(12)發(fā)明專(zhuān)利(10)授權(quán)公告號(hào)CN1180482(65)同一申請(qǐng)的已公布的文獻(xiàn)號(hào)(83)生物保藏信息(73)專(zhuān)利權(quán)人山東碧藍(lán)生物科技有限公司地址271000山東省泰安市寧陽(yáng)經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)磁窯立交橋南2000米(72)發(fā)明人胡著然王麗榮塔拉布京娜·娜杰日達(dá)斯克里亞賓娜·瑪爾法樊梅娜林顯華呂文亮王雨平張?zhí)鹛?74)專(zhuān)利代理機(jī)構(gòu)濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司37221專(zhuān)利代理師張曉鵬A61K35/742(2015.01)A61P37/04(2006.01)A23K10/18(2016.01)審查員胡雨嘉一株枯草芽孢桿菌及其在提高動(dòng)物免疫力中的應(yīng)用本發(fā)明公開(kāi)了一株枯草芽孢桿菌及其在提高動(dòng)物免疫力中的應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域。所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis來(lái)源于俄羅斯多年凍土，具備良好的菌株性能。其能夠顯著耐低溫、耐高溫、耐人工胃酸、耐膽鹽、耐人工腸液；對(duì)典型的動(dòng)物腸道致病菌如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、致病性金黃色葡萄球菌等都等多種酶；能夠發(fā)揮疫苗佐劑功能，達(dá)到與傳統(tǒng)21.一株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),其命名為枯草芽孢桿菌NBL-BQ218,其保2.一種微生物菌劑，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌。3.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌或權(quán)利要求2所述的微生物菌劑在制備以下任意一項(xiàng)產(chǎn)品中的應(yīng)用：(2)用于抑制畜禽腸道致病菌的產(chǎn)品；(3)用于增加畜禽腸道長(zhǎng)度，提高飼料消化吸收率的產(chǎn)品；(4)用于提高畜禽免疫能力的產(chǎn)品；(5)用作畜禽的疫苗佐劑的產(chǎn)品；其中，所述畜禽腸道致病菌為大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和嗜水氣單胞菌。4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述提高畜禽免疫能力包括提高畜禽平均日增重、平均日采食量及料重比，降低畜禽腹瀉率，提高畜禽體內(nèi)免疫球蛋白水平，提高免疫5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗佐劑能夠與疫苗結(jié)合使用，增強(qiáng)免疫應(yīng)答，降低抗原使用量、高效激活免疫系統(tǒng)和延長(zhǎng)效價(jià)水平。(1)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌；(2)權(quán)利要求2所述的微生物菌劑。3技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株枯草芽孢桿菌及其在提高動(dòng)物免疫力中的應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]公開(kāi)該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。[0003]全面禁抗時(shí)代的到來(lái)，養(yǎng)殖端也在積極尋求新的解決方案，以天然植物提取物、有生態(tài)制劑的發(fā)展引起廣泛關(guān)注。微生態(tài)制劑是由一種或多種正常菌群微生物所制成的生物制品，可以改善動(dòng)物腸道中微生物菌群平衡，增強(qiáng)機(jī)體黏膜免疫、提升疫苗免疫效果、抵抗病原微生物感染、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)消化吸收、提高料肉比和生產(chǎn)性能、節(jié)能減排，有效提高畜禽的健康水平和養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。[0004]微生態(tài)制劑發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素在于所選用的菌種性能。目前，可用于微生態(tài)制劑生產(chǎn)的菌種主要有芽孢桿菌、乳酸桿菌、酵母菌和雙歧桿菌等。李光智等提供了一種枯草芽孢桿菌，耐受性強(qiáng)、具有廣譜抗菌性且高效降解淀粉和纖維素的功能；魏可鋒等研究表了一株具有高效抑菌性能的枯草芽孢桿菌BYS2,能夠耐高溫、耐酸、耐膽鹽，不僅能適應(yīng)胃腸道內(nèi)環(huán)境，而且對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌具有顯著的抑制作用；專(zhuān)利CN112239735A提供了一株枯草芽孢桿菌，具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶的能力，可以降低嗜水氣單胞菌對(duì)草魚(yú)產(chǎn)生的損傷。但目前對(duì)菌種增強(qiáng)疫苗免疫效果的相關(guān)研究尚不全面，大部分相關(guān)研究是對(duì)菌種進(jìn)行基因重組后作為疫苗佐劑，如李志會(huì)等提供了將表面展示FDIBP重組枯草芽孢桿菌芽抱及大腸桿菌不耐熱毒素(LT)與人IgG(hlgG)作為佐劑共孵育制備疫苗；Hu等利用FMDV抗原位點(diǎn)表位盒基因和霍亂毒素B基因成功構(gòu)建重組芽孢桿菌，并分別口服免疫小鼠和豚鼠，研究結(jié)果表明重組孢子可以誘導(dǎo)接種動(dòng)物肺和腸灌洗液中的抗病毒IgA抗體和血清IgG抗體免疫應(yīng)答以及T淋巴細(xì)胞增值和IFN-γ分泌應(yīng)答；Mou等成功將TGEV纖突蛋白展示在芽孢表面，口服免疫約克夏仔豬后，糞便IgA和血清中IgG中和抗體滴度升高。也有部分研究從菌株中提取相應(yīng)的蛋白用于對(duì)病毒的免疫增強(qiáng)，如王小娥等采用超聲波破碎、TritonX-100處理技術(shù)提取的乳酸桿菌、地衣芽孢桿菌株OMP以不同方式、含量與新城疫病毒尿囊液混合再與油乳佐劑制成免疫原結(jié)果顯示接種添加了OMP的免疫原能明顯激發(fā)免疫應(yīng)答持續(xù)產(chǎn)生高滴度抗體能有效地抵抗相應(yīng)強(qiáng)毒的攻行重組直接用作疫苗佐劑等多方面兼具優(yōu)異的功能。4發(fā)明內(nèi)容[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一株枯草芽孢桿菌及其在提高動(dòng)物免疫力中的應(yīng)用，本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌能夠顯著耐低溫、耐高溫、耐人工胃酸、耐膽鹽、耐人工腸液；對(duì)典型的動(dòng)物腸道致病菌如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、致病性金黃色葡萄球提高動(dòng)物的消化吸收率；還能夠發(fā)揮佐劑功能，達(dá)到與傳統(tǒng)佐劑相同或更優(yōu)的免疫刺激效[0007]本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一株枯草芽孢桿菌，該菌株保藏編號(hào)為CCTCCNO:M[0008]在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述枯草芽孢桿菌使用形式包括其活菌、發(fā)酵液、菌粉中的一種或多種。[0009]本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供一種微生物菌劑，包括上述的枯草芽孢桿菌。[0010]本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供上述的枯草芽孢桿菌或上述的微生物菌劑在制備以下任意一項(xiàng)產(chǎn)品中的應(yīng)用：[0011](1)用于生產(chǎn)木聚糖酶、果糖基轉(zhuǎn)移[0012](2)用于抑制畜禽腸道致病菌；[0016]在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述用于提高畜禽免疫能力包括提高畜禽平均日增[0017]在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述畜禽腸道致病菌包括但不限于大腸桿菌、沙門(mén)氏[0018]在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述疫苗佐劑能夠與多種疫苗結(jié)合使用，增強(qiáng)免疫應(yīng)[0019]本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供一種產(chǎn)品，包括如下任意[0022]本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供一種提高畜禽免疫力的方法，給畜禽飼喂上述的枯草芽孢桿菌或上述的微生物菌劑。[0023]在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，給畜禽飼喂上述的枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌的使用形式為菌株噴干菌粉，所述菌株噴干菌粉中活菌數(shù)≥1.0×1011CFU/g。[0024]本發(fā)明的有益效果為：[0025]本發(fā)明首次報(bào)道了一株枯草芽孢桿菌，其來(lái)源于俄羅斯多年凍土中壤土的取樣，液；對(duì)典型的動(dòng)物腸道致病菌如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、致病性金黃色葡萄球菌等都具有較強(qiáng)5歧化酶(SOD)等多種酶；能夠發(fā)揮免疫佐劑功能，達(dá)到與傳統(tǒng)佐劑相同或更優(yōu)的免疫刺激效果，增強(qiáng)動(dòng)物抵抗力，減少疫病發(fā)生，提升動(dòng)物福利。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌經(jīng)過(guò)動(dòng)物免疫水平試驗(yàn)和免疫佐劑效果試驗(yàn)表明顯著提高仔豬的免疫水平，也可以達(dá)到與傳統(tǒng)佐劑相當(dāng)?shù)拇碳っ庖叩男Ч?，具有良好的?shí)際應(yīng)用價(jià)值。附圖說(shuō)明[0026]構(gòu)成本發(fā)明的一部分的說(shuō)明書(shū)附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。[0027]圖1是本發(fā)明實(shí)施例的枯草芽孢桿菌NBL-BQ218的菌落形態(tài)圖；[0028]圖2是本發(fā)明實(shí)施例的枯草芽孢桿菌NBL-BQ218的顯微鏡鏡檢形態(tài)；[0029]圖3是本發(fā)明實(shí)施例的枯草芽孢桿菌NBL-BQ218的進(jìn)化樹(shù)分析；[0030]圖4是本發(fā)明實(shí)施例的枯草芽孢桿菌NBL-BQ218的溶血性試驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施方式[0031]為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本發(fā)明的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。[0032]實(shí)施例1:菌種的分離[0033]1.1試驗(yàn)材料[0034]樣品：在薩哈(雅庫(kù)特)共和國(guó)的昆加拉地區(qū)進(jìn)行多年凍土中壤土的取樣。每個(gè)試驗(yàn)區(qū)分別從兩個(gè)不同的深度0-10cm和10-20cm各取5個(gè)樣品，共取3個(gè)試驗(yàn)區(qū)的樣品。每個(gè)樣[0037]1.2儀器與設(shè)備[0039]1.3菌株的篩選[0040]分離：取10g放于裝有90mL0.9%生理鹽水的錐形瓶中，恒溫?fù)u床30℃、180r/min平板涂布，37℃下恒溫培養(yǎng)1-2d。[0041]純化：挑取不同形態(tài)的菌落進(jìn)行純化，直至得到形態(tài)單一的純化菌落，將單菌落在斜面保存培養(yǎng)基培養(yǎng)1-2d成孢后4℃保存?zhèn)溆?。[0042]實(shí)施例2:菌種的鑒定[0043]2.1菌株的形態(tài)特征[0044]將單菌落劃線(xiàn)接種至NA平板上，將平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，30℃培養(yǎng)24h,形成[0046]將菌種送到上海生工進(jìn)行全基因組測(cè)序，使用Blast將基因預(yù)測(cè)得到的16srRNA序6列(SEQIDNO.1)NCBI的16s數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，設(shè)置參數(shù)identify>95.然后選取identify最高的前30條16srRNA序列(不足則全取),并利用muscle軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)后，采用FastTree軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilisstrain)同源性最高。將該菌株命名為NBL-BQ218。枯草芽孢桿菌NBL-BQ218(BacillussubtilisstrainNBL-BQ218)于2023年11月10日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC),保藏地址為湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，郵編為430072,保藏編號(hào)為[0048]AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTAC[0049]2.3菌種的生理生化鑒定[0051]嗜鹽性：在4%的NaCl下生長(zhǎng)。[0053]實(shí)施例3:菌種耐受性[0054]3.1膽鹽耐受性試驗(yàn)[0055]將0.3%的豬膽鹽加入到液體培養(yǎng)基(牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、蒸餾水1L、pH7.2)中，121℃高壓滅菌25min.將實(shí)施例2中的菌株NBL-BQ218接種到上述培養(yǎng)基中，377℃,搖床(180rpm)培養(yǎng)，在0、4、8、24h取樣進(jìn)行平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，計(jì)算存活率。菌株存活率(%)=N/N?×100%其中，N表示不同取樣時(shí)間的活菌數(shù)；N。表示0小時(shí)的活菌數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。表1菌株NBL-BQ218對(duì)膽鹽的耐受性時(shí)間(h)048存活率(%)10°CFU/mL以上的活菌數(shù)，具有56%左右的存活率。[0062]3.2胃酸耐受性試驗(yàn)[0063]人工胃液制備：1%胃蛋白酶(Amresco公司)、0.85%的氯化鈉溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0,然后用細(xì)菌過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。將實(shí)施例2中的菌株NBL-BQ218接種到上述人工胃液中，37℃,搖床(180rpm)培養(yǎng)，在0、4、8、24h取樣進(jìn)行平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，計(jì)算存活率。菌株存活率(%)=N/N?×100%其中，N表示不同取樣時(shí)間的活菌數(shù)；N。表示0小時(shí)的活菌數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。表2菌株NBL-BQ218對(duì)胃酸的耐受性時(shí)間(h)048存活率(%)處理后仍然有35%左右的存活率，活菌數(shù)保持在10CFU/mL以上，說(shuō)明該菌能夠耐受胃酸環(huán)[0070]3.3腸液耐受性試驗(yàn)[0071]人工腸液制備：將Na?HPO?6.8g溶解于500mL蒸餾水中，用0.4%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.8,定容到1L,121℃高壓滅菌25min后冷卻，隨后加入10g胰蛋白酶(Amresco公司)。將實(shí)施例2中的菌株NBL-BQ218接種到上述人工腸液中，37℃,搖床(180rpm)培養(yǎng)，在0、4、8、24h取樣進(jìn)行平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，計(jì)算存活率。菌株存活率(%)=N/N?×100%其中，N表示不同取樣時(shí)間的活菌數(shù)；N。表示0小時(shí)的活菌數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。表3NBL-BQ218對(duì)腸液的耐受性時(shí)間(h)048存活率(%)率保持在70%以上，表明該菌株NBL-BQ218能夠耐受人工腸液，可以在腸道中定植發(fā)揮作[0078]3.4高溫耐受性試驗(yàn)[0079]取5mL實(shí)施例2中的菌株NBL-BQ218培養(yǎng)24h后得到的培養(yǎng)液于試管中，放置于60℃8培養(yǎng)箱中處理。在菌株熱處理前、熱處理40min和熱處理60min時(shí)取樣進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算存活[0080]結(jié)果表明，菌株NBL-BQ218經(jīng)60℃熱處理40min,存活率為85.21%;經(jīng)60℃熱處理60min,存活率為62.76%。由此表明，菌株NBL-BQ218具有良好的耐高溫能力。[0081]3.5低溫耐受性試驗(yàn)[0082]將實(shí)施例2中菌株NBL-BQ218過(guò)夜培養(yǎng)，以合適的接種量接種于100mL液體培養(yǎng)基中(初始活菌數(shù)為1*10CFU/mL),分別在4℃、10℃、25℃、37℃,搖床(180rpm)培養(yǎng)18h后測(cè)定活菌數(shù)。[0084]表4菌株NBL-BQ培養(yǎng)溫度活菌數(shù)[0086]實(shí)施例4:菌種酶活測(cè)定[0087]將實(shí)施例2中的菌株NBL-BQ218按照3%的接種量，接種到液體培養(yǎng)基(牛肉膏3g、淀粉酶(參考GB8275-2009)和植酸酶(GOST31487-2012),在培養(yǎng)2d測(cè)定木聚糖酶活性(GOSTR55302-2012)和果糖基轉(zhuǎn)移酶(在55℃和pH5.5條件下，每1分鐘催化形成1μM葡萄糖的酶的數(shù)量)、蛋白酶活性(包括堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶，參考SB/T[0088]試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。蛋白酶活性(U/mL)活性(U/L)性(U/L)性(U/L)性(U/mL)堿性蛋白酶白酶中性蛋白酶123125544[0091]實(shí)施例5:菌種安全性測(cè)定[0092]1.溶血試驗(yàn)[0093]將實(shí)施例2中菌株NBL-BQ218以劃線(xiàn)方式接種于含血細(xì)胞(每10mL瓊脂加0.8mL)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1d,觀(guān)察有無(wú)環(huán)帶現(xiàn)象出現(xiàn)。[0094]結(jié)果表明(圖4),接種菌株周?chē)鸁o(wú)環(huán)帶出現(xiàn)，菌株NBL-BQ218無(wú)溶血性。[0095]2.小鼠安全性試驗(yàn)[0096]將實(shí)施例2中的菌株NBL-BQ218發(fā)酵噴干形成菌粉，活菌數(shù)為1000億CFU/g。選取健康昆明白小鼠40只，雌雄各半，按照體重隨機(jī)分成兩組，每組10只。試9灌胃5000mg/kg菌粉，24h內(nèi)分兩次灌胃)和對(duì)照組(每只小鼠灌等量的生理鹽水)。試驗(yàn)前，小鼠隔夜禁食16h,不禁水。給藥后立即觀(guān)察動(dòng)物的中毒表現(xiàn)和死亡情況，其后每日至少觀(guān)織臟器是否異常。[0097]試驗(yàn)結(jié)果如表6和表7所示。性別處理數(shù)量(只)體重(g)0天7天雌實(shí)驗(yàn)組雄實(shí)驗(yàn)組性別處理數(shù)量(只)死亡率(%)臨床癥狀觀(guān)察實(shí)驗(yàn)組00未見(jiàn)異常實(shí)驗(yàn)組0000未見(jiàn)異常未見(jiàn)異常00未見(jiàn)異常[0103]由表6和表7可知，小鼠在灌胃菌粉后14d觀(guān)察期內(nèi)未見(jiàn)任何中毒癥狀和死亡情況，且各性別動(dòng)物呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。觀(guān)察期后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行剖檢，未發(fā)現(xiàn)器官及組織有異常癥狀，表[0104]實(shí)施例6:抑菌效果試驗(yàn)[0105]將實(shí)施例2中的菌株NBL-BQ218接種于50mLNB培養(yǎng)基(青島海博)中，37℃,搖床(180rpm)培養(yǎng)24h,結(jié)束后，5000rpm離心20min,利用上清液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。[0106]將常見(jiàn)動(dòng)物病原菌大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、嗜水氣單胞菌作為指示菌，分別于45℃的胰蛋白胨大豆瓊脂TSA(青島海博)培養(yǎng)基混合均勻倒入平皿中。待培養(yǎng)基冷卻之后用打孔器以0.7cm直徑在培養(yǎng)基上打孔，每孔加入80μL上清液至不溢出。37℃培養(yǎng)24h觀(guān)察并測(cè)定各抑菌圈大小。[0107]試驗(yàn)結(jié)果如表8所示。[0108]表8菌株NBL-BQ218對(duì)動(dòng)物常見(jiàn)病原菌的抑制作用大腸桿菌沙門(mén)氏菌金黃色葡萄球菌產(chǎn)氣莢膜梭菌嗜水氣單胞菌菌、嗜水氣單胞菌等常見(jiàn)動(dòng)物病原菌均具有較好的抑制作用。[0111]實(shí)施例7:菌株對(duì)仔豬免疫水平的測(cè)定[0113]選用(30±2)日齡、平均體重為(8.15±0.05)kg的斷奶仔豬60頭，隨機(jī)分為2組，空組飼喂基礎(chǔ)日糧；試驗(yàn)處理組在每噸基礎(chǔ)日糧中添加NBL-BQ218菌粉，使日糧中益生菌的含和飲水，驅(qū)蟲(chóng)、消毒及免疫均按豬場(chǎng)常規(guī)飼養(yǎng)管理程序進(jìn)行?；A(chǔ)日糧參照NRC(2012)標(biāo)準(zhǔn)配制?；A(chǔ)日糧各組分及含量如表9所示。[0114]表9基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分(風(fēng)干基礎(chǔ))11原料組成含量(%)玉米豆粕魚(yú)粉乳清粉豆油食鹽磷酸氫鈣葡萄糖檸檬酸5.005.001.000.401.201.50碳酸鈣賴(lài)氨酸蛋氨酸蘇氨酸色氨酸石粉氯化膽堿預(yù)混料合計(jì)營(yíng)養(yǎng)成分②消化能(MJ/kg)粗蛋白質(zhì)(%)鈣(%)總磷(%)有效磷(%)賴(lài)氨酸(%)蛋氨酸(%)蘇氨酸(%)色氨酸(%)0.710.600.451.240.400.7015mg,硒：0.3mg,碘：0.4mg,維生素A:6000IU,維生素D?:400IU,維生素E:50IU,維生素K?:2mg,維生素B?:3.5mg,維生素B?:5.5mg,維生素B?:3.5mg,維生素B??:25.0μg,生物素：[0119]生長(zhǎng)性能：試驗(yàn)全程以欄為單位記錄采食量，第1和28d對(duì)每頭仔豬空腹稱(chēng)重，計(jì)算1～28d的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADF1)及料重比(F/G)。具體計(jì)算方法：ADG=欄總增重/(欄仔豬數(shù)×試驗(yàn)天數(shù)),ADFI=欄總采食量/(欄仔豬數(shù)×試驗(yàn)天數(shù)),F/G=ADFI/[0120]腹瀉率：試驗(yàn)期內(nèi)每天分別觀(guān)察仔豬的腹瀉情況，并做好記錄。每頭仔豬腹瀉1d記為1個(gè)腹瀉頭次，試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算各組的腹瀉率(DR)。DR=[腹瀉頭次總數(shù)/(試驗(yàn)仔豬總頭數(shù)×試驗(yàn)總天數(shù))]×100%。檢測(cè)結(jié)果如表10所示。[0121]腸粘膜sIgA:在0d和28d每個(gè)處理的每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1頭豬，取空腸和回腸中段20cm,沿縱軸剪開(kāi)腸道，用冰的PBS溶液沖洗外壁和內(nèi)容物，用玻片輕輕地刮取腸黏液于10mL離心管中，加入2倍體積的0.9%生理鹽水，低溫下充分震蕩混勻30min,12000g、4℃離心20min后所獲全部上清液，-20℃凍存上清備用。利用豬分泌型免疫球蛋白A(sIgA)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)腸粘膜中的sIgA含量。檢測(cè)結(jié)果如表11所示。[0122]表10菌株NBL-BQ218對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉率的影響指標(biāo)空白對(duì)照組終末體重(kg)[0124]注：“*”表示與對(duì)照組差異顯著(P<0.05),下表同。[0125]由表10可知，各組初始體重差異均不顯著(P>0.05)。與空白對(duì)照相比，試驗(yàn)處理組終末體重、平均日增重ADG顯著提升(P<0.05);平均日采食量ADFI差異均不顯著(P>0.05),料肉比F/G和腹瀉率顯著降低(P<0.05)。表11菌株NBL-BQ218對(duì)斷奶仔豬腸粘膜sIgA水平的影響時(shí)間空白對(duì)照組空腸sIgA回腸sIgA[0129]由表11可知，28d時(shí)，試驗(yàn)處理組空腸sIgA含量比空白對(duì)照組提高7.92%,但差異不顯著(P>0.05);回腸內(nèi)容物sIgA含量顯著高于空白對(duì)照組，提高18.31%(P<0.05)。[0130]實(shí)施例8:菌株對(duì)肉雞生長(zhǎng)和免疫的影響[0132]1.1試驗(yàn)分組[0133]選用1日齡健康的肉雞，按體重?zé)o差異原則分為3個(gè)處理組。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只雞。共54只，預(yù)飼期7天。[0134]對(duì)照組(CK)飼喂基礎(chǔ)日糧；[0135]低劑量組添加菌株NBL-BQ218為5×10?CFU/g;[0136]高劑量組添加菌株NBL-BQ218為1×10?CFU/g。[0137]采用商品肉雞料作為基礎(chǔ)飼糧，自由采食和飲水。益生菌通過(guò)拌料添加。試驗(yàn)記錄每周體重和采食量。免疫程序：7天新城疫，14d法氏囊。[0138]1.2樣品采集[0139]采用商品肉雞料作為基礎(chǔ)飼糧，自由采食和飲水。記錄每天加料量，換水，每2-3天進(jìn)行試驗(yàn)拌料，清糞。益生菌通過(guò)拌料添加。試驗(yàn)記錄每周體重和采食量。[0140]1.3指標(biāo)檢測(cè)[0141]1.3.1生長(zhǎng)性能(每周統(tǒng)計(jì))[0142]試驗(yàn)肉雞每周稱(chēng)重結(jié)料，統(tǒng)計(jì)肉雞各階段平均日增重(ADG)和料重比(F:G)。[0143]1.3.2屠宰性能[0144]屠體重：放血，去羽毛、腳角質(zhì)層、趾殼和喙殼后的重量為屠體重。[0145]屠宰率(%)=屠體重/活重×100%。頭腳的重量。全凈膛率(%)=全凈膛重/活重×100%。[0147]胸肌率：沿著胸骨脊切開(kāi)皮膚并向背部剝離，用刀切離附著于胸骨脊側(cè)面的肌肉和肩胛部肌腱，即可將整塊去皮的胸肌剝離，稱(chēng)重，胸肌率=兩側(cè)胸肌/活重×100%。[0148]1.3.3免疫力測(cè)定[0149](1)免疫器官指數(shù)[0150]試驗(yàn)雞屠宰后，準(zhǔn)確摘取胸腺、脾臟和法氏囊，去除多余組織稱(chēng)鮮重，根據(jù)各免疫器官重及宰前活體重計(jì)算出其免疫器官指數(shù)，計(jì)算公式如下：[0151]免疫器官指數(shù)(g/kg)=免疫器官重量(g)/宰前活體重(kg)[0152](2)血清免疫因子(ELISA檢測(cè)試劑盒)[0154]1.3.4血清生化指標(biāo)[0155]飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，采集翅下靜脈血約5mL,37℃靜置30min,3000r/min、4℃離心15min,分離血清，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素(UREA)、總蛋白(TP)和肌酐(CREA)含量或活性。[0157]2.1不同試驗(yàn)菌株對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響[0158]表12試驗(yàn)肉雞全期生長(zhǎng)性能組別料肉比[0160]注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05),肩標(biāo)有相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。[0161]由表12可見(jiàn)，添加NBL-BQ218低劑量組(5×10?CFU/g)料肉比最低，顯著低于對(duì)照組，平均日增重最高，生長(zhǎng)性能最好。[0162]2.2不同試驗(yàn)菌株對(duì)肉雞屠宰性能的影響[0163]表13試驗(yàn)肉雞屠宰性能組別[0165]注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05),肩標(biāo)有相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。[0166]由表13可見(jiàn)，添加菌株NBL-BQ218,與對(duì)照組相比，雖然胸肌率均高于對(duì)照組，NBL-BQ218-高劑量組全凈膛率顯著高于對(duì)照組6.37%。[0167]2.3不同試驗(yàn)菌株對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響[0168]表14試驗(yàn)肉雞免疫器官指數(shù)組別[0170]注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05),肩標(biāo)有相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。[0171]由表14可見(jiàn)，添加NBL-BQ218胸腺和脾臟指數(shù)均較高，其中低劑量組脾臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組，高劑量組胸腺指數(shù)最高。[0172]2.4不同試驗(yàn)菌株對(duì)肉雞腸道相對(duì)長(zhǎng)度的影響[0173]表15試驗(yàn)肉雞腸道相對(duì)長(zhǎng)度組別空腸cm/kg回腸cm/kg[0175]注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05),肩標(biāo)有相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。[0176]添加菌株NBL-BQ218,十二指腸相對(duì)長(zhǎng)度均高于對(duì)照組；尤其是低劑量組，十二指[0177]2.5不同試驗(yàn)菌株對(duì)肉雞血清中免疫因子的影響[0178]表16試驗(yàn)肉雞血清中免疫因子水平14/18頁(yè)14/18頁(yè)組別[0180]注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05),肩標(biāo)有相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。[0182]2.7不同試驗(yàn)菌株對(duì)肉雞血糖血脂的影響[0183]表17試驗(yàn)肉雞血糖血脂的影響組別[0185]注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05),肩標(biāo)有相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。[0186]由表17可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組血糖含量均有所升高，總膽固醇TC含量均有[0187]隨添加量提高，血清中甘油三酯TG含量降低，NBL-BQ218高劑量組TG顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明具有一定的降血脂能力。[0188]2.8不同試驗(yàn)菌株對(duì)肉雞血清蛋白含量的影響[0189]表18試驗(yàn)肉雞血清中蛋白含量的影響組別[0191]注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05),肩標(biāo)有相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。[0192]總蛋白包含白蛋白和球蛋白。試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，血清蛋白水平無(wú)顯著差異，說(shuō)明試驗(yàn)菌株對(duì)肉雞蛋白代謝無(wú)不利影響。[0193]2.9不同試驗(yàn)菌株對(duì)肉雞肝功和腎功的影響[0194]表19試驗(yàn)肉雞肝功指標(biāo)組別[0196]注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05),肩標(biāo)有相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。[0197]肝功能中的谷草轉(zhuǎn)氨酶AST、谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT和堿性磷酸酶ALP偏高預(yù)示著肝臟異[0198]表20試驗(yàn)肉雞腎功指標(biāo)組別NBL-BQ218-中[0201]注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05),肩標(biāo)有相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。[0202]CREA是肌肉在體內(nèi)代謝的產(chǎn)物，血液中的CREA主要是由腎臟過(guò)濾，由尿液排出體外，CREA的水平代表腎臟功能，UREA可以反映動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收以及對(duì)氮的利用情況。腎功能中的肌酐CREA和尿素氮UREA升高則反應(yīng)則提示腎臟排毒功能出現(xiàn)問(wèn)題，腎臟功異。[0203]實(shí)施例9:菌株免疫增強(qiáng)效果試驗(yàn)[0205]將60只1日齡三黃雞隨機(jī)分成2組，每組30只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中添加10?CFU/g的菌粉。1～3周齡：粗蛋白20.79%,代謝能12.26MJ/kg,鈣0.94%,磷0.64%,有效磷0.48%,賴(lài)氨酸1.10%,蛋氨酸0.44%,粗纖維4.66%;4周齡：粗蛋白18.30%,代謝能12.43MJ/kg,鈣0.88%,磷0.63%,有效磷0.46%,賴(lài)氨酸0.95%,蛋氨酸0.35%,粗纖維5.0%。[0206]將三黃雞喂養(yǎng)于飼養(yǎng)籠中，用白熾燈控制溫度為30℃左右恒溫，在7日齡用新城疫IV系弱毒疫苗滴鼻進(jìn)行首次免疫，21日齡進(jìn)行2次免疫。[0207]雛雞飼喂至28日齡時(shí)，每組隨機(jī)取5只放血?dú)⑺?，采?～10mL,快速取出胸腺、脾腺、脾臟、法氏囊重量計(jì)算器官系數(shù)(器官系數(shù)=器官濕重：體重)。[0208]試驗(yàn)結(jié)果如表21和表22所示。[0209]表21菌株對(duì)肉雞免疫器官的影響法氏囊指數(shù)[0212]由表21可知，試驗(yàn)組免疫器官指數(shù)均高于對(duì)照組，其中胸腺指數(shù)提升10.3%,脾臟指數(shù)提升18.2%,法氏囊指數(shù)提升11.2%。[0213]表22菌株對(duì)肉雞新城疫血凝抑制價(jià)的影響[0214]組別X±SEX試驗(yàn)-X對(duì)照處理組4.12±0.551.17對(duì)照組2.95±0.43/[0215]由表22可知，試驗(yàn)組對(duì)新城照組快。[0216]實(shí)施例10:NBL-BQ218增強(qiáng)新城疫抗體效價(jià)[0217]1.試驗(yàn)動(dòng)物：7日齡的蛋雞60只[0218]2.材料與試劑：96孔V型微量反應(yīng)板、微量振蕩器、1%紅細(xì)胞懸液、生理鹽水、微量LaSota株弱毒；新城疫血凝抗原等。[0219]3.抗原制備：將雞新城疫LaSota株接種9～11日齡雞胚，收獲尿囊液，經(jīng)檢測(cè)血凝價(jià)(HA)ND≥1:640病毒含量在尿腔內(nèi)注射的感染量≥10?EID50/0.1mL,可用于試驗(yàn)。[0220]4.抗