(19)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局(10)申請(qǐng)公布號(hào)CN120210143A(21)申請(qǐng)?zhí)?02510694929.7(22)申請(qǐng)日2025.05.28(71)申請(qǐng)人浙江大學(xué)路866號(hào)(74)專利代理機(jī)構(gòu)杭州初塵專利代理事務(wù)所專利代理師萬(wàn)靜序列表(電子公布)附圖7頁(yè)(54)發(fā)明名稱一種(2R,3R)-丁二醇脫氫酶突變體及其在制備(2S)-羥基環(huán)己酮中的應(yīng)用(57)摘要本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一(2S)-羥基環(huán)己酮中的應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)于野生型BsBDH進(jìn)行了多輪突變，篩選到熱穩(wěn)定性明顯提高的突變體，并且其對(duì)于cis-CHD的催化活性也明顯提高，其中，引入了非天然氨基酸的突變體在催化效率上是野生型BsBDH的214.48倍，可以看出，本申請(qǐng)?zhí)峁┑腂sBDH突變體在催化順式-1,2-環(huán)己二醇氧化制備(2S)-21.一種(2R,3R)-丁二醇脫氫酶突變體，其特征在于，由SEQIDNO.1所示氨基酸的序列進(jìn)行突變得到，突變形式為下述中的一種：(1)第22位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第61位天冬酰胺突變?yōu)楦拾彼?、?12位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０?、?30位丙氨酸突變?yōu)榫彼帷⒌?60位丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?、?80位異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?2)第22位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第112位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０?、?30位丙氨酸突變?yōu)榫彼帷⒌?58位蘇氨酸突變?yōu)楦拾彼?、?60位丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼帷⒌?80位異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?3)第22位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第61位天冬酰胺突變?yōu)楦拾彼?、?30位丙氨酸突變?yōu)榫彼?、?58位蘇氨酸突變?yōu)楦拾彼帷⒌?60位丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?、?80位異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?4)第22位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第61位天冬酰胺突變?yōu)楦拾彼?、?12位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０?、?30位丙氨酸突變?yōu)榫彼?、?60位丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?、?80位異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?、?93位酪氨酸突變?yōu)榻z氨酸；(5)第22位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第61位天冬酰胺突變?yōu)楦拾彼?、?12位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０?、?18位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?、?30位丙氨酸突變?yōu)榫彼帷⒌?60位丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?、?80位異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?、?93位酪氨酸突變?yōu)榻z氨酸。2.一種含非天然氨基酸的(2R,3R)-丁二醇脫氫酶突變體，其特征在于，由SEQIDNO.1所示氨基酸的序列進(jìn)行下述突變得到：第22位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第50位苯丙氨酸突變?yōu)?,5-二氯苯丙氨酸、第112位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０贰⒌?18位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?、?30位丙氨酸突變?yōu)榫彼?、?58位蘇氨酸突變?yōu)楦拾彼?、?60位丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?、?80位異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?、?93位酪氨酸突變?yōu)榻z氨酸。3.編碼如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的(2R,3R)-丁二醇脫氫酶突變體的基因。4.重組載體，其特征在于，所述重組載體包含如權(quán)利要求3所述的基因。5.基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含如權(quán)利要求3所述的基因。6.如權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的(2R,3R)-丁二醇脫氫酶突變體在催化順式-1,2-環(huán)己二醇氧化制備(2S)-羥基環(huán)己酮的應(yīng)用。7.一種生物催化合成(2S)-羥基環(huán)己酮的方法，其特征在于，以順式-1,2-環(huán)己二醇為底物，以權(quán)利要求1或2所述的(2R,3R)-丁二醇脫氫酶突變體為催化劑，組成反應(yīng)體系，合成(2S)-羥基環(huán)己酮。的鋅離子。3一種(2R,3R)-丁二醇脫氫酶突變體及其在制備(2S)-羥基環(huán)己酮中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種(2R,3R)-丁二醇脫氫酶突變體及其在制備(2S)-羥基環(huán)己酮中的應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]環(huán)狀α-羥基酮及其下游產(chǎn)物環(huán)狀β-氨基醇的空間位阻使其具備一定的生物活性，常作為關(guān)鍵砌塊用于合成抗病毒和拮抗劑藥物。例如，膽囊收縮素(CCK-B)受體拮抗劑(CI-1015)含有(1S,2S)-反式-2-氨基環(huán)己醇，可用于治療焦慮和恐慌障礙；磷酸二酯酶III抑制劑及抗心律失常藥物維納卡蘭的合成需要(1R,2R)-反式-2-氨基環(huán)己醇。因此，綠色、高效合成光學(xué)純環(huán)狀a-羥基酮具有良好的應(yīng)用前景。[0003]根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，環(huán)狀α-羥基酮及環(huán)狀β-氨基醇通常利用酶級(jí)聯(lián)催化的方法生產(chǎn)。首先，環(huán)氧化合物通過(guò)環(huán)氧化物水解酶水解生成鄰二醇；此后，鄰二醇通過(guò)2,3-丁二醇前文獻(xiàn)報(bào)道的生產(chǎn)方法中，均采用枯草芽孢桿菌來(lái)源(Bacillussubtilis)的2,3-丁二醇[0004]但BsBDH對(duì)環(huán)狀鄰二醇的催化活性較低，嚴(yán)重限制了酶級(jí)聯(lián)催化的效率，并且BsBDH熱穩(wěn)定性低，導(dǎo)致使用過(guò)程中酶的催化活性損失嚴(yán)重，表現(xiàn)出低催化活性，距離工業(yè)化應(yīng)用仍有較大的距離。[0005]中國(guó)專利CN116042557A中，對(duì)BsBD發(fā)明內(nèi)容[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中BsBDH對(duì)環(huán)狀鄰二醇的催化活性低的缺陷，本發(fā)明提供了一種(2R,3R)-丁二醇脫氫酶突變體及其在制備(2S)-羥基環(huán)己酮中的應(yīng)用，具體技術(shù)方案如下：第一方面，本發(fā)明提供了一種(2R,3R)-丁二醇脫氫酶突變體，由SEQIDNO.1所示氨基酸的序列進(jìn)行突變得到，突變形式為下述中的一種：(1)第22位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第61位天冬酰胺突變?yōu)楦拾彼?、?12位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０?、?30位丙氨酸突變?yōu)榫彼?、?60位丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?、?80位異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?2)第22位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第112位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０贰⒌?30位丙氨酸突變?yōu)榫彼?、?58位蘇氨酸突變?yōu)楦拾彼帷⒌?60位丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?、?80位異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?3)第22位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第61位天冬酰胺突變?yōu)楦拾彼?、?30位丙氨酸突變?yōu)榫彼?、?58位蘇氨酸突變?yōu)楦拾彼帷⒌?60位丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼帷⒌?80位異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?(4)第22位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第61位天冬酰胺突變?yōu)楦拾彼?、?12位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０?、?30位丙氨酸突變?yōu)榫彼?、?60位丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼帷⒌?80位異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?、?93位酪氨酸突變?yōu)榻z氨酸；(5)第22位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第61位天冬酰胺突變?yōu)楦拾彼?、?12位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０?、?18位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?、?30位丙氨酸突變?yōu)榫彼帷⒌?60位丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?、?80位異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?、?93位酪氨酸突變?yōu)榻z氨酸。[0007]本發(fā)明選擇9個(gè)可以同時(shí)提高BsBDH催化活性和熱穩(wěn)定性的單點(diǎn)突變，通過(guò)Gibson組裝進(jìn)行隨機(jī)組合，獲得熱穩(wěn)定性和催化活性均得到明顯提高的組合突變體，并在其基礎(chǔ)上，利用半理性設(shè)計(jì)進(jìn)行飽和突變，最終得到對(duì)順式-1,2-環(huán)己二醇(cis-CHD)催化活性提[0008]第二方面，本發(fā)明提供了一種含非天然氨基酸的(2R,3R)-丁二醇脫氫酶突變體，由SEQIDNO.1所示氨基酸的序列進(jìn)行下述突變得到：第22位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第50位苯丙氨酸突變?yōu)?,5-二氯苯丙氨酸、第112位谷氨酰胺突變?yōu)樘於０?、?18位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼帷⒌?30位丙氨酸突變?yōu)榫彼?、?58位蘇氨酸突變?yōu)楦拾彼帷⒌?60位丙氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?、?80位異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼帷⒌?93位酪氨酸突變?yōu)榻z氨酸。了產(chǎn)物的釋放，因此，本發(fā)明在上述BsBDH突變體的基礎(chǔ)上在F50位點(diǎn)引入2,5-二氯苯丙氨酸，進(jìn)一步擴(kuò)大底物的通道，從而獲得顯著提高對(duì)cis-CHD催化活性的突變體。[0010]第三方面，本發(fā)明提供了編碼上述(2R,3R)-丁二醇脫氫酶突變體的基因。[0011]第四方面，本發(fā)明提供了重組載體，所述重組載體包含上述基因。[0012]第五方面，本發(fā)明提供了基因工程菌，所述基因工程菌包含上述基因。[0013]第六方面，本發(fā)明提供了上述(2R,3R)-丁二醇脫氫酶突變體在催化順式-1,2-環(huán)己二醇氧化制備(2S)-羥基環(huán)己酮的應(yīng)用。[0014]第七方面，本發(fā)明提供了一種生物催化合成(2S)-羥基環(huán)己酮的方法，以順式-1,2-環(huán)己二醇為底物，以上述(2R,3R)-丁二醇脫氫酶突變體為催化劑，組成反應(yīng)體系，合成(2S)-羥基環(huán)己酮。[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明對(duì)于野生型BsBDH進(jìn)行了多輪突變，篩選到熱穩(wěn)定性明顯提高的突變體，并且其對(duì)于cis-CHD的催化活性也明顯提高，其中，引入了非天然氨基酸的突變體在催化效率二醇氧化制備(2S)-羥基環(huán)己酮方面具有極大的應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明測(cè)定結(jié)果圖。CN120210143A說(shuō)明書5[0020]圖4為實(shí)施例2中高通量篩選得到的正向突變體的酶活測(cè)定結(jié)果圖。[0021]圖5為實(shí)施例3中6×His標(biāo)簽更換位置示意圖。[0022]圖6為實(shí)施例3中6×His標(biāo)簽更換位置前后蛋白純化示意圖；其中，A:N端6×His標(biāo)簽，B:C端6×His標(biāo)簽，1:菌液，2:上樣流穿液，3:洗滌流穿液，4:洗脫流穿液。[0023]圖7為實(shí)施例3中GMML培養(yǎng)基中Zn2+濃度對(duì)酶催化活性的影響結(jié)果圖。[0024]圖8為實(shí)施例3中6×His標(biāo)簽位置及培養(yǎng)基類型對(duì)酶催化活性的影響結(jié)果圖。[0025]圖9為實(shí)施例4中產(chǎn)物釋放通道示意圖。[0026]圖10為實(shí)施例4中50位點(diǎn)引入非天然氨基酸對(duì)酶催化活性的影響結(jié)果圖。[0027]圖11為實(shí)施例4中50位點(diǎn)引入3-氯苯丙氨酸的產(chǎn)物釋放通道示意圖。[0028]圖12為實(shí)施例4中50位點(diǎn)引入2,5-二氯苯丙氨酸的產(chǎn)物釋放通道示意圖。[0029]為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說(shuō)明都是示例性的，且僅僅是本發(fā)明一部分的實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。[0030]基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。[0034]非天然氨基酸引入所用試劑：L-3-氯苯丙氨酸購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，L-2,5-二氯苯丙氨酸、L-2,5-二氟苯丙氨酸購(gòu)自上海麥克林科技股份有限公司。[0035]酶活單位(U)的定義：氧化反應(yīng)中每分鐘生成1μmolNADH或者還原反應(yīng)中每分鐘消耗1μmolNADH所需的酶量。[0036]以下實(shí)施例中，所述BsBDH野生型酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其編碼序列如SEQIDNO.2所示。6atgaaggcagcaagatggcataaccaaaaggatatccgtattgaacgccgggaaaagtaaagatcaaagtcaaatggtgcggcatctgcggaagtgatttaatctttattccggttgacaaaccgcacccattaacaaatgaaacggcacctggtgaagttgtcgaagtcggagaaggcgttgaaaattataaagttggagaccgcgtttacacacggccaccaaggcgcctacaaccttgatgaacaaatgggattcctcggcttagccttctctgaatacgtctctgtggatgaagagcttttgttcaaacttcctgatgaattatctcgttgaaccttctgcagttgctctatacgctgtccgctcaagcaaactcaaagcaggccggctgcggcccgatcggacttcttgtcattgaagcgctgaaggctgccggtgcactttctcctgaacgccagcaaaaagctgaggagcttggcgcgatcatcgttgacattaatgaaagaaggctatttctcagccgacaaactcgtaacgaaaaaaataggcttcggggctcttattaaagagaaaagccaagtcaaa[0038]實(shí)施例1BsBDH的熱穩(wěn)定性組合突變體篩選點(diǎn)突變進(jìn)行隨機(jī)組合(單點(diǎn)突變的熱穩(wěn)定性數(shù)據(jù)如表1所示),隨機(jī)組合過(guò)程采用Gibson組裝：(1)按照位點(diǎn)鄰近的原則將九個(gè)位點(diǎn)分為三組，T22V、N61G、Q112N為第一片段，A230R、通過(guò)定點(diǎn)突變構(gòu)建T22V、N61G、Q112N、T22V/N61G、T22V/Q112N、N61G/Q112N、T22V/N61G/種可能性；(2)以1_F、1_R為引物分別對(duì)8種第一片段進(jìn)行PCR,獲得8種重組片段，用2_F、2_R、3_F、3_R分別對(duì)第二、三片段進(jìn)行PCR以獲得重組片段；(3)對(duì)重組片段進(jìn)行菌落PCR,通過(guò)DNA凝膠電泳驗(yàn)證片段長(zhǎng)度大小，條帶大小符合1.6kb的測(cè)定序列。本機(jī)挑選獲得了152個(gè)突變體或野生型，包括1個(gè)野生型、9個(gè)單點(diǎn)突變、29點(diǎn)突變、38個(gè)四點(diǎn)突變、30個(gè)五點(diǎn)突變、16個(gè)點(diǎn)突變(部分突變體的半衰期數(shù)據(jù)如表3所示)。[0039]表1單點(diǎn)突變體的熱穩(wěn)定性突變體半衰期(min)7引物名稱引物序列(5'to3')GCCAAAAGTGGAGCCGGGAACGGCTCCACTTTTGGCTCTTCCCATTAACAGGTGAAACGGGCCGTTTCACCTGTTAATGGGTCCTTGATGAAAACATGGGATGAATCCCATGTTTTCATCAAGGTTACGTTCACGAATCTCAGCGAAGTCCACTGGTATTGCCGGTGAAATTTCACCCATAATTGTAGTGGACCGAACGATCTGGTAATCAAAGAACGTATTGATTACCAGATCGTTCGGATGTAATCAAAGAAAAAACAGTAAAAGGAATTACTTTTACTGTTTTTTCTTTGATTACGACTCTTATTAAAGATAAAAGCCAAGTCACTTGGCTTTTATCTTTAATAAGAG突變體半衰期(min)R285K/A230R/E335D/Q1T22V/A230R/T258G/A260N61G/A230R/T258G/I280L/R285K/E3T22V/N61G/A230R/T258G/A260M/I2T22V/N61G/Q112N/A230R/A26T22V/N61G/Q112N/A230R/A260M/I2T22V/Q112N/A230R/T258G/A260M/I2T22V/N61G/Q112N/A230R/A26T22V/Q112N/A230R/A260M/I28T22V/N61G/Q112N/A230R/A260M/I28T22V/N61G/Q112N/A230R/T258G/A260M/I280L/R288模板(5ng/μL)1μL,4)4℃保存。第二片段66ng第三片段50ng2)4℃保存。[0045]以(2R,3R)-丁二醇為底物，在37℃下水浴進(jìn)行熱失活處理120min,熱處理后的比酶活與未熱處理的比酶活之比即殘余酶活。[0046]篩選得到半衰期最高的三個(gè)組合突變體均為六點(diǎn)突變：T22V/N61G/Q112N/A230R/活，而野生型在相同熱處理?xiàng)l件下，殘余酶活僅剩10.5%(如圖1所示)。T值測(cè)定結(jié)果顯示進(jìn)行純化并測(cè)定對(duì)cis-CHD的催化活性，6M2對(duì)cis-CHD的比酶活優(yōu)于6M1、6M3,為0.91U/mg,是野生型(0.51U/mg)的1.78倍(圖3),本發(fā)明將以6M2作為基礎(chǔ)進(jìn)行后續(xù)的底物結(jié)合口袋改造。[0047]實(shí)施例2通過(guò)半理性設(shè)計(jì)策略提高6M2的催化活性本實(shí)施例2中，測(cè)定突變體對(duì)cis-CHD的活性，通過(guò)迭代飽和突變進(jìn)行改造，具體篩選方法如9△OD?40°△OD?40/0D60大于母本的即篩選得到對(duì)cis-CHD催化活性提高的突變體。[0048]從圖4可知，在第一輪篩選中篩選得到6M2/Y293S對(duì)cis-CHD的催化活性略有提高，為0.61U/mg。因此，后續(xù)在6M2/Y293S基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行第二輪迭代飽和突變，其中6M2/Y293S/L118F的催化活性得到了進(jìn)一步提升，比酶活為0.80U/mg。[0049]表4迭代飽和突變所用引物引物名稱引物序列(5'to3')GCCGAGNNKTCCCATGTTTTCGTCGCGNNKTCCGATAATTCCTTT[0050]實(shí)施例3非天然氨基酸引入方法和條件探索1、His標(biāo)簽位置對(duì)蛋白純化的影響使用基于終止密碼子抑制的基因密碼子拓展技術(shù)定點(diǎn)引入非天然氨基酸，非天然突變體。[0051]由于存在非天然氨基酸引入效率的限制，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)中存在遇到TAG密碼子終止表達(dá)的截?cái)啾磉_(dá)蛋白，若6×His標(biāo)簽表達(dá)于蛋白質(zhì)N端，則通過(guò)蛋白質(zhì)純化后，體系內(nèi)混有截?cái)啾磉_(dá)蛋白。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR將6×His標(biāo)簽由N端移至C端(如圖5所示),僅表達(dá)至C端的蛋白質(zhì)含有6×His標(biāo)簽。因此，經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)純化可得到正確引入非天然氨基酸且完整表達(dá)的蛋白質(zhì)。[0052]表56×His標(biāo)簽位置改變所用引物名稱引物序列(5'to3')ATGGGCAGCAGCAGCAGCGGCCTGGTGAGACCTAACCTCGAGCACCACCACCAGTTAGGTCTAACAAGGATTTT[0053]此外，通過(guò)PCR將pET-28a(+)-BsBDH上需要引入非天然氨基酸的位點(diǎn)定點(diǎn)突變?yōu)榘凑諢峒しㄞD(zhuǎn)化流程操作，最終將菌液涂布于含Kan(50μg/mL)和Spe(50μg/mL)的培養(yǎng)平板上，37℃培養(yǎng)12h,挑取單菌落培養(yǎng)，并使用25%甘油保存菌液并貯藏于-80℃冰箱。[0055]本研究通過(guò)PCR將6×His標(biāo)簽由N端移至C端(突變體帶有NC表明6×His標(biāo)簽由N端移至C端),以115位點(diǎn)引入3-氯苯丙氨酸的BsBDH為例，蛋白質(zhì)純化結(jié)果如圖6所示，當(dāng)6×簽移至C端時(shí)，蛋白純化液中僅在52kDa附近存在蛋白條帶，符合完整表達(dá)的BsBDH分子量GMML培養(yǎng)基進(jìn)行蛋白表達(dá)，并測(cè)定酶催化活性。[0057]如圖7所示，6M2使用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余使用含不同濃度Zn2+的GMML培養(yǎng)基培養(yǎng)。位置以及培養(yǎng)基對(duì)酶催化活性的影響，本研究分別對(duì)LB培養(yǎng)基和GMML培養(yǎng)基培養(yǎng)的6M2及cis-CHD的比酶活下降至0.34U/mg。[0058]實(shí)施例4定點(diǎn)引入非天然氨基酸提高催化活性4.5A、5.4A,形成的通道面積較小。[0059]基于擴(kuò)大產(chǎn)物釋放通道的思路，在50位點(diǎn)引入鹵素修飾的苯丙氨酸類似物，通過(guò)鹵素的極性破壞50、115、291位點(diǎn)之間的疏水相互作用。首先通過(guò)PCR將50位點(diǎn)替換為琥珀密碼子TAG,將F50替換為3-氯苯丙氨酸(3-ClF),但由圖10可知，NC6M2/Y293S/L118F/F50-3-ClF其催化活性并未得到提高，反而下降了一倍。底物結(jié)合口袋的分析表明，其活性下降的原因可能是由于3-ClF的氯原子并未正確朝向I291和F115,而與S39的羥基形成了氫鍵作用(圖11)。[0060]表6非天然氨基酸引入所用引物引物名稱引物序列(5'to3')GCCCGATCTAGATTCCGGTTG[0061]因此，使用2,5-二氯苯丙氨酸(2,5-2ClF)替代3-ClF,2,5-2ClF結(jié)構(gòu)上的2-Cl可能與50位點(diǎn)主鏈的肽鍵形成氫鍵，從而固定了2,5-2ClF的側(cè)鏈構(gòu)象，使5-Cl正確朝向I291和Y293S/L118F/