第37頁（共38頁）2021-2025年高考生物真題知識點分類匯編之基因工程（一）一．選擇題（共12小題）1．（2025?安徽）質(zhì)粒K中含有β﹣半乳糖苷酶基因，將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細胞后，其編碼的酶可分解X﹣gal，產(chǎn)生藍色物質(zhì)，進而形成藍色菌落，如圖所示?？蒲行〗M以該質(zhì)粒作為載體。采用基因工程技術(shù)實現(xiàn)人源干擾素基因在大腸桿菌中的高效表達。下列敘述錯誤的是（）A．使用氯化鈣處理大腸桿菌以提高轉(zhuǎn)化效率，可增加篩選平板上白色和藍色菌落數(shù) B．如果篩選平板中僅含卡那霉素，生長出的白色菌落不可判定為含目的基因的菌株 C．因質(zhì)粒K中含兩個標(biāo)記基因，篩選平板中長出的白色菌落即為表達目標(biāo)蛋白的菌株 D．若篩選平板中藍色菌落偏多，原因可能是質(zhì)粒K經(jīng)酶切后自身環(huán)化并導(dǎo)入了大腸桿菌2．（2025?四川）下列以土豆為材料的實驗描述，錯誤的是（）A．土豆DNA溶于酒精后，與二苯胺試劑混合呈藍色 B．向土豆勻漿中加入一定量的碘液后，溶液會呈藍色 C．利用土豆勻漿制備的培養(yǎng)基，可用于酵母菌的培養(yǎng) D．土豆中的過氧化氫酶可用于探究pH對酶活性的影響3．（2025?選擇性）下列關(guān)于耐高溫的DNA聚合酶的敘述正確的是（）A．基本單位是脫氧核苷酸 B．在細胞內(nèi)或細胞外均可發(fā)揮作用 C．當(dāng)模板DNA和脫氧核苷酸存在時即可催化反應(yīng) D．為維持較高活性，適宜在70℃～75℃下保存4．（2024?湖南）某同學(xué)將質(zhì)粒DNA進行限制酶酶切時，發(fā)現(xiàn)DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是（）A．限制酶失活，更換新的限制酶 B．酶切條件不合適，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和酶的用量等 C．質(zhì)粒DNA突變導(dǎo)致酶識別位點缺失，更換正常質(zhì)粒DNA D．酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶5．（2024?河北）下列相關(guān)實驗操作正確的是（）A．配制PCR反應(yīng)體系時，加入等量的4種核糖核苷酸溶液作為擴增原料 B．利用添加核酸染料的凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳后，在紫外燈下觀察結(jié)果 C．將配制的酵母培養(yǎng)基煮沸并冷卻后，在酒精燈火焰旁倒平板 D．將接種環(huán)燒紅，迅速蘸取酵母菌液在培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，獲得單菌落6．（2024?天津）胰島素的研發(fā)走過了：動物提取—化學(xué)合成—重組胰島素生產(chǎn)—胰島素類似物生產(chǎn)等歷程。有關(guān)敘述錯誤的是（）A．動物體內(nèi)胰島素由胰島B細胞合成并胞吐出細胞 B．氨基酸是化學(xué)合成胰島素的原料 C．用大腸桿菌和乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)胰島素需相同的啟動子 D．利用蛋白質(zhì)工程可生產(chǎn)速效胰島素等胰島素類似物7．（2024?選擇性）關(guān)于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的實驗，下列敘述正確的是（）A．瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小 B．凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置 C．在同一電場作用下，DNA片段越長，向負極遷移速率越快 D．瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來8．（2024?福建）中國水仙是一種三倍體觀賞花卉。傳統(tǒng)生產(chǎn)采用分球莖繁殖方式，不僅周期長、產(chǎn)率低、花色單調(diào)，還易積累病毒。下列措施無法達到改良目的的是（）A．用水仙鱗片進行植物組織培養(yǎng)以提高產(chǎn)率 B．利用單倍體育種對中國水仙進行品種選育 C．選用水仙幼嫩組織作為外植體獲得脫毒苗 D．通過基因工程技術(shù)引入外源基因改變花色9．（2024?山東）關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法正確的是（）A．整個提取過程中可以不使用離心機 B．研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，應(yīng)充分搖勻再倒入燒杯中 C．鑒定過程中DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變 D．僅設(shè)置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾10．（2024?山東）制備熒光標(biāo)記的DNA探針時，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大腸桿菌DNA聚合酶、擴增緩沖液、H2O和4種脫氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和堿基被熒光標(biāo)記的dATP）的反應(yīng)管①～④中，分別加入如表所示的適量單鏈DNA。已知形成的雙鏈DNA區(qū)遵循堿基互補配對原則，且在本實驗的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個連續(xù)堿基對的雙鏈DNA區(qū)。能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針的反應(yīng)管有（）反應(yīng)管加入的單鏈DNA①5′﹣GCCGATCTTTATA﹣3′3′﹣GACCGGCTAGAAA﹣5′②5′﹣AGAGCCAATTGGC﹣3′③5′﹣ATTTCCCGATCCG﹣3′3′﹣AGGGCTAGGCATA﹣5′④5′﹣TTCACTGGCCAGT﹣3′A．①② B．②③ C．①④ D．③④11．（2024?臺灣）某警察利用PCR技術(shù)分析刑案現(xiàn)場DNA樣本甲，以及嫌疑人乙、丙、丁的血液DNA樣本。四樣本的PCR產(chǎn)物分別以同一膠體進行電泳結(jié)果如圖所示，黑色條帶為產(chǎn)物在膠片上的訊號，產(chǎn)物分子量越大泳動越慢，條帶會位于膠片較高位置。下列推論何者正確（）A．如圖可顯示轉(zhuǎn)錄后修飾現(xiàn)象的異同，可用來判斷誰最可能是犯人 B．如圖可觀測到基因點突變位置，以判斷犯人 C．三人之中，丁最有可能是此案的犯人 D．四個樣本的PCR反應(yīng)需使用相同的引子對組合，才能進行比較分析12．（2024?江西）γ﹣氨基丁酸在醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。利用L﹣谷氨酸脫羧酶（GadB）催化L﹣谷氨酸脫羧是高效生產(chǎn)γ﹣氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L﹣谷氨酸脫羧酶基因（gadB）導(dǎo)入生產(chǎn)菌株E.coliA，構(gòu)建了以L﹣谷氨酸鈉為底物高效生產(chǎn)γ﹣氨基丁酸的菌株E.coliB。下列敘述正確的是（）A．上圖表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB B．E.coliB發(fā)酵生產(chǎn)γ﹣氨基丁酸時，L﹣谷氨酸鈉的作用是供能 C．E.coliA和E.coliB都能高效降解γ﹣氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構(gòu)建重組質(zhì)粒二．實驗題（共1小題）13．（2025?重慶）絕大多數(shù)哺乳動物生來怕辣，而小型哺乳動物樹鼩先天不怕辣，喜食含辣椒素類物質(zhì)的植物。為探究其原因，我國研究人員進行了系列研究。（1）研究發(fā)現(xiàn)，樹鼩的受體蛋白TR1對辣椒素的敏感性低于其他哺乳動物。為研究樹鼩和其他哺乳動物TR1蛋白的差異，可設(shè)計開展如下實驗：①；②將分別進行酶切并連接；③將重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌；④分離表達的TR1蛋白質(zhì)測定，明確蛋白之間的差異。（2）樹鼩及一些哺乳動物的TR1蛋白存在差異，如圖所示。據(jù)分析，樹鼩對辣椒素的敏感性降低，很可能是由于TR1第579位氨基酸差異造成的，可證實該推測的實驗思路是。（3）樹鼩與其喜食植物的地理分布基本一致，據(jù)此可推測樹鼩對含辣椒素類物質(zhì)植物的適應(yīng)形成的必要條件是。三．解答題（共7小題）14．（2025?選擇性）馬鈴薯作為重要農(nóng)作物，提高其冷耐受性可拓展優(yōu)質(zhì)馬鈴薯的種植區(qū)域。我國科研人員發(fā)現(xiàn)，野生馬鈴薯中S基因的表達與其冷耐受性調(diào)控有關(guān)，將該基因?qū)朐耘囫R鈴薯中可顯著增強其抗寒能力?；卮鹣铝袉栴}。限制酶識別序列及切割位點BglⅡ5′﹣A↓GATCT﹣3′3′﹣TCTAG↑A﹣5′NdeⅠ5′﹣CA↓TATG﹣3′3′﹣GTAT↑AC﹣5′XhoⅠ5′﹣C↓TCGAG﹣3′3′﹣GAGCT↑C﹣5′EcoRⅠ5′﹣G↓AATTC﹣3′3′﹣CTTAA↑G﹣5′BamHⅠ5′﹣G↓GATCC﹣3′3′﹣CCTAG↑G﹣5′SalⅠ5′﹣G↓TCGAC﹣3′3′﹣CAGCT↑G﹣5′XbaⅠ5′﹣T↓CTAGA﹣3′3′AGATC↑T﹣5′（1）PCR擴增目的基因時，需要模板DNA、引物、、含Mg2+的緩沖液和耐高溫的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的步驟中起作用。（2）圖中標(biāo)識了載體和S基因中限制酶的切割位點。為將S基因正確插入載體，PCR擴增S基因時需在引物的（填“5′端”或“3′端”）添加限制酶識別序列，結(jié)合上表分析，上游引物應(yīng)添加的堿基序列是5′﹣﹣3′，切割載體時應(yīng)選用的兩種限制酶是。PCR擴增產(chǎn)物和載體分別被限制酶切割后，經(jīng)純化和連接，獲得含S基因的表達載體并導(dǎo)入農(nóng)桿菌。（3）用攜帶S基因的農(nóng)桿菌侵染栽培馬鈴薯愈傷組織時，基因表達載體中T﹣DNA進入愈傷組織細胞，將S基因整合到，抗性基因可用于篩選成功轉(zhuǎn)化的愈傷組織。該愈傷組織經(jīng)形成芽、根，繼續(xù)培育可獲得抗寒能力顯著增強的馬鈴薯植株。15．（2025?四川）桿菌M2合成的短肽拉索西丁能有效殺死多種臨床耐藥細菌。拉索西丁能與細菌的核糖體結(jié)合，阻止攜帶氨基酸的tRNA進入核糖體位點2。有人將合成拉索西丁的相關(guān)基因（lrcA﹣lrcF）導(dǎo)入鏈霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用機制如圖?；卮鹣铝袉栴}。注：①F1、F2、F3和F4為與相應(yīng)位置的DNA配對的單鏈引物，“→”指引物5′﹣3′方向。②密碼子對應(yīng)的氨基酸：AAA—賴氨酸；AUG—甲硫氨酸（起始）；UUC—苯丙氨酸；ACA—蘇氨酸；UCG—絲氨酸。（1）用PCR技術(shù)從桿菌M2基因組中擴增lrcA﹣lrcF目的基因時，應(yīng)選用引物。本研究載體使用了鏈霉菌的復(fù)制原點，其目的是。（2）采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切構(gòu)建的重組質(zhì)粒，產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測應(yīng)產(chǎn)生條電泳條帶，電泳檢測酶切產(chǎn)物的目的是。（3）由圖可知，拉索西丁與核糖體結(jié)合后，會阻止攜帶（填氨基酸名稱）的tRNA進入結(jié)合位點，導(dǎo)致，最終引起細菌死亡。（4）重組鏈霉菌的目的基因產(chǎn)物經(jīng)驗證有殺菌活性，但重組菌在實驗室多次培養(yǎng)后，提取的目的基因產(chǎn)物殺菌活性喪失，可能的原因是。若運用發(fā)酵工程來生產(chǎn)拉素西丁工程藥物，除產(chǎn)物活性外還需進一步研究的問題有（答出1點即可）。16．（2025?湖南）非洲豬瘟病毒是一種雙鏈DNA病毒，可引起急性豬傳染病。基因A編碼該病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白A，其在病毒侵入宿主細胞和誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。回答下列問題：（1）制備特定抗原①獲取基因A，構(gòu)建重組質(zhì)粒（該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖所示）。重組質(zhì)粒的必備元件包括目的基因、限制酶切割位點、標(biāo)記基因、啟動子和等；為確定基因A已連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，應(yīng)選用圖中的一對引物對待測質(zhì)粒進行PCR擴增，預(yù)期擴增產(chǎn)物的片段大小為bp。②將DNA測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌構(gòu)建重組菌。培養(yǎng)重組菌，誘導(dǎo)蛋白A合成。收集重組菌發(fā)酵液進行離心，發(fā)現(xiàn)上清液中無蛋白A，可能的原因是（答出兩點即可）。（2）制備抗蛋白A單克隆抗體用蛋白A對小鼠進行免疫后，將免疫小鼠B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，誘導(dǎo)融合的常用方法有（答出一種即可）。選擇培養(yǎng)時，對雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)和，多次篩選獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細胞。體外培養(yǎng)或利用小鼠大量生產(chǎn)的抗蛋白A單克隆抗體，可用于非洲豬瘟的早期診斷。17．（2025?河北）為治理水體中對生物有毒害的鎘污染，研究者構(gòu)建了分泌信號肽SP7、鎘離子結(jié)合蛋白CADR、定位于細胞壁的蛋白GP1和黃色熒光蛋白YFP編碼序列融合表達的載體，轉(zhuǎn)入單細胞衣藻，實現(xiàn)CADR大量合成、分泌并定位于細胞壁，以吸附水體中的鎘離子?；卮鹣铝袉栴}：（1）在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脫氧核苷酸中，隨著PCR反應(yīng)進行，分子數(shù)量逐漸減少的是和。模板與引物在PCR反應(yīng)的階段開始結(jié)合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高溫，其原因為。（2）載體中可用的酶切位點信息和擬構(gòu)建載體的部分結(jié)構(gòu)如圖1所示。在將CADR、GP1和YFP基因逐個構(gòu)建到載體時，為避免錯誤連接，需向以上三個基因的兩端分別添加限制酶識別序列，其中GP1兩端應(yīng)添加（填兩種限制酶）的識別序列。用DNA連接酶連接時，可催化載體和目的基因之間形成鍵。（3）若在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)基因衣藻表現(xiàn)為，初步表明融合蛋白表達成功。將轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻置于含鎘離子的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時間后，若轉(zhuǎn)基因衣藻細胞壁比野生型衣藻細胞壁的鎘離子含量，則表明融合蛋白能結(jié)合鎘離子。（4）將轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻在不同鎘離子濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6天后，檢測細胞密度，結(jié)果見圖2。轉(zhuǎn)基因衣藻在含有不同濃度鎘離子的培養(yǎng)液中生長均優(yōu)于野生型衣藻的原因可能是。240μmol?L﹣1鎘離子濃度下，轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻生長均被明顯抑制的原因可能是。（5）轉(zhuǎn)基因衣藻可用于水體鎘污染治理，與施加化學(xué)藥物法相比，能體現(xiàn)出其環(huán)境治理優(yōu)勢的兩個特性是和。（填標(biāo)號）①衣藻作為生物材料在水體中可自我繁殖②衣藻生長速率受鎘離子濃度影響③衣藻可吸收水體中能引起富營養(yǎng)化的物質(zhì)④衣藻吸附的鎘可沿食物鏈傳遞18．（2025?山東）種子休眠是抵御穗發(fā)芽的一種機制。通過對Ti質(zhì)粒的改造，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將Ti質(zhì)粒上的T﹣DNA隨機整合到小麥基因組中，篩選到2個種子休眠相關(guān)基因的插入失活純合突變體。與野生型相比，突變體種子的萌發(fā)率降低。小麥基因組序列信息已知。（1）Ti質(zhì)粒上與其在農(nóng)桿菌中的復(fù)制能力相關(guān)的結(jié)構(gòu)為。選用圖甲中的SmaⅠ對抗除草劑基因X進行完全酶切，再選擇SmaⅠ和對Ti質(zhì)粒進行完全酶切，將產(chǎn)生的黏性末端補平，補平時使用的酶是。利用DNA連接酶將酶切后的包含抗除草劑基因X的片段與酶切并補平的Ti質(zhì)粒進行連接，構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；經(jīng)卡那霉素篩選并提取質(zhì)粒后再選用限制酶進行完全酶切并電泳檢測，若電泳結(jié)果呈現(xiàn)一長一短2條帶，較短的條帶長度近似為bp，則一定為正向重組質(zhì)粒。（2）為證明這兩個突變體是由于T﹣DNA插入到小麥基因組中同一基因?qū)е碌?，提取基因組DNA，經(jīng)酶切后產(chǎn)生含有T﹣DNA的基因組片段（圖乙）。在此酶切過程中，限于后續(xù)PCR難以擴增大片段DNA，最好使用識別序列為（填“4”“6”或“8”）個堿基對的限制酶，且T﹣DNA中應(yīng)不含該酶的酶切位點。需首先將圖乙的片段，才能利用引物P1和P2成功擴增未知序列。PCR擴增出未知序列后，進行了一系列操作，其中可以判斷出2條片段的未知序列是否屬于同一個基因的操作為（填“瓊脂糖凝膠電泳”或“測序和序列比對”）。（3）通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的含有野生型基因的表達載體轉(zhuǎn)入突變植株，如果檢測到野生型基因，（填“能”或“不能”）確定該植株的表型為野生型。19．（2025?選擇性）香樹脂醇具有抗炎等功效，從植物中提取難度大、產(chǎn)率低。通過在酵母菌中表達外源香樹脂醇合酶基因N，可高效生產(chǎn)香樹脂醇?；卮鹣铝袉栴}。（1）可從中查詢基因N的編碼序列，設(shè)計特定引物。如圖1所示，a鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，為保證基因N與質(zhì)粒pYL正確連接，需在引物1和引物2的5′端分別引入和限制酶識別序列。PCR擴增基因N，特異性酶切后，利用連接DNA片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒，大小約9.5kb（kb為千堿基對），假設(shè)構(gòu)建重組質(zhì)粒前后，質(zhì)粒pYL對應(yīng)部分大小基本不變。（2）進一步篩選構(gòu)建的質(zhì)粒，以1﹣4號菌株中提取的質(zhì)粒為模板，使用引物1和引物2進行PCR擴增，電泳PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖2。在第5組的PCR反應(yīng)中，使用無菌水代替實驗組的模板DNA，目的是檢驗PCR反應(yīng)中是否有的污染。初步判斷實驗組（從“1～4”中選填）的質(zhì)粒中成功插入了基因N，理由是。（3）為提高香樹脂醇合酶催化效率，將編碼第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的堿基序列替換為編碼丙氨酸的堿基序列，丙氨酸的密碼子有GCA等。a是誘變第240位脯氨酸編碼序列的引物（GCA為誘變序列），b、c、d其中一條是誘變第243位苯丙氨酸的引物，其配對模板與a的配對模板相同。據(jù)此分析，丙氨酸的密碼子除GCA外，還有。a：5′﹣…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…﹣3′b：5′﹣…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…﹣3′c：5′﹣…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…﹣3′d：5′﹣…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…﹣3′（4）進一步檢測轉(zhuǎn)基因酵母菌發(fā)酵得到的含量并進行比較，可以選出最優(yōu)的香樹脂醇合酶基因的改造方案。20．（2025?浙江）3﹣磷酸甘油脫氫酶（GPD）是酵母細胞中甘油合成的關(guān)鍵酶。利用某假絲酵母菌株為材料，克隆具有高效催化效率的3﹣磷酸甘油脫氫酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通過第1次PCR擴增出該基因的中間部分，再通過第2次PCR分別擴增出該基因的兩側(cè)，經(jīng)拼接獲得完整基因的序列，如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：（1）分析不同物種的GPD蛋白序列，確定蛋白質(zhì)上相同的氨基酸區(qū)段，依據(jù)這些氨基酸所對應(yīng)的，確定DNA序列，進而設(shè)計1對引物。以該菌株基因組DNA為模板進行第1次PCR，利用凝膠電泳分離并純化DNA片段，進一步測定PCR產(chǎn)物的序列。在制備PCR反應(yīng)體系時，每次用微量移液器吸取不同試劑前，需要確認或調(diào)整刻度和量程，還需要。（2）若在上述PCR擴增結(jié)果中，除獲得一條陽性條帶外，還出現(xiàn)了另外一條條帶，不可能的原因是。A．DNA模板被其他酵母細胞的基因組DNA污染B．每個引物與DNA模板存在2個配對結(jié)合位點C．在基因組中Gpd基因有2個拷貝D．在基因組中存在1個與Gpd基因序列高度相似的其他基因（3）為獲得完整的Gpd基因，分別用限制性核酸內(nèi)切酶PstⅠ和SalⅠ單酶切基因組DNA后，各自用DNA連接酶連接形成環(huán)形DNA，再用苯酚—氯仿抽提除去雜質(zhì)，最后加入沉淀環(huán)形DNA。根據(jù)第一次PCR產(chǎn)物測定獲得的序列，重新設(shè)計一對引物，以環(huán)形DNA為模板進行第二次PCR，最后進行測序。用于第二次PCR的一對引物，其序列應(yīng)是DNA鏈上的（A．P1和P2B．P3和P4C．P1和P4D．P2和P3）。根據(jù)測序結(jié)果拼接獲得完整的Gpd基因序列，其中的啟動子和終止子具有功能。（4）為確定克隆獲得的Gpd基因的準(zhǔn)確性，可將獲得的基因序列與已建立的進行比對。將Gpd基因的編碼區(qū)與連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母細胞中，實現(xiàn)利用釀酒酵母高效合成甘油的目的。

2021-2025年高考生物真題知識點分類匯編之基因工程（一）參考答案與試題解析一．選擇題（共12小題）題號1234567891011答案CABBBCABADD題號12答案A一．選擇題（共12小題）1．（2025?安徽）質(zhì)粒K中含有β﹣半乳糖苷酶基因，將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細胞后，其編碼的酶可分解X﹣gal，產(chǎn)生藍色物質(zhì)，進而形成藍色菌落，如圖所示?？蒲行〗M以該質(zhì)粒作為載體。采用基因工程技術(shù)實現(xiàn)人源干擾素基因在大腸桿菌中的高效表達。下列敘述錯誤的是（）A．使用氯化鈣處理大腸桿菌以提高轉(zhuǎn)化效率，可增加篩選平板上白色和藍色菌落數(shù) B．如果篩選平板中僅含卡那霉素，生長出的白色菌落不可判定為含目的基因的菌株 C．因質(zhì)粒K中含兩個標(biāo)記基因，篩選平板中長出的白色菌落即為表達目標(biāo)蛋白的菌株 D．若篩選平板中藍色菌落偏多，原因可能是質(zhì)粒K經(jīng)酶切后自身環(huán)化并導(dǎo)入了大腸桿菌【分析】基因表達載體要包含啟動子、終止子、標(biāo)記基因、目的基因和復(fù)制原點。標(biāo)記基因的作用是便于篩選重組DNA?！窘獯稹拷猓篈、使用氯化鈣處理大腸桿菌可使大腸桿菌處于易于吸收周圍DNA分子的感受態(tài)，提高轉(zhuǎn)化效率，更多質(zhì)粒K進入大腸桿菌，可增加篩選平板上藍色菌落數(shù)，A正確；B、如果篩選平板中僅含卡那霉素，生長出的白色菌落是含有質(zhì)粒的菌株，但不一定含有目的基因，B正確；C、因質(zhì)粒K中含兩個標(biāo)記基因，目的基因的插入破壞了β﹣半乳糖苷酶基因，使其無法表達β﹣半乳糖苷酶，篩選平板中長出的白色菌落即為導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的菌株，但是否表達目標(biāo)蛋白，還需要用抗原﹣抗體雜交技術(shù)檢測，C錯誤；D、若篩選平板中藍色菌落偏多，說明質(zhì)粒上的β﹣半乳糖苷酶基因仍然保持完整并且成功表達出β﹣半乳糖苷酶，可能是質(zhì)粒K經(jīng)酶切后自身環(huán)化并導(dǎo)入了大腸桿菌，D正確。故選：C?！军c評】本題主要考查基因表達載體的構(gòu)建，考查考生對標(biāo)記基因、雙標(biāo)記法的理解能力及分析、解決問題的能力。2．（2025?四川）下列以土豆為材料的實驗描述，錯誤的是（）A．土豆DNA溶于酒精后，與二苯胺試劑混合呈藍色 B．向土豆勻漿中加入一定量的碘液后，溶液會呈藍色 C．利用土豆勻漿制備的培養(yǎng)基，可用于酵母菌的培養(yǎng) D．土豆中的過氧化氫酶可用于探究pH對酶活性的影響【分析】土豆主要含有淀粉，淀粉的鑒定用碘液試劑，溶液呈藍色；土豆含有過氧化氫酶，用于探究pH對酶活性的影響。【解答】解：A、DNA不溶于酒精，在用二苯胺鑒定DNA時，需要水浴加熱才能呈現(xiàn)藍色，A錯誤；B、土豆含淀粉，淀粉遇碘液變藍，B正確；C、土豆勻漿有糖類等營養(yǎng)成分，可制備培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌，C正確；D、土豆含有過氧化氫酶，能通過設(shè)置不同pH，觀察反應(yīng)速率以探究pH對酶活性的影響，D正確。故選：A?！军c評】本題考查了學(xué)生對生物實驗原理和操作的理解，重點涉及DNA的提取、淀粉的鑒定、微生物培養(yǎng)和酶活性的影響等相關(guān)知識點。3．（2025?選擇性）下列關(guān)于耐高溫的DNA聚合酶的敘述正確的是（）A．基本單位是脫氧核苷酸 B．在細胞內(nèi)或細胞外均可發(fā)揮作用 C．當(dāng)模板DNA和脫氧核苷酸存在時即可催化反應(yīng) D．為維持較高活性，適宜在70℃～75℃下保存【分析】酶的本質(zhì)：酶是活細胞產(chǎn)生的具有催化作用的有機物，其中絕大多數(shù)是蛋白質(zhì)，少數(shù)是RNA。【解答】解：A、耐高溫的DNA聚合酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，基本單位為氨基酸，A錯誤；B、耐高溫DNA聚合酶在細胞內(nèi)的DNA復(fù)制和體外的PCR反應(yīng)中均能發(fā)揮作用，B正確；C、PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進行，需提供DNA模板，分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物，4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶；同時通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進行，C錯誤；D、溫度過高，會使酶的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，使酶永久失活，酶制劑適宜在低溫下保存，D錯誤。故選：B?！军c評】本題考查耐高溫的DNA聚合酶和PCR技術(shù)的相關(guān)內(nèi)容，要求學(xué)生能運用所學(xué)的知識正確作答。4．（2024?湖南）某同學(xué)將質(zhì)粒DNA進行限制酶酶切時，發(fā)現(xiàn)DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是（）A．限制酶失活，更換新的限制酶 B．酶切條件不合適，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和酶的用量等 C．質(zhì)粒DNA突變導(dǎo)致酶識別位點缺失，更換正常質(zhì)粒DNA D．酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶【分析】1、酶是活細胞產(chǎn)生的具有催化作用的有機物，大多數(shù)是蛋白質(zhì)，少部分是RNA。2、限制酶特異性識別并切割DNA上的特定位點?！窘獯稹拷猓篈、限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應(yīng)更換新的限制酶，A正確；B、酶切條件不合適通常會使切割效果下降，此時應(yīng)有部分DNA被酶切，B錯誤；C、質(zhì)粒DNA突變會導(dǎo)致限制酶識別位點缺失，進而造成限制酶無法進行切割，此時應(yīng)更換為正常質(zhì)粒，C正確；D、質(zhì)粒DNA上酶切位點被甲基化修飾，會導(dǎo)致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進行酶切，此時應(yīng)換用對DNA甲基化不敏感的限制酶，D正確。故選：B?！军c評】本題主要考查基因工程中限制酶的相關(guān)知識，學(xué)生要掌握限制酶的作用特點，正確分析選項進行解答，本題難度適中。5．（2024?河北）下列相關(guān)實驗操作正確的是（）A．配制PCR反應(yīng)體系時，加入等量的4種核糖核苷酸溶液作為擴增原料 B．利用添加核酸染料的凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳后，在紫外燈下觀察結(jié)果 C．將配制的酵母培養(yǎng)基煮沸并冷卻后，在酒精燈火焰旁倒平板 D．將接種環(huán)燒紅，迅速蘸取酵母菌液在培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，獲得單菌落【分析】PCR技術(shù)反應(yīng)的條件：①穩(wěn)定的緩沖溶液環(huán)境；②DNA模板；③2種引物；④四種脫氧核苷酸；⑤耐高溫的DNA聚合酶等?！窘獯稹拷猓篈、PCR的原理是DNA復(fù)制，DNA的單體是脫氧核糖核苷酸，配制PCR反應(yīng)體系時，加入4種脫氧核糖核苷酸的等量混合液作為擴增原料，A錯誤；B、瓊脂糖凝膠制備中加入的核酸染料能與DNA分子結(jié)合，凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來，B正確；C、將配制的酵母培養(yǎng)基高溫滅菌并冷卻到不燙手（50℃左右）后，在酒精燈火焰旁倒平板，C錯誤；D、將接種環(huán)燒紅，待冷卻后（避免菌種被燙死），蘸取酵母菌液在培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，獲得單菌落，D錯誤。故選：B。【點評】本題考查DNA片段的擴增與電泳鑒定、微生物的培養(yǎng)等相關(guān)知識，意在考查學(xué)生的識記能力和判斷能力，運用所學(xué)知識綜合分析問題的能力是解答本題的關(guān)鍵。6．（2024?天津）胰島素的研發(fā)走過了：動物提取—化學(xué)合成—重組胰島素生產(chǎn)—胰島素類似物生產(chǎn)等歷程。有關(guān)敘述錯誤的是（）A．動物體內(nèi)胰島素由胰島B細胞合成并胞吐出細胞 B．氨基酸是化學(xué)合成胰島素的原料 C．用大腸桿菌和乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)胰島素需相同的啟動子 D．利用蛋白質(zhì)工程可生產(chǎn)速效胰島素等胰島素類似物【分析】蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求?！窘獯稹拷猓篈、動物體內(nèi)的胰島素是由胰島B細胞通過胞吐方式分泌的蛋白質(zhì)類激素，A正確；B、胰島素屬于分泌蛋白，其合成的原料是氨基酸，B正確；C、用大腸桿菌生產(chǎn)胰島素，用自身相應(yīng)蛋白基因的啟動子，而利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)胰島素，則需要用奶牛的乳腺蛋白基因的啟動子，C錯誤；D、利用蛋白質(zhì)工程通過改造胰島素合成基因，來生產(chǎn)速效胰島素等胰島素類似物，以提高療效，D正確。故選：C。【點評】本題主要考查基因工程、蛋白質(zhì)工程的相關(guān)知識，要求學(xué)生有一定的理解分析能力，能夠結(jié)合題干信息和所學(xué)知識進行分析應(yīng)用。7．（2024?選擇性）關(guān)于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的實驗，下列敘述正確的是（）A．瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小 B．凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置 C．在同一電場作用下，DNA片段越長，向負極遷移速率越快 D．瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來【分析】PCR技術(shù)：（1）概念：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。（2）原理：DNA雙鏈復(fù)制。（3）前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對引物。（4）條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、ATP、一對引物、耐高溫的DNA聚合酶。（5）過程：高溫變性：DNA解旋過程（PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開）；低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補鏈DNA上；中溫延伸：合成子鏈?！窘獯稹拷猓篈、在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)，瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小，A正確；B、凝膠載樣緩沖液中指示劑可起標(biāo)記的作用，是指示DNA分子對應(yīng)長度所出現(xiàn)位置，B錯誤；C、DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，通常DNA片段越長，遷移速率越慢，C錯誤；D、凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來，D錯誤。故選：A。【點評】本題考查了PCR技術(shù)的相關(guān)知識，要求考生能結(jié)合所學(xué)知識準(zhǔn)確答題。8．（2024?福建）中國水仙是一種三倍體觀賞花卉。傳統(tǒng)生產(chǎn)采用分球莖繁殖方式，不僅周期長、產(chǎn)率低、花色單調(diào)，還易積累病毒。下列措施無法達到改良目的的是（）A．用水仙鱗片進行植物組織培養(yǎng)以提高產(chǎn)率 B．利用單倍體育種對中國水仙進行品種選育 C．選用水仙幼嫩組織作為外植體獲得脫毒苗 D．通過基因工程技術(shù)引入外源基因改變花色【分析】1、雜交育種的原理是基因重組；其優(yōu)點是可以將不同個體的優(yōu)良性狀集中于同一個體上，且方法簡單，可預(yù)見強。2、誘變育種的原理是基因突變；方法是用物理因素（如X射線、γ射線、紫外線、激光等）或化學(xué)因素（如亞硝酸、硫酸二乙酯等）來處理生物，使其在細胞分裂間期DNA復(fù)制時發(fā)生差錯，從而引起基因突變；其優(yōu)點是可提高變異頻率，出現(xiàn)新性狀，大幅度改良某些性狀，加速育種進程。3、單倍體育種的原理是染色體變異；方法是用花藥離體培養(yǎng)獲得單倍體植株，再人工誘導(dǎo)染色體數(shù)目加倍；優(yōu)點是純合體自交后代不發(fā)生性狀分離，因而能明顯縮短育種年限。4、多倍體育種的原理是染色體變異；方法是利用秋水仙素處理萌發(fā)的種子或幼苗；優(yōu)點是莖稈粗壯，葉片、果實和種子都比較大，糖類和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的含量都有所增加。5、基因工程育種的原理是基因重組；優(yōu)點是能按照人們的意愿定向改造生物的性狀?！窘獯稹拷猓篈、用水仙鱗片進行植物組織培養(yǎng)，可以快速繁殖，提高產(chǎn)率，可以達到改良目的，A正確；B、中國水仙是三倍體，在減數(shù)分裂過程中會發(fā)生聯(lián)會紊亂，不能產(chǎn)生正常的配子，所以無法利用單倍體育種對其進行品種選育，B錯誤；C、選用水仙幼嫩組織作為外植體進行植物組織培養(yǎng)，可以獲得脫毒苗，可以達到改良目的，C正確；D、通過基因工程技術(shù)引入外源基因可以改變花色，可以達到改良目的，D正確。故選：B?！军c評】本題主要考查生物育種的相關(guān)知識，要求學(xué)生有一定的理解分析能力，能夠結(jié)合題干信息和所學(xué)知識進行分析應(yīng)用。9．（2024?山東）關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法正確的是（）A．整個提取過程中可以不使用離心機 B．研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，應(yīng)充分搖勻再倒入燒杯中 C．鑒定過程中DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變 D．僅設(shè)置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾【分析】DNA的粗提取與鑒定的實驗原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的氯化鈉溶液中的溶解度不同，利用這一特點可以選擇適當(dāng)濃度的鹽溶液可以將DNA溶解或析出，從而達到分離的目的；②DNA不溶于酒精溶液，細胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶解于酒精，利用這一原理可以將蛋白質(zhì)和DNA進一步分離；③在沸水浴的條件下DNA遇二苯胺會呈現(xiàn)藍色?！窘獯稹拷猓篈、研磨后，可以用過濾的方法得到上清液，可以不使用離心機，A正確；B、研磨液在4℃冰箱中放置的目的是為了獲得上清液，不應(yīng)再充分搖勻，B錯誤；C、鑒定過程中的沸水浴加熱可能使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，C錯誤；D、該實驗中，為排除二苯胺加熱后可能變藍對實驗結(jié)果的干擾，設(shè)置加二苯胺不加DNA一個對照組即可，D錯誤。故選：A?！军c評】本題考查“DNA的粗提取和鑒定”的相關(guān)知識，意在考查考生的理解能力和實驗與探究能力，進一步考查生命觀念、科學(xué)思維和科學(xué)探究等核心素養(yǎng)。10．（2024?山東）制備熒光標(biāo)記的DNA探針時，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大腸桿菌DNA聚合酶、擴增緩沖液、H2O和4種脫氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和堿基被熒光標(biāo)記的dATP）的反應(yīng)管①～④中，分別加入如表所示的適量單鏈DNA。已知形成的雙鏈DNA區(qū)遵循堿基互補配對原則，且在本實驗的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個連續(xù)堿基對的雙鏈DNA區(qū)。能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針的反應(yīng)管有（）反應(yīng)管加入的單鏈DNA①5′﹣GCCGATCTTTATA﹣3′3′﹣GACCGGCTAGAAA﹣5′②5′﹣AGAGCCAATTGGC﹣3′③5′﹣ATTTCCCGATCCG﹣3′3′﹣AGGGCTAGGCATA﹣5′④5′﹣TTCACTGGCCAGT﹣3′A．①② B．②③ C．①④ D．③④【分析】多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段：1、PCR原理：目的基因DNA受熱變性后解為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合；然后以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶作用下進行延伸，即將4種脫氧核苷酸加到引物的3'端，如此重復(fù)循環(huán)多次。由于延伸后得到的產(chǎn)物又可以作為下一個循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即呈指數(shù)形式擴增（約為2n，其中n為擴增循環(huán)的次數(shù)）。2、PCR反應(yīng)過程是：變性→復(fù)性→延伸。3、結(jié)果：上述三步反應(yīng)完成后，一個DNA分子就變成了兩個DNA分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反應(yīng)過程都是在PCR擴增儀中完成的?！窘獯稹拷猓篈BCD、分析反應(yīng)管①～④中分別加入的適量單鏈DNA可知，①中兩條單鏈DNA分子之間具有互補的序列，但雙鏈DNA區(qū)之外的3'端無模板，因此無法進行DNA合成，不能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針；②中單鏈DNA分子內(nèi)具有自身互補的序列，由于在本實驗的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個連續(xù)堿基對的雙鏈DNA區(qū)，故一條單鏈DNA分子不發(fā)生自身環(huán)化，但兩條鏈可以形成雙鏈DNA區(qū)，由于DNA合成的鏈中不含堿基A，不能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針；③中兩條單鏈DNA分子之間具有互補的序列，且雙鏈DNA區(qū)之外的3'端有模板和堿基T，因此進行DNA合成能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針；④中單鏈DNA分子內(nèi)具有自身互補的序列，一條單鏈DNA分子不發(fā)生自身環(huán)化，兩條鏈可以形成雙鏈DNA區(qū)，且雙鏈DNA區(qū)之外的3'端有模板和堿基T，因此進行DNA合成能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針。綜上，能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針的反應(yīng)管有：③④。故選：D。【點評】本題考查PCR的相關(guān)知識，意在考查考生的理解能力、獲取信息的能力和綜合運用能力，進一步考查生命觀念和科學(xué)思維。11．（2024?臺灣）某警察利用PCR技術(shù)分析刑案現(xiàn)場DNA樣本甲，以及嫌疑人乙、丙、丁的血液DNA樣本。四樣本的PCR產(chǎn)物分別以同一膠體進行電泳結(jié)果如圖所示，黑色條帶為產(chǎn)物在膠片上的訊號，產(chǎn)物分子量越大泳動越慢，條帶會位于膠片較高位置。下列推論何者正確（）A．如圖可顯示轉(zhuǎn)錄后修飾現(xiàn)象的異同，可用來判斷誰最可能是犯人 B．如圖可觀測到基因點突變位置，以判斷犯人 C．三人之中，丁最有可能是此案的犯人 D．四個樣本的PCR反應(yīng)需使用相同的引子對組合，才能進行比較分析【分析】PCR原理：在高溫作用下，打開DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4種游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端自3'端延伸的。實際上就是在體外模擬細胞內(nèi)DNA的復(fù)制過程。DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈?！窘獯稹拷猓篈、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是RNA，而PCR是一項體外擴增DNA的技術(shù)，故如圖技術(shù)是顯示DNA分子的異同，可用來判斷誰最可能是犯人，A錯誤；B、PCR擴增法可用于基因點突變的檢出，其基本原理是DNA雙鏈復(fù)制，但該技術(shù)用于鑒別犯人的理論基礎(chǔ)是DNA分子的特異性，通過與樣品的相似度進行比較分析，B錯誤；C、據(jù)圖可知，丙與樣品DNA最相似，最可能是犯人，C錯誤；D、PCR擴增時需要一對引物，四個樣本的PCR反應(yīng)需使用相同的引子對（引物）組合，根據(jù)堿基互補配對原則，才能與樣本進行比較分析，D正確。故選：D。【點評】本題以刑偵探案為背景，考查PCR的原理及應(yīng)用，要求考生能明確相關(guān)知識點，結(jié)合題圖分析作答。12．（2024?江西）γ﹣氨基丁酸在醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。利用L﹣谷氨酸脫羧酶（GadB）催化L﹣谷氨酸脫羧是高效生產(chǎn)γ﹣氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L﹣谷氨酸脫羧酶基因（gadB）導(dǎo)入生產(chǎn)菌株E.coliA，構(gòu)建了以L﹣谷氨酸鈉為底物高效生產(chǎn)γ﹣氨基丁酸的菌株E.coliB。下列敘述正確的是（）A．上圖表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB B．E.coliB發(fā)酵生產(chǎn)γ﹣氨基丁酸時，L﹣谷氨酸鈉的作用是供能 C．E.coliA和E.coliB都能高效降解γ﹣氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構(gòu)建重組質(zhì)粒【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：1、目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。2、基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。3、將目的基因?qū)胧荏w細胞：根據(jù)受體細胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ㄓ修r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱游锛毎钣行У姆椒ㄊ秋@微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛毎姆椒ㄊ歉惺軕B(tài)細胞法。4、目的基因的檢測與鑒定：（1）分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因——PCR檢測等技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA——PCR檢測等技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)——抗原—抗體雜交技術(shù)。（2）個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等?！窘獯稹拷猓篈、根據(jù)圖示可知，運用PCR技術(shù)可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB，A正確；B、L﹣谷氨酸脫羧酶（GadB）催化L﹣谷氨酸脫羧是高效生產(chǎn)γ﹣氨基丁酸，E.coliB中表達L﹣谷氨酸脫羧酶（GadB），從而發(fā)酵生產(chǎn)γ﹣氨基丁酸，該過程中L﹣谷氨酸鈉是反應(yīng)原料，而非起供能作用，B錯誤；C、題干中E.coliA和E.coliB均為產(chǎn)生γ﹣氨基丁酸的菌種，而不是高效降解γ﹣氨基丁酸的菌種，C錯誤；D、根據(jù)圖示，利用NcoⅠ和KpnⅠ對質(zhì)粒和目的基因進行雙酶切，從而構(gòu)建重組質(zhì)粒，不一定可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構(gòu)建重組質(zhì)粒（視質(zhì)粒和目的基因所在DNA分子中酶切位點的情況而定），D錯誤。故選：A?！军c評】本題考查基因工程的相關(guān)知識，要求考生理解識記有關(guān)技術(shù)的原理及操作步驟，掌握各操作步驟中需要注意的細節(jié)，能將教材中的知識結(jié)合題中信息進行遷移應(yīng)用。二．實驗題（共1小題）13．（2025?重慶）絕大多數(shù)哺乳動物生來怕辣，而小型哺乳動物樹鼩先天不怕辣，喜食含辣椒素類物質(zhì)的植物。為探究其原因，我國研究人員進行了系列研究。（1）研究發(fā)現(xiàn)，樹鼩的受體蛋白TR1對辣椒素的敏感性低于其他哺乳動物。為研究樹鼩和其他哺乳動物TR1蛋白的差異，可設(shè)計開展如下實驗：①克隆樹鼩和其他哺乳動物的TR1基因；②將目的基因與載體分別進行酶切并連接；③將重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌；④分離表達的TR1蛋白質(zhì)測定氨基酸序列，明確蛋白之間的差異。（2）樹鼩及一些哺乳動物的TR1蛋白存在差異，如圖所示。據(jù)分析，樹鼩對辣椒素的敏感性降低，很可能是由于TR1第579位氨基酸差異造成的，可證實該推測的實驗思路是利用基因編輯技術(shù)改變樹鼩的TR1基因，使編碼的TR1蛋白的第579位氨基酸由M變?yōu)門，檢測樹鼩對辣椒素的敏感性是否提高。（3）樹鼩與其喜食植物的地理分布基本一致，據(jù)此可推測樹鼩對含辣椒素類物質(zhì)植物的適應(yīng)形成的必要條件是樹鼩群體出現(xiàn)可遺傳的變異和含辣椒素類植物對樹鼩的定向選擇。【分析】基因工程的基本操作程序是目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細胞、目的基因的檢測與鑒定?！窘獯稹拷猓海?）基因工程的基本操作程序，分析①為克隆樹鼩和其他哺乳動物TR1蛋白基因。②為將樹鼩、其他哺乳動物TR1蛋白基因和載體分別進行酶切并連接構(gòu)建基因表達載體。④為檢測樹鼩和其他哺乳動物TRI蛋白質(zhì)的氨基酸序列。（2）樹鼩TRI蛋白第579位氨基酸為M，人和小鼠TR1蛋白第579位氨基酸為T，利用基因編輯技術(shù)改變樹鼩的TR1基因，使編碼的TR1蛋白的第579位氨基酸由M變?yōu)門，若替換后樹鼩對辣椒素的敏感性升高，則可以證實樹鼩對辣椒素的敏感性降低是由TRI蛋白第579位氨基酸序列差異造成的。（3）適應(yīng)形成的必要條件是樹鼩群體出現(xiàn)可遺傳的變異和含辣椒素類植物對樹鼩進行定向選擇，使得樹鼩種群中對辣椒素敏感度低的基因頻率升高，讓樹鼩適應(yīng)含辣椒素類物質(zhì)的植物。故答案為：（1）①克隆樹鼩和其他哺乳動物的TR1基因②目的基因與載體③氨基酸序列（2）利用基因編輯技術(shù)改變樹鼩的TR1基因，使編碼的TR1蛋白的第579位氨基酸由M變?yōu)門，檢測樹鼩對辣椒素的敏感性是否提高（3）樹鼩群體出現(xiàn)可遺傳的變異和含辣椒素類植物對樹鼩的定向選擇【點評】本題考查基因工程的相關(guān)內(nèi)容，要求學(xué)生能結(jié)合所學(xué)知識正確作答。三．解答題（共7小題）14．（2025?選擇性）馬鈴薯作為重要農(nóng)作物，提高其冷耐受性可拓展優(yōu)質(zhì)馬鈴薯的種植區(qū)域。我國科研人員發(fā)現(xiàn)，野生馬鈴薯中S基因的表達與其冷耐受性調(diào)控有關(guān)，將該基因?qū)朐耘囫R鈴薯中可顯著增強其抗寒能力。回答下列問題。限制酶識別序列及切割位點BglⅡ5′﹣A↓GATCT﹣3′3′﹣TCTAG↑A﹣5′NdeⅠ5′﹣CA↓TATG﹣3′3′﹣GTAT↑AC﹣5′XhoⅠ5′﹣C↓TCGAG﹣3′3′﹣GAGCT↑C﹣5′EcoRⅠ5′﹣G↓AATTC﹣3′3′﹣CTTAA↑G﹣5′BamHⅠ5′﹣G↓GATCC﹣3′3′﹣CCTAG↑G﹣5′SalⅠ5′﹣G↓TCGAC﹣3′3′﹣CAGCT↑G﹣5′XbaⅠ5′﹣T↓CTAGA﹣3′3′AGATC↑T﹣5′（1）PCR擴增目的基因時，需要模板DNA、引物、4種脫氧核苷酸、含Mg2+的緩沖液和耐高溫的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的延伸步驟中起作用。（2）圖中標(biāo)識了載體和S基因中限制酶的切割位點。為將S基因正確插入載體，PCR擴增S基因時需在引物的5'端（填“5′端”或“3′端”）添加限制酶識別序列，結(jié)合上表分析，上游引物應(yīng)添加的堿基序列是5′﹣AGATCT﹣3′，切割載體時應(yīng)選用的兩種限制酶是BamHⅠ、EcoRⅠ。PCR擴增產(chǎn)物和載體分別被限制酶切割后，經(jīng)純化和連接，獲得含S基因的表達載體并導(dǎo)入農(nóng)桿菌。（3）用攜帶S基因的農(nóng)桿菌侵染栽培馬鈴薯愈傷組織時，基因表達載體中T﹣DNA進入愈傷組織細胞，將S基因整合到栽培馬鈴薯愈傷組織細胞的染色體上，抗性基因2可用于篩選成功轉(zhuǎn)化的愈傷組織。該愈傷組織經(jīng)再分化形成芽、根，繼續(xù)培育可獲得抗寒能力顯著增強的馬鈴薯植株?！痉治觥?、基因工程的步驟：目的基因的提取、目的基因與運載體結(jié)合、目的基因?qū)胧荏w細胞、目的基因的檢測與鑒定。2、對限制酶選擇條件：不能破壞目的基因和啟動子、終止子，以便于目的基因和載體正確連接?！窘獯稹拷猓海?）PCR擴增目的基因時，需要模板DNA、引物、4種脫氧核苷酸、含Mg2+的緩沖液和耐高溫的DNA聚合酶。PCR一般分為變性、復(fù)性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步驟中起作用。（2）擴增目的基因時，需要在引物的5'端添加限制酶的識別序列。在載體的啟動子和終止子之間有BamHⅠ、EcoRⅠ和XbaⅠ的識別序列，而S基因內(nèi)部含有XbaⅠ、NdeⅠ和BamHⅠ的識別序列，使用上述限制酶會切割基因，結(jié)合各種限制酶的識別序列及切割位點，需要用BamHⅠ、EcoRⅠ切割載體，用BamHⅠ的同尾酶BglⅡ和EcoRⅠ切割S基因，故PCR擴增S基因時需在上游引物添加的堿基序列是5'﹣AGATCT﹣3'。（3）T﹣DNA屬于可轉(zhuǎn)移DNA，用攜帶S基因的農(nóng)桿菌侵染栽培馬鈴薯愈傷組織時，基因表達載體中T﹣DNA進入愈傷組織細胞，將S基因整合到栽培馬鈴薯愈傷組織細胞的染色體上，抗性基因1位于T﹣DNA外部，用于篩選含有重組載體的農(nóng)桿菌，而抗性基因2位于T﹣DNA內(nèi)部，可用于篩選成功轉(zhuǎn)化的愈傷組織。該愈傷組織經(jīng)再分化形成芽、根，繼續(xù)培育可獲得抗寒能力顯著增強的馬鈴薯植株。故答案為：（1）4種脫氧核苷酸延伸（2）5'端AGATCTBamHⅠ、EcoRⅠ（3）栽培馬鈴薯愈傷組織細胞的染色體上2再分化【點評】本題考查基因工程的相關(guān)知識，意在考查學(xué)生的識記能力和判斷能力、運用所學(xué)知識綜合分析問題的能力。15．（2025?四川）桿菌M2合成的短肽拉索西丁能有效殺死多種臨床耐藥細菌。拉索西丁能與細菌的核糖體結(jié)合，阻止攜帶氨基酸的tRNA進入核糖體位點2。有人將合成拉索西丁的相關(guān)基因（lrcA﹣lrcF）導(dǎo)入鏈霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用機制如圖。回答下列問題。注：①F1、F2、F3和F4為與相應(yīng)位置的DNA配對的單鏈引物，“→”指引物5′﹣3′方向。②密碼子對應(yīng)的氨基酸：AAA—賴氨酸；AUG—甲硫氨酸（起始）；UUC—苯丙氨酸；ACA—蘇氨酸；UCG—絲氨酸。（1）用PCR技術(shù)從桿菌M2基因組中擴增lrcA﹣lrcF目的基因時，應(yīng)選用F2和F4引物。本研究載體使用了鏈霉菌的復(fù)制原點，其目的是保證載體在鏈霉菌細胞中能正常復(fù)制。（2）采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切構(gòu)建的重組質(zhì)粒，產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測應(yīng)產(chǎn)生2條電泳條帶，電泳檢測酶切產(chǎn)物的目的是驗證重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功（驗證重組質(zhì)粒是否包含目的基因或驗證重組載體是否構(gòu)建成功或驗證目的基因成功導(dǎo)入質(zhì)粒）。（3）由圖可知，拉索西丁與核糖體結(jié)合后，會阻止攜帶苯丙氨酸（填氨基酸名稱）的tRNA進入結(jié)合位點，導(dǎo)致翻譯受阻，細菌無法合成蛋白質(zhì)，最終引起細菌死亡。（4）重組鏈霉菌的目的基因產(chǎn)物經(jīng)驗證有殺菌活性，但重組菌在實驗室多次培養(yǎng)后，提取的目的基因產(chǎn)物殺菌活性喪失，可能的原因是目的基因發(fā)生突變或變異。若運用發(fā)酵工程來生產(chǎn)拉素西丁工程藥物，除產(chǎn)物活性外還需進一步研究的問題有發(fā)酵條件優(yōu)化（拉索西丁的分離純化方法、工程鏈霉菌的生產(chǎn)穩(wěn)定性、鏈霉菌的生物安全性、優(yōu)化發(fā)酵條件、優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方、改變菌體活性、提高產(chǎn)物合成效率、改變副產(chǎn)物產(chǎn)等，答案不唯一）（答出1點即可）?！痉治觥炕蚬こ碳夹g(shù)的基本步驟：（1）目的基因的篩選和獲取從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。（2）基因表達載體的構(gòu)建基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等，標(biāo)記基因可便于目的基因的鑒定和篩選，是基因工程的核心步驟。（3）將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ㄓ修r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法。將目的基因?qū)雱游锛毎钣行У姆椒ㄊ秋@微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛毎姆椒ㄊ氢}離子處理法。（4）目的基因的檢測與鑒定分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因——PCR等技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA——PCR等技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)——抗原—抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等?！窘獯稹拷猓海?）引物需要結(jié)合到模板的3'端，且與目的基因的部分堿基序列互補配對，子鏈延伸方向為5'端→3'端，因此用PCR技術(shù)從桿菌M2基因組中擴增lrcA﹣lrcF目的基因時，應(yīng)選用F2、F4引物。載體使用鏈霉菌的復(fù)制原點，是為了保證保證載體在鏈霉菌細胞中能正常復(fù)制，使目的基因能夠在鏈霉菌中穩(wěn)定存在并遺傳給后代。（2）采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切構(gòu)建的重組質(zhì)粒，會得到載體片段和目的基因片段，共2條電泳條帶。電泳檢測酶切產(chǎn)物的目的是驗證重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功（驗證重組質(zhì)粒是否包含目的基因或驗證重組載體是否構(gòu)建成功或驗證目的基因成功導(dǎo)入質(zhì)粒），若能得到預(yù)期的載體片段和目的基因片段大小的條帶，說明酶切成功，重組質(zhì)粒構(gòu)建可能成功。（3）拉索西丁能與細菌的核糖體結(jié)合，阻止攜帶氨基酸的tRNA進入核糖體位點2。因為位點2對應(yīng)的密碼子是UUC，編碼苯丙氨酸。拉索西丁阻止攜帶苯丙氨酸的tRNA進入結(jié)合位點，會導(dǎo)致翻譯受阻，細菌無法合成蛋白質(zhì)，最終引起細菌死亡。（4）重組鏈霉菌在實驗室多次培養(yǎng)后，提取的目的基因產(chǎn)物殺菌活性喪失，可能的原因是目的基因發(fā)生突變或變異，導(dǎo)致其表達的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)改變，從而失去殺菌活性。若運用發(fā)酵工程來生產(chǎn)拉索西丁工程藥物，除產(chǎn)物活性外還需進一步研究的問題有發(fā)酵條件的優(yōu)化，如：拉索西丁的分離純化方法、工程鏈霉菌的生產(chǎn)穩(wěn)定性、鏈霉菌的生物安全性、優(yōu)化發(fā)酵條件、優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方、改變菌體活性、提高產(chǎn)物合成效率、改變副產(chǎn)物產(chǎn)等。故答案為：（1）F2、F4保證載體在鏈霉菌細胞中能正常復(fù)制（2）2驗證重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功（驗證重組質(zhì)粒是否包含目的基因或驗證重組載體是否構(gòu)建成功或驗證目的基因成功導(dǎo)入質(zhì)粒）（3）苯丙氨酸翻譯受阻，細菌無法合成蛋白質(zhì)（4）目的基因發(fā)生突變或變異發(fā)酵條件優(yōu)化（拉索西丁的分離純化方法、工程鏈霉菌的生產(chǎn)穩(wěn)定性、鏈霉菌的生物安全性、優(yōu)化發(fā)酵條件、優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方、改變菌體活性、提高產(chǎn)物合成效率、改變副產(chǎn)物產(chǎn)等，答案不唯一）【點評】本題考查基因工程的相關(guān)內(nèi)容，要求學(xué)生能結(jié)合所學(xué)知識正確作答。16．（2025?湖南）非洲豬瘟病毒是一種雙鏈DNA病毒，可引起急性豬傳染病。基因A編碼該病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白A，其在病毒侵入宿主細胞和誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用?；卮鹣铝袉栴}：（1）制備特定抗原①獲取基因A，構(gòu)建重組質(zhì)粒（該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖所示）。重組質(zhì)粒的必備元件包括目的基因、限制酶切割位點、標(biāo)記基因、啟動子和終止子或復(fù)制原點等；為確定基因A已連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，應(yīng)選用圖中的一對引物P1和P3對待測質(zhì)粒進行PCR擴增，預(yù)期擴增產(chǎn)物的片段大小為782bp。②將DNA測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌構(gòu)建重組菌。培養(yǎng)重組菌，誘導(dǎo)蛋白A合成。收集重組菌發(fā)酵液進行離心，發(fā)現(xiàn)上清液中無蛋白A，可能的原因是重組菌沒有裂解（或沒有將蛋白A釋放到細胞外或轉(zhuǎn)速過高使蛋白A發(fā)生沉淀或蛋白A親水性較差發(fā)生沉淀或蛋白A被大腸桿菌的蛋白酶降解）（答出兩點即可）。（2）制備抗蛋白A單克隆抗體用蛋白A對小鼠進行免疫后，將免疫小鼠B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，誘導(dǎo)融合的常用方法有PEG融合法（或電融合法或滅活病毒誘導(dǎo)法）（答出一種即可）。選擇培養(yǎng)時，對雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，多次篩選獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細胞。體外培養(yǎng)或利用小鼠大量生產(chǎn)的抗蛋白A單克隆抗體，可用于非洲豬瘟的早期診斷?！痉治觥炕蚬こ滩僮鞑襟E：1、目的基因的獲?。簭淖匀唤缫延械奈锓N中分離，或人工合成。人工合成可通過反轉(zhuǎn)錄法（以mRNA為模板合成DNA）、化學(xué)合成法（已知目的基因核苷酸序列時直接合成）等。2、基因表達載體的構(gòu)建：這是基因工程的核心步驟。將目的基因與載體（如質(zhì)粒）用限制酶切割，再用DNA連接酶連接，形成重組DNA分子。載體需具備限制酶切割位點、標(biāo)記基因、啟動子、終止子等元件，以保證目的基因在受體細胞中能穩(wěn)定存在、復(fù)制和表達。3、將目的基因?qū)胧荏w細胞：根據(jù)受體細胞類型選擇合適方法。如導(dǎo)入植物細胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法；導(dǎo)入動物細胞常用顯微注射技術(shù)；導(dǎo)入微生物細胞常用感受態(tài)細胞法（用Ca2?處理細胞使其處于感受態(tài)）。4、目的基因的檢測與鑒定：分子水平檢測包括DNA分子雜交（檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細胞）、DNA﹣RNA雜交（檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄）、抗原﹣抗體雜交（檢測目的基因是否翻譯）；個體水平鑒定如觀察轉(zhuǎn)基因生物是否表現(xiàn)出相應(yīng)性狀。【解答】解：（1）①重組質(zhì)粒的必備元件包含目的基因（這里是基因A）、限制酶切割位點（用于插入目的基因等操作）、標(biāo)記基因（便于篩選含有重組質(zhì)粒的細胞）、啟動子（驅(qū)動目的基因轉(zhuǎn)錄）和終止子（終止轉(zhuǎn)錄）或復(fù)制原點（保證質(zhì)粒能在宿主細胞中復(fù)制）。要確定基因A已連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，應(yīng)選擇能跨越基因A且方向合適的引物。觀察可知，P1與基因上游的非編碼區(qū)堿基互補配對，P3與基因下游且靠近啟動子的區(qū)域堿基互補配對，P1和P3這對引物符合要求。從圖中可知基因A長度為582bp，P1到啟動子區(qū)域長度為200bp，所以預(yù)期擴增產(chǎn)物片段大小為582+200═782bp。②清液無蛋白A的原因：將DNA測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌構(gòu)建重組菌后，培養(yǎng)重組菌誘導(dǎo)蛋白A合成，收集發(fā)酵液離心后上清液無蛋白A。可能是重組菌沒有裂解，導(dǎo)致蛋白A無法釋放到細胞外；也可能是沒有將蛋白A釋放到細胞外；或者轉(zhuǎn)速過高使蛋白A發(fā)生沉淀；蛋白A親水性較差發(fā)生沉淀；蛋白A被大腸桿菌的蛋白酶降解等。（2）用蛋白A對小鼠進行免疫后，將免疫小鼠B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，誘導(dǎo)融合的常用方法有PEG融合法（利用聚乙二醇促進細胞融合）、電融合法（通過電刺激使細胞融合）或滅活病毒誘導(dǎo)法（利用滅活的病毒促使細胞融合）。選擇培養(yǎng)時，對雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測等多次篩選，目的是獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體（抗蛋白A抗體）的細胞。體外培養(yǎng)或利用小鼠大量生產(chǎn)的抗蛋白A單克隆抗體，由于單克隆抗體具有特異性強、靈敏度高的特點，可用于非洲豬瘟的早期診斷。故答案為：（1）①終止子或復(fù)制原點；P1和P3；782②重組菌沒有裂解（或沒有將蛋白A釋放到細胞外或轉(zhuǎn)速過高使蛋白A發(fā)生沉淀或蛋白A親水性較差發(fā)生沉淀或蛋白A被大腸桿菌的蛋白酶降解）（2）PEG融合法（或電融合法或滅活病毒誘導(dǎo)法）；抗體檢測【點評】該題聚焦于非洲豬瘟病毒相關(guān)的生物技術(shù)應(yīng)用，圍繞基因工程和細胞工程展開，涵蓋重組質(zhì)粒的組成元件、引物的選擇與產(chǎn)物大小計算、蛋白未在上清液出現(xiàn)的原因分析，以及單克隆抗體制備過程中的細胞融合方法與雜交瘤細胞篩選等重要知識點。綜合考查學(xué)生對這兩個領(lǐng)域基礎(chǔ)知識的掌握與運用能力。學(xué)生要牢固掌握基因工程和細胞工程的基本概念與原理；學(xué)會從圖中獲取有效信息；牢記細胞融合等生物技術(shù)的常用方法及其原理，避免混淆。17．（2025?河北）為治理水體中對生物有毒害的鎘污染，研究者構(gòu)建了分泌信號肽SP7、鎘離子結(jié)合蛋白CADR、定位于細胞壁的蛋白GP1和黃色熒光蛋白YFP編碼序列融合表達的載體，轉(zhuǎn)入單細胞衣藻，實現(xiàn)CADR大量合成、分泌并定位于細胞壁，以吸附水體中的鎘離子?；卮鹣铝袉栴}：（1）在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脫氧核苷酸中，隨著PCR反應(yīng)進行，分子數(shù)量逐漸減少的是引物和脫氧核苷酸。模板與引物在PCR反應(yīng)的復(fù)性階段開始結(jié)合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高溫，其原因為PCR過程需要在高溫下進行，普通DNA聚合酶在高溫下會變性失活。（2）載體中可用的酶切位點信息和擬構(gòu)建載體的部分結(jié)構(gòu)如圖1所示。在將CADR、GP1和YFP基因逐個構(gòu)建到載體時，為避免錯誤連接，需向以上三個基因的兩端分別添加限制酶識別序列，其中GP1兩端應(yīng)添加SmaⅠ和EcoRⅠ（填兩種限制酶）的識別序列。用DNA連接酶連接時，可催化載體和目的基因之間形成磷酸二酯鍵。（3）若在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)基因衣藻表現(xiàn)為發(fā)出黃色熒光，初步表明融合蛋白表達成功。將轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻置于含鎘離子的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時間后，若轉(zhuǎn)基因衣藻細胞壁比野生型衣藻細胞壁的鎘離子含量高，則表明融合蛋白能結(jié)合鎘離子。（4）將轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻在不同鎘離子濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6天后，檢測細胞密度，結(jié)果見圖2。轉(zhuǎn)基因衣藻在含有不同濃度鎘離子的培養(yǎng)液中生長均優(yōu)于野生型衣藻的原因可能是轉(zhuǎn)基因衣藻細胞表面的融合蛋白能結(jié)合鎘離子，降低了鎘離子對衣藻細胞的毒害作用。240μmol?L﹣1鎘離子濃度下，轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻生長均被明顯抑制的原因可能是鎘離子濃度過高，超出了融合蛋白的吸附能力，所以轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻都受到鎘離子的毒害。（5）轉(zhuǎn)基因衣藻可用于水體鎘污染治理，與施加化學(xué)藥物法相比，能體現(xiàn)出其環(huán)境治理優(yōu)勢的兩個特性是①和③。（填標(biāo)號）①衣藻作為生物材料在水體中可自我繁殖②衣藻生長速率受鎘離子濃度影響③衣藻可吸收水體中能引起富營養(yǎng)化的物質(zhì)④衣藻吸附的鎘可沿食物鏈傳遞【分析】基因工程操作一般有以下四步：1、目的基因的獲?。簭淖匀唤缫延械奈锓N中分離，或人工合成。人工合成可通過反轉(zhuǎn)錄法（以mRNA為模板合成DNA）、化學(xué)合成法（已知目的基因核苷酸序列時直接合成）等。2、基因表達載體的構(gòu)建：這是基因工程的核心步驟。將目的基因與載體（如質(zhì)粒）用限制酶切割，再用DNA連接酶連接，形成重組DNA分子。載體需具備限制酶切割位點、標(biāo)記基因、啟動子、終止子等元件，以保證目的基因在受體細胞中能穩(wěn)定存在、復(fù)制和表達。3、將目的基因?qū)胧荏w細胞：根據(jù)受體細胞類型選擇合適方法。如導(dǎo)入植物細胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法；導(dǎo)入動物細胞常用顯微注射技術(shù)；導(dǎo)入微生物細胞常用感受態(tài)細胞法（用Ca2?處理細胞使其處于感受態(tài)）。4、目的基因的檢測與鑒定：分子水平檢測包括PCR檢測、抗原﹣抗體雜交（檢測目的基因是否翻譯）；個體水平鑒定如觀察轉(zhuǎn)基因生物是否表現(xiàn)出相應(yīng)性狀?！窘獯稹拷猓海?）在PCR反應(yīng)中，引物與模板鏈結(jié)合后，在DNA聚合酶的作用下，以脫氧核苷酸為原料合成新的DNA鏈。隨著反應(yīng)的進行，引物會結(jié)合到新合成的DNA鏈上，數(shù)量逐漸減少；脫氧核苷酸作為合成DNA的原料，不斷被消耗，分子數(shù)量也逐漸減少。PCR反應(yīng)包括變性、復(fù)性和延伸三個階段。在復(fù)性階段，溫度降低，引物與模板DNA單鏈的互補序列通過堿基互補配對原則結(jié)合。PCR過程需要在高溫下進行（如變性階段需90﹣95℃高溫使DNA雙鏈解開），普通的DNA聚合酶在高溫下會變性失活，而PCR中使用的DNA聚合酶需耐高溫，這樣才能在高溫條件下保持活性，催化DNA子鏈的合成。（2）觀察可知，為避免錯誤連接，GP1基因兩端添加SmaⅠ和EcoRⅠ的識別序列。因為將CADR、GP1和YFP基因逐個構(gòu)建到載體，用這兩種限制酶切割載體和GP1基因后，可產(chǎn)生不同的黏性末端，能保證目的基因準(zhǔn)確插入載體。又因為NbeⅠ和XbaⅠ限制酶切割后產(chǎn)生相同的黏性末端，按照連接的順序在將GP1連接到載體時應(yīng)用SmaⅠ和EcoRⅠ。用DNA連接酶連接時，可催化載體和目的基因之間形成磷酸二酯鍵，從而將載體和目的基因連接起來。（3）因為構(gòu)建的載體中有黃色熒光蛋白YFP編碼序列，若在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)基因衣藻表現(xiàn)為發(fā)出黃色熒光，初步表明融合蛋白表達成功，因為只有融合蛋白成功表達，才會有黃色熒光蛋白產(chǎn)生。將轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻置于含鎘離子的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時間后，由于轉(zhuǎn)基因衣藻能合成并分泌定位于細胞壁的融合蛋白（含鎘離子結(jié)合蛋白CADR），若轉(zhuǎn)基因衣藻細胞壁比野生型衣藻細胞壁的鎘離子含量高，則表明融合蛋白能結(jié)合鎘離子。（4）轉(zhuǎn)基因衣藻在含有不同濃度鎘離子的培養(yǎng)液中生長均優(yōu)于野生型衣藻，原因可能是轉(zhuǎn)基因衣藻細胞表面的融合蛋白能結(jié)合鎘離子，降低了鎘離子對衣藻細胞的毒害作用。在240μmol/L鎘離子濃度下，鎘離子濃度過高，超出了融合蛋白的吸附能力，大量鎘離子仍然會對衣藻細胞產(chǎn)生毒害作用，所以轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻生長都被明顯抑制。（5）與施加化學(xué)藥物法相比，轉(zhuǎn)基因衣藻用于水體鎘污染治理，衣藻作為生物材料在水體中可自我繁殖（①），能夠持續(xù)發(fā)揮吸附鎘離子的作用；衣藻可吸收水體中能引起富營養(yǎng)化的物質(zhì)（③），在治理鎘污染的同時，對水體的富營養(yǎng)化也有一定的改善作用。而衣藻生長速率受鎘離子濃度影響（②）不是其環(huán)境治理優(yōu)勢；衣藻吸附的鎘可沿食物鏈傳遞（④）會帶來潛在風(fēng)險，也不是優(yōu)勢。故答案為：（1）引物；脫氧核苷酸；復(fù)性；PCR過程需要在高溫下進行，普通DNA聚合酶在高溫下會變性失活（2）SmaⅠ和EcoRⅠ；磷酸二酯（3）發(fā)出黃色熒光；高（4）轉(zhuǎn)基因衣藻細胞表面的融合蛋白能結(jié)合鎘離子，降低了鎘離子對衣藻細胞的毒害作用；鎘離子濃度過高，超出了融合蛋白的吸附能力，所以轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻都受到鎘離子的毒害。（5）①；③【點評】本題涵蓋基因工程（PCR技術(shù)、限制酶與DNA連接酶應(yīng)用、載體構(gòu)建）、蛋白質(zhì)表達檢測以及生物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)等多個高中生物重點知識模塊，既考查學(xué)生對基礎(chǔ)知識的記憶，又考查分析推理能力。對基因工程、細胞代謝、生物與環(huán)境關(guān)系等基礎(chǔ)知識，學(xué)生要準(zhǔn)確記憶和理解；要學(xué)會從圖表中提取關(guān)鍵信息；對于分析原因類問題，要結(jié)合所學(xué)知識，進行合理、嚴(yán)謹?shù)倪壿嬐茖?dǎo)。18．（2025?山東）種子休眠是抵御穗發(fā)芽的一種機制。通過對Ti質(zhì)粒的改造，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將Ti質(zhì)粒上的T﹣DNA隨機整合到小麥基因組中，篩選到2個種子休眠相關(guān)基因的插入失活純合突變體。與野生型相比，突變體種子的萌發(fā)率降低。小麥基因組序列信息已知。（1）Ti質(zhì)粒上與其在農(nóng)桿菌中的復(fù)制能力相關(guān)的結(jié)構(gòu)為復(fù)制原點。選用圖甲中的SmaⅠ對抗除草劑基因X進行完全酶切，再選擇SmaⅠ和XbaⅠ對Ti質(zhì)粒進行完全酶切，將產(chǎn)生的黏性末端補平，補平時使用的酶是DNA聚合酶。利用DNA連接酶將酶切后的包含抗除草劑基因X的片段與酶切并補平的Ti質(zhì)粒進行連接，構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；經(jīng)卡那霉素篩選并提取質(zhì)粒后再選用限制酶SmaⅠ和SpeⅠ進行完全酶切并電泳檢測，若電泳結(jié)果呈現(xiàn)一長一短2條帶，較短的條帶長度近似為550bp，則一定為正向重組質(zhì)粒。（2）為證明這兩個突變體是由于T﹣DNA插入到小麥基因組中同一基因?qū)е碌?，提取基因組DNA，經(jīng)酶切后產(chǎn)生含有T﹣DNA的基因組片段（圖乙）。在此酶切過程中，限于后續(xù)PCR難以擴增大片段DNA，最好使用識別序列為4（填“4”“6”或“8”）個堿基對的限制酶，且T﹣DNA中應(yīng)不含該酶的酶切位點。需首先將圖乙的片段環(huán)化，才能利用引物P1和P2成功擴增未知序列。PCR擴增出未知序列后，進行了一系列操作，其中可以判斷出2條片段的未知序列是否屬于同一個基因的操作為測序和序列比對（填“瓊脂糖凝膠電泳”或“測序和序列比對”）。（3）通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的含有野生型基因的表達載體轉(zhuǎn)入突變植株，如果檢測到野生型基因，不能（填“能”或“不能”）確定該植株的表型為野生型。【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的篩選和獲取從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。（2）基因表達載體的構(gòu)建基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等，標(biāo)記基因可便于目的基因的鑒定和篩選，是基因工程的核心步驟。（3）將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ㄓ修r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法。將目的基因?qū)雱游锛毎钣行У姆椒ㄊ秋@微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛毎姆椒ㄊ歉惺軕B(tài)細胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因——PCR等技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA——PCR等技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)——抗原—抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等?！窘獯稹拷猓海?）DNA復(fù)制的起點是復(fù)制原點，因此Ti質(zhì)粒上與其在農(nóng)桿菌中的復(fù)制能力相關(guān)的結(jié)構(gòu)為復(fù)制原點。根據(jù)SmaⅠ限制酶識別序列可知，酶切形成的是平末端，若質(zhì)粒僅用SmaⅠ酶切，抗除草劑基因和質(zhì)?？梢哉蚪尤胍部梢苑聪蚪尤?，且無法區(qū)分，為了確定是否是正向重組質(zhì)粒，因此在構(gòu)建重組質(zhì)粒時需要用到另一種限制酶，抗除草劑因需要插入到啟動子和終止子之間，用BamHⅠ切割會破壞終止子，SpeⅠ切割會破壞抗除草劑基因，只有XbaⅠ產(chǎn)生的黏性末端可以用DNA聚合酶補齊（DNA合成方向為5′→3′）。重組的T﹣DNA片段上含有一個SmaⅠ和SpeⅠ酶切位點，可以選擇用SmaⅠ和SpeⅠ進行酶切，經(jīng)過兩種酶的酶切后電泳呈現(xiàn)一長一短2種條帶。若正向連接，較短的條帶長度近似為550bp，若反向連接，較短的條帶長度近似為200bp。（2）由于后續(xù)PCR難以擴增大片段DNA，所以最好選擇識別序列為4個堿基的限制酶，原因是識別序列越短，酶切位點越多，切割產(chǎn)生的片段可能越小，更有利于后續(xù)的PCR擴增。由于引物是根據(jù)已知序列設(shè)計的，但此時需要擴增未知序列，因此可以將圖乙的片段環(huán)化，這樣就可以利用現(xiàn)有引物擴增出未知序列。為了確定未知