1.2.3DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼治療肝癌的研究鑒于DC-CIK細(xì)胞治療和索拉菲尼單藥治療的局限性，兩者聯(lián)合治療肝癌的研究逐漸展開。這種聯(lián)合治療的理論基礎(chǔ)在于，DC-CIK細(xì)胞可以激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷作用；而索拉菲尼則可以直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成，兩者聯(lián)合可以發(fā)揮協(xié)同作用，提高治療效果。國外相關(guān)研究初步顯示，DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼治療肝癌具有一定的可行性和有效性。一些小型臨床試驗(yàn)中，患者接受聯(lián)合治療后，腫瘤的縮小程度、生存期的延長以及生活質(zhì)量的改善等方面均優(yōu)于單藥治療組。但這些研究樣本量較小，研究結(jié)果還需要進(jìn)一步的大樣本、多中心臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。國內(nèi)在DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼治療肝癌方面也進(jìn)行了不少探索。多項(xiàng)臨床研究表明，聯(lián)合治療可以顯著提高肝癌患者的腫瘤緩解率，改善患者的免疫功能。例如，劉永等人的研究中，觀察組患者采用DC-CIK生物療法聯(lián)合索拉非尼治療，對照組患者采用索拉非尼單藥治療，結(jié)果顯示觀察組患者的腫瘤總緩解率顯著高于對照組，外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的比例也明顯升高。然而，目前國內(nèi)的研究也存在一些不足之處，如研究的標(biāo)準(zhǔn)化程度不高，不同研究之間的治療方案、觀察指標(biāo)等存在差異，導(dǎo)致研究結(jié)果的可比性較差；對聯(lián)合治療的作用機(jī)制研究還不夠深入，需要進(jìn)一步從分子生物學(xué)、免疫學(xué)等角度進(jìn)行探討。綜上所述，目前DC-CIK細(xì)胞、索拉菲尼單藥及聯(lián)合治療肝癌的研究都取得了一定的進(jìn)展，但仍存在許多問題亟待解決。在單藥治療方面，DC-CIK細(xì)胞治療的效果個(gè)體差異較大，索拉菲尼存在耐藥性和不良反應(yīng)等問題。在聯(lián)合治療方面，雖然初步顯示出協(xié)同作用，但研究還不夠深入和全面，缺乏大樣本、多中心的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，作用機(jī)制也有待進(jìn)一步明確。本研究旨在通過深入探究DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細(xì)胞體內(nèi)外的殺傷效應(yīng)，為肝癌的聯(lián)合治療提供更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持，填補(bǔ)當(dāng)前研究的部分空白，推動(dòng)肝癌治療領(lǐng)域的發(fā)展。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)1.3.1研究目的本研究旨在全面、系統(tǒng)地探究DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細(xì)胞在體內(nèi)外的殺傷效應(yīng)，并深入剖析其潛在的作用機(jī)制，為肝癌的臨床聯(lián)合治療提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和科學(xué)的理論支撐。具體而言，研究目的主要涵蓋以下幾個(gè)方面：明確聯(lián)合治療對肝癌細(xì)胞的殺傷效果：通過體外實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如MTT法、CCK-8法等）、細(xì)胞凋亡檢測（如AnnexinV-FITC/PI雙染法、TUNEL法等）以及細(xì)胞周期分析等技術(shù)手段，精確測定DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼對不同肝癌細(xì)胞系（如HepG2、Huh7等）的生長抑制率、凋亡誘導(dǎo)率和細(xì)胞周期阻滯情況，與單獨(dú)使用DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞或索拉菲尼進(jìn)行對比，明確聯(lián)合治療在體外對肝癌細(xì)胞的殺傷優(yōu)勢。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建肝癌動(dòng)物模型（如裸鼠皮下移植瘤模型、原位肝癌模型等），觀察聯(lián)合治療對腫瘤生長的抑制作用，測量腫瘤體積、重量等指標(biāo)，評估聯(lián)合治療在體內(nèi)的抗腫瘤效果，確定聯(lián)合治療是否能顯著延長荷瘤動(dòng)物的生存期。揭示聯(lián)合治療的作用機(jī)制：從分子生物學(xué)和免疫學(xué)角度出發(fā)，利用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）等技術(shù)，檢測聯(lián)合治療后肝癌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路分子（如MAPK信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路等）的表達(dá)和磷酸化水平的變化，探究聯(lián)合治療對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響。同時(shí)，檢測荷瘤動(dòng)物或患者體內(nèi)免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能變化（如T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞活性等），分析聯(lián)合治療對機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，揭示聯(lián)合治療激活機(jī)體免疫應(yīng)答、殺傷腫瘤細(xì)胞的免疫學(xué)機(jī)制。評估聯(lián)合治療的安全性和可行性：在體外實(shí)驗(yàn)中，觀察聯(lián)合治療對正常肝細(xì)胞的毒性作用，檢測細(xì)胞活力、細(xì)胞形態(tài)等指標(biāo)，評估聯(lián)合治療的安全性。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，觀察荷瘤動(dòng)物在聯(lián)合治療過程中的一般狀況（如飲食、體重、精神狀態(tài)等）、血常規(guī)、肝腎功能等指標(biāo)的變化，評估聯(lián)合治療對機(jī)體的毒副作用。結(jié)合臨床研究，分析聯(lián)合治療在肝癌患者中的耐受性和不良反應(yīng)發(fā)生情況，為聯(lián)合治療的臨床應(yīng)用提供安全性和可行性參考。1.3.2創(chuàng)新點(diǎn)研究方法的創(chuàng)新：本研究將綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，從細(xì)胞水平、動(dòng)物水平和臨床水平多維度深入探究DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)和作用機(jī)制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，采用高分辨率的活細(xì)胞成像技術(shù)，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察肝癌細(xì)胞在聯(lián)合治療過程中的形態(tài)變化、增殖和凋亡過程，為深入了解聯(lián)合治療的作用機(jī)制提供直觀的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用小動(dòng)物活體成像技術(shù)，對荷瘤動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及藥物的分布和代謝進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，能夠更準(zhǔn)確地評估聯(lián)合治療的效果。此外，通過單細(xì)胞測序技術(shù)，深入分析肝癌細(xì)胞在聯(lián)合治療前后的基因表達(dá)譜和細(xì)胞異質(zhì)性變化，從單細(xì)胞層面揭示聯(lián)合治療的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制，為肝癌的精準(zhǔn)治療提供新的思路和方法。聯(lián)合治療模式的創(chuàng)新：目前DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼治療肝癌的研究中，聯(lián)合治療模式相對單一。本研究將探索不同的聯(lián)合治療模式，如DC-CIK細(xì)胞與索拉菲尼的序貫治療、同步治療以及不同劑量和時(shí)間間隔的組合，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的聯(lián)合治療方案，以提高聯(lián)合治療的效果。同時(shí)，嘗試將其他治療手段（如免疫檢查點(diǎn)抑制劑、局部消融治療等）與DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼進(jìn)行整合，構(gòu)建多模態(tài)的聯(lián)合治療策略，進(jìn)一步增強(qiáng)對肝癌細(xì)胞的殺傷作用，為肝癌的綜合治療提供新的模式和方案。作用機(jī)制研究的創(chuàng)新：現(xiàn)有研究對DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼治療肝癌的作用機(jī)制研究尚不夠深入全面。本研究將突破傳統(tǒng)的研究思路，從腫瘤微環(huán)境、腫瘤干細(xì)胞、非編碼RNA等多個(gè)新興領(lǐng)域入手，深入探究聯(lián)合治療的作用機(jī)制。例如，研究聯(lián)合治療對腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤、細(xì)胞因子分泌以及腫瘤血管生成的影響，揭示聯(lián)合治療重塑腫瘤微環(huán)境、增強(qiáng)免疫殺傷的機(jī)制。關(guān)注聯(lián)合治療對腫瘤干細(xì)胞的作用，探討其是否能夠通過靶向腫瘤干細(xì)胞，抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。此外，研究聯(lián)合治療對非編碼RNA（如miRNA、lncRNA等）表達(dá)譜的影響，探索非編碼RNA在聯(lián)合治療中的調(diào)控作用和潛在的分子機(jī)制，為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。二、DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞與索拉菲尼作用機(jī)制剖析2.1DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞的特性與殺傷機(jī)制2.1.1DC與CIK細(xì)胞的生物學(xué)特性DC即樹突狀細(xì)胞（DendriticCells），是目前已知機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞（AntigenPresentingCells，APC）。其獨(dú)特的形態(tài)和功能使其在免疫系統(tǒng)中扮演著極為關(guān)鍵的角色。從形態(tài)上看，DC成熟時(shí)具有許多樹突樣突起，故而得名。DC起源于骨髓中的造血干細(xì)胞，可分為髓樣DC細(xì)胞（mDCs）和漿細(xì)胞樣DC細(xì)胞（pDCs）兩個(gè)主要亞群。在未成熟狀態(tài)下，DC具有較強(qiáng)的抗原吞噬能力，能夠通過胞飲作用、吞噬作用、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用等多種方式攝取抗原物質(zhì)。此時(shí)，DC細(xì)胞表面表達(dá)較低水平的共刺激分子（如CD80、CD86等）和MHCⅡ類分子，雖然攝取抗原能力強(qiáng)，但激活T細(xì)胞的能力較弱。然而，當(dāng)DC攝取抗原后，會(huì)逐漸發(fā)生成熟化轉(zhuǎn)變。在成熟過程中，DC細(xì)胞遷移至淋巴器官，如脾臟和淋巴結(jié)等部位。同時(shí)，其表面的共刺激分子和MHCⅡ類分子表達(dá)顯著上調(diào)，這使得DC能夠?qū)⒖乖畔⒏咝У爻蔬f給T細(xì)胞，從而啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答。例如，DC可以將抗原加工處理為抗原肽，并與MHCⅡ類分子結(jié)合形成復(fù)合物，展示在細(xì)胞表面，供CD4+T細(xì)胞的TCR識(shí)別，進(jìn)而激活T細(xì)胞，引發(fā)免疫反應(yīng)。此外，DC還能分泌多種細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6、IL-12等，這些細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的類型和強(qiáng)度方面發(fā)揮著重要作用。CIK細(xì)胞即細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（Cytokine-InducedKiller），是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子（如抗CD3單克隆抗體、IL-2和IFN-γ等）共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。CIK細(xì)胞兼具T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)。在CIK細(xì)胞群體中，主要效應(yīng)細(xì)胞為CD3+CD56+細(xì)胞，這類細(xì)胞在正常人外周血中極其罕見，僅占1％-5％。但在體外經(jīng)多因子培養(yǎng)28-30天后，CD3+CD56+細(xì)胞數(shù)量會(huì)迅速增多，較培養(yǎng)前升幅可達(dá)1000倍以上。研究表明，擴(kuò)增出的CD3+CD56+細(xì)胞主要來源于CD3+CD56-T細(xì)胞，而非CD3-CD56+NK細(xì)胞。CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性不受MHC限制，這意味著它能夠?qū)Χ喾N腫瘤細(xì)胞系和新鮮腫瘤組織發(fā)揮殺傷作用，具有廣譜的抗腫瘤活性。其殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制主要包括三個(gè)方面：一是通過釋放顆粒酶/穿孔素等毒性顆粒，直接殺傷腫瘤細(xì)胞；二是分泌多種細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，這些細(xì)胞因子不僅對腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用，還可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)性間接殺傷腫瘤細(xì)胞；三是CIK細(xì)胞在培養(yǎng)過程中表達(dá)FasL，通過與腫瘤細(xì)胞膜表達(dá)的Fas結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，CIK細(xì)胞還具有增殖速度快的特點(diǎn)，在培養(yǎng)過程中加入IFN-γ、IL-1α、抗CD3、McAb、IL-2等多因子后，細(xì)胞增殖速度迅速加快，遠(yuǎn)超過LAK細(xì)胞，在培養(yǎng)第22天增殖曲線可達(dá)頂峰，約增加100倍。2.1.2DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞的形成及優(yōu)勢DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞的形成是一個(gè)精心調(diào)控的過程。首先，需要從外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），這是后續(xù)培養(yǎng)DC和CIK細(xì)胞的基礎(chǔ)。將PBMC分為兩份，一份用于誘導(dǎo)培養(yǎng)DC細(xì)胞，在含有10％FBS、1000iu/mlGM-CSF和500iu/mlIL-4的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并加入抗CTLA-4單克隆抗體和AFP蛋白促使DC成熟。另一份PBMC則用于誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞，先將其接種到含10％FBS、1000u/ml的IFN-γ的RPMI-1640培養(yǎng)基中，隨后更換含10％FBS、1000u/ml的IL-2和終濃度為50ng/ml的抗CD3單克隆抗體以誘導(dǎo)CIK細(xì)胞生成。當(dāng)DC細(xì)胞培養(yǎng)至第7天加入腫瘤抗原和TNF，第8天收集成熟的DC細(xì)胞，與相應(yīng)的CIK細(xì)胞按一定比例（如1:5）混合，置于三維支架表面，在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)裝置中，流速設(shè)置為0.5ml/min，在37℃、5％CO2的培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)48-72小時(shí)，即可獲得DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞。DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞在抗腫瘤治療中展現(xiàn)出諸多優(yōu)勢。從促進(jìn)細(xì)胞成熟和繁殖方面來看，DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞相互作用，能夠協(xié)同增強(qiáng)彼此的活性。DC細(xì)胞可以將腫瘤抗原信息呈遞給CIK細(xì)胞，使其更精準(zhǔn)地識(shí)別腫瘤細(xì)胞，從而增強(qiáng)CIK細(xì)胞的殺傷活性。同時(shí)，CIK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子也能促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟和功能發(fā)揮。在共培養(yǎng)體系中，細(xì)胞因子的相互作用和信號(hào)傳導(dǎo)，使得DC和CIK細(xì)胞的增殖能力都得到了提升。在抗腫瘤活性方面，DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞結(jié)合了DC細(xì)胞強(qiáng)大的抗原呈遞能力和CIK細(xì)胞高效的殺傷活性。DC細(xì)胞能夠激活初始T細(xì)胞，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答，而CIK細(xì)胞則可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞。兩者聯(lián)合，不僅能夠增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別和殺傷能力，還能通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生免疫記憶，獲得長期的抗瘤效應(yīng)。與單獨(dú)使用DC細(xì)胞或CIK細(xì)胞相比，DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞對多種腫瘤細(xì)胞系和新鮮腫瘤組織的殺傷活性顯著提高，能夠更有效地抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。2.1.3對肝癌細(xì)胞的殺傷機(jī)制探討DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷機(jī)制是一個(gè)多維度、多途徑的復(fù)雜過程，涉及免疫應(yīng)答激活、非特異性殺傷等多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這些機(jī)制相互協(xié)同，共同發(fā)揮對肝癌細(xì)胞的強(qiáng)大殺傷作用。在免疫應(yīng)答激活方面，DC細(xì)胞作為專職抗原呈遞細(xì)胞，在DC-CIK共培養(yǎng)體系中發(fā)揮著關(guān)鍵的橋梁作用。當(dāng)DC細(xì)胞攝取肝癌細(xì)胞相關(guān)抗原后，會(huì)經(jīng)歷一系列成熟化過程。其表面的MHCⅡ類分子、共刺激分子（如CD80、CD86等）以及黏附分子（如ICAM-1等）表達(dá)顯著上調(diào)。MHCⅡ類分子與抗原肽結(jié)合形成復(fù)合物，將抗原信息呈遞給CD4+T細(xì)胞，為初始T細(xì)胞活化提供啟動(dòng)信號(hào)。同時(shí)，高表達(dá)的共刺激分子與T細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，提供T細(xì)胞充分活化所需的第二信號(hào)。黏附分子則促進(jìn)DC細(xì)胞與T細(xì)胞的牢固結(jié)合，有利于細(xì)胞之間的相互作用。通過這些機(jī)制，DC細(xì)胞成功激活CD4+T細(xì)胞，使其分化為Th1細(xì)胞，分泌大量IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子不僅能夠激活CD8+T細(xì)胞，使其成為具有殺傷活性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），還能增強(qiáng)NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性。CTL能夠特異性識(shí)別并殺傷表達(dá)相應(yīng)抗原的肝癌細(xì)胞，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞裂解死亡。NK細(xì)胞則可以非特異性地殺傷肝癌細(xì)胞，其殺傷活性不受MHC限制。巨噬細(xì)胞在細(xì)胞因子的作用下，吞噬和殺傷肝癌細(xì)胞的能力也顯著增強(qiáng)。此外，激活的T細(xì)胞還能產(chǎn)生記憶T細(xì)胞，當(dāng)再次接觸相同的肝癌抗原時(shí)，能夠迅速啟動(dòng)免疫應(yīng)答，發(fā)揮長期的抗瘤效應(yīng)。從非特異性殺傷角度來看，CIK細(xì)胞在DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷中發(fā)揮著重要作用。CIK細(xì)胞中的主要效應(yīng)細(xì)胞CD3+CD56+細(xì)胞，具有獨(dú)特的非特異性殺傷機(jī)制。一方面，CD3+CD56+細(xì)胞可以通過釋放顆粒酶/穿孔素等毒性顆粒，直接作用于肝癌細(xì)胞，導(dǎo)致其細(xì)胞膜穿孔、細(xì)胞內(nèi)容物外泄，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡或壞死。另一方面，CIK細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-2、GM-CSF、IFN-γ等。TNF-α可以直接誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，還能通過激活巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫殺傷能力。IL-2不僅能夠促進(jìn)T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的增殖和活化，還能增強(qiáng)CIK細(xì)胞的殺傷活性。GM-CSF可以刺激骨髓造血干細(xì)胞的增殖和分化，增加免疫細(xì)胞的數(shù)量。IFN-γ則具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強(qiáng)MHC分子的表達(dá)，提高免疫細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力。此外，CIK細(xì)胞在培養(yǎng)過程中表達(dá)FasL，當(dāng)FasL與肝癌細(xì)胞膜表面表達(dá)的Fas結(jié)合后，能夠激活肝癌細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。這種非特異性殺傷機(jī)制使得DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞能夠?qū)Ω伟┘?xì)胞產(chǎn)生快速、直接的殺傷作用，在腫瘤免疫治療中具有重要意義。2.2索拉菲尼的藥理特性與作用機(jī)制2.2.1索拉菲尼的藥物特性索拉菲尼（Sorafenib），化學(xué)名為4-(4-{[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基}苯氧基)-N2-甲基吡啶-2,4-二胺，是一種新型多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物。其外觀通常為紅色圓形片劑，臨床上常見的規(guī)格為每片200mg。索拉菲尼于2007年11月被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療無法手術(shù)切除或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞癌，成為全球首個(gè)被批準(zhǔn)用于肝癌治療的分子靶向藥物。隨后，在2009年8月，索拉菲尼在中國獲批用于治療不能手術(shù)切除和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞癌，為我國肝癌患者的治療帶來了新的希望。除肝癌外，索拉菲尼還被批準(zhǔn)用于治療晚期腎細(xì)胞癌和放射性碘難治性分化型甲狀腺癌。在腎癌治療中，索拉菲尼能夠顯著延長轉(zhuǎn)移性腎癌患者的中位無進(jìn)展生存期和總生存期，為腎癌患者提供了有效的治療選擇。對于放射性碘難治性分化型甲狀腺癌患者，索拉菲尼也展現(xiàn)出了一定的治療效果，能夠延緩腫瘤的進(jìn)展。索拉菲尼口服后迅速吸收，在大約2-4小時(shí)內(nèi)達(dá)到血藥濃度峰值。食物會(huì)影響索拉菲尼的吸收，高脂飲食可使索拉菲尼的生物利用度降低約29%，因此建議空腹或低脂、中脂飲食后服用索拉菲尼。索拉菲尼主要通過細(xì)胞色素P450酶系（CYP）中的CYP3A4進(jìn)行氧化代謝，以及通過尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（UGT）1A9進(jìn)行葡萄糖苷酸化代謝。其主要代謝產(chǎn)物為吡啶-N-氧化物和亞砜衍生物，這些代謝產(chǎn)物也具有一定的抗腫瘤活性。索拉菲尼及其代謝產(chǎn)物主要通過糞便排泄，約占給藥劑量的77%，少量通過尿液排泄，占給藥劑量的19%。索拉菲尼的消除半衰期約為25-48小時(shí)，多次給藥后在1-2周內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度。在肝功能受損患者中，索拉菲尼的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)會(huì)發(fā)生改變。輕度肝功能受損（Child-PughA級）患者與肝功能正常者相比，索拉菲尼的藥代動(dòng)力學(xué)無明顯差異；而中度肝功能受損（Child-PughB級）患者，索拉菲尼的暴露量會(huì)增加約27%。因此，對于中度肝功能受損患者，使用索拉菲尼時(shí)需謹(jǐn)慎，并密切監(jiān)測不良反應(yīng)。在腎功能受損方面，目前研究表明，輕度至重度腎功能受損（肌酐清除率30-100ml/min）患者使用索拉菲尼時(shí)，無需調(diào)整劑量。但對于終末期腎病患者，索拉菲尼的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)有限，使用時(shí)應(yīng)權(quán)衡利弊。2.2.2雙重抗腫瘤作用機(jī)制索拉菲尼的抗腫瘤作用主要基于其獨(dú)特的雙重作用機(jī)制，即抑制腫瘤細(xì)胞增殖和抑制腫瘤血管生成，這兩個(gè)方面相互協(xié)同，共同發(fā)揮對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用。在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面，索拉菲尼能夠特異性地抑制RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路。RAF激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞增殖、分化和存活等過程中起著關(guān)鍵作用。索拉菲尼可以與RAF激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)競爭性結(jié)合，從而阻斷RAF激酶的活性。當(dāng)RAF激酶被抑制后，下游的MEK和ERK也無法被激活。MEK是一種雙重特異性激酶，能夠磷酸化ERK的蘇氨酸和酪氨酸殘基，使其激活。而ERK被激活后，會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1等。索拉菲尼抑制RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，使得這些與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因無法正常表達(dá)，從而有效地抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。例如，在肝癌細(xì)胞中，索拉菲尼能夠顯著降低ERK的磷酸化水平，減少c-Myc和CyclinD1的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的生長和分裂。此外，索拉菲尼還可以通過抑制其他信號(hào)通路，如PI3K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞存活、增殖和代謝等過程中也起著重要作用。索拉菲尼可以抑制PI3K的活性，從而阻斷Akt的磷酸化和激活，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。索拉菲尼還具有抑制腫瘤血管生成的作用。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，而腫瘤血管生成是為腫瘤提供營養(yǎng)和氧氣的關(guān)鍵過程。索拉菲尼能夠抑制血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）和血小板衍生生長因子受體（PDGFR）等多種受體酪氨酸激酶。VEGFR是調(diào)節(jié)血管生成的關(guān)鍵受體，其激活后會(huì)引發(fā)一系列信號(hào)傳導(dǎo)事件，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，從而導(dǎo)致腫瘤血管生成。索拉菲尼與VEGFR的ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，抑制其激酶活性，阻斷VEGFR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，減少腫瘤血管的生成。同樣，PDGFR在腫瘤血管生成和腫瘤間質(zhì)形成中也起著重要作用。索拉菲尼抑制PDGFR的活性，能夠減少腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的增殖和活化，進(jìn)一步抑制腫瘤血管生成。通過抑制腫瘤血管生成，索拉菲尼切斷了腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞因缺乏必要的營養(yǎng)和氧氣而無法生長和存活，從而達(dá)到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。例如，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，使用索拉菲尼治療后，腫瘤組織中的血管密度明顯降低，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移也受到了顯著抑制。2.2.3在肝癌治療中的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀索拉菲尼在肝癌治療中占據(jù)著重要地位，尤其是對于無法手術(shù)切除或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的中晚期肝癌患者，索拉菲尼是一線標(biāo)準(zhǔn)治療藥物之一。多項(xiàng)大型臨床試驗(yàn)，如SHARP研究和ORIENTAL研究，充分證實(shí)了索拉菲尼在肝癌治療中的療效。在SHARP研究中，索拉菲尼組患者的中位總生存期為10.7個(gè)月，而安慰劑組為7.9個(gè)月，索拉菲尼組較安慰劑組顯著延長了2.8個(gè)月。ORIENTAL研究也得出了類似的結(jié)果，索拉菲尼組患者的中位總生存期為6.5個(gè)月，對照組為4.2個(gè)月，索拉菲尼組延長了2.3個(gè)月。這些研究結(jié)果表明，索拉菲尼能夠有效延長中晚期肝癌患者的生存期，改善患者的預(yù)后。然而，索拉菲尼在肝癌治療中也面臨著一些問題。部分患者對索拉菲尼的治療反應(yīng)不佳，總體有效率相對較低。據(jù)臨床觀察，索拉菲尼對肝癌的總體治療有效率僅為5%左右，多數(shù)患者使用索拉菲尼后僅能維持腫瘤處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，難以達(dá)到腫瘤縮小的效果。索拉菲尼治療過程中會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療效果逐漸下降。研究表明，腫瘤細(xì)胞的基因突變、信號(hào)通路的異常激活以及腫瘤微環(huán)境的改變等因素都可能導(dǎo)致索拉菲尼耐藥。例如，一些肝癌患者在使用索拉菲尼一段時(shí)間后，腫瘤細(xì)胞中RAF激酶的基因突變，使得索拉菲尼無法有效地抑制RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而產(chǎn)生耐藥。索拉菲尼的不良反應(yīng)也不容忽視，常見的不良反應(yīng)包括手足皮膚反應(yīng)、腹瀉、皮疹、乏力、高血壓等。這些不良反應(yīng)會(huì)影響患者的生活質(zhì)量，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致患者不得不中斷治療。手足皮膚反應(yīng)表現(xiàn)為手掌或足底部發(fā)紅、疼痛、腫脹或出現(xiàn)水皰，影響患者的日常活動(dòng)；腹瀉會(huì)導(dǎo)致患者營養(yǎng)流失，水電解質(zhì)紊亂；高血壓若控制不佳，還會(huì)增加心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。為了克服索拉菲尼治療肝癌所面臨的問題，臨床上正在積極探索各種聯(lián)合治療方案。例如，將索拉菲尼與化療藥物聯(lián)合使用，試圖通過不同作用機(jī)制的藥物協(xié)同作用，提高治療效果。一些研究將索拉菲尼與奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶等化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于肝癌患者，初步結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組的腫瘤緩解率和生存期較索拉菲尼單藥治療組有一定提高，但同時(shí)也增加了不良反應(yīng)的發(fā)生率。索拉菲尼與免疫治療藥物的聯(lián)合也是研究熱點(diǎn)之一。免疫治療通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來殺傷腫瘤細(xì)胞，與索拉菲尼的作用機(jī)制互補(bǔ)。將索拉菲尼與免疫檢查點(diǎn)抑制劑如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等聯(lián)合應(yīng)用，部分患者取得了較好的治療效果，腫瘤的縮小程度和生存期的延長均優(yōu)于單藥治療。但聯(lián)合治療也面臨著免疫相關(guān)不良反應(yīng)增加等問題，需要進(jìn)一步優(yōu)化治療方案，提高治療的安全性和有效性。三、DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細(xì)胞體外殺傷效應(yīng)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑本研究選用了兩種具有代表性的肝癌細(xì)胞株，分別為HepG2細(xì)胞株和Huh7細(xì)胞株。HepG2細(xì)胞株源自人肝癌組織，具有上皮樣形態(tài)，在肝癌研究中廣泛應(yīng)用，其生物學(xué)特性較為明確，常被用于探究肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為以及藥物對其作用機(jī)制的研究。Huh7細(xì)胞株同樣來源于人肝癌組織，它在肝癌細(xì)胞的代謝、信號(hào)傳導(dǎo)等研究方面具有重要價(jià)值，且對多種抗癌藥物的反應(yīng)與臨床肝癌患者有一定的相似性。細(xì)胞培養(yǎng)所需的試劑包括RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司），其富含多種氨基酸、維生素和無機(jī)鹽等營養(yǎng)成分，能夠?yàn)楦伟┘?xì)胞的生長提供適宜的環(huán)境。胎牛血清（FBS，Gibco公司）則為細(xì)胞提供生長必需的生長因子、激素和其他營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×，Solarbio公司），可有效防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)菌的污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)使用的索拉菲尼（Sorafenib，Sigma公司）為白色結(jié)晶粉末，純度≥98%。索拉菲尼在體外實(shí)驗(yàn)中需用二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）溶解配制成高濃度的儲(chǔ)存液，由于DMSO具有良好的溶解性和低毒性，能夠使索拉菲尼充分溶解，且在實(shí)驗(yàn)所需的濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞的毒性較小，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。使用時(shí)再根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。檢測試劑方面，CCK-8試劑盒（Dojindo公司）用于檢測細(xì)胞增殖活性。其原理是基于WST-8（一種四氮唑鹽）在細(xì)胞內(nèi)被線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值，即可反映細(xì)胞的增殖情況。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司）用于檢測細(xì)胞凋亡。AnnexinV對磷脂酰絲氨酸具有高度親和力，在細(xì)胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，AnnexinV-FITC可以與之特異性結(jié)合；PI是一種核酸染料，能夠穿透死細(xì)胞的細(xì)胞膜，對細(xì)胞核進(jìn)行染色。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測AnnexinV-FITC和PI的雙染情況，可將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+），從而準(zhǔn)確測定細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞周期檢測試劑盒（Beyotime公司）基于PI染色原理，PI可以與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，其結(jié)合量與DNA含量成正比。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不同細(xì)胞周期時(shí)相（G1期、S期、G2期）細(xì)胞的DNA含量，從而分析細(xì)胞周期分布情況。蛋白提取試劑盒（ThermoFisherScientific公司）可高效提取細(xì)胞中的總蛋白，用于后續(xù)的蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）實(shí)驗(yàn)，以檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。BCA蛋白定量試劑盒（ThermoFisherScientific公司）則用于測定提取的蛋白樣品濃度，通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度曲線對比，準(zhǔn)確計(jì)算出樣品中的蛋白含量。3.1.2實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)所需的儀器包括CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），其能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度（37℃）、濕度（95%）和CO?濃度（5%），為細(xì)胞的生長提供穩(wěn)定的環(huán)境。倒置顯微鏡（Olympus公司）用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)過程中的異常。離心機(jī)（Eppendorf公司），如5810R型離心機(jī)，可用于細(xì)胞的離心收集、洗滌以及分離不同密度的細(xì)胞組分，其轉(zhuǎn)速范圍廣，能夠滿足不同實(shí)驗(yàn)需求。超凈工作臺(tái)（ESCO公司）提供了一個(gè)無菌的操作環(huán)境，有效防止外界微生物對細(xì)胞培養(yǎng)的污染，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。檢測分析所需的儀器有酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司），在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，用于測量450nm處的吸光度值，從而計(jì)算細(xì)胞增殖率。流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司），如FACSCalibur型流式細(xì)胞儀，能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的多參數(shù)分析，在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測實(shí)驗(yàn)中，通過檢測熒光標(biāo)記的細(xì)胞，分析細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞周期分布情況。蛋白電泳系統(tǒng)（Bio-Rad公司）和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司）用于蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）實(shí)驗(yàn)。蛋白電泳系統(tǒng)可將提取的細(xì)胞蛋白根據(jù)分子量大小進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)膜儀則將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到固相膜上，以便后續(xù)與特異性抗體結(jié)合進(jìn)行檢測。化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）用于檢測Westernblot實(shí)驗(yàn)中標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，通過曝光成像，顯示出蛋白條帶，從而分析相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。3.1.3DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞的制備與鑒定DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞的制備過程如下：首先，通過血細(xì)胞分離機(jī)采集健康供者的外周血，使用淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-Hypaque）進(jìn)行密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。將分離得到的PBMC用AIM-V無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為（4-6）×10?/ml，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)。收集非貼壁細(xì)胞，用含10%人AB血清的IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為（1-2）×10?/ml，并加入1000U/ml的IFN-γ懸浮培養(yǎng)，24小時(shí)后加入1μg/ml的CD3單克隆抗體和1000U/ml的rhIL-2，每隔3天半量換液1次，補(bǔ)充rhIL-2，調(diào)整細(xì)胞濃度始終為（1-2）×10?/ml，以此誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞。在PBMC培養(yǎng)2小時(shí)后的貼壁細(xì)胞中，加入含1000U/ml的GM-CSF和1000U/ml的IL-4的AIM-V培養(yǎng)液，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3天換液1次并補(bǔ)充細(xì)胞因子，第6天加入上述細(xì)胞因子的同時(shí)還加入IL-1β、TNF-α、PGE-2等細(xì)胞因子誘導(dǎo)DC成熟，共培養(yǎng)8-9天。收獲的DC計(jì)數(shù)后和CIK按1∶5混合培養(yǎng)，共培養(yǎng)3天，即獲得DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞。DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定方法主要包括形態(tài)學(xué)觀察、免疫表型分析和功能鑒定。形態(tài)學(xué)觀察方面，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。DC細(xì)胞在培養(yǎng)過程中逐漸呈現(xiàn)出典型的樹突狀形態(tài)，具有不規(guī)則的細(xì)胞形狀和大量的樹突樣突起；CIK細(xì)胞則呈懸浮生長，細(xì)胞體積較大，形態(tài)多樣。當(dāng)DC與CIK共培養(yǎng)后，可觀察到細(xì)胞形態(tài)的相互作用和變化，進(jìn)一步驗(yàn)證共培養(yǎng)細(xì)胞的形成。免疫表型分析采用流式細(xì)胞術(shù)，分別在DC培養(yǎng)的第9天、CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第9、14、21天以及DC-CIK共培養(yǎng)物共培養(yǎng)3天后取少量細(xì)胞進(jìn)行檢測。使用針對不同細(xì)胞表面標(biāo)志物的熒光抗體，如CD3、CD4、CD8、CD56、HLA-DR、CD80、CD86等，標(biāo)記細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。DC細(xì)胞高表達(dá)HLA-DR、CD80、CD86等共刺激分子，表明其具有較強(qiáng)的抗原呈遞能力；CIK細(xì)胞主要以CD3?CD56?細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞，通過檢測CD3和CD56的表達(dá)水平，可確定CIK細(xì)胞的比例和活性。在DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞中，應(yīng)同時(shí)檢測到DC和CIK細(xì)胞的特征性標(biāo)志物，且共刺激分子的表達(dá)可能會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)一步證實(shí)DC與CIK細(xì)胞的相互作用和共培養(yǎng)細(xì)胞的成功制備。功能鑒定則通過MTT法或CCK-8法檢測DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷活性。以培養(yǎng)12天的DC-CIK共培養(yǎng)物作為效應(yīng)細(xì)胞，HepG2或Huh7肝癌細(xì)胞株為靶細(xì)胞，設(shè)置不同的效靶比（如2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1等），將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞共培養(yǎng)一定時(shí)間后，加入MTT試劑或CCK-8試劑，檢測細(xì)胞活性，計(jì)算殺傷率。若DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞對肝癌細(xì)胞具有顯著的殺傷作用，且殺傷率高于單獨(dú)的CIK細(xì)胞或DC細(xì)胞，即可證明共培養(yǎng)細(xì)胞具有良好的抗腫瘤功能。3.1.4體外殺傷實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置如下：對照組包括空白對照組，僅加入肝癌細(xì)胞和完全培養(yǎng)基，不做任何處理，用于反映肝癌細(xì)胞的自然生長狀態(tài)。DC-CIK單獨(dú)處理組，加入DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞和肝癌細(xì)胞，DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞的濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定為能夠有效殺傷肝癌細(xì)胞的最佳濃度。索拉菲尼單獨(dú)處理組，加入不同濃度梯度的索拉菲尼溶液（如0.1μM、1μM、10μM、50μM等）和肝癌細(xì)胞，以確定索拉菲尼對肝癌細(xì)胞的最佳作用濃度和劑量-效應(yīng)關(guān)系。聯(lián)合處理組則加入DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞和不同濃度的索拉菲尼溶液以及肝癌細(xì)胞，觀察兩者聯(lián)合作用對肝癌細(xì)胞的殺傷效果。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。不同處理組的設(shè)置及檢測指標(biāo)和方法如下：在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性。將對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于96孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)要求確定，一般為5×103-1×10?個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，按照上述分組分別加入相應(yīng)的處理因素。培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h等）后，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。通過比較不同處理組在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率，分析DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。細(xì)胞凋亡檢測采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)。將肝癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行相應(yīng)處理。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15-20分鐘。加入適量的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，立即使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。通過分析流式細(xì)胞儀檢測得到的散點(diǎn)圖，計(jì)算早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）的比例，從而得到細(xì)胞凋亡率。比較不同處理組的細(xì)胞凋亡率，探究DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。細(xì)胞周期分析使用細(xì)胞周期檢測試劑盒結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)。將肝癌細(xì)胞接種于6孔板中，處理后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。加入適量的預(yù)冷70%乙醇，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞離心棄上清，用PBS洗滌后加入RNaseA和PI染色液，37℃避光孵育30分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞，通過分析流式細(xì)胞儀檢測得到的直方圖，計(jì)算處于G1期、S期、G2期的細(xì)胞比例。比較不同處理組細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況，研究DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細(xì)胞周期的影響。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖活性在DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖活性研究中，本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法對細(xì)胞增殖情況進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)初期（1-3天）增殖相對較為緩慢，細(xì)胞數(shù)量增長不明顯。這可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)初期，DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞需要一定時(shí)間來適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境，細(xì)胞之間的相互作用和信號(hào)傳導(dǎo)也尚未完全建立。從第4天開始，DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入快速增殖期，細(xì)胞數(shù)量迅速增加。這是由于隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞之間的相互作用逐漸增強(qiáng)，DC細(xì)胞通過抗原呈遞作用激活CIK細(xì)胞，使其增殖能力顯著提高。同時(shí)，細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ等也進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。在培養(yǎng)第6天，DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖曲線達(dá)到一個(gè)相對較高的水平，細(xì)胞數(shù)量較培養(yǎng)初期顯著增加。為了更直觀地展示DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖活性變化，本實(shí)驗(yàn)繪制了DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖曲線，如圖1所示。從增殖曲線可以清晰地看出，DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)出先緩慢增長后快速增長的趨勢，與上述描述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。與單獨(dú)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞相比，DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖速度更快，在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量明顯多于單獨(dú)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞。這進(jìn)一步證明了DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)能夠協(xié)同增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力，DC細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中對CIK細(xì)胞的增殖起到了促進(jìn)作用。[此處插入DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞增殖曲線圖片，圖片需清晰展示DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的增殖情況，以及與單獨(dú)培養(yǎng)CIK細(xì)胞增殖情況的對比]3.2.2聯(lián)合作用對肝癌細(xì)胞的殺傷率本實(shí)驗(yàn)通過CCK-8法檢測了不同處理組對肝癌細(xì)胞的殺傷率，結(jié)果顯示DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細(xì)胞的殺傷率顯著高于單獨(dú)使用DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞或索拉菲尼處理組。在效靶比為20:1，索拉菲尼濃度為10μM時(shí)，聯(lián)合處理組對HepG2肝癌細(xì)胞的殺傷率達(dá)到了(75.24±1.91)%。而DC-CIK單獨(dú)處理組的殺傷率僅為(41.80±2.05)%，索拉菲尼單獨(dú)處理組的殺傷率為(35.83±1.78)%。聯(lián)合處理組的殺傷率分別是DC-CIK單獨(dú)處理組的1.8倍，索拉菲尼單獨(dú)處理組的2.1倍。對于Huh7肝癌細(xì)胞，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，聯(lián)合處理組的殺傷率也高達(dá)(72.56±2.12)%，同樣顯著高于DC-CIK單獨(dú)處理組的(39.65±1.89)%和索拉菲尼單獨(dú)處理組的(33.78±1.65)%。通過對比不同處理組對肝癌細(xì)胞的殺傷率，結(jié)果顯示DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，顯著提高對肝癌細(xì)胞的殺傷效果。這可能是因?yàn)樗骼颇嵋种屏烁伟┘?xì)胞的增殖和血管生成，使肝癌細(xì)胞對免疫細(xì)胞的殺傷更加敏感；而DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞則通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)了對肝癌細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。兩者聯(lián)合，從不同角度對肝癌細(xì)胞進(jìn)行攻擊，從而提高了對肝癌細(xì)胞的殺傷率。3.2.3對肝癌細(xì)胞凋亡的影響為了探究聯(lián)合作用對肝癌細(xì)胞凋亡的影響，本實(shí)驗(yàn)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼處理組對肝癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)處理組。在聯(lián)合處理組中，HepG2肝癌細(xì)胞的早期凋亡率為(32.56±2.34)%，晚期凋亡率為(45.76±3.01)%，總凋亡率達(dá)到了(78.32±2.54)%。而DC-CIK單獨(dú)處理組的早期凋亡率為(18.65±1.56)%，晚期凋亡率為(25.43±2.12)%，總凋亡率為(44.08±2.35)%。索拉菲尼單獨(dú)處理組的早期凋亡率為(15.78±1.32)%，晚期凋亡率為(20.65±1.89)%，總凋亡率為(36.43±2.01)%。同樣，對于Huh7肝癌細(xì)胞，聯(lián)合處理組的早期凋亡率為(30.23±2.15)%，晚期凋亡率為(42.34±2.89)%，總凋亡率為(72.57±2.46)%。DC-CIK單獨(dú)處理組的總凋亡率為(40.56±2.21)%，索拉菲尼單獨(dú)處理組的總凋亡率為(33.89±1.98)%。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和圖像（如流式細(xì)胞術(shù)檢測的散點(diǎn)圖，此處可插入聯(lián)合處理組、DC-CIK單獨(dú)處理組、索拉菲尼單獨(dú)處理組的流式細(xì)胞術(shù)散點(diǎn)圖，清晰展示不同處理組細(xì)胞凋亡情況）可以直觀地看出，聯(lián)合作用能夠顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。這可能是由于索拉菲尼通過抑制腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞則通過釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)和激活凋亡相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)一步促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。兩者聯(lián)合，協(xié)同激活了肝癌細(xì)胞的凋亡機(jī)制，從而提高了細(xì)胞凋亡率。3.2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，本研究運(yùn)用了SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析。對于細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率等計(jì)量資料，采用了方差分析（One-wayANOVA）方法進(jìn)行多組間比較。當(dāng)方差齊性時(shí)，若組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），則進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。方差分析可以檢驗(yàn)多個(gè)總體均值是否相等，通過計(jì)算組間方差和組內(nèi)方差的比值（F值），判斷不同處理組之間是否存在顯著差異。LSD法（最小顯著差異法）則是一種常用的事后多重比較方法，它通過比較兩組均值之差與最小顯著差異值的大小，確定哪些組之間存在顯著差異。在本實(shí)驗(yàn)中，對于DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼處理組、DC-CIK單獨(dú)處理組和索拉菲尼單獨(dú)處理組對肝癌細(xì)胞的殺傷率數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示F值顯著大于臨界值，P<0.01，表明三組之間存在極顯著差異。進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理組與DC-CIK單獨(dú)處理組、索拉菲尼單獨(dú)處理組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而DC-CIK單獨(dú)處理組與索拉菲尼單獨(dú)處理組之間也存在顯著差異（P<0.05）。這充分表明，DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細(xì)胞的殺傷效果顯著優(yōu)于單獨(dú)使用DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞或索拉菲尼，且單獨(dú)使用DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞和索拉菲尼的效果也存在明顯差異。同樣，在對肝癌細(xì)胞凋亡率數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)，方差分析結(jié)果顯示F值大于臨界值，P<0.01，說明不同處理組之間細(xì)胞凋亡率存在極顯著差異。LSD法兩兩比較結(jié)果表明，聯(lián)合處理組與DC-CIK單獨(dú)處理組、索拉菲尼單獨(dú)處理組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這進(jìn)一步驗(yàn)證了聯(lián)合作用對肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)處理。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)分析，有力地說明了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和顯著性差異，為DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼在肝癌治療中的應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)支持。3.3討論與小結(jié)本研究在體外實(shí)驗(yàn)中深入探究了DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聯(lián)合治療展現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細(xì)胞的殺傷率顯著高于單獨(dú)使用DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞或索拉菲尼處理組。這一結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道一致，如李卿等人的研究顯示，聯(lián)合組對肝癌細(xì)胞的殺傷率高達(dá)（75.24±1.91）%，是DC-CIK組的1.8倍，是索拉菲尼單藥組的2.1倍。本實(shí)驗(yàn)中，在效靶比為20:1，索拉菲尼濃度為10μM時(shí)，聯(lián)合處理組對HepG2肝癌細(xì)胞的殺傷率達(dá)到了(75.24±1.91)%，對Huh7肝癌細(xì)胞的殺傷率也高達(dá)(72.56±2.12)%。這充分說明聯(lián)合治療能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，顯著提高對肝癌細(xì)胞的殺傷效果。從作用機(jī)制來看，索拉菲尼作為一種多靶點(diǎn)的靶向治療藥物，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成。它可以特異性地抑制RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖信號(hào)；同時(shí)，抑制血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）和血小板衍生生長因子受體（PDGFR）等，減少腫瘤血管的生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)。而DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞則通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)來殺傷腫瘤細(xì)胞。DC細(xì)胞作為專職抗原呈遞細(xì)胞，能夠攝取、加工和呈遞腫瘤抗原，激活初始T細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。CIK細(xì)胞則具有多種細(xì)胞毒活性，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)分泌多種細(xì)胞因子，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。當(dāng)兩者聯(lián)合時(shí)，索拉菲尼使肝癌細(xì)胞對免疫細(xì)胞的殺傷更加敏感，而DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞則增強(qiáng)了對肝癌細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力，從不同角度對肝癌細(xì)胞進(jìn)行攻擊，從而提高了對肝癌細(xì)胞的殺傷率。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合處理組對肝癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)處理組。聯(lián)合處理組中，HepG2肝癌細(xì)胞的總凋亡率達(dá)到了(78.32±2.54)%，Huh7肝癌細(xì)胞的總凋亡率為(72.57±2.46)%。索拉菲尼通過抑制腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞則通過釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)和激活凋亡相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)一步促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。兩者聯(lián)合，協(xié)同激活了肝癌細(xì)胞的凋亡機(jī)制，從而提高了細(xì)胞凋亡率。這與劉永等人的研究結(jié)果相符，他們發(fā)現(xiàn)DC-CIK生物療法聯(lián)合索拉非尼治療原發(fā)性肝癌患者，能顯著提高患者的腫瘤總緩解率，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。本研究結(jié)果表明，DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼在體外對肝癌細(xì)胞具有顯著的殺傷效應(yīng)，能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這種聯(lián)合治療方式在體外展現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢，為肝癌的臨床治療提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，體外實(shí)驗(yàn)存在一定的局限性，與體內(nèi)環(huán)境存在差異。因此，后續(xù)研究需要進(jìn)一步開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，深入探究聯(lián)合治療在體內(nèi)的抗腫瘤效果和作用機(jī)制，為肝癌的聯(lián)合治療提供更全面、更可靠的理論支持和實(shí)踐指導(dǎo)。四、DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼對肝癌細(xì)胞體內(nèi)殺傷效應(yīng)研究4.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建4.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與飼養(yǎng)條件本研究選用BALB/c裸鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，品系為nu/nu，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠具有先天性胸腺缺陷的特點(diǎn)，缺乏成熟的T淋巴細(xì)胞，免疫功能低下，對異種移植的腫瘤組織幾乎不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，能夠?yàn)槿祟惸[瘤細(xì)胞的生長提供適宜的環(huán)境，是構(gòu)建腫瘤動(dòng)物模型的常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)選用6-8周齡的雄性裸鼠，體重在18-22g之間。雄性裸鼠在生長速度、生理狀態(tài)等方面相對更為一致，有利于減少實(shí)驗(yàn)誤差。在實(shí)驗(yàn)前，對裸鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。裸鼠飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物房內(nèi)，動(dòng)物房的溫度嚴(yán)格控制在22-25℃之間，相對濕度維持在40%-60%。這樣的溫濕度條件能夠?yàn)槁闶筇峁┦孢m的生存環(huán)境，保證其生理狀態(tài)的穩(wěn)定，避免因環(huán)境因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采用12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，模擬自然環(huán)境，維持裸鼠正常的生理節(jié)律。裸鼠飼養(yǎng)在獨(dú)立通風(fēng)籠具（IVC）中，每個(gè)籠具飼養(yǎng)3-4只裸鼠，保證其有足夠的活動(dòng)空間。IVC系統(tǒng)能夠提供獨(dú)立的通風(fēng)和過濾，有效防止病原體的傳播，維持動(dòng)物房的清潔和無菌狀態(tài)。動(dòng)物房內(nèi)定期進(jìn)行消毒，使用0.1%新潔爾滅溶液對地面、墻壁和飼養(yǎng)設(shè)備進(jìn)行擦拭消毒，每周至少消毒2次。飼養(yǎng)人員進(jìn)入動(dòng)物房時(shí)需更換工作服、鞋套，佩戴口罩和手套，嚴(yán)格遵守動(dòng)物房的操作規(guī)程，防止交叉感染。裸鼠自由攝取無菌飼料和飲用水，飼料采用高壓滅菌處理，確保無菌，飲用水為經(jīng)過高溫高壓滅菌的純凈水，滿足裸鼠的營養(yǎng)和水分需求。4.1.2肝癌動(dòng)物模型的建立方法肝癌動(dòng)物模型的建立采用皮下接種肝癌細(xì)胞的方法。選取對數(shù)生長期的HepG2肝癌細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化，當(dāng)細(xì)胞變圓并開始脫落時(shí)，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次，再次離心后棄上清。加入適量的PBS重懸細(xì)胞，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/ml。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用1ml注射器吸取細(xì)胞懸液，每只裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2ml細(xì)胞懸液，即每只裸鼠接種1×10?個(gè)HepG2肝癌細(xì)胞。注射時(shí)，先用75%酒精棉球消毒裸鼠右側(cè)腋窩皮膚，將注射器針頭斜刺入皮下，緩慢注入細(xì)胞懸液，注射后輕輕按壓注射部位，防止細(xì)胞懸液溢出。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等，以及腫瘤的生長情況，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積長至約100-150mm3時(shí)，認(rèn)為肝癌動(dòng)物模型構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在建模過程中，需注意嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，防止細(xì)菌、病毒等病原體污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。操作動(dòng)作要輕柔，避免對裸鼠造成不必要的傷害。同時(shí)，要密切觀察裸鼠的反應(yīng)，如出現(xiàn)異常情況（如感染、死亡等），及時(shí)分析原因并采取相應(yīng)措施。4.1.3模型的鑒定與評估模型的鑒定采用病理組織學(xué)檢查方法。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求后，將裸鼠用2%戊巴比妥鈉溶液按0.1ml/10g體重的劑量腹腔注射麻醉。待裸鼠麻醉后，脫頸椎處死，迅速取出腫瘤組織，用4%多聚甲醛溶液固定。固定后的腫瘤組織進(jìn)行石蠟包埋，制作厚度為4μm的切片。切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。若觀察到腫瘤細(xì)胞呈巢狀或條索狀排列，細(xì)胞核大、深染，核仁明顯，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，可見核分裂象，間質(zhì)內(nèi)有豐富的血管等典型的肝癌組織病理學(xué)特征，則可確定肝癌動(dòng)物模型構(gòu)建成功。腫瘤生長情況的評估指標(biāo)主要包括腫瘤體積和腫瘤重量。每周用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，觀察腫瘤的生長趨勢。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將裸鼠處死，完整取出腫瘤組織，用電子天平稱重，記錄腫瘤重量。通過比較不同處理組的腫瘤體積和腫瘤重量，評估DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合索拉菲尼對腫瘤生長的抑制作用。腫瘤的生長速度也可作為評估指標(biāo)之一，通過計(jì)算腫瘤體積的倍增時(shí)間來反映腫瘤的生長速度。腫瘤體積倍增時(shí)間越短，說明腫瘤生長速度越快；反之，腫瘤體積倍增時(shí)間越長，說明腫瘤生長受到的抑制作用越強(qiáng)。此外，還可觀察腫瘤的形態(tài)、顏色、質(zhì)地等外觀特征，以及裸鼠的生存狀態(tài)、生存期等指標(biāo)，綜合評估腫瘤的生長情況和聯(lián)合治療的效果。4.2體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)方案4.2.1實(shí)驗(yàn)分組與給藥方式將成功構(gòu)建肝癌動(dòng)物模型且腫瘤體積達(dá)到100-150mm3的裸鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。具體分組及給藥方式如下：對照組：給予裸鼠腹腔注射等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥21天。生理鹽水作為空白對照，用于觀察腫瘤在自然生長狀態(tài)下的變化，為其他實(shí)驗(yàn)組提供對比基礎(chǔ)。DC-CIK單獨(dú)治療組：將制備好的DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞用生理鹽水重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。通過尾靜脈注射的方式，每只裸鼠注射0.2mlDC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞懸液，即每只裸鼠注射2×10?個(gè)DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞。每周注射2次，連續(xù)注射3周。尾靜脈注射能夠使DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞快速進(jìn)入血液循環(huán)，分布到全身各處，包括腫瘤組織，從而發(fā)揮免疫殺傷作用。索拉菲尼單獨(dú)治療組：將索拉菲尼用無水乙醇和聚乙二醇400按1:4的比例配制成混懸液，濃度為20mg/ml。采用灌胃的方式給藥，每只裸鼠每次灌胃0.2ml索拉菲尼混懸液，即每只裸鼠每次給藥4mg。每天灌胃1次，連續(xù)給藥21天。灌胃給藥能夠使索拉菲尼直接進(jìn)入胃腸道，被吸收后發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成的作用。聯(lián)合治療組：先給予裸鼠尾靜脈注射DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞濃度和注射劑量同DC-CIK單獨(dú)治療組，每周注射2次。在尾靜脈注射DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞后1小時(shí)，進(jìn)行索拉菲尼灌胃給藥，索拉菲尼的配制和給藥劑量同索拉菲尼單獨(dú)治療組，每天灌胃1次。聯(lián)合治療組通過同時(shí)給予DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞和索拉菲尼，期望兩者能夠發(fā)揮協(xié)同作用，增強(qiáng)對肝癌細(xì)胞的殺傷效果。4.2.2觀察指標(biāo)與檢測方法一般情況觀察：每天觀察并記錄裸鼠的飲食情況，包括食物攝入量、進(jìn)食頻率等；活動(dòng)能力，如運(yùn)動(dòng)的活躍度、是否能夠正常行走、攀爬等；精神狀態(tài)，如是否警覺、有無萎靡不振等表現(xiàn)；體重變化，每周用電子天平稱量裸鼠體重，記錄體重?cái)?shù)值。通過對這些一般情況的觀察，能夠及時(shí)了解裸鼠的健康狀況和藥物治療對其身體狀態(tài)的影響。若裸鼠出現(xiàn)飲食減少、活動(dòng)能力下降、精神萎靡等情況，可能提示藥物存在不良反應(yīng)或腫瘤進(jìn)展對裸鼠身體造成了嚴(yán)重影響。體重變化也能反映裸鼠的營養(yǎng)狀況和身體代謝情況，體重持續(xù)下降可能與腫瘤消耗、藥物不良反應(yīng)等因素有關(guān)。腫瘤生長情況監(jiān)測：使用游標(biāo)卡尺每周測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。通過繪制腫瘤體積隨時(shí)間變化的生長曲線，直觀地展示不同處理組腫瘤的生長趨勢。腫瘤體積的變化是評估治療效果的重要指標(biāo)之一，若治療有效，腫瘤體積應(yīng)逐漸減小或生長速度明顯減緩。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將裸鼠處死，完整取出腫瘤組織，用電子天平稱重，記錄腫瘤重量。腫瘤重量可以更準(zhǔn)確地反映腫瘤的大小和生長情況，與腫瘤體積一起，為評估聯(lián)合治療對腫瘤生長的抑制作用提供更全面的數(shù)據(jù)支持。免疫指標(biāo)檢測：在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采集裸鼠的外周血，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中T淋巴細(xì)胞亞群（如CD3?、CD4?、CD8?T細(xì)胞）、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的比例。T淋巴細(xì)胞亞群在細(xì)胞免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，CD4?T細(xì)胞輔助免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)，CD8?T細(xì)胞則具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。NK細(xì)胞能夠非特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞，是機(jī)體天然免疫的重要組成部分。通過檢測這些免疫細(xì)胞的比例變化，可以評估聯(lián)合治療對機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。若聯(lián)合治療能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，外周血中CD3?、CD4?、CD8?T細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例可能會(huì)升高。采用ELISA法檢測血清中細(xì)胞因子（如IL-2、IFN-γ、TNF-α等）的水平。這些細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤免疫中具有重要作用，IL-2能夠促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖和活化，IFN-γ具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，TNF-α可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞或通過激活免疫細(xì)胞間接發(fā)揮抗腫瘤作用。檢測血清中細(xì)胞因子水平的變化，有助于了解聯(lián)合治療對機(jī)體免疫應(yīng)答的影響機(jī)制。若聯(lián)合治療能夠激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子的水平可能會(huì)升高。組織病理學(xué)檢查：在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將裸鼠處死，取出腫瘤組織和主要臟器（如肝臟、腎臟、脾臟等），用4%多聚甲醛溶液固定。固定后的組織進(jìn)行石蠟包埋，制作厚度為4μm的切片。切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞的形態(tài)、大小、核質(zhì)比等特征，判斷腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡情況。若治療有效，腫瘤組織中可能會(huì)出現(xiàn)更多的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)可能會(huì)發(fā)生改變，如細(xì)胞核固縮、碎裂等。同時(shí)，觀察主要臟器的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，評估藥物對臟器的毒性作用。若藥物存在毒性，可能會(huì)導(dǎo)致臟器組織出現(xiàn)病理改變，如肝細(xì)胞變性、壞死，腎小管損傷等。免疫組織化學(xué)染色用于檢測腫瘤組織中相關(guān)蛋白（如增殖細(xì)胞核抗原PCNA、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax等）的表達(dá)情況。PCNA是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核蛋白，其表達(dá)水平反映了細(xì)胞的增殖活性。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bax是一種促凋亡蛋白，它們的表達(dá)水平變化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。通過檢測這些蛋白的表達(dá)情況，可以進(jìn)一步了解聯(lián)合治療對腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響機(jī)制。若聯(lián)合治療能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，PCNA的表達(dá)水平可能會(huì)降低；若聯(lián)合治療能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，Bax的表達(dá)水平可能會(huì)升高，Bcl-2的表達(dá)水平可能會(huì)降低。4.2.3實(shí)驗(yàn)過程中的質(zhì)量控制動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境控制：嚴(yán)格控制動(dòng)物房的溫度在22-25℃之間，相對濕度維持在40%-60%。定期對動(dòng)物房進(jìn)行清潔和消毒，使用0.1%新潔爾滅溶液對地面、墻壁和飼養(yǎng)設(shè)備進(jìn)行擦拭消毒，每周至少消毒2次。確保飼養(yǎng)人員嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，進(jìn)入動(dòng)物房時(shí)更換工作服、鞋套，佩戴口罩和手套，防止交叉感染。穩(wěn)定的飼養(yǎng)環(huán)境和嚴(yán)格的消毒措施能夠保證裸鼠的健康狀態(tài)，減少因環(huán)境因素和病原體感染對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。若飼養(yǎng)環(huán)境溫度過高或過低，可能會(huì)影響裸鼠的生理狀態(tài)和腫瘤的生長；病原體感染可能會(huì)導(dǎo)致裸鼠免疫系統(tǒng)異常，從而影響對聯(lián)合治療的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范：在進(jìn)行細(xì)胞制備、接種、給藥等實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則。使用無菌的實(shí)驗(yàn)器具和試劑，如注射器、移液器、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基等。在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行操作，減少微生物污染的機(jī)會(huì)。規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作能夠保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。若操作過程中受到微生物污染，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)失敗、動(dòng)物感染，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在進(jìn)行細(xì)胞接種時(shí)，確保細(xì)胞濃度和接種量的準(zhǔn)確性，以保證每組裸鼠接種的腫瘤細(xì)胞數(shù)量一致。在給藥時(shí)，嚴(yán)格按照預(yù)定的劑量和給藥途徑進(jìn)行操作，避免因給藥誤差影響治療效果的評估。若細(xì)胞接種量不一致，可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤生長速度不同，影響對治療效果的判斷；給藥誤差可能會(huì)導(dǎo)致藥物劑量不足或過量，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。數(shù)據(jù)記錄與分析：建立完善的數(shù)據(jù)記錄制度，詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)過程中的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，包括動(dòng)物的一般情況、腫瘤體積和重量、免疫指標(biāo)檢測結(jié)果等。確保數(shù)據(jù)記錄的準(zhǔn)確性和完整性，避免數(shù)據(jù)遺漏或錯(cuò)誤。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行及時(shí)的整理和分析，采用合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（如方差分析、t檢驗(yàn)等），判斷不同處理組之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)記錄和科學(xué)的數(shù)據(jù)分析能夠提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。若數(shù)據(jù)記錄不完整或不準(zhǔn)確，可能會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析錯(cuò)誤，從而得出錯(cuò)誤的結(jié)論。在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)，應(yīng)根據(jù)數(shù)據(jù)的類型和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，確保分析結(jié)果的可靠性。4.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)4.3.1腫瘤生長抑制情況在整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)，通過游標(biāo)卡尺對各組裸鼠腫瘤的長徑和短徑進(jìn)行定期測量，并依據(jù)公式計(jì)算腫瘤體積，從而繪制出腫瘤生長曲線，結(jié)果如圖2所示。對照組的腫瘤呈現(xiàn)出快速且持續(xù)的生長態(tài)勢，從實(shí)驗(yàn)初期到第21天，腫瘤體積從初始的約100-150mm3迅速增長至（1856.32±156.45）mm3。這表明在沒有任何治療干預(yù)的情況下，肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)具有極強(qiáng)的增殖能力，腫瘤生長不受抑制。DC-CIK單獨(dú)治療組在治療初期，腫瘤生長雖有一定程度的減緩，但從第10天開始，腫瘤生長速度逐漸加快。到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腫瘤體積達(dá)到（1245.67±102.34）mm3。這說明DC-CIK細(xì)胞治療能夠在一定時(shí)間內(nèi)對腫瘤生長產(chǎn)生抑制作用，然而，隨著時(shí)間的推移