DB6111楊凌農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)示范區(qū)地方標準DB6111/T133—2019谷子雜種快速鑒定技術(shù)規(guī)范TechnicalSpecificationforRapidIdentificationofFoxtailMilletHybrids楊凌示范區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布I1谷子雜種快速鑒定技術(shù)規(guī)范1范圍2規(guī)范性引用文件33術(shù)語和定義雜種F1HybridF1一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)，是一類由幾個核苷酸(一般為1～6個)為重復單位組4鑒定步驟含量，用dO稀釋到所需工作濃度(3QLng./試驗所用試劑見附錄A。4.2PCR擴增反應(yīng)體系和程序2試驗所用試劑見附錄A。將反應(yīng)體系混勻后進行PCR擴增：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，50℃~65℃退火45s，72buffer，混合均勻，短時間內(nèi)置于4℃保存，長時間內(nèi)置于-20℃保存?zhèn)溆?。擴增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰封底：每板15ml8%聚丙烯酰胺，加入150μL10%過硫酸銨和15μL四甲基乙二胺，聚合1m待凝膠1h后，將與6×Loadingbuffer混合后的PCR擴增產(chǎn)物每個點樣孔加入3μL。電泳緩沖液為銀染：固定完成后，倒出固定液，加入銀染液，振脫色：銀染完成后，倒出銀染液，加入ddH2O，振顯影：脫色完成后，倒出ddH2O，加入300mL現(xiàn)配的顯影液，待譜帶清晰（以Marker為準）后照相用附錄B中的SSR引物進行PCR擴增，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，篩選出親本間差異性標記。結(jié)果記錄見表1。3表2F1多態(tài)性檢測結(jié)果記載表F?基因型5鑒定結(jié)果匯總4實驗相關(guān)試劑稱取10gCTAB加入80mLddH2O，置于65°C水浴鍋內(nèi)加熱至溶解，用ddH2O定容至1用100mL量筒量取氯仿96mL，加入4稱取4.5g氫氧化鈉，加入300,BLmld用醛，充分混勻(現(xiàn)配現(xiàn)用)。6退火溫度(℃)F:CTGCTGCAAGCAGCGACTCCGR:CGAGGTTAGAGGCGATCCF:GCAAGCAACAGTCCATGGCCGAR:GCTGCGAGCTTGCGTGACCAAS8001F:ACCAGCACAAGCCACACGCAR:TGGCAACAACCAAATTAAGGGCF:TTATGCCAATGTCCCCGGCGGTR:CGCCGTTTCCGATCCAAGCAAS7051F:GCCCCGGACATAGTTGTTACTGR:TTGTCGCGTTAGCTTAGGATF:GCGTGGAGTCCTCTACCTTTTATR:TCCTCTTTTCTCCTTTTGF:GGCTCTCGAGTGTCCTCTCTR:AGCAGCAAGAAATGGTGTGTF:CGTAGCTACTTGTTCCACGAGR:CCGCGACTTCATCAGTGAATAF:CGTCTCCTGAACCAAGCCTAR:TCTCCTCCTCATCTTGGGTF:CGCATTGAAAATCCTCCTTCR:CCCAACCTAGCCAACCAGTCAAS6091F:CATAAAAATCTCAGCCCCAAR:GTAGCATCTCATGGCTTTF:CAGCAGTCATGGATAGTCTCGR:TACAGCATCCGGTTTCCF:ACCCCATCCCCATGTGTGTTTR:AGCAGGCCTCAACGGCCCCAAS5011F:TTGGAGCGTAGCGCATCAGR:AGCCCCTCCGTCTCTCTCACF:AAAGGTAGCCAGCTGCCCCGTGR:TGGTTCCATGTGGCCAGAAAAGAAAGC7引物編號退火溫度(℃)F:TCGCTGCAACCAAAAGC1F:TACAGGCCGGTCACCAGF:TCAGCTCACCCCTCTCAF:TGCGTGTGGCGATGTGAOF:CGGCCGATCCAACCTCAF:TGGCTGTTGCTGAACCCR:GCAGATCAGCCACCACCCAAGAAGF:TTGGCCAGCACGTACGAF:TCGATTACGG