第43頁(yè)（共43頁(yè)）2021-2025年高考生物真題知識(shí)點(diǎn)分類(lèi)匯編之基因工程（三）一．選擇題（共9小題）1．（2023?新課標(biāo)）某同學(xué)擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接酶為工具，將目的基因（兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)）和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是（）A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接 B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接 C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接 D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接2．（2023?浙江）某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實(shí)驗(yàn)得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3﹣GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計(jì)了引物1和引物2用于PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。下列敘述正確的是（）A．Gata3基因的啟動(dòng)子無(wú)法控制GFP基因的表達(dá) B．翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2號(hào)條帶的小鼠是野生型，4號(hào)條帶的小鼠是Gata3﹣GFP基因純合子 D．若用引物1和引物3進(jìn)行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合子3．（2023?湖北）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通過(guò)DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否 D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落4．（2023?福建）關(guān)于“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”（實(shí)驗(yàn)Ⅰ）和“DNA的粗提取與鑒定”（實(shí)驗(yàn)Ⅱ）的實(shí)驗(yàn)操作，下列相關(guān)敘述正確的是（）A．實(shí)驗(yàn)Ⅰ中，PCR實(shí)驗(yàn)所需的移液器、槍頭、蒸餾水等必須進(jìn)行高壓滅菌處理 B．實(shí)驗(yàn)Ⅰ中，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，加樣前應(yīng)先接通電源 C．實(shí)驗(yàn)Ⅱ中，取洋蔥研磨液的上清液，加入等體積冷酒精后析出粗提取的DNA D．實(shí)驗(yàn)Ⅱ中，將白色絲狀物直接加入到二苯胺試劑中并進(jìn)行沸水浴，用于鑒定DNA5．（2023?北京）抗蟲(chóng)作物對(duì)害蟲(chóng)的生存產(chǎn)生壓力，會(huì)使害蟲(chóng)種群抗性基因頻率迅速提高，導(dǎo)致作物的抗蟲(chóng)效果逐漸減弱。為使轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉保持抗蟲(chóng)效果，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上會(huì)采取一系列措施。以下措施不能實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的是（）A．在轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉種子中混入少量常規(guī)種子 B．大面積種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉，并施用殺蟲(chóng)劑 C．轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉與小面積的常規(guī)棉間隔種植 D．轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉大田周?chē)O(shè)置常規(guī)棉隔離帶6．（2023?江蘇）某生物社團(tuán)利用洋蔥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。下列相關(guān)敘述正確的是（）A．洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮可代替半透膜探究質(zhì)膜的透性 B．洋蔥勻漿中加入新配制的斐林試劑，溶液即呈磚紅色 C．制作根尖有絲分裂裝片時(shí)，解離、漂洗、按壓蓋玻片都能更好地將細(xì)胞分散開(kāi) D．粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺試劑后顯藍(lán)色7．（2022?遼寧）抗蟲(chóng)和耐除草劑玉米雙抗12﹣5是我國(guó)自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因品種。為給監(jiān)管轉(zhuǎn)基因生物安全提供依據(jù)，采用PCR方法進(jìn)行目的基因監(jiān)測(cè)，反應(yīng)程序如圖所示。下列敘述正確的是（）A．預(yù)變性過(guò)程可促進(jìn)模板DNA邊解旋邊復(fù)制 B．后延伸過(guò)程可使目的基因的擴(kuò)增更加充分 C．延伸過(guò)程無(wú)需引物參與即可完成半保留復(fù)制 D．轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測(cè)含有目的基因后即可上市8．（2022?山東）關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（）A．過(guò)濾液沉淀過(guò)程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解 B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀 C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)9．（2022?福建）科研人員在2003年完成了大部分的人類(lèi)基因組測(cè)序工作，2022年宣布測(cè)完剩余的8%序列。這些序列富含高度重復(fù)序列，且多位于端粒區(qū)和著絲點(diǎn)區(qū)。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．通過(guò)人類(lèi)基因組可以確定基因的位置和表達(dá)量 B．人類(lèi)基因組中一定含有可轉(zhuǎn)錄但不翻譯的基因 C．著絲點(diǎn)區(qū)的突變可能影響姐妹染色單體的正常分離 D．人類(lèi)基因組測(cè)序全部完成有助于細(xì)胞衰老分子機(jī)制的研究二．解答題（共11小題）10．（2023?廣東）種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對(duì)野生型擬南芥（2n＝10）進(jìn)行誘變，篩選到一株種子增大的突變體。通過(guò)遺傳分析和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)野生型DAI基因發(fā)生一個(gè)堿基G到A的替換，突變后的基因?yàn)殡[性基因，據(jù)此推測(cè)突變體的表型與其有關(guān)，開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DAI基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變?cè)斐?，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與植株的種子大小相近。（2）用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DAI基因，用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物和進(jìn)行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DAI基因可以正常表達(dá)，其上下游序列需具備。（3）轉(zhuǎn)化后，T﹣DNA（其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時(shí)不發(fā)生交換）可在基因組單一位點(diǎn)插入也可以同時(shí)插入多個(gè)位點(diǎn)。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下，選出單一位點(diǎn)插入的植株，并進(jìn)一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株（圖1）。用于后續(xù)驗(yàn)證突變基因與表型的關(guān)系。①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T0代植株并自交，將T1代種子播種在選擇培養(yǎng)基上，能夠萌發(fā)并生長(zhǎng)的陽(yáng)性個(gè)體即表示其基因組中插入了。②T1代陽(yáng)性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，選擇陽(yáng)性率約%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。③將②中選出的T2代陽(yáng)性植株（填“自交”、“與野生型雜交”或“與突變體雜交”）所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽(yáng)性率達(dá)到%的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。為便于在后續(xù)研究中檢測(cè)該突變，研究者利用PCR擴(kuò)增野生型和突變型基因片段，再使用限制性核酸內(nèi)切酶X切割產(chǎn)物，通過(guò)核酸電泳即可進(jìn)行突變檢測(cè)，相關(guān)信息見(jiàn)圖2，在圖2電泳圖中將酶切結(jié)果對(duì)應(yīng)位置的條帶涂黑。11．（2023?山東）科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J﹣V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測(cè)，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。（1）與圖甲中啟動(dòng)子結(jié)合的酶是。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有（答出2個(gè)結(jié)構(gòu)即可）。（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的（填“a鏈”或“b鏈”）相應(yīng)部分的序列相同。（3）重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了，條帶2所檢出的蛋白（填“是”或“不是”）由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。12．（2023?遼寧）天然β淀粉酶大多耐熱性差，不利于工業(yè)化應(yīng)用。我國(guó)學(xué)者借助PCR改造β﹣淀粉酶基因，并將改造的基因與pLN23質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌，最終獲得耐高溫的β﹣淀粉酶。回答下列問(wèn)題：（1）上述過(guò)程屬于工程。（2）PCR中使用的聚合酶屬于（填寫(xiě)編號(hào)）。①以DNA為模板的RNA聚合酶②以RNA為模板的RNA聚合酶③以DNA為模板的DNA聚合酶④以RNA為模板的DNA聚合酶（3）某天然β﹣淀粉酶由484個(gè)氨基酸構(gòu)成，研究發(fā)現(xiàn)，將該酶第476位天冬氨酸替換為天冬酰胺，耐熱性明顯提升。在圖1所示的β﹣淀粉酶基因改造方案中，含已替換堿基的引物是（填寫(xiě)編號(hào)）。（4）為了使上述改造后的基因能在大腸桿菌中高效表達(dá)，由圖2所示的pLN23質(zhì)粒構(gòu)建得到基因表達(dá)載體。除圖示信息外，基因表達(dá)載體中還應(yīng)該有目的基因（即改造后的基因）和。（5）目的基因（不含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）全長(zhǎng)為1.5kb，將其插入BamHⅠ位點(diǎn)。用EcoRⅠ酶切來(lái)自于不同大腸桿菌菌落的質(zhì)粒DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定DNA片段長(zhǎng)度，這一操作的目的是。正確連接的基因表達(dá)載體被EcoRⅠ酶切后長(zhǎng)度為kb。（6）采用PCR還能在分子水平上確定目的基因是否轉(zhuǎn)錄，根據(jù)中心法則，可通過(guò)反應(yīng)獲得PCR的模板。13．（2023?天津）構(gòu)建可利用纖維素產(chǎn)乙醇的轉(zhuǎn)基因釀酒酵母菌株是解決能源危機(jī)的手段之一，為此設(shè)計(jì)表達(dá)載體，思路如下。（1）外源基因的選擇纖維素常見(jiàn)生物降解途徑如圖。釀酒酵母通常無(wú)法吸收纖維素、寡糖和纖維二糖，應(yīng)向釀酒酵母轉(zhuǎn)入圖中三種酶的基因，并使其表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞（內(nèi)/外）發(fā)揮作用。（2）外源基因的插入方法同源重組是堿基序列基本相同的DNA區(qū)段通過(guò)配對(duì)、鏈斷裂和再連接而產(chǎn)生片段交換的過(guò)程。通過(guò)同源重組將外源基因插入染色體的特定位點(diǎn)可獲得遺傳穩(wěn)定的工程菌株，如甲圖所示。釀酒酵母基因組有多個(gè)AB短序列。為通過(guò)同源重組將外源基因插入AB之間，在設(shè)計(jì)表達(dá)載體時(shí)，可采用PCR技術(shù)在外源基因兩端分別引入A和B，獲得乙圖所示長(zhǎng)片段。PCR時(shí)應(yīng)選用的一對(duì)引物為（從P1～P6中選）。（3）標(biāo)記基因的選擇URA3是尿嘧啶合成關(guān)鍵酶基因，常被用作標(biāo)記基因。另外，URA3編碼的蛋白可將外源5﹣氟乳清酸轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。①為得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株1，需將酶Ⅰ基因同URA3一起插入U(xiǎn)RA3缺陷型釀酒酵母基因組AB之間，并利用的培養(yǎng)基篩選存活菌株。②在后續(xù)插入酶Ⅱ基因時(shí)，為繼續(xù)利用URA3作為篩選標(biāo)記，需切除菌株1的URA3。為此設(shè)計(jì)表達(dá)載體時(shí)，還應(yīng)向URA3兩端引入釀酒酵母基因組中不存在的同源區(qū)段C和C′，并以方式排列才能通過(guò)同源重組達(dá)到上述目的。此后，需要將菌株1在的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，存活菌株即為URA3被成功切除的菌株1′。（4）表達(dá)載體的構(gòu)建綜上，為將三種酶基因依次插入釀酒酵母基因組中，在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，A、B、C、C′、URA3和酶基因應(yīng)采用圖的排布方式。14．（2023?浙江）賴(lài)氨酸是人體不能合成的必需氨基酸，而人類(lèi)主要食物中的賴(lài)氨酸含量很低，利用生物技術(shù)可提高食物中賴(lài)氨酸含量?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）植物細(xì)胞合成的賴(lài)氨酸達(dá)到一定濃度時(shí)，能抑制合成過(guò)程中兩種關(guān)鍵酶的活性，導(dǎo)致賴(lài)氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調(diào)節(jié)方式屬于。根據(jù)這種調(diào)節(jié)方式，在培養(yǎng)基中添加，用于篩選經(jīng)人工誘變的植物懸浮細(xì)胞，可得到抗賴(lài)氨酸類(lèi)似物的細(xì)胞突變體，通過(guò)培養(yǎng)獲得再生植株。（2）隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞工程結(jié)合和發(fā)展，2011年我國(guó)首次利用轉(zhuǎn)基因和體細(xì)胞核移植技術(shù)成功培育了高產(chǎn)賴(lài)氨酸轉(zhuǎn)基因克隆奶牛。其基本流程為：①構(gòu)建乳腺專(zhuān)一表達(dá)載體。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，為獲取富含賴(lài)氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通過(guò)檢索獲取其編碼序列，用化學(xué)合成法制備得到。再將獲得的目的基因與含有乳腺特異性啟動(dòng)子的相應(yīng)載體連接，構(gòu)建出乳腺專(zhuān)一表達(dá)載體。②表達(dá)載體轉(zhuǎn)入牛胚胎成纖維細(xì)胞（BEF）。將表達(dá)載體包裹到磷脂等構(gòu)成的脂質(zhì)體內(nèi)，與BEF膜發(fā)生，表達(dá)載體最終進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)生轉(zhuǎn)化。③核移植。將轉(zhuǎn)基因的BEF作為核供體細(xì)胞，從牛卵巢獲取卵母細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)及去核后作為。將兩種細(xì)胞進(jìn)行電融合，電融合的作用除了促進(jìn)細(xì)胞融合，同時(shí)起到了重組細(xì)胞發(fā)育的作用。④重組細(xì)胞的體外培養(yǎng)及胚胎移植。重組細(xì)胞體外培養(yǎng)至，植入代孕母牛子宮內(nèi)，直至小牛出生。⑤檢測(cè)。DNA水平檢測(cè)：利用PCR技術(shù)，以非轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞中存在目的基因。RNA水平檢測(cè)：從非轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞，提取總RNA，對(duì)總RNA進(jìn)行處理，以去除DNA污染，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，并以此為，利用特定引物擴(kuò)增目的基因片段。結(jié)果顯示目的基因在轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而不在牛耳組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，原因是什么？。15．（2023?河北）單細(xì)胞硅藻具有生產(chǎn)生物柴油的潛在價(jià)值。研究者將硅藻脂質(zhì)合成相關(guān)的蘋(píng)果酸酶（ME）基因構(gòu)建到超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入硅藻細(xì)胞，以期獲得高產(chǎn)生物柴油的硅藻品系?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）根據(jù)DNA和蛋白質(zhì)在特定濃度乙醇溶液中的差異獲得硅藻粗提DNA，PCR擴(kuò)增得到目的基因。（2）超表達(dá)載體的基本組件包括復(fù)制原點(diǎn)、目的基因、標(biāo)記基因、和等。本研究中目的基因?yàn)椤＃?）PCR擴(kuò)增時(shí)引物通過(guò)原則與模板特異性結(jié)合。根據(jù)表達(dá)載體序列設(shè)計(jì)了圖1所示的兩條引物，對(duì)非轉(zhuǎn)基因硅藻品系A(chǔ)和轉(zhuǎn)ME基因硅藻候選品系B進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。其中，樣品1為本實(shí)驗(yàn)的組，樣品2有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果表明。（4）利用單細(xì)胞硅藻生產(chǎn)生物柴油的影響因素包括胞內(nèi)脂質(zhì)含量和繁殖速率等。圖3為硅藻胞內(nèi)脂質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果。據(jù)圖分析，相對(duì)于品系A(chǔ)，品系B的胞內(nèi)脂質(zhì)含量平均水平明顯。同時(shí)，還需測(cè)定以比較在相同發(fā)酵條件下品系A(chǔ)與B的繁殖速率。（5）胞內(nèi)脂質(zhì)合成需要大量ATP。ME催化蘋(píng)果酸氧化脫羧反應(yīng)產(chǎn)生NADH。研究表明，品系B線粒體中ME含量顯著高于品系A(chǔ)。據(jù)此分析，ME基因超表達(dá)使線粒體中NADH水平升高，，最終促進(jìn)胞內(nèi)脂質(zhì)合成。（6）相對(duì)于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻進(jìn)行生物柴油生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)之處為。（答出兩點(diǎn)即可）16．（2023?甲卷）接種疫苗是預(yù)防傳染病的一項(xiàng)重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的傳播，降低乙型肝炎發(fā)病率。乙肝病毒是一種DNA病毒。重組乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技術(shù)獲得的乙肝病毒表面抗原（一種病毒蛋白）?；卮鹣铝袉?wèn)題。（1）接種上述重組乙肝疫苗不會(huì)在人體中產(chǎn)生乙肝病毒，原因是。（2）制備重組乙肝疫苗時(shí)，需要利用重組表達(dá)載體將乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）導(dǎo)入酵母細(xì)胞中表達(dá)。重組表達(dá)載體中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是。能識(shí)別載體中的啟動(dòng)子并驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄的酶是。（3）目的基因?qū)虢湍讣?xì)胞后，若要檢測(cè)目的基因是否插入染色體中，需要從酵母細(xì)胞中提取進(jìn)行DNA分子雜交，DNA分子雜交時(shí)應(yīng)使用的探針是。（4）若要通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的基因在酵母細(xì)胞中是否表達(dá)出目的蛋白，請(qǐng)簡(jiǎn)要寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)思路。。17．（2023?乙卷）GFP是水母體內(nèi)存在的能發(fā)綠色熒光的一種蛋白?？蒲腥藛T以GFP基因?yàn)椴牧?，利用基因工程技術(shù)獲得了能發(fā)其他顏色熒光的蛋白，豐富了熒光蛋白的顏色種類(lèi)?；卮鹣铝袉?wèn)題。（1）構(gòu)建突變基因文庫(kù)?？蒲腥藛T將GFP基因的不同突變基因分別插入載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌制備出GFP基因的突變基因文庫(kù)。通常，基因文庫(kù)是指。（2）構(gòu)建目的基因表達(dá)載體。科研人員從構(gòu)建的GFP突變基因文庫(kù)中提取目的基因（均為突變基因）構(gòu)建表達(dá)載體，其模式圖如下所示（箭頭為GFP突變基因的轉(zhuǎn)錄方向）。圖中①為，②為，其作用是；圖中氨芐青霉素抗性基因是一種標(biāo)記基因，其作用是。（3）目的基因的表達(dá)?？蒲腥藛T將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌有的發(fā)綠色熒光，有的發(fā)黃色熒光，有的不發(fā)熒光。請(qǐng)從密碼子特點(diǎn)的角度分析，發(fā)綠色熒光的可能原因是（答出1點(diǎn)即可）。（4）新蛋白與突變基因的關(guān)聯(lián)性分析。將上述發(fā)黃色熒光的大腸桿菌分離純化后，對(duì)其所含的GFP突變基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其堿基序列與GFP基因的不同，將該GFP突變基因命名為YFP基因（黃色熒光蛋白基因）。若要通過(guò)基因工程的方法探究YFP基因能否在真核細(xì)胞中表達(dá)，實(shí)驗(yàn)思路是。18．（2023?海南）基因遞送是植物遺傳改良的重要技術(shù)之一，我國(guó)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作開(kāi)發(fā)了一種新型基因遞送系統(tǒng)（切—浸—生芽Cut﹣Dip﹣Budding，簡(jiǎn)稱(chēng)CDB法）。圖1與圖2分別是利用常規(guī)轉(zhuǎn)化法和CDB法在某植物中遞送基因的示意圖?；卮鹣铝袉?wèn)題。（1）圖1中，從外植體轉(zhuǎn)變成愈傷組織的過(guò)程屬于；從愈傷組織到幼苗的培養(yǎng)過(guò)程需要的激素有生長(zhǎng)素和，該過(guò)程還需要光照，其作用是。（2）圖1中的愈傷組織，若不經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)環(huán)節(jié)，直接誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的植株可以保持植株A的。圖1中，含有外源基因的轉(zhuǎn)化植株A若用于生產(chǎn)種子，其包裝需標(biāo)注。（3）圖1與圖2中，農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，可將外源基因遞送到植物細(xì)胞中的原因是。（4）已知某酶（PDS）缺失會(huì)導(dǎo)致植株白化。某團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體（含有綠色熒光蛋白標(biāo)記基因），利用圖2中的CDB法將該重組載體導(dǎo)入植株B，長(zhǎng)出毛狀根，成功獲得轉(zhuǎn)化植株B。據(jù)此分析，從毛狀根中獲得陽(yáng)性毛狀根段的方法是，圖2中，鑒定導(dǎo)入幼苗中的基因編輯載體是否成功發(fā)揮作用的方法是，依據(jù)是。（5）與常規(guī)轉(zhuǎn)化法相比，采用CDB法進(jìn)行基因遞送的優(yōu)點(diǎn)是（答出2點(diǎn)即可）。19．（2023?江蘇）為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達(dá)，運(yùn)用重組酶技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒，如圖1所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：（1）分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí)，配制的兩個(gè)反應(yīng)體系中不同的有，擴(kuò)增程序中最主要的不同是。（2）有關(guān)基因序列如圖2。引物F2﹣F、F1﹣R應(yīng)在下列選項(xiàng)中選用。A.ATGGTG﹣﹣﹣﹣﹣CAACCAB.TGGTTG﹣﹣﹣﹣CACCATC.GACGAG﹣﹣﹣CTGCAGD.CTGCAG﹣﹣﹣﹣﹣CTCGTC（3）將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。這一過(guò)程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程相比，無(wú)需使用的酶主要有。（4）轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯(cuò)誤的有。A.稀釋涂布平板需控制每個(gè)平板30～300個(gè)菌落B.抗性平板上未長(zhǎng)出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高C.抗性平板上常常會(huì)出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落D.抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落無(wú)需進(jìn)一步劃線純化（5）為了驗(yàn)證平板上菌落中的質(zhì)粒是否符合設(shè)計(jì)，用不同菌落的質(zhì)粒為模板，用引物F1﹣F和F2﹣R進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，質(zhì)粒P1～P4的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3。根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有。（6）對(duì)于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過(guò)基因測(cè)序確認(rèn)，原因是。20．（2022?海南）以我國(guó)科學(xué)家為主的科研團(tuán)隊(duì)將OSNL（即4個(gè)基因Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A的縮寫(xiě)）導(dǎo)入黑羽雞胚成纖維細(xì)胞（CEFs），誘導(dǎo)其重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS），再誘導(dǎo)iPS分化為誘導(dǎo)原始生殖細(xì)胞（iPGCs），然后將iPGCs注射到孵化2.5天的白羽雞胚血管中，最終獲得具有黑羽雞遺傳特性的后代，實(shí)驗(yàn)流程如圖?；卮鹣铝袉?wèn)題。（1）CEFs是從孵化9天的黑羽雞胚中分離獲得的，為了獲得單細(xì)胞懸液，雞胚組織剪碎后需用處理。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)通常需要在合成培養(yǎng)基中添加等天然成分，以滿足細(xì)胞對(duì)某些細(xì)胞因子的需求。（2）體外獲取OSNL的方法有（答出1種即可）。若要在CEFs中表達(dá)外源基因的蛋白，需構(gòu)建基因表達(dá)載體，載體中除含有目的基因和標(biāo)記基因外，還須有啟動(dòng)子和等。啟動(dòng)子是識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)。（3）iPS細(xì)胞和iPGCs細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能不同的根本原因是。（4）誘導(dǎo)iPS細(xì)胞的技術(shù)與體細(xì)胞核移植技術(shù)的主要區(qū)別是。（5）該實(shí)驗(yàn)流程中用到的生物技術(shù)有（答出2點(diǎn)即可）。

2021-2025年高考生物真題知識(shí)點(diǎn)分類(lèi)匯編之基因工程（三）參考答案與試題解析一．選擇題（共9小題）題號(hào)123456789答案CBDCBABBA一．選擇題（共9小題）1．（2023?新課標(biāo)）某同學(xué)擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接酶為工具，將目的基因（兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)）和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是（）A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接 B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接 C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接 D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接【分析】限制酶選擇原則：（1）根據(jù)目的基因兩端的限制酶識(shí)別和切割位點(diǎn)確定限制酶種類(lèi)具體原則：應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的，不能位于目的基因內(nèi)部，防止破壞目的基因，同時(shí)為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化或反向連接，可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒。（2）根據(jù)質(zhì)粒特點(diǎn)確定限制酶種類(lèi)具體原則：①保證切割的黏性末端與目的基因的相同，以便兩者能夠連接。②保證切割后的質(zhì)粒至少保留一個(gè)標(biāo)記基因，以便進(jìn)行篩選；保留復(fù)制原點(diǎn)，以便在受體細(xì)胞中維持穩(wěn)定和表達(dá)?！窘獯稹拷猓篈、限制酶3切割后的末端是平末端，E.coliDNA連接酶連接的是黏性末端，應(yīng)用T4DNA連接酶連接，A錯(cuò)誤；B、據(jù)圖可知，限制酶3切割后的末端是平末端，而限制酶1切割后的末端是黏性末端，若用兩種酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)導(dǎo)致DNA連接酶無(wú)法連接，B錯(cuò)誤；C、質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，可避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接，且兩者均形成黏性末端，此后再用T4DNA連接酶連接，可構(gòu)建重組表達(dá)載體，效率較高，C正確；D、限制酶4會(huì)破壞質(zhì)粒上的標(biāo)記基因（抗生素抗性基因），故不能選擇該酶進(jìn)行切割，D錯(cuò)誤。故選：C?！军c(diǎn)評(píng)】本題考查限制酶及基因表達(dá)載體構(gòu)建的相關(guān)知識(shí)，意在考查學(xué)生的理解能力和判斷能力，運(yùn)用所學(xué)知識(shí)綜合分析問(wèn)題的能力是解答本題的關(guān)鍵。2．（2023?浙江）某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實(shí)驗(yàn)得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3﹣GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計(jì)了引物1和引物2用于PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。下列敘述正確的是（）A．Gata3基因的啟動(dòng)子無(wú)法控制GFP基因的表達(dá) B．翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2號(hào)條帶的小鼠是野生型，4號(hào)條帶的小鼠是Gata3﹣GFP基因純合子 D．若用引物1和引物3進(jìn)行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合子【分析】1、PCR技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫(xiě)，是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。2、PCR技術(shù)需要的條件：目的基因、引物、四種脫氧核苷酸、耐高溫DNA聚合酶?！窘獯稹拷猓篈、分析圖中可知，啟動(dòng)子在編碼區(qū)的左側(cè)，GFP基因整合Gata3基因的右側(cè)，啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄后，可以在Gata3基因轉(zhuǎn)錄后，使GFP基因轉(zhuǎn)錄，Gata3基因的啟動(dòng)子也能控制GFP基因的表達(dá)，A錯(cuò)誤；B、基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯均是從5′→3′，因啟動(dòng)子在左側(cè)，轉(zhuǎn)錄和翻譯方向均為從左向右，Gata3蛋白在GFP蛋白的左側(cè)，所以翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；C、整合GFP基因后，核酸片段變長(zhǎng)，2號(hào)個(gè)體只有大片段，所以是Gata3﹣GFP基因純合子，4號(hào)個(gè)體只有小片段，是野生型，C錯(cuò)誤；D、若用引物1和引物3進(jìn)行PCR，雜合子和Gata3﹣GFP基因純合子都能擴(kuò)增出相應(yīng)的片段則不能區(qū)分雜合子和純合子，D錯(cuò)誤；故選：B?！军c(diǎn)評(píng)】本題主要考查PCR和基因表達(dá)的相關(guān)內(nèi)容，需要學(xué)生理解掌握PCR和基因表達(dá)的過(guò)程，并具有一定的識(shí)圖能力，屬于理解應(yīng)用層次的考查。3．（2023?湖北）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通過(guò)DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否 D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落【分析】據(jù)圖分析可知，氨芐青霉素抗性基因（AmpR）內(nèi)含有ScaⅠ和PvuⅠ的酶切位點(diǎn)，四環(huán)素抗性基因（TetR）內(nèi)含有HindⅢ、SphⅠ和SalⅠ的酶切位點(diǎn)?！窘獯稹拷猓篈、若只用HindⅢ一種酶切質(zhì)粒和目的基因，則產(chǎn)生相同的黏性末端，可能導(dǎo)致目的基因正向連接或反向連接，故目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確；B、若用PvuⅠ酶切，則會(huì)破壞氨芐青霉素抗性基因（AmpR），而重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；C、若用SphⅠ酶切，則目的基因插入到四環(huán)素抗性基因（TetR）中，重組質(zhì)粒的大小與空質(zhì)粒不同，故可通過(guò)DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；D、若用SphⅠ酶切，則會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因（TetR），氨芐青霉素抗性基因（AmpR）不受影響，則重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因（AmpR），因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯(cuò)誤。故選：D?！军c(diǎn)評(píng)】本題考查基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程中限制酶的選擇原則等知識(shí)，意在考查考生對(duì)知識(shí)的理解和應(yīng)用能力。4．（2023?福建）關(guān)于“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”（實(shí)驗(yàn)Ⅰ）和“DNA的粗提取與鑒定”（實(shí)驗(yàn)Ⅱ）的實(shí)驗(yàn)操作，下列相關(guān)敘述正確的是（）A．實(shí)驗(yàn)Ⅰ中，PCR實(shí)驗(yàn)所需的移液器、槍頭、蒸餾水等必須進(jìn)行高壓滅菌處理 B．實(shí)驗(yàn)Ⅰ中，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，加樣前應(yīng)先接通電源 C．實(shí)驗(yàn)Ⅱ中，取洋蔥研磨液的上清液，加入等體積冷酒精后析出粗提取的DNA D．實(shí)驗(yàn)Ⅱ中，將白色絲狀物直接加入到二苯胺試劑中并進(jìn)行沸水浴，用于鑒定DNA【分析】DNA粗提取和鑒定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精；DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性。（2）DNA的鑒定：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色?！窘獯稹拷猓篈、為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水等在使用前都必須進(jìn)行高壓滅菌處理，移液器不需要高壓蒸汽滅菌，A錯(cuò)誤；B、PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，應(yīng)先加樣后接通電源，B錯(cuò)誤；C、DNA不溶于酒精，細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)可溶于酒精，因此離心后取上清液加入等體積的冷酒精進(jìn)行DNA的粗提取，C正確；D、鑒定DNA時(shí)，應(yīng)將絲狀物溶解在2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺試劑并進(jìn)行沸水浴，D錯(cuò)誤。故選：C?！军c(diǎn)評(píng)】本題主要考查的是DNA的粗提取與鑒定的相關(guān)知識(shí)，意在考查學(xué)生對(duì)基礎(chǔ)知識(shí)的理解掌握，難度適中。5．（2023?北京）抗蟲(chóng)作物對(duì)害蟲(chóng)的生存產(chǎn)生壓力，會(huì)使害蟲(chóng)種群抗性基因頻率迅速提高，導(dǎo)致作物的抗蟲(chóng)效果逐漸減弱。為使轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉保持抗蟲(chóng)效果，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上會(huì)采取一系列措施。以下措施不能實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的是（）A．在轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉種子中混入少量常規(guī)種子 B．大面積種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉，并施用殺蟲(chóng)劑 C．轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉與小面積的常規(guī)棉間隔種植 D．轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉大田周?chē)O(shè)置常規(guī)棉隔離帶【分析】轉(zhuǎn)基因生物的安全性問(wèn)題：食物安全（滯后效應(yīng)、過(guò)敏源、營(yíng)養(yǎng)成分改變）、生物安全（對(duì)生物多樣性的影響）、環(huán)境安全（對(duì)生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的影響），對(duì)待轉(zhuǎn)基因技術(shù)的利弊，正確的做法應(yīng)該是趨利避害，不能因噎廢食?！窘獯稹拷猓篈、在轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉種子中混入少量常規(guī)種子，則常規(guī)種子長(zhǎng)成的普通植株能為敏感性（不抗蟲(chóng)）個(gè)體提供生存空間，增加與抗蟲(chóng)個(gè)體的競(jìng)爭(zhēng)，避免抗性基因頻率升高過(guò)快，提高了抗蟲(chóng)棉的抗蟲(chóng)持久性，A正確；B、大面積種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉、施用殺蟲(chóng)劑，都會(huì)進(jìn)一步選擇并保存抗性強(qiáng)的個(gè)體，導(dǎo)致敏感性個(gè)體死亡，從而加快害蟲(chóng)種群抗性基因頻率提高，不利于抗蟲(chóng)棉的抗蟲(chóng)持久性，B錯(cuò)誤；CD、將轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉與小面積的常規(guī)棉間隔種植以及轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉大田周?chē)O(shè)置常規(guī)棉隔離帶，作用機(jī)理相似：可以使敏感型個(gè)體存活，敏感性個(gè)體能與抗性強(qiáng)的棉鈴蟲(chóng)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，不會(huì)導(dǎo)致抗性基因頻率升高過(guò)快，提高了抗蟲(chóng)棉的抗蟲(chóng)持久性，CD正確。故選：B?！军c(diǎn)評(píng)】本題主要以抗蟲(chóng)棉抗蟲(chóng)效果的保持為情境，考查轉(zhuǎn)基因作物的安全性問(wèn)題，要求考生明確相關(guān)內(nèi)容，能結(jié)合題意分析作答。6．（2023?江蘇）某生物社團(tuán)利用洋蔥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。下列相關(guān)敘述正確的是（）A．洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮可代替半透膜探究質(zhì)膜的透性 B．洋蔥勻漿中加入新配制的斐林試劑，溶液即呈磚紅色 C．制作根尖有絲分裂裝片時(shí)，解離、漂洗、按壓蓋玻片都能更好地將細(xì)胞分散開(kāi) D．粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺試劑后顯藍(lán)色【分析】DNA粗提取和鑒定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精；DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性。（2）DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性：蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒(méi)有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60﹣80℃的高溫，而DNA在80℃以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜，但對(duì)DNA沒(méi)有影響。（3）DNA的鑒定：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色?！窘獯稹拷猓篈、用洋蔥鱗片葉內(nèi)表皮的原生質(zhì)層具有選擇透過(guò)性，可代替半透膜探究質(zhì)膜的透性，A正確；B、洋蔥勻漿中加入新配制的斐林試劑，需要水浴加熱條件下才會(huì)呈磚紅色，B錯(cuò)誤；C、制作根尖有絲分裂裝片時(shí)，解離、按壓蓋玻片都能更好地將細(xì)胞分散開(kāi)，漂洗是防止解離過(guò)度，C錯(cuò)誤；D、粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺試劑后，在沸水浴加熱的條件下顯藍(lán)色，D錯(cuò)誤。故選：A?！军c(diǎn)評(píng)】本題主要考查的是DNA的粗提取與鑒定的相關(guān)知識(shí)，意在考查學(xué)生對(duì)基礎(chǔ)知識(shí)的理解掌握，難度適中。7．（2022?遼寧）抗蟲(chóng)和耐除草劑玉米雙抗12﹣5是我國(guó)自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因品種。為給監(jiān)管轉(zhuǎn)基因生物安全提供依據(jù)，采用PCR方法進(jìn)行目的基因監(jiān)測(cè)，反應(yīng)程序如圖所示。下列敘述正確的是（）A．預(yù)變性過(guò)程可促進(jìn)模板DNA邊解旋邊復(fù)制 B．后延伸過(guò)程可使目的基因的擴(kuò)增更加充分 C．延伸過(guò)程無(wú)需引物參與即可完成半保留復(fù)制 D．轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測(cè)含有目的基因后即可上市【分析】PCR技術(shù)：1、概念：PCR全稱(chēng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。2、原理：DNA復(fù)制。3、前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對(duì)引物。4、條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。5、過(guò)程：①高溫變性：DNA解旋過(guò)程（PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開(kāi)不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開(kāi)）；②低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈?！窘獯稹拷猓篈、預(yù)變性過(guò)程可促進(jìn)模板DNA解旋，沒(méi)有促進(jìn)復(fù)制，A錯(cuò)誤；B、后延伸過(guò)程可使目的基因的擴(kuò)增更加充分，B正確；C、延伸過(guò)程仍需引物參與才能完成半保留復(fù)制，C錯(cuò)誤；D、轉(zhuǎn)基因品種經(jīng)檢測(cè)含有目的基因并能穩(wěn)定表達(dá)，且有生物活性后才能上市，D錯(cuò)誤。故選：B?！军c(diǎn)評(píng)】本題考查PCR技術(shù)的相關(guān)知識(shí)，要求考生識(shí)記PCR技術(shù)的概念、原理、條件、過(guò)程等基礎(chǔ)知識(shí)，能結(jié)合所學(xué)的知識(shí)準(zhǔn)確判斷各選項(xiàng)。8．（2022?山東）關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（）A．過(guò)濾液沉淀過(guò)程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解 B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀 C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)【分析】DNA粗提取和鑒定的原理：1、DNA的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精。2、DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性不同。3、DNA的鑒定：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色。【解答】解：A、過(guò)濾液沉淀過(guò)程在4℃冰箱中進(jìn)行可以使酶的活性降低，可以防止DNA降解，A正確；B、離心研磨液是為了加速細(xì)胞膜、細(xì)胞器、一些較大雜質(zhì)等的沉淀，B錯(cuò)誤；C、在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色，C正確；D、粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)，D正確。故選：B?！军c(diǎn)評(píng)】本題考查DNA的粗提取和鑒定，對(duì)于此類(lèi)試題，需要考生注意的細(xì)節(jié)較多，如實(shí)驗(yàn)的原理、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象等，需要考生在平時(shí)的學(xué)習(xí)過(guò)程中注意積累。9．（2022?福建）科研人員在2003年完成了大部分的人類(lèi)基因組測(cè)序工作，2022年宣布測(cè)完剩余的8%序列。這些序列富含高度重復(fù)序列，且多位于端粒區(qū)和著絲點(diǎn)區(qū)。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．通過(guò)人類(lèi)基因組可以確定基因的位置和表達(dá)量 B．人類(lèi)基因組中一定含有可轉(zhuǎn)錄但不翻譯的基因 C．著絲點(diǎn)區(qū)的突變可能影響姐妹染色單體的正常分離 D．人類(lèi)基因組測(cè)序全部完成有助于細(xì)胞衰老分子機(jī)制的研究【分析】人類(lèi)基因組計(jì)劃：1、概念：人類(lèi)基因的測(cè)序并了解其組成、結(jié)構(gòu)、功能和相互關(guān)系．英文簡(jiǎn)稱(chēng)HGP。2、人類(lèi)基因組計(jì)劃的目的：測(cè)定人類(lèi)基因組的全部DNA序列，解讀其中包含的遺傳信息。3、參加人類(lèi)基因組計(jì)劃的國(guó)家：美國(guó)、英國(guó)、德國(guó)、日本、法國(guó)和中國(guó)，中國(guó)承擔(dān)1%的測(cè)序任務(wù)。4、內(nèi)容：繪制人類(lèi)遺傳信息的地圖，主要包括遺傳圖、物理圖、序列圖、轉(zhuǎn)錄圖等。5、意義：對(duì)于人類(lèi)疾病的診斷和預(yù)防等具有重要意義，同時(shí)有可能導(dǎo)致?tīng)?zhēng)奪基因資源、基因歧視等負(fù)面效應(yīng)的出現(xiàn)?！窘獯稹拷猓篈、通過(guò)人類(lèi)基因組測(cè)序可確定基因的位置，但不能知道表達(dá)量，A錯(cuò)誤；B、有些基因可轉(zhuǎn)錄出某些RNA（tRNA），但不翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，B正確；C、著絲點(diǎn)分裂姐妹染色單體可分離為子染色體，染色體數(shù)目加倍，著絲點(diǎn)區(qū)的突變可能影響姐妹染色單體的正常分離，C正確；D、細(xì)胞的衰老與基因有關(guān)，人類(lèi)基因組測(cè)序全部完成有助于細(xì)胞衰老分子機(jī)制的研究，D正確。故選：A。【點(diǎn)評(píng)】本題主要考查轉(zhuǎn)錄翻譯、細(xì)胞的有絲分裂、細(xì)胞的衰老等知識(shí)，要求考生能把握知識(shí)內(nèi)在聯(lián)系，運(yùn)用相關(guān)知識(shí)進(jìn)行推理并作出合理判斷。二．解答題（共11小題）10．（2023?廣東）種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對(duì)野生型擬南芥（2n＝10）進(jìn)行誘變，篩選到一株種子增大的突變體。通過(guò)遺傳分析和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)野生型DAI基因發(fā)生一個(gè)堿基G到A的替換，突變后的基因?yàn)殡[性基因，據(jù)此推測(cè)突變體的表型與其有關(guān)，開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DAI基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變?cè)斐?，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與野生型植株的種子大小相近。（2）用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DAI基因，用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物和運(yùn)載體進(jìn)行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DAI基因可以正常表達(dá)，其上下游序列需具備啟動(dòng)子和終止子。（3）轉(zhuǎn)化后，T﹣DNA（其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時(shí)不發(fā)生交換）可在基因組單一位點(diǎn)插入也可以同時(shí)插入多個(gè)位點(diǎn)。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下，選出單一位點(diǎn)插入的植株，并進(jìn)一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株（圖1）。用于后續(xù)驗(yàn)證突變基因與表型的關(guān)系。①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T0代植株并自交，將T1代種子播種在選擇培養(yǎng)基上，能夠萌發(fā)并生長(zhǎng)的陽(yáng)性個(gè)體即表示其基因組中插入了DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代陽(yáng)性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，選擇陽(yáng)性率約75%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。③將②中選出的T2代陽(yáng)性植株自交（填“自交”、“與野生型雜交”或“與突變體雜交”）所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽(yáng)性率達(dá)到100%的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。為便于在后續(xù)研究中檢測(cè)該突變，研究者利用PCR擴(kuò)增野生型和突變型基因片段，再使用限制性核酸內(nèi)切酶X切割產(chǎn)物，通過(guò)核酸電泳即可進(jìn)行突變檢測(cè)，相關(guān)信息見(jiàn)圖2，在圖2電泳圖中將酶切結(jié)果對(duì)應(yīng)位置的條帶涂黑?！痉治觥?、基因突變包括顯性突變和隱性突變。2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心步驟：目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因。（1）啟動(dòng)子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。（2）終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端，其作用使轉(zhuǎn)錄終止。（3）標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。常用的標(biāo)記基因是抗生素抗性基因。3、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：【解答】解：（1）由題干信息可知，突變體是野生型DAI基因發(fā)生隱性突變產(chǎn)生的，因此采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DAI基因（顯性基因）轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變?cè)斐桑瑒t轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與野生型植株的種子大小相近，即表現(xiàn)顯性性狀。（2）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，通過(guò)PCR擴(kuò)增的DAI基因和運(yùn)載體需要用限制酶進(jìn)行切割，然后用DNA連接酶將兩者連接起來(lái)。其中在DAI基因的上游序列添加啟動(dòng)子，在DAI基因的下游序列添加終止子，以利于DAI基因可以正常表達(dá)。（3）①由圖1可知，T0代植株用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（T﹣DNA攜帶DAI基因和卡那霉素抗性基因）進(jìn)行了處理，若自交產(chǎn)生的T1代種子播種在含有卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上出現(xiàn)能夠正常生長(zhǎng)的個(gè)體，說(shuō)明其基因組中插入了DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代陽(yáng)性植株細(xì)胞中染色體上含有DAI基因，由于題干“選出單一位點(diǎn)插入的植株，并進(jìn)一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株”，因此T1代陽(yáng)性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽(yáng)性：陰性＝3：1，故選擇陽(yáng)性率約75%（）的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。③將②中選出的T2代陽(yáng)性植株自交所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，選擇單株種植在選擇性培養(yǎng)基上陽(yáng)性率達(dá)到100%的幼苗作為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株，因?yàn)檫@時(shí)所有的幼苗都含有DAI基因。分析圖2可知，突變型基因是由野生基因中某一位置的堿基G替換為堿基A造成的，因此其基因長(zhǎng)度都是150bp，由于野生型基因中沒(méi)有限制酶X的切割位點(diǎn)，而突變型基因中含有限制酶X的切割位點(diǎn)，會(huì)將突變型基因切割成50bp和100bp兩個(gè)片段，即電泳圖中野生型基因只有150bp一個(gè)條帶，而突變型基因有50bp和100bp兩個(gè)條帶。圖示如下：故答案為：（1）野生型（2）運(yùn)載體啟動(dòng)子和終止子（3）①DAI基因和卡那霉素抗性基因②75③自交100【點(diǎn)評(píng)】本題結(jié)合圖形，考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，要求考生識(shí)記基因工程的原理、操作步驟，掌握各操作步驟中需要注意的細(xì)節(jié)，能結(jié)合所學(xué)的知識(shí)準(zhǔn)確答題。11．（2023?山東）科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J﹣V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測(cè)，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。（1）與圖甲中啟動(dòng)子結(jié)合的酶是RNA聚合酶。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)（答出2個(gè)結(jié)構(gòu)即可）。（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物F1、R2或F2、R1。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的a鏈（填“a鏈”或“b鏈”）相應(yīng)部分的序列相同。（3）重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了J﹣V5融合蛋白，條帶2所檢出的蛋白不是（填“是”或“不是”）由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的?！痉治觥勘磉_(dá)載體上各序列的作用：?jiǎn)?dòng)子是作用是與RNA聚合酶結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，終止子的作用是終止轉(zhuǎn)錄，標(biāo)記基因用來(lái)篩選重組DNA，復(fù)制原點(diǎn)是質(zhì)粒復(fù)制的起點(diǎn)?！窘獯稹拷猓海?）啟動(dòng)子是作用是與RNA聚合酶結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，所以與圖甲中啟動(dòng)子結(jié)合的酶是RNA聚合酶。除圖甲中標(biāo)出的啟動(dòng)子、終止子結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)、限制酶切割位點(diǎn)，標(biāo)記基因用來(lái)篩選重組DNA，復(fù)制原點(diǎn)是質(zhì)粒復(fù)制的起點(diǎn)，限制酶切割位點(diǎn)限制酶識(shí)別序列。（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，啟動(dòng)子和終止子之間的片段的序列排序，進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物F1、R2或F2、R1。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與b鏈互補(bǔ)，與圖甲中J基因的a鏈相應(yīng)部分的序列相同。（3）重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平，結(jié)果如圖乙所示。其中出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了J﹣V5融合蛋白，抗J蛋白抗體檢測(cè)出現(xiàn)條帶2，抗V5抗體檢測(cè)不出現(xiàn)條帶2，說(shuō)明條帶2所檢出的蛋白不是由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。故答案為：（1）RNA聚合酶標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)（2）F1、R2或F2、R1a鏈（3）J﹣V5融合蛋白不是【點(diǎn)評(píng)】本題考查了基因工程的相關(guān)知識(shí)，準(zhǔn)確理解基因工程的四個(gè)步驟是解題的關(guān)鍵。12．（2023?遼寧）天然β淀粉酶大多耐熱性差，不利于工業(yè)化應(yīng)用。我國(guó)學(xué)者借助PCR改造β﹣淀粉酶基因，并將改造的基因與pLN23質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌，最終獲得耐高溫的β﹣淀粉酶。回答下列問(wèn)題：（1）上述過(guò)程屬于蛋白質(zhì)工程。（2）PCR中使用的聚合酶屬于③（填寫(xiě)編號(hào)）。①以DNA為模板的RNA聚合酶②以RNA為模板的RNA聚合酶③以DNA為模板的DNA聚合酶④以RNA為模板的DNA聚合酶（3）某天然β﹣淀粉酶由484個(gè)氨基酸構(gòu)成，研究發(fā)現(xiàn)，將該酶第476位天冬氨酸替換為天冬酰胺，耐熱性明顯提升。在圖1所示的β﹣淀粉酶基因改造方案中，含已替換堿基的引物是②（填寫(xiě)編號(hào)）。（4）為了使上述改造后的基因能在大腸桿菌中高效表達(dá)，由圖2所示的pLN23質(zhì)粒構(gòu)建得到基因表達(dá)載體。除圖示信息外，基因表達(dá)載體中還應(yīng)該有目的基因（即改造后的基因）和標(biāo)記基因。（5）目的基因（不含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）全長(zhǎng)為1.5kb，將其插入BamHⅠ位點(diǎn)。用EcoRⅠ酶切來(lái)自于不同大腸桿菌菌落的質(zhì)粒DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定DNA片段長(zhǎng)度，這一操作的目的是篩選導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌。正確連接的基因表達(dá)載體被EcoRⅠ酶切后長(zhǎng)度為5.7kb。（6）采用PCR還能在分子水平上確定目的基因是否轉(zhuǎn)錄，根據(jù)中心法則，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得PCR的模板。【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：1、目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸?kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。4、目的基因的檢測(cè)與鑒定：（1）分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因﹣﹣DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA﹣﹣分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)﹣﹣抗原﹣抗體雜交技術(shù)。（2）個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等?！窘獯稹拷猓海?）根據(jù)蛋白質(zhì)的功能改變基因的結(jié)構(gòu)，最終獲得耐高溫的β﹣淀粉酶，這屬于蛋白質(zhì)工程。（2）PCR的原理是DNA雙鏈復(fù)制，利用的酶是耐熱的DNA聚合酶，合成子鏈時(shí)是以DNA為模板。（3）根據(jù)β﹣淀粉酶的編碼序列，替換的堿基在編碼序列中，則利用的引物應(yīng)該把編碼序列全部擴(kuò)增在內(nèi)，則所用的引物是②③。再結(jié)合題意可知，β﹣淀粉酶由484個(gè)氨基酸構(gòu)成，而替換位點(diǎn)位于476位，則含已替換堿基的引物是②。（4）作為基因工程載體的質(zhì)粒應(yīng)該包含：復(fù)制原點(diǎn)、限制酶的切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子和終止子，根據(jù)圖示的表達(dá)載體可知應(yīng)還要包括目的基因和標(biāo)記基因。（5）目的基因通過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，大腸桿菌菌落的質(zhì)粒DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定DNA片段長(zhǎng)度，這一操作的目的是篩選出導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌。正確連接的基因表達(dá)載體只有一個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，則切割后的長(zhǎng)度為4.2+1.5＝5.7kb。（6）轉(zhuǎn)錄是以DNA為模板合成RNA的過(guò)程，通過(guò)PCR在分子水平上確定目的基因是否轉(zhuǎn)錄，則需要以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出DNA作為PCR反應(yīng)的模板。故答案為：（1）蛋白質(zhì)（2）③（3）②（4）標(biāo)記基因（5）篩選導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌5.7（6）逆轉(zhuǎn)錄【點(diǎn)評(píng)】本題以β淀粉酶的相關(guān)研究為知識(shí)背景，考查基因工程和蛋白質(zhì)工程的相關(guān)操作，熟記和理解相關(guān)知識(shí)并能用于解決實(shí)際問(wèn)題是解答本題的關(guān)鍵。13．（2023?天津）構(gòu)建可利用纖維素產(chǎn)乙醇的轉(zhuǎn)基因釀酒酵母菌株是解決能源危機(jī)的手段之一，為此設(shè)計(jì)表達(dá)載體，思路如下。（1）外源基因的選擇纖維素常見(jiàn)生物降解途徑如圖。釀酒酵母通常無(wú)法吸收纖維素、寡糖和纖維二糖，應(yīng)向釀酒酵母轉(zhuǎn)入圖中三種酶的基因，并使其表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞外（內(nèi)/外）發(fā)揮作用。（2）外源基因的插入方法同源重組是堿基序列基本相同的DNA區(qū)段通過(guò)配對(duì)、鏈斷裂和再連接而產(chǎn)生片段交換的過(guò)程。通過(guò)同源重組將外源基因插入染色體的特定位點(diǎn)可獲得遺傳穩(wěn)定的工程菌株，如甲圖所示。釀酒酵母基因組有多個(gè)AB短序列。為通過(guò)同源重組將外源基因插入AB之間，在設(shè)計(jì)表達(dá)載體時(shí)，可采用PCR技術(shù)在外源基因兩端分別引入A和B，獲得乙圖所示長(zhǎng)片段。PCR時(shí)應(yīng)選用的一對(duì)引物為P1和P6（從P1～P6中選）。（3）標(biāo)記基因的選擇URA3是尿嘧啶合成關(guān)鍵酶基因，常被用作標(biāo)記基因。另外，URA3編碼的蛋白可將外源5﹣氟乳清酸轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。①為得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株1，需將酶Ⅰ基因同URA3一起插入U(xiǎn)RA3缺陷型釀酒酵母基因組AB之間，并利用不含尿嘧啶的培養(yǎng)基篩選存活菌株。②在后續(xù)插入酶Ⅱ基因時(shí)，為繼續(xù)利用URA3作為篩選標(biāo)記，需切除菌株1的URA3。為此設(shè)計(jì)表達(dá)載體時(shí)，還應(yīng)向URA3兩端引入釀酒酵母基因組中不存在的同源區(qū)段C和C′，并以方式2排列才能通過(guò)同源重組達(dá)到上述目的。此后，需要將菌株1在含有5﹣氟乳清酸和尿嘧啶的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，存活菌株即為URA3被成功切除的菌株1′。（4）表達(dá)載體的構(gòu)建綜上，為將三種酶基因依次插入釀酒酵母基因組中，在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，A、B、C、C′、URA3和酶基因應(yīng)采用圖D的排布方式?！痉治觥炕蚬こ淌侵赴凑杖藗兊脑竿M(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品．基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，又叫做DNA重組技術(shù)?！窘獯稹拷猓海?）由于酵母菌無(wú)法吸收纖維素、寡糖和纖維二糖，所以導(dǎo)入分解纖維素的酶發(fā)揮作用的場(chǎng)所在細(xì)胞外。（2）根據(jù)題干信息“當(dāng)目的基因兩側(cè)的小段序列與基因表達(dá)載體上某序列相同時(shí)，就可以發(fā)生同源切割，將目的基因直接插入”，要保證目的基因兩側(cè)的小段序列與基因表達(dá)載體上某序列相同，需要選擇P1和P6這對(duì)引物進(jìn)行PCR。（3）①選擇了尿嘧啶合成基因（UGA）常用作標(biāo)記基因，則應(yīng)該將酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，如果導(dǎo)入成功，則形成菌落；如果沒(méi)有導(dǎo)入，則缺乏尿嘧啶，不能生存；方式一，C和C'方向相反，如果切割，則末端在一條鏈上，不能連接，所以選擇方式二，連接方向相同，切割后形成末端，便于連接。②由于尿嘧啶可以使5﹣氟乳清酸轉(zhuǎn)化為對(duì)酵母菌有毒物質(zhì)，所以應(yīng)該在含有5﹣氟乳清酸的培養(yǎng)基上，如果切割成功，則不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，則會(huì)產(chǎn)生有毒物質(zhì)，不能形成菌落。（4）在明確了表達(dá)載體整體構(gòu)建思路后，最終的表達(dá)載體需要同時(shí)滿足兩個(gè)條件：一是需要將UR43標(biāo)記基因與目的基因（酶基因）一起插入釀酒酵母基因組AB之間，所以A、B應(yīng)置于標(biāo)記基因與目的基因最外側(cè)；二是需要利用C、C片段切除URA3標(biāo)記基因，同時(shí)不能影響酶基因，所以C、C應(yīng)緊鄰URA3兩側(cè)。同時(shí)滿足上述條件的只有圖D。故答案為：（1）外（2）P1和P6（3）不含尿嘧啶；2；含有5﹣氟乳清酸和尿嘧啶（4）D【點(diǎn)評(píng)】本題以獲得能產(chǎn)生乙醇的工程菌株為背景，考查基因工程的相關(guān)內(nèi)容，重點(diǎn)考查基因表達(dá)載體的構(gòu)建，掌握各操作步驟中需要注意的細(xì)節(jié)問(wèn)題，識(shí)記PCR技術(shù)的原理和過(guò)程，能結(jié)合所學(xué)的知識(shí)準(zhǔn)確答題。14．（2023?浙江）賴(lài)氨酸是人體不能合成的必需氨基酸，而人類(lèi)主要食物中的賴(lài)氨酸含量很低，利用生物技術(shù)可提高食物中賴(lài)氨酸含量。回答下列問(wèn)題：（1）植物細(xì)胞合成的賴(lài)氨酸達(dá)到一定濃度時(shí)，能抑制合成過(guò)程中兩種關(guān)鍵酶的活性，導(dǎo)致賴(lài)氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調(diào)節(jié)方式屬于負(fù)反饋調(diào)節(jié)。根據(jù)這種調(diào)節(jié)方式，在培養(yǎng)基中添加過(guò)量的賴(lài)氨酸類(lèi)似物，用于篩選經(jīng)人工誘變的植物懸浮細(xì)胞，可得到抗賴(lài)氨酸類(lèi)似物的細(xì)胞突變體，通過(guò)培養(yǎng)獲得再生植株。（2）隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞工程結(jié)合和發(fā)展，2011年我國(guó)首次利用轉(zhuǎn)基因和體細(xì)胞核移植技術(shù)成功培育了高產(chǎn)賴(lài)氨酸轉(zhuǎn)基因克隆奶牛。其基本流程為：①構(gòu)建乳腺專(zhuān)一表達(dá)載體。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，為獲取富含賴(lài)氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通過(guò)檢索基因數(shù)據(jù)庫(kù)獲取其編碼序列，用化學(xué)合成法制備得到。再將獲得的目的基因與含有乳腺特異性啟動(dòng)子的相應(yīng)載體連接，構(gòu)建出乳腺專(zhuān)一表達(dá)載體。②表達(dá)載體轉(zhuǎn)入牛胚胎成纖維細(xì)胞（BEF）。將表達(dá)載體包裹到磷脂等構(gòu)成的脂質(zhì)體內(nèi)，與BEF膜發(fā)生融合，表達(dá)載體最終進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)生轉(zhuǎn)化。③核移植。將轉(zhuǎn)基因的BEF作為核供體細(xì)胞，從牛卵巢獲取卵母細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)及去核后作為受體細(xì)胞。將兩種細(xì)胞進(jìn)行電融合，電融合的作用除了促進(jìn)細(xì)胞融合，同時(shí)起到了激活重組細(xì)胞發(fā)育的作用。④重組細(xì)胞的體外培養(yǎng)及胚胎移植。重組細(xì)胞體外培養(yǎng)至桑葚胚或囊胚，植入代孕母牛子宮內(nèi)，直至小牛出生。⑤檢測(cè)。DNA水平檢測(cè)：利用PCR技術(shù)，以非轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以含有目的基因的BEF為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞中存在目的基因。RNA水平檢測(cè)：從非轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞，提取總RNA，對(duì)總RNA進(jìn)行DNA酶處理，以去除DNA污染，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，并以此為PCR的模板，利用特定引物擴(kuò)增目的基因片段。結(jié)果顯示目的基因在轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而不在牛耳組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，原因是什么？構(gòu)建的表達(dá)載體只含有乳腺特異性啟動(dòng)子，泌乳期只能在乳腺細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，而在牛耳細(xì)胞中不能表達(dá)?！痉治觥?、負(fù)反饋調(diào)節(jié)是指在一個(gè)系統(tǒng)中，系統(tǒng)工作的效果，反過(guò)來(lái)又作為信息調(diào)節(jié)該系統(tǒng)的工作，并且使系統(tǒng)工作的效果減弱或受到限制，從而保持系統(tǒng)的穩(wěn)定。2、基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸?kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因﹣DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA﹣分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。3、細(xì)胞核移植：將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體。用核移植的方法得到的動(dòng)物稱(chēng)為克隆動(dòng)物?！窘獯稹拷猓海?）植物細(xì)胞合成的賴(lài)氨酸達(dá)到一定濃度時(shí)，能抑制合成過(guò)程中兩種關(guān)鍵酶的活性，導(dǎo)致賴(lài)氨酸含量維持在一定濃度水平，這種調(diào)節(jié)方式體現(xiàn)了“在一個(gè)系統(tǒng)中，系統(tǒng)工作的效果，反過(guò)來(lái)又作為信息調(diào)節(jié)該系統(tǒng)的工作，并且使系統(tǒng)工作的效果減弱或受到限制”的特點(diǎn)，因而屬于負(fù)反饋調(diào)節(jié)。如果想得到抗賴(lài)氨酸類(lèi)似物的細(xì)胞突變體可在培養(yǎng)基中添加過(guò)量的賴(lài)氨酸類(lèi)似物，觀察突變體細(xì)胞能否正常生存。（2）①獲取目的基因的方法有多種，從基因文庫(kù)中獲取、PCR擴(kuò)增、化學(xué)方法合成等。若要獲取富含賴(lài)氨酸的酪蛋白基因，可通過(guò)檢索序列數(shù)據(jù)庫(kù)獲取其編碼序列，最后再用化學(xué)合成法制備得到。②將構(gòu)建好的基因表達(dá)載體包裹到磷脂等構(gòu)成的脂質(zhì)體內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞膜的流動(dòng)性，使其與BEF膜發(fā)生融合，基因表達(dá)載體進(jìn)入細(xì)胞完成轉(zhuǎn)化。③細(xì)胞核移植過(guò)程中，因?yàn)槁涯讣?xì)胞中含有促使細(xì)胞核表達(dá)全能性的物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)條件，所以常用處于減數(shù)第二次分裂中期的去核卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞。誘導(dǎo)細(xì)胞核和卵母細(xì)胞融合的方法是電融合法，該方法除了能促進(jìn)細(xì)胞融合，同時(shí)具有激活重組細(xì)胞發(fā)育的作用。④重組細(xì)胞發(fā)育的早期胚胎要到適宜階段才能進(jìn)行移植。一般牛、羊要培養(yǎng)到桑葚胚或囊胚階段，將胚胎移入代孕母牛子宮內(nèi)發(fā)育，直至小牛出生。⑤陽(yáng)性對(duì)照：按照當(dāng)前實(shí)驗(yàn)方案一定能得到正面預(yù)期結(jié)果的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照是已知的對(duì)測(cè)量結(jié)果有影響的因素，目的是確定實(shí)驗(yàn)程序無(wú)誤。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照正好相反。在DNA水平檢測(cè)過(guò)程中，以非轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以含有目的基因的BEF為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞中存在目的基因。在RNA水平檢測(cè)過(guò)程中，從非轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞，提取總RNA，為了除去其中的DNA污染，需要添加DNA酶使其水解，得到純凈的RNA后，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，并以此為PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增目的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：目的基因在轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而不在牛耳組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，分析其原因是：構(gòu)建的表達(dá)載體只含有乳腺特異性啟動(dòng)子，泌乳期只能在乳腺細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，而在牛耳細(xì)胞中不能表達(dá)。故答案為：（1）負(fù)反饋調(diào)節(jié)；過(guò)量的賴(lài)氨酸類(lèi)似物（2）序列數(shù)據(jù)庫(kù)；融合；受體細(xì)胞；激活；桑葚胚或囊胚；含有目的基因的BEF；DNA酶；PCR的模板；構(gòu)建的表達(dá)載體只含有乳腺特異性啟動(dòng)子，泌乳期只能在乳腺細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，而在牛耳細(xì)胞中不能表達(dá)【點(diǎn)評(píng)】本題考查基因工程和動(dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù)，意在考查學(xué)生識(shí)記所學(xué)知識(shí)要點(diǎn)，把握知識(shí)間的內(nèi)在聯(lián)系，形成知識(shí)網(wǎng)絡(luò)的能力，同時(shí)獲取題干信息準(zhǔn)確答題。15．（2023?河北）單細(xì)胞硅藻具有生產(chǎn)生物柴油的潛在價(jià)值。研究者將硅藻脂質(zhì)合成相關(guān)的蘋(píng)果酸酶（ME）基因構(gòu)建到超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入硅藻細(xì)胞，以期獲得高產(chǎn)生物柴油的硅藻品系?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）根據(jù)DNA和蛋白質(zhì)在特定濃度乙醇溶液中的溶解度差異獲得硅藻粗提DNA，PCR擴(kuò)增得到目的基因。（2）超表達(dá)載體的基本組件包括復(fù)制原點(diǎn)、目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子和終止子等。本研究中目的基因?yàn)樘O(píng)果酸酶基因（或“ME基因”）。（3）PCR擴(kuò)增時(shí)引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與模板特異性結(jié)合。根據(jù)表達(dá)載體序列設(shè)計(jì)了圖1所示的兩條引物，對(duì)非轉(zhuǎn)基因硅藻品系A(chǔ)和轉(zhuǎn)ME基因硅藻候選品系B進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。其中，樣品1為本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組，樣品2有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果表明引物間的載體序列整合到硅藻細(xì)胞基因組中（或“ME基因序列整合到硅藻細(xì)胞基因組中”）。（4）利用單細(xì)胞硅藻生產(chǎn)生物柴油的影響因素包括胞內(nèi)脂質(zhì)含量和繁殖速率等。圖3為硅藻胞內(nèi)脂質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果。據(jù)圖分析，相對(duì)于品系A(chǔ)，品系B的胞內(nèi)脂質(zhì)含量平均水平明顯增加。同時(shí)，還需測(cè)定細(xì)胞數(shù)量以比較在相同發(fā)酵條件下品系A(chǔ)與B的繁殖速率。（5）胞內(nèi)脂質(zhì)合成需要大量ATP。ME催化蘋(píng)果酸氧化脫羧反應(yīng)產(chǎn)生NADH。研究表明，品系B線粒體中ME含量顯著高于品系A(chǔ)。據(jù)此分析，ME基因超表達(dá)使線粒體中NADH水平升高，有氧呼吸生成的ATP增多，最終促進(jìn)胞內(nèi)脂質(zhì)合成。（6）相對(duì)于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻進(jìn)行生物柴油生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)之處為節(jié)約土地資源、不受季節(jié)和氣候限制（或“節(jié)約糧食資源”或“節(jié)約淡水”或“能夠通過(guò)發(fā)酵大量生產(chǎn)”）。（答出兩點(diǎn)即可）【分析】1、PCR的含義：PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫(xiě)，它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在生物體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。2、PCR原理：DNA半保留復(fù)制。3、PCR基本條件：DNA模板、4種脫氧核苷三磷酸、2種引物、耐高溫的DNA聚合酶、緩沖液?！窘獯稹拷猓海?）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA和蛋白質(zhì)。因此，根據(jù)DNA和蛋白質(zhì)在特定濃度乙醇溶液中的溶解度差異可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法得到的粗提DNA可以作為PCR擴(kuò)增目的基因的模板。（2）基因表達(dá)載體除目的基因、標(biāo)記基因外，還必須有啟動(dòng)子、終止子等。啟動(dòng)子和終止子均為一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段。它們分別位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是來(lái)源于硅藻的蘋(píng)果酸酶（ME）基因。（3）PCR是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。對(duì)照實(shí)驗(yàn)一般要設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組中以非轉(zhuǎn)基因的硅藻細(xì)胞基因組DNA作為PCR模板，而在實(shí)驗(yàn)組中以轉(zhuǎn)ME基因的硅藻細(xì)胞基因組DNA作為模板。如此比較兩個(gè)實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果可以判定引物間的載體序列是否整合到硅藻細(xì)胞的基因組中，從而推測(cè)ME基因序列是否整合到硅藻細(xì)胞基因組中。（4）硅藻細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量和繁殖速率是利用單細(xì)胞硅藻生產(chǎn)生物柴油的兩個(gè)重要影響因素。據(jù)圖3分析可知，相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因硅藻細(xì)胞品系A(chǔ)，轉(zhuǎn)基因硅藻細(xì)胞品系B的胞內(nèi)脂質(zhì)含量平均值顯著提高。在測(cè)定硅藻細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的同時(shí)，還需測(cè)定在相同發(fā)酵條件下品系A(chǔ)與B的硅藻細(xì)胞數(shù)量，從而可篩選獲得高產(chǎn)生物柴油的優(yōu)良硅藻細(xì)胞品系。（5）細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的合成需要大量ATP。蘋(píng)果酸酶（ME）可催化蘋(píng)果酸生成NADH。研究表明，品系B線粒體中ME含量顯著高于品系A(chǔ)。據(jù)此分析可知，ME基因的超表達(dá)導(dǎo)致線粒體中的NADH水平升高，NADH進(jìn)一步通過(guò)有氧呼吸產(chǎn)生大量ATP，最終促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的合成。（6）相對(duì)于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻進(jìn)行生物柴油生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)為：能夠通過(guò)發(fā)酵大量生產(chǎn)、不受季節(jié)和氣候限制、節(jié)約土地資源、節(jié)約淡水以及節(jié)約糧食資源等。故答案為：（1）溶解度（2）啟動(dòng)子終止子蘋(píng)果酸酶基因（或“ME基因”）（3）堿基互補(bǔ)配對(duì)對(duì)照引物間的載體序列整合到硅藻細(xì)胞基因組中（或“ME基因序列整合到硅藻細(xì)胞基因組中”）（4）增加細(xì)胞數(shù)量（5）有氧呼吸生成的ATP增多（6）節(jié)約土地資源、不受季節(jié)和氣候限制（或“節(jié)約糧食資源”或“節(jié)約淡水”或“能夠通過(guò)發(fā)酵大量生產(chǎn)”）【點(diǎn)評(píng)】本題考查PCR技術(shù)的相關(guān)知識(shí)，意在考查學(xué)生的識(shí)記能力和判斷能力，具備運(yùn)用所學(xué)知識(shí)綜合分析問(wèn)題的能力是解答本題的關(guān)鍵。16．（2023?甲卷）接種疫苗是預(yù)防傳染病的一項(xiàng)重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的傳播，降低乙型肝炎發(fā)病率。乙肝病毒是一種DNA病毒。重組乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技術(shù)獲得的乙肝病毒表面抗原（一種病毒蛋白）?；卮鹣铝袉?wèn)題。（1）接種上述重組乙肝疫苗不會(huì)在人體中產(chǎn)生乙肝病毒，原因是重組乙肝疫苗成分為蛋白質(zhì)，無(wú)法獨(dú)立在宿主體內(nèi)增殖。（2）制備重組乙肝疫苗時(shí)，需要利用重組表達(dá)載體將乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）導(dǎo)入酵母細(xì)胞中表達(dá)。重組表達(dá)載體中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是便于重組DNA分子的篩選。能識(shí)別載體中的啟動(dòng)子并驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄的酶是RNA聚合酶。（3）目的基因?qū)虢湍讣?xì)胞后，若要檢測(cè)目的基因是否插入染色體中，需要從酵母細(xì)胞中提取核染色體DNA（核DNA）進(jìn)行DNA分子雜交，DNA分子雜交時(shí)應(yīng)使用的探針是被標(biāo)記的目的基因的單鏈DNA片段。（4）若要通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的基因在酵母細(xì)胞中是否表達(dá)出目的蛋白，請(qǐng)簡(jiǎn)要寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)思路。①檢測(cè)目的基因是否插入：通過(guò)基因探針，利用DNA分子雜交技術(shù)，檢測(cè)目的基因是否插入到酵母細(xì)胞的染色體上；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄：通過(guò)使用基因探針，利用分子雜交技術(shù)，檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄形成mRNA；③檢測(cè)是否翻譯：通過(guò)使用相應(yīng)抗體，利用抗原﹣抗體雜交技術(shù)，檢測(cè)mRNA是否翻譯形成蛋白質(zhì)?！痉治觥炕蚬こ碳夹g(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸?kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定。【解答】解：（1）分析題意可知，重組乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技術(shù)獲得的乙肝病毒表面抗原（一種病毒蛋白），由于細(xì)胞生物的遺傳物質(zhì)是DNA，而蛋白質(zhì)注入人體后，不能進(jìn)行復(fù)制，也無(wú)法獨(dú)立增殖，故接種上述重組乙肝疫苗不會(huì)在人體中產(chǎn)生乙肝病毒。（2）重組表達(dá)載體中通常含有抗生素抗性基因，其中抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選；啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，可用于驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，并最終表達(dá)出蛋白質(zhì)。（3）目的基因的檢測(cè)與鑒定的第一步是檢測(cè)受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因，故需要提取酵母細(xì)胞染色體DNA（核DNA）進(jìn)行目的基因鑒定；基因探針是一段帶有檢測(cè)標(biāo)記、與目的基因互補(bǔ)的單鏈DNA片段。（4）若要通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的基因在酵母細(xì)胞中是否表達(dá)出目的蛋白，即檢測(cè)其插入、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程是否成功：①檢測(cè)目的基因是否插入：通過(guò)基因探針，利用DNA分子雜交技術(shù)，檢測(cè)目的基因是否插入到酵母細(xì)胞的染色體上；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄：通過(guò)使用基因探針，利用分子雜交技術(shù)，檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄形成mRNA；③