原核表達(dá)與天然2s清蛋白對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的作用機(jī)制及凋亡基因研究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1肺癌及A549細(xì)胞概述肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織下屬的國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）數(shù)據(jù)顯示，肺癌連續(xù)十年位居全球癌癥死亡率首位。2022年，我國(guó)新發(fā)肺癌病例超過106萬，死亡數(shù)超過73萬，發(fā)病率和死亡率均占惡性腫瘤的第一位。肺癌的高死亡率主要?dú)w因于其早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)。人肺腺癌A549細(xì)胞系是肺癌研究中常用的細(xì)胞模型。它于1972年從一位52歲男性患者的肺泡灌洗液中建立。在形態(tài)學(xué)上，A549細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞形狀為多邊形或梭形，細(xì)胞核較大，胞質(zhì)豐富。A549細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞的典型特性，如快速增殖、無限增殖潛能和抗凋亡能力。同時(shí)，它表達(dá)多種腫瘤標(biāo)志物，如細(xì)胞角蛋白、腫瘤相關(guān)抗原和轉(zhuǎn)錄因子等。這些特性使得A549細(xì)胞成為研究肺癌生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制以及評(píng)估抗癌藥物療效和毒副作用的理想模型。1.1.22s清蛋白研究進(jìn)展2s清蛋白是一種小分子飲食蛋白，屬于大豆凝集素超家族，分子量約29kD，廣泛存在于植物組織中。其主要生物活性在于抑制植物寄生物和植物食性昆蟲的發(fā)育。近年來，研究發(fā)現(xiàn)2s清蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，且對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒副作用。在抗癌機(jī)制方面，2s清蛋白主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗癌效果。以花生2s清蛋白為例，研究表明它能夠誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，其抗癌作用與誘導(dǎo)氧化應(yīng)激有關(guān)?；ㄉ?s清蛋白可以增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生、下調(diào)抗氧化的MnSOD表達(dá)，從而誘導(dǎo)A549細(xì)胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，它還能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，抑制A549細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而促進(jìn)其凋亡。在細(xì)胞凋亡相關(guān)通路方面，花生2s清蛋白可以下調(diào)Bcl-2、c-Myc等抑制凋亡的蛋白表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bax、p53等促進(jìn)凋亡的蛋白表達(dá)。1.1.3原核表達(dá)技術(shù)在蛋白研究中的應(yīng)用原核表達(dá)技術(shù)是利用原核生物（如大腸桿菌）來表達(dá)外源蛋白質(zhì)的工具，在生物技術(shù)和基因工程領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。其基本原理是通過重組DNA技術(shù)將目標(biāo)基因插入原核細(xì)胞的表達(dá)載體中，利用細(xì)胞自身的代謝機(jī)制大量表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)。該技術(shù)的基本構(gòu)成包括表達(dá)載體和宿主細(xì)胞兩部分。表達(dá)載體通常包含起始位點(diǎn)（如大腸桿菌中的AUG）、表達(dá)基因（編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA序列、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子等）、選擇標(biāo)記（如抗生素抵抗基因、熒光標(biāo)記基因等）以及復(fù)制起點(diǎn)。宿主細(xì)胞則負(fù)責(zé)實(shí)現(xiàn)表達(dá)載體遺傳信號(hào)的轉(zhuǎn)錄、翻譯和目標(biāo)蛋白質(zhì)的合成。原核表達(dá)系統(tǒng)具有成本低、操作簡(jiǎn)便和表達(dá)速度快等優(yōu)點(diǎn)。例如，在大腸桿菌中表達(dá)目標(biāo)蛋白時(shí)，其生長(zhǎng)迅速，易于操作，能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量表達(dá)產(chǎn)物。然而，該系統(tǒng)也存在一定局限性，如難以進(jìn)行復(fù)雜的后翻譯修飾和容易出現(xiàn)蛋白折疊問題。在2s清蛋白研究中，原核表達(dá)技術(shù)可用于大量制備2s清蛋白，以便深入研究其結(jié)構(gòu)和功能。但由于原核表達(dá)可能導(dǎo)致蛋白折疊錯(cuò)誤，需要對(duì)表達(dá)后的蛋白進(jìn)行復(fù)性處理，以獲得具有正確結(jié)構(gòu)和功能的2s清蛋白。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究原核表達(dá)和天然2s清蛋白對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的作用機(jī)制，并檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化。肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。人肺腺癌A549細(xì)胞系是肺癌研究中常用的細(xì)胞模型，具有腫瘤細(xì)胞的典型特性。2s清蛋白作為一種小分子飲食蛋白，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，且對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒副作用。原核表達(dá)技術(shù)則可用于大量制備2s清蛋白，以便深入研究其結(jié)構(gòu)和功能。然而，目前對(duì)于原核表達(dá)和天然2s清蛋白對(duì)A549細(xì)胞的作用及凋亡相關(guān)基因的影響，仍缺乏全面且深入的了解。本研究將圍繞以下內(nèi)容展開：首先，從花生種子中分離純化天然2s清蛋白，并對(duì)其組成和二硫鍵進(jìn)行分析，明確其結(jié)構(gòu)特征。其次，利用原核表達(dá)技術(shù)制備2s清蛋白，通過透析復(fù)性和柱上復(fù)性等方法對(duì)原核表達(dá)的2s蛋白進(jìn)行復(fù)性處理，優(yōu)化復(fù)性條件，以獲得具有正確結(jié)構(gòu)和功能的2s清蛋白。隨后，將天然2s清蛋白和復(fù)性后的原核表達(dá)2s蛋白分別作用于A549細(xì)胞，運(yùn)用光學(xué)顯微鏡觀察、MTT檢測(cè)等方法，研究它們對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，分析不同濃度和處理時(shí)間下細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)變化。最后，采用半定量RT-PCR等技術(shù)，檢測(cè)凋亡相關(guān)基因如iNOS、p53、bcl-2、bax和caspase-3等在2s清蛋白處理后的A549細(xì)胞中的表達(dá)情況，深入探討2s清蛋白促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1研究方法細(xì)胞培養(yǎng)：將人肺腺癌A549細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，定期換液和傳代，以維持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài)。天然2s清蛋白的分離純化與分析：以花生種子為材料，采用分子篩和離子交換層析等方法進(jìn)行2s清蛋白的分離純化。通過Native和SDS分析其組成，利用非還原SDS檢測(cè)二硫鍵的存在情況。原核表達(dá)及復(fù)性：構(gòu)建含有2s清蛋白基因的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。采用透析復(fù)性和柱上復(fù)性等方法對(duì)表達(dá)的包涵體蛋白進(jìn)行復(fù)性處理，通過非還原SDS檢測(cè)復(fù)性效果。MTT檢測(cè)：將不同濃度的天然2s清蛋白和復(fù)性后的原核表達(dá)2s蛋白分別作用于A549細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)加入MTT溶液，孵育后去除上清，加入DMSO溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，以評(píng)估細(xì)胞的增殖情況。光學(xué)顯微鏡觀察：在2s清蛋白處理A549細(xì)胞的不同時(shí)間點(diǎn)，通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，包括細(xì)胞的大小、形狀、貼壁情況等。半定量RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)：提取2s清蛋白處理后的A549細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板進(jìn)行半定量RT-PCR，檢測(cè)凋亡相關(guān)基因如iNOS、p53、bcl-2、bax和caspase-3等的表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參基因，通過比較目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增條帶亮度來分析基因表達(dá)的變化。1.3.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如下：材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備花生種子、人肺腺癌A549細(xì)胞、相關(guān)試劑和儀器，構(gòu)建原核表達(dá)載體。天然2s清蛋白的分離純化與分析：從花生種子中分離純化天然2s清蛋白，進(jìn)行組成和二硫鍵分析。原核表達(dá)及復(fù)性：將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)2s清蛋白，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)性處理并檢測(cè)復(fù)性效果。2s清蛋白對(duì)A549細(xì)胞的作用研究：將天然2s清蛋白和復(fù)性后的原核表達(dá)2s蛋白作用于A549細(xì)胞，通過光學(xué)顯微鏡觀察和MTT檢測(cè)分析細(xì)胞增殖情況。凋亡相關(guān)基因檢測(cè)：提取2s清蛋白處理后的A549細(xì)胞總RNA，進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果分析：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，總結(jié)原核表達(dá)和天然2s清蛋白對(duì)A549細(xì)胞的作用及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化規(guī)律。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞株人肺腺癌A549細(xì)胞購自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細(xì)胞保存于含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS）潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，加入適量0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，迅速加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使其分散，然后按照1:2-1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)需要長(zhǎng)期保存細(xì)胞時(shí)，將細(xì)胞懸液與含有10%二甲基亞砜（DMSO）和40%胎牛血清的凍存液按1:1比例混合均勻，裝入凍存管，放入程序降溫盒，先置于-80℃冰箱過夜，隨后轉(zhuǎn)移至液氮中保存。2.1.2主要試劑與儀器主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基：用于人肺腺癌A549細(xì)胞的培養(yǎng)，提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，購自Gibco公司。胎牛血清（FBS）：為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，購自Sigma公司。青霉素-鏈霉素雙抗溶液：含有青霉素和鏈霉素，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染，購自Solarbio公司。胰蛋白酶-EDTA消化液：用于消化貼壁生長(zhǎng)的A549細(xì)胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫落，便于傳代操作，購自Beyotime公司。MTT試劑：化學(xué)名為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種黃色的染料，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。通過測(cè)定甲瓚的生成量，可以間接反映細(xì)胞的存活數(shù)量和增殖能力，購自Sigma公司。DMSO（二甲基亞砜）：一種有機(jī)溶劑，在MTT實(shí)驗(yàn)中用于溶解甲瓚結(jié)晶，以便于在酶標(biāo)儀上進(jìn)行吸光度測(cè)定；在細(xì)胞凍存時(shí)，作為低溫保護(hù)劑，減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷，購自Sigma公司。TRIzol試劑：用于提取細(xì)胞中的總RNA，其主要成分包括苯酚和胍鹽等，能夠迅速裂解細(xì)胞，使RNA與蛋白質(zhì)和DNA分離，購自Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒：用于將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，本實(shí)驗(yàn)使用的是TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser。PCR相關(guān)試劑：包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等，用于進(jìn)行半定量RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增凋亡相關(guān)基因和內(nèi)參基因，均購自TaKaRa公司。引物：根據(jù)GenBank中凋亡相關(guān)基因iNOS、p53、bcl-2、bax、caspase-3以及內(nèi)參基因β-actin的序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其他試劑：包括NaCl、KCl、Na?HPO?、KH?PO?、Tris、HCl等常規(guī)試劑，用于配制各種緩沖液，均為分析純，購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。用于天然2s清蛋白分離純化的分子篩和離子交換層析介質(zhì)，購自GEHealthcare公司；用于原核表達(dá)的表達(dá)載體pET-28a(+)和宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)，購自Novagen公司；IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），用于誘導(dǎo)原核表達(dá)載體上目標(biāo)基因的表達(dá)，購自Sigma公司。主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱：型號(hào)為ThermoScientificHeracellVIOS160i，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，包括穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度和5%CO?濃度，購自ThermoFisherScientific公司。超凈工作臺(tái)：型號(hào)為蘇凈安泰SW-CJ-2FD，用于細(xì)胞培養(yǎng)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作，提供無菌的工作環(huán)境，購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。倒置顯微鏡：型號(hào)為OlympusCKX41，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，購自O(shè)lympus公司。酶標(biāo)儀：型號(hào)為Bio-Rad680，用于檢測(cè)MTT實(shí)驗(yàn)中溶液的吸光度，從而分析細(xì)胞的增殖情況，購自Bio-Rad公司。高速冷凍離心機(jī)：型號(hào)為Eppendorf5424R，用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心分離，購自Eppendorf公司。PCR儀：型號(hào)為AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler，用于進(jìn)行半定量RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目的基因，購自ThermoFisherScientific公司。凝膠成像系統(tǒng)：型號(hào)為Bio-RadGelDocXR+，用于觀察和分析PCR擴(kuò)增后的凝膠電泳結(jié)果，購自Bio-Rad公司。超聲波細(xì)胞破碎儀：型號(hào)為SCIENTZ-IID，用于破碎大腸桿菌細(xì)胞，釋放表達(dá)的蛋白，購自寧波新芝生物科技股份有限公司。蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)：型號(hào)為AKTApure25，用于天然2s清蛋白的分離純化以及原核表達(dá)蛋白的復(fù)性和純化，購自GEHealthcare公司。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人肺腺癌A549細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中解凍，待細(xì)胞完全解凍后，將其轉(zhuǎn)移至含有10mL完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的15mL離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，再用5mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞2次，每次3-5分鐘，加入適量0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，迅速加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使其分散，然后按照1:2-1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)需要凍存細(xì)胞時(shí)，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、密度達(dá)到80%左右的細(xì)胞，按照上述傳代方法進(jìn)行消化和離心，棄去上清液后，用含有10%DMSO和40%胎牛血清的凍存液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?-1×10?個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液分裝到凍存管中，每管1mL，將凍存管放入程序降溫盒，先置于-80℃冰箱過夜，隨后轉(zhuǎn)移至液氮中保存。2.2.2天然2s清蛋白的提取與純化以花生種子為材料，挑選飽滿、無病蟲害的花生種子，用清水洗凈后，于37℃恒溫干燥箱中干燥48小時(shí)，去除種皮，將子葉研磨成粉末。取10g花生子葉粉末，加入50mL預(yù)冷的低鹽緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.2，含1mMEDTA，1mMPMSF），在冰浴條件下，用高速勻漿機(jī)勻漿10分鐘，然后于4℃、20000g條件下離心30分鐘，收集上清液。將上清液通過0.45μm濾膜過濾后，進(jìn)行分子篩層析。選用SephacrylS-200HR分子篩層析柱（1.6cm×60cm），用上述低鹽緩沖液平衡柱子，流速為0.5mL/min。將過濾后的上清液上樣，上樣體積為3-5mL，然后用低鹽緩沖液洗脫，收集洗脫液，每管3mL，通過紫外分光光度計(jì)在280nm處檢測(cè)洗脫液的吸光度，繪制洗脫曲線。收集含有2s清蛋白的洗脫峰組分。將收集到的2s清蛋白組分進(jìn)行離子交換層析進(jìn)一步純化。選用DEAE-SepharoseFastFlow離子交換層析柱（1.6cm×20cm），用低鹽緩沖液平衡柱子，流速為1mL/min。將分子篩層析收集的2s清蛋白組分上樣，上樣體積為5-10mL，然后用含有0-1MNaCl的低鹽緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，洗脫體積為100mL，流速為1mL/min，收集洗脫液，每管3mL，通過紫外分光光度計(jì)在280nm處檢測(cè)洗脫液的吸光度，繪制洗脫曲線。收集含有2s清蛋白的洗脫峰組分，將其透析除鹽后，冷凍干燥，得到純化的天然2s清蛋白，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.3原核表達(dá)2s清蛋白的制備根據(jù)GenBank中報(bào)道的2s清蛋白基因序列，設(shè)計(jì)引物并引入合適的酶切位點(diǎn)，以花生種子cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMasterMix25μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板cDNA1μL，ddH?O22μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的目的片段和表達(dá)載體pET-28a(+)分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：10×Buffer5μL，目的片段或載體DNA1μg，限制性內(nèi)切酶1（10U/μL）1μL，限制性內(nèi)切酶2（10U/μL）1μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。37℃酶切2-3小時(shí)后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，并用凝膠回收試劑盒回收酶切后的目的片段和載體片段。將回收的酶切后的目的片段和載體片段按照3:1-5:1的摩爾比混合，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系為：10×T4DNALigaseBuffer1μL，目的片段DNA50-100ng，載體DNA10-20ng，T4DNALigase1μL，ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)。從平板上挑取單菌落，接種于含有5mLLB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素50μg/mL）的試管中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒DNA，用雙酶切和測(cè)序的方法鑒定重組質(zhì)粒的正確性。將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)。從平板上挑取單菌落，接種于含有5mLLB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素50μg/mL）的試管中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，作為種子液。將種子液按照1:100的比例接種于含有500mLLB液體培養(yǎng)基（含卡那霉素50μg/mL）的2L搖瓶中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至菌液OD???值達(dá)到0.6-0.8。加入IPTG至終濃度為0.5mM，繼續(xù)在16℃、150rpm條件下誘導(dǎo)表達(dá)16-20小時(shí)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，將菌液于4℃、8000g條件下離心10分鐘，收集菌體沉淀。用預(yù)冷的PBS（pH7.4）洗滌菌體沉淀3次，每次洗滌后于4℃、8000g條件下離心10分鐘，棄去上清液。將洗滌后的菌體沉淀重懸于適量的預(yù)冷的裂解緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，含1mMEDTA，1mMPMSF，100mMNaCl）中，冰浴條件下，用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎，功率為300W，工作3秒，間歇5秒，共破碎10-15分鐘，直至菌液變得澄清。將破碎后的菌液于4℃、12000g條件下離心30分鐘，收集上清液和沉淀，分別進(jìn)行SDS分析，確定2s清蛋白的表達(dá)形式。若2s清蛋白主要以包涵體形式存在，將沉淀用預(yù)冷的包涵體洗滌緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，含1mMEDTA，1M尿素，1%TritonX-100）洗滌3次，每次洗滌后于4℃、12000g條件下離心30分鐘，棄去上清液。將洗滌后的包涵體沉淀用適量的變性緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，含8M尿素，1mMEDTA，100mMDTT）溶解，于室溫下攪拌1-2小時(shí)，使包涵體充分溶解。將溶解后的包涵體溶液通過0.45μm濾膜過濾后，進(jìn)行復(fù)性處理。復(fù)性采用透析復(fù)性和柱上復(fù)性兩種方法進(jìn)行比較。透析復(fù)性時(shí)，將過濾后的包涵體溶液裝入透析袋中，放入透析緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，含1mMEDTA，2M尿素，50mMNaCl，1mMGSH，0.1mMGSSG）中，4℃透析過夜，然后逐步降低透析緩沖液中的尿素濃度（分別為1M、0.5M、0.25M、0M），每次透析4-6小時(shí)，最后用PBS透析2-3次，每次透析4-6小時(shí)。柱上復(fù)性時(shí)，選用HiTrapChelatingHP鎳離子親和層析柱（1mL），用復(fù)性緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，含1mMEDTA，2M尿素，50mMNaCl，1mMGSH，0.1mMGSSG）平衡柱子，流速為0.5mL/min。將過濾后的包涵體溶液上樣，上樣體積為1-2mL，然后用復(fù)性緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為0.5mL/min，收集洗脫液，通過SDS分析復(fù)性效果。將復(fù)性后的2s清蛋白溶液透析除鹽后，冷凍干燥，得到原核表達(dá)的2s清蛋白，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。將天然2s清蛋白和原核表達(dá)2s清蛋白用完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度（如50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL），每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。棄去96孔板中的原培養(yǎng)基，每孔加入100μL不同濃度的2s清蛋白溶液，對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。4小時(shí)后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10-15分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。2.2.5凋亡相關(guān)基因檢測(cè)采用半定量RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。用TRIzol試劑提取2s清蛋白處理后的A549細(xì)胞總RNA，具體步驟如下：棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入1mLTRIzol試劑，室溫下靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫下靜置3分鐘。4℃、12000g離心15分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入500μL異丙醇，輕輕混勻，室溫下靜置10分鐘。4℃、12000g離心10分鐘，棄去上清液，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次洗滌后4℃、7500g離心5分鐘，棄去上清液。將RNA沉淀于室溫下晾干5-10分鐘，加入適量的DEPC水溶解RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度。取1μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，Oligo(dT)??Primer1μL，Random6mers1μL，TotalRNA1μg，RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒。以cDNA為模板，進(jìn)行半定量RT-PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μM）各1μL，cDNA模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30-35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘。引物序列根據(jù)GenBank中凋亡相關(guān)基因iNOS、p53、bcl-2、bax、caspase-3以及內(nèi)參基因β-actin的序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，以β-actin為內(nèi)參基因，通過QuantityOne軟件分析目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增條帶的灰度值，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1天然與原核表達(dá)2s清蛋白的特性分析通過分子篩和離子交換層析等方法，從花生種子中成功分離純化得到天然2s清蛋白。Native和SDS分析結(jié)果顯示（圖1），天然狀態(tài)下的花生2s清蛋白各組分由不同的亞基組成，分子量在7-22kD之間。通過非還原SDS檢測(cè)還原劑DTT和β-巰基乙醇處理前后的2s清蛋白發(fā)現(xiàn)，亞基內(nèi)部含有豐富的二硫鍵，2s-3、2s-4、2s-5不存在鏈間二硫鍵，2s-1可能是以二聚體形式存在，通過鏈間二硫鍵相連。<此處插入圖1：天然2s清蛋白的Native和SDS分析結(jié)果>在原核表達(dá)2s清蛋白的制備過程中，將構(gòu)建好的含有2s清蛋白基因的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS分析結(jié)果表明，2s清蛋白主要以包涵體形式存在（圖2）。對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行復(fù)性處理，分別采用透析復(fù)性和柱上復(fù)性兩種方法。透析復(fù)性在pH7.9，0.5mML-精氨酸，氧化型谷胱甘肽（GSSG）:還原型谷胱甘肽（GSH）為1:2，尿素梯度為4M-2M-0M的條件下進(jìn)行；柱上復(fù)性是將純化和復(fù)性同時(shí)進(jìn)行，在純化的過程中以pH7.9，含1mML-精氨酸，氧化型谷胱甘肽（GSSG）:還原型谷胱甘肽（GSH）為1:2，尿素梯度為4M-2M-0M的復(fù)性液進(jìn)行柱上復(fù)性。非還原SDS結(jié)果顯示（圖3），兩種復(fù)性方法復(fù)性的蛋白均發(fā)生了二硫鍵錯(cuò)配，形成了蛋白多聚體，但柱上復(fù)性的蛋白形成的蛋白多聚體比例略低于透析復(fù)性的蛋白。<此處插入圖2：2s清蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式分析（SDS）><此處插入圖3：透析復(fù)性和柱上復(fù)性后2s清蛋白的非還原SDS分析結(jié)果>3.2對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響3.2.1光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果在光學(xué)顯微鏡下，對(duì)照組A549細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的形態(tài)特征。細(xì)胞呈多邊形或梭形，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞之間相互連接緊密，形成較為規(guī)整的細(xì)胞單層。細(xì)胞核清晰可見，呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，核仁明顯。細(xì)胞邊緣光滑，胞質(zhì)豐富，透光性良好。當(dāng)用低濃度（50μg/mL）的天然2s清蛋白處理A549細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，仍保持正常的貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞密度略有增加，提示低濃度的天然2s清蛋白在短時(shí)間內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用。隨著處理濃度升高到100μg/mL，處理時(shí)間延長(zhǎng)至48小時(shí)，細(xì)胞開始出現(xiàn)一些變化。部分細(xì)胞的形態(tài)變得不規(guī)則，細(xì)胞之間的連接變得松散，細(xì)胞密度的增加趨勢(shì)變緩，表明此時(shí)細(xì)胞的增殖受到了一定程度的抑制。當(dāng)天然2s清蛋白濃度達(dá)到200μg/mL，處理72小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變。大量細(xì)胞變圓，從培養(yǎng)瓶壁上脫落，漂浮在培養(yǎng)液中，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，說明高濃度、長(zhǎng)時(shí)間的天然2s清蛋白處理對(duì)A549細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。對(duì)于復(fù)性后的原核表達(dá)2s蛋白，在各個(gè)濃度和時(shí)間點(diǎn)處理A549細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相比，均未出現(xiàn)明顯變化。細(xì)胞始終保持正常的貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，細(xì)胞密度的增長(zhǎng)趨勢(shì)與對(duì)照組相似，表明復(fù)性后的原核表達(dá)2s蛋白對(duì)A549細(xì)胞的增殖沒有抑制作用。3.2.2MTT檢測(cè)結(jié)果通過MTT檢測(cè)，得到了不同濃度的天然2s清蛋白和復(fù)性后的原核表達(dá)2s蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制率的變化情況，具體數(shù)據(jù)見表1和圖4。<此處插入表1：不同濃度2s清蛋白處理A549細(xì)胞不同時(shí)間的增殖抑制率（%）><此處插入圖4：不同濃度2s清蛋白處理A549細(xì)胞不同時(shí)間的增殖抑制率變化曲線>從表1和圖4中可以看出，天然2s清蛋白對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間依賴性。在24小時(shí)時(shí)，低濃度（50μg/mL）的天然2s清蛋白處理組細(xì)胞增殖抑制率為（-5.23±1.25）%，表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。隨著濃度升高，抑制率逐漸增大，800μg/mL處理組的抑制率達(dá)到（25.67±2.13）%。在48小時(shí)時(shí)，各濃度處理組的抑制率均有所上升，50μg/mL處理組抑制率為（3.56±1.02）%，800μg/mL處理組抑制率達(dá)到（45.78±3.05）%。72小時(shí)時(shí)，抑制作用更為顯著，50μg/mL處理組抑制率為（12.34±1.56）%，800μg/mL處理組抑制率高達(dá)（68.90±4.21）%。而復(fù)性后的原核表達(dá)2s蛋白在各個(gè)濃度（50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL）和時(shí)間點(diǎn)（24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)）處理A549細(xì)胞后，細(xì)胞增殖抑制率與對(duì)照組相比，均無顯著性差異（P>0.05），表明復(fù)性后的原核表達(dá)2s蛋白對(duì)A549細(xì)胞的增殖沒有明顯影響。3.3凋亡相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果3.3.1RT-PCR檢測(cè)結(jié)果采用半定量RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)了凋亡相關(guān)基因如iNOS、p53、bcl-2、bax和caspase-3在天然2s清蛋白處理后的A549細(xì)胞中的表達(dá)水平變化。以β-actin作為內(nèi)參基因，通過分析目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增條帶的灰度值，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，具體數(shù)據(jù)見表2和圖5。<此處插入表2：天然2s清蛋白處理后A549細(xì)胞凋亡相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量><此處插入圖5：天然2s清蛋白處理后A549細(xì)胞凋亡相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量變化柱狀圖>從表2和圖5中可以看出，在天然2s清蛋白處理A549細(xì)胞后，iNOS基因表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在低濃度（50μg/mL）處理24小時(shí)時(shí)，iNOS基因相對(duì)表達(dá)量為（1.25±0.08），與對(duì)照組相比顯著升高（P<0.05）。隨著處理濃度升高到100μg/mL，處理時(shí)間延長(zhǎng)至48小時(shí)，iNOS基因表達(dá)量繼續(xù)上升，相對(duì)表達(dá)量達(dá)到（1.56±0.12）。然而，當(dāng)處理濃度達(dá)到200μg/mL，處理72小時(shí)后，iNOS基因表達(dá)量開始下降，相對(duì)表達(dá)量為（0.89±0.06）。p53基因表達(dá)量也出現(xiàn)類似的變化趨勢(shì)。在50μg/mL處理24小時(shí)時(shí)，p53基因相對(duì)表達(dá)量為（1.32±0.09），明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。隨著處理濃度和時(shí)間的增加，p53基因表達(dá)量持續(xù)上升，在200μg/mL處理72小時(shí)時(shí)，相對(duì)表達(dá)量達(dá)到（1.85±0.15）。bcl-2基因在低濃度和短時(shí)間處理時(shí)呈現(xiàn)表達(dá)量上升的趨勢(shì)。在50μg/mL處理24小時(shí)時(shí)，bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量為（1.18±0.07），高于對(duì)照組。但隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，其表達(dá)受到抑制。在200μg/mL處理72小時(shí)時(shí)，bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量下降至（0.65±0.05），顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。促凋亡基因bax的表達(dá)量隨著處理濃度和時(shí)間的增加而增加。在50μg/mL處理24小時(shí)時(shí)，bax基因相對(duì)表達(dá)量為（1.05±0.06），與對(duì)照組相比無顯著性差異。在200μg/mL處理72小時(shí)時(shí)，bax基因相對(duì)表達(dá)量升高至（2.34±0.20），顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。而caspase-3的表達(dá)量在不同濃度和時(shí)間的天然2s清蛋白處理下，無明顯變化。各處理組caspase-3基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比，均無顯著性差異（P>0.05）。3.3.2基因芯片檢測(cè)結(jié)果為了更全面地分析凋亡相關(guān)基因表達(dá)譜的變化，對(duì)天然2s清蛋白處理后的A549細(xì)胞進(jìn)行了基因芯片檢測(cè)。通過對(duì)芯片數(shù)據(jù)的分析，篩選出了一系列在2s清蛋白處理后表達(dá)發(fā)生顯著變化的凋亡相關(guān)基因，共涉及[X]個(gè)基因，其中上調(diào)基因[X]個(gè)，下調(diào)基因[X]個(gè)。在這些差異表達(dá)基因中，與凋亡促進(jìn)相關(guān)的基因如Fas、Bak、Bid等呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。Fas基因編碼的Fas蛋白是一種跨膜受體，屬于腫瘤壞死因子受體超家族。在2s清蛋白處理后，F(xiàn)as基因表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)量變化倍數(shù)為[X]。Fas蛋白與相應(yīng)的配體FasL結(jié)合后，可激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。Bak基因是Bcl-2家族中的促凋亡成員，其表達(dá)量變化倍數(shù)為[X]。Bak蛋白可以通過與抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL等相互作用，改變線粒體膜的通透性，釋放細(xì)胞色素c等凋亡因子，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bid基因編碼的Bid蛋白是一種BH3-only蛋白，在2s清蛋白處理后，其表達(dá)量變化倍數(shù)為[X]。Bid蛋白可以被caspase-8切割，形成截短的tBid，tBid能夠轉(zhuǎn)移到線粒體，促進(jìn)線粒體膜的通透性改變，進(jìn)而激活凋亡通路。而與凋亡抑制相關(guān)的基因如Bcl-2、Bcl-XL、IAPs等則呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。Bcl-2基因是最早被發(fā)現(xiàn)的抗凋亡基因之一，在2s清蛋白處理后，其表達(dá)量變化倍數(shù)為[X]。Bcl-2蛋白可以通過抑制線粒體膜通透性的改變，阻止細(xì)胞色素c等凋亡因子的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-XL基因編碼的Bcl-XL蛋白也是一種抗凋亡蛋白，其表達(dá)量變化倍數(shù)為[X]。Bcl-XL蛋白可以與促凋亡蛋白Bax、Bak等結(jié)合，抑制它們的促凋亡活性。IAPs（凋亡抑制蛋白）家族基因在2s清蛋白處理后表達(dá)下調(diào)，其中Survivin基因的表達(dá)量變化倍數(shù)為[X]。Survivin蛋白是IAPs家族的重要成員，它可以直接抑制caspase-3、caspase-7等凋亡執(zhí)行酶的活性，從而抑制細(xì)胞凋亡。通過基因芯片檢測(cè)，還發(fā)現(xiàn)了一些與凋亡相關(guān)的信號(hào)通路基因表達(dá)發(fā)生變化。例如，PI3K-Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因PI3K、Akt等表達(dá)下調(diào)，而PTEN基因表達(dá)上調(diào)。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞存活、增殖和凋亡調(diào)控中起著重要作用。PI3K被激活后，可以磷酸化磷脂酰肌醇，產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3能夠招募Akt到細(xì)胞膜上并使其激活。激活的Akt可以通過磷酸化下游的多種靶蛋白，如Bad、FoxO等，抑制細(xì)胞凋亡。而PTEN是一種腫瘤抑制基因，它可以通過去磷酸化PIP3，負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路。在2s清蛋白處理后，PI3K、Akt基因表達(dá)下調(diào)，PTEN基因表達(dá)上調(diào)，這可能導(dǎo)致PI3K-Akt信號(hào)通路的活性受到抑制，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。四、討論4.1原核表達(dá)與天然2s清蛋白特性差異分析本研究結(jié)果顯示，天然2s清蛋白對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且呈濃度和時(shí)間依賴性。而原核表達(dá)復(fù)性后的2s蛋白對(duì)A549細(xì)胞的增殖沒有抑制作用。這一差異可能源于二者在結(jié)構(gòu)和活性上的不同。從結(jié)構(gòu)上看，天然2s清蛋白各組分由不同亞基組成，分子量在7-22kD之間，亞基內(nèi)部含有豐富的二硫鍵，2s-1可能以二聚體形式通過鏈間二硫鍵相連，2s-3、2s-4、2s-5不存在鏈間二硫鍵。這種復(fù)雜且有序的結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮生物活性的基礎(chǔ)。相比之下，原核表達(dá)的2s蛋白在復(fù)性過程中出現(xiàn)了問題。無論是透析復(fù)性還是柱上復(fù)性，復(fù)性后的蛋白均發(fā)生了二硫鍵錯(cuò)配，形成了蛋白多聚體。雖然柱上復(fù)性形成的蛋白多聚體比例略低于透析復(fù)性，但總體上都導(dǎo)致了蛋白結(jié)構(gòu)的異常。二硫鍵在維持蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性方面起著關(guān)鍵作用。原核表達(dá)蛋白的二硫鍵錯(cuò)配，使得其無法形成正確的空間構(gòu)象，從而影響了蛋白的活性。原核表達(dá)系統(tǒng)本身的特點(diǎn)也可能是導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)和活性異常的原因。原核表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌，雖然具有成本低、表達(dá)速度快等優(yōu)點(diǎn)，但它缺乏真核細(xì)胞所具有的復(fù)雜的蛋白折疊和修飾機(jī)制。在原核細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白，尤其是一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白，容易形成包涵體。包涵體是由錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集而成的不溶性顆粒。在本研究中，2s清蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體形式存在。從包涵體中提取的蛋白需要經(jīng)過復(fù)性處理，才能恢復(fù)其正確的結(jié)構(gòu)和活性。然而，復(fù)性過程是一個(gè)復(fù)雜且難以控制的過程，容易出現(xiàn)二硫鍵錯(cuò)配等問題。在本研究中采用的透析復(fù)性和柱上復(fù)性方法，雖然在一定程度上嘗試解決復(fù)性問題，但都未能成功獲得具有正確結(jié)構(gòu)和活性的原核表達(dá)2s蛋白。4.2對(duì)A549細(xì)胞增殖影響機(jī)制探討天然2s清蛋白對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間依賴性。在低濃度和短時(shí)間處理時(shí)，低濃度（50μg/mL）的天然2s清蛋白處理組細(xì)胞增殖抑制率為（-5.23±1.25）%，表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。這可能是因?yàn)樵诘蛣┝肯?，?xì)胞對(duì)2s清蛋白產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)，啟動(dòng)了一些補(bǔ)償性的增殖機(jī)制。隨著處理濃度升高和時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用逐漸顯著，800μg/mL處理72小時(shí)時(shí)，抑制率高達(dá)（68.90±4.21）%。這種濃度和時(shí)間依賴的抑制作用表明，2s清蛋白對(duì)A549細(xì)胞的增殖影響是一個(gè)漸進(jìn)的過程，可能涉及多個(gè)生物學(xué)過程的改變。從凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化來看，2s清蛋白處理后，iNOS和p53基因表達(dá)量都出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。iNOS是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，其產(chǎn)生的一氧化氮（NO）在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。在低濃度2s清蛋白處理初期，iNOS基因表達(dá)上調(diào)，可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NO水平升高，NO可以作為一種信號(hào)分子，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。隨著處理濃度和時(shí)間的增加，iNOS基因表達(dá)下降，可能是細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的一種反饋調(diào)節(jié)，以維持細(xì)胞的生存。p53基因是一種重要的腫瘤抑制基因，被稱為“基因組的守護(hù)者”。在2s清蛋白處理后，p53基因表達(dá)上調(diào)，激活的p53蛋白可以通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如上調(diào)促凋亡基因bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)，以及激活caspase家族蛋白等。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，p53基因表達(dá)下降，可能是細(xì)胞在凋亡過程中，對(duì)p53蛋白的需求逐漸減少，或者是p53蛋白的降解增加。bcl-2基因在低濃度和短時(shí)間處理的時(shí)候呈現(xiàn)表達(dá)量上升的趨勢(shì)，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)又被抑制。bcl-2是一種抗凋亡基因，其編碼的Bcl-2蛋白可以通過抑制線粒體膜通透性的改變，阻止細(xì)胞色素c等凋亡因子的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡。在低濃度和短時(shí)間處理時(shí)，bcl-2基因表達(dá)上調(diào)，可能是細(xì)胞對(duì)2s清蛋白處理的一種自我保護(hù)機(jī)制，以抑制細(xì)胞凋亡。但隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，bcl-2基因表達(dá)被抑制，可能是由于2s清蛋白激活的凋亡信號(hào)通路逐漸增強(qiáng)，克服了bcl-2蛋白的抗凋亡作用。促凋亡基因bax的表達(dá)量隨著處理濃度和時(shí)間的增加而增加。Bax蛋白是Bcl-2家族中的促凋亡成員，它可以與Bcl-2蛋白形成異二聚體，或者單獨(dú)作用于線粒體，增加線粒體膜的通透性，釋放細(xì)胞色素c等凋亡因子，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。bax基因表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了2s清蛋白通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。caspase-3的表達(dá)量無明顯變化。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行酶，它可以被多種凋亡信號(hào)激活，進(jìn)而切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在本研究中，caspase-3表達(dá)量無明顯變化，可能是由于2s清蛋白誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制不依賴于caspase-3的激活，或者是caspase-3的激活發(fā)生在基因表達(dá)水平之后，通過其他方式如蛋白水解激活。也有可能是本研究的檢測(cè)方法不夠靈敏，未能檢測(cè)到caspase-3表達(dá)量的細(xì)微變化。4.3凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡關(guān)系分析在細(xì)胞凋亡過程中，凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化起著關(guān)鍵作用。本研究中，通過半定量RT-PCR和基因芯片檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)天然2s清蛋白處理A549細(xì)胞后，多種凋亡相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化。這些基因表達(dá)的改變，共同調(diào)節(jié)著細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。iNOS基因在低濃度2s清蛋白處理初期表達(dá)上調(diào)，隨后下降。iNOS催化產(chǎn)生的NO在細(xì)胞凋亡中具有雙重作用。低濃度的NO可以作為一種信號(hào)分子，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，如通過激活caspase家族蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而高濃度的NO則可能導(dǎo)致細(xì)胞壞死。在本研究中，低濃度2s清蛋白處理初期，iNOS基因表達(dá)上調(diào)，可能通過產(chǎn)生適量的NO，激活凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。隨著處理濃度和時(shí)間的增加，iNOS基因表達(dá)下降，可能是細(xì)胞為了避免過度凋亡而進(jìn)行的一種自我保護(hù)機(jī)制。p53基因作為一種重要的腫瘤抑制基因，在2s清蛋白處理后表達(dá)上調(diào)。p53蛋白可以通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。一方面，p53蛋白可以直接激活促凋亡基因bax的表達(dá)，bax蛋白可以與線粒體膜上的Bcl-2蛋白結(jié)合，形成異二聚體，從而改變線粒體膜的通透性，釋放細(xì)胞色素c等凋亡因子，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另一方面，p53蛋白還可以抑制抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)，削弱其抗凋亡作用。在本研究中，p53基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)伴隨著bax基因表達(dá)增加和bcl-2基因表達(dá)抑制，表明p53蛋白可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。bcl-2基因在低濃度和短時(shí)間處理時(shí)表達(dá)上調(diào)，隨后被抑制。bcl-2蛋白是一種抗凋亡蛋白，它可以通過抑制線粒體膜通透性的改變，阻止細(xì)胞色素c等凋亡因子的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡。在低濃度和短時(shí)間處理時(shí)，bcl-2基因表達(dá)上調(diào)，可能是細(xì)胞對(duì)2s清蛋白處理的一種自我保護(hù)反應(yīng)，以維持細(xì)胞的存活。然而，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，2s清蛋白激活的凋亡信號(hào)通路逐漸增強(qiáng)，bcl-2基因表達(dá)被抑制，使得細(xì)胞的抗凋亡能力減弱，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。bax基因作為促凋亡基因，其表達(dá)量隨著2s清蛋白處理濃度和時(shí)間的增加而增加。Bax蛋白可以在線粒體外膜上形成多聚體，增加線粒體膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，招募并激活caspase-9，進(jìn)而激活下游的caspase-3等凋亡執(zhí)行酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在本研究中，bax基因表達(dá)上調(diào)，表明2s清蛋白可能通過促進(jìn)bax基因表達(dá)，增加Bax蛋白的含量，從而促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡?；蛐酒瑱z測(cè)還發(fā)現(xiàn)，與凋亡相關(guān)的Fas、Bak、Bid等基因表達(dá)上調(diào)，而Bcl-XL、IAPs等基因表達(dá)下調(diào)。Fas基因編碼的Fas蛋白與配體FasL結(jié)合后，可激活死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路。Bak和Bid基因表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。Bcl-XL和IAPs基因表達(dá)下調(diào)，削弱了細(xì)胞的抗凋亡能力。這些基因表達(dá)的協(xié)同變化，共同促進(jìn)了2s清蛋白誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡。綜上所述，天然2s清蛋白可能通過調(diào)節(jié)iNOS、p53、bcl-2、bax等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。其中，p53蛋白在調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白表達(dá)方面起著重要作用。這些基因表達(dá)變化之間相互關(guān)聯(lián)、相互影響，共同構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與2s清蛋白誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡過程。4.4研究結(jié)果的潛在應(yīng)用價(jià)值與展望本研究揭示了天然2s清蛋白對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用及其凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化，這在肺癌治療和藥物研發(fā)領(lǐng)域具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。從肺癌治療角度來看，天然2s清蛋白為肺癌的治療提供了新的潛在策略。目前，肺癌的治療方法主要包括手術(shù)、化療、放療和靶向治療等，但這些治療方法存在一定的局限性，如化療藥物的毒副作用、腫瘤的耐藥性等。天然2s清蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性的抑制作用，且對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒副作用，這使其有望成為一種新型的肺癌治療藥物或輔助治療手段。通過進(jìn)一步研究其作用機(jī)制和體內(nèi)藥效，有可能開發(fā)出基于2s清蛋白的靶向治療藥物，提高肺癌的治療效果，減少對(duì)正常組織的損傷。在藥物研發(fā)方面，本研究為新型抗癌藥物的開發(fā)提供了重要的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2s清蛋白誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，尤其是其對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用，為