(19)國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局(71)申請人哈爾濱沛奇隆生物制藥有限公司地址150000黑龍江省哈爾濱市雙城經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)娃哈哈路4號(hào)(102國道門)(72)發(fā)明人張伊驍范立民梁生福林欽婷王曉苗(74)專利代理機(jī)構(gòu)北京牛思巴巴知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理A61L有限公司16203專利代理師劉靜榮A61L27/48(2006.01)(54)發(fā)明名稱一種膠原蛋白生長因子復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用本發(fā)明提供了一種膠原蛋白生長因子復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物材料制備技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的制備方法能夠優(yōu)化膠原-bFGF復(fù)合材料產(chǎn)品的力學(xué)性能、抗降解性能、延長產(chǎn)品中FGF的緩釋周期；本發(fā)明通過加入抗氧化劑、利用優(yōu)先與氧化自由基結(jié)合的機(jī)制，在凍干以及儲(chǔ)存過程中提升bFGF穩(wěn)定性；采用急速預(yù)凍方式，減小形成冰晶尺寸，減緩局部pH或離子21.一種膠原蛋白生長因子復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：將膠原蛋白溶液與誘導(dǎo)溶液混合，進(jìn)行纖維化誘導(dǎo)處理，得到纖維化膠原溶液；對所述纖維化膠原溶液進(jìn)行梯度清洗換液處理，所述梯度清洗換液處理包括第一次清洗換液、第二次清洗換液和第三次清洗換液，所述第一次清洗換液、第二次清洗換液和第三次清洗換液中采用的緩沖溶液用量依次遞減，得到清洗后膠原蛋白溶液；將配制溶液進(jìn)行冷凍干燥處理，得到膠原蛋白生長因子復(fù)合材料；所述誘導(dǎo)溶液中含有磷酸鹽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述膠原蛋白溶液在進(jìn)行纖維化誘導(dǎo)處理前還包括進(jìn)行過濾除菌處理；所述過濾除菌處理包括先采用0.4~0.5μm濾膜進(jìn)行過濾，再采用0.1~0.3μm濾膜進(jìn)行過所述膠原蛋白溶液的濃度為1~10mg/ml;所述磷酸鹽的濃度為0.1~0.4M;所述磷酸鹽包括磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀中的一種或幾種；所述膠原蛋白溶液與誘導(dǎo)溶液混合的體積比為3~20:1。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)溶液中還含有氯化鈉；所述氯化鈉的濃度為0.1~2M;所述纖維化誘導(dǎo)處理的pH為6.0~8.0;所述纖維化誘導(dǎo)處理的溫度為25~38℃;所述纖維化誘導(dǎo)處理的時(shí)間為1~36h。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述依次遞減的用量遞減倍數(shù)為0.3~0.8倍；所述梯度清洗換液處理采用的緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液；所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為10~25mM,pH值為7.5~8.0;所述Tris-HCl緩沖溶液的濃度為5~10mM,pH值為7.5~9.5;所述第一次清洗換液采用的緩沖溶液用量為膠原溶液重量的8~15倍。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述補(bǔ)加緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液；所述配制溶液中的膠原蛋白濃度為5~10mg/g;所述bFGF的添加量為300~600IU/ml。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述抗氧化劑選自甘露醇、抗壞血酸、所述甘露醇的添加終濃度為0.1~0.2M;所述抗壞血酸的添加終濃度為5~20mM;所述甘油的添加終濃度為0.1~0.2M;所述蘆丁的添加終濃度為5~20mM;所述表兒茶素的添加濃終度為5~20mM;所述兒茶素的添加終濃度為5~20mM。37.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述冷凍干燥處理的上樣量為0.3~8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述冷凍干燥處理包括以下階段：冷凍階段：溫度-45~-40℃,維持15~60min;第一干燥階段：溫度-20~-15℃,維持140~220min,真空度0.2bar;第二干燥階段：溫度-15~-10℃,維持280~460min,真空度0.2bar;第三干燥階段：溫度-5~5℃,維持1100~1520min,真空度0.2bar;第四干燥階段：溫度10~20℃,維持240~300min。9.通過權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述的制備方法制得的膠原蛋白生長因子復(fù)合材料。10.權(quán)利要求9所述的膠原蛋白生長因子復(fù)合材料在制備促軟組織修復(fù)材料中的應(yīng)用。4一種膠原蛋白生長因子復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及生物材料制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種膠原蛋白生長因子復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]軟組織修復(fù)是臨床醫(yī)學(xué)的重要挑戰(zhàn)，涉及創(chuàng)傷愈合、術(shù)后修復(fù)及慢性潰瘍治療等領(lǐng)域。膠原蛋白作為人體細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，因其良好的生物相容性、可降解性及促細(xì)其纖維狀結(jié)構(gòu)和力學(xué)支撐特性，尤其適合作為軟組織修復(fù)的支架材料。然而，單純膠原蛋白的被動(dòng)修復(fù)機(jī)制存在局限性，如細(xì)胞增殖速率低、血管生成能力不足等，難以滿足復(fù)雜創(chuàng)面的高效修復(fù)需求。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)是一種具有多效性的內(nèi)源性活性蛋白，可顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、血管新生及細(xì)胞外基質(zhì)合成，是主動(dòng)調(diào)控組織修復(fù)的關(guān)鍵因活性調(diào)控的雙重機(jī)制加速修復(fù)進(jìn)程。[0003]中國專利CN101279104A公開了一種含有生長因子的膠原蛋白海綿的制備方法，包括以下步驟：1.用動(dòng)物的皮或結(jié)締組織生產(chǎn)膠原蛋白酶解液；2.用表皮細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子分別加入膠原蛋白的酶解液中；3.將含有表皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子的膠原蛋白酶解液經(jīng)真空冷凍干燥成海綿狀；4.將含有表皮細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子的膠原蛋白海綿切割、包裝、鈷60照射滅菌。[0004]但是上述技術(shù)無法避免制備過程中bFGF的失活、從而影響終產(chǎn)品安全有效性的問發(fā)明內(nèi)容[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種膠原蛋白生長因子復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用，能[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種膠原蛋白生長因子復(fù)合材料的制備方法，包括以下步驟：將膠原蛋白溶液與誘導(dǎo)溶液混合，進(jìn)行纖維化誘導(dǎo)處理，得到纖維化膠原溶液；對所述纖維化膠原溶液進(jìn)行梯度清洗換液處理，所述梯度清洗換液處理包括第一次清洗換液、第二次清洗換液和第三次清洗換液，所述第一次清洗換液、第二次清洗換液和第三次清洗換液中采用的緩沖溶液用量依次遞減，得到清洗后膠原蛋白溶液；將清洗后膠原溶液與補(bǔ)加緩沖溶液、bFGF和抗氧化劑混合，得到配制溶液；將配制溶液進(jìn)行冷凍干燥處理，得到膠原蛋白生長因子復(fù)合材料；所述誘導(dǎo)溶液中含有磷酸鹽。[0007]優(yōu)選的，所述膠原蛋白溶液在進(jìn)行纖維化誘導(dǎo)處理前還包括進(jìn)行過濾除菌處理；所述過濾除菌處理包括先采用0.4~0.5μm濾膜進(jìn)行過濾，再采用0.1~0.3μm濾膜進(jìn)5行過濾；所述膠原蛋白溶液的濃度為1~10mg/ml;所述磷酸鹽的濃度為0.1~0.4M;所述磷酸鹽包括磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀中的一種或幾種；所述膠原蛋白溶液與誘導(dǎo)溶液混合的體積比為3~20:1。[0008]優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)溶液中還含有氯化鈉；所述氯化鈉的濃度為0.1~2M;所述纖維化誘導(dǎo)處理的pH為6.0~8.0;所述纖維化誘導(dǎo)處理的溫度為25~38℃;所述纖維化誘導(dǎo)處理的時(shí)間為1~36h。[0009]優(yōu)選的，所述依次遞減的用量遞減倍數(shù)為0.3~0.8倍；所述梯度清洗換液處理采用的緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液；所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為10~25mM,pH值為7.5~8.0;所述Tris-HCl緩沖溶液的濃度為5~10mM,pH值為7.5~9.5;所述第一次清洗換液采用的緩沖溶液用量為膠原溶液重量的8~15倍。[0010]優(yōu)選的，所述補(bǔ)加緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液；所述配制溶液中的膠原蛋白濃度為5~10mg/g;所述bFGF的添加量為300~600IU/ml。一種或幾種；所述甘露醇的添加終濃度為0.1~0.2M;所述抗壞血酸的添加終濃度為5~20mM;所述甘油的添加終濃度為0.1~0.2M;所述蘆丁的添加終濃度為5~20mM;所述表兒茶素的添加濃終度為5~20mM;所述兒茶素的添加終濃度為5~20mM。[0012]優(yōu)選的，所述冷凍干燥處理的上樣量為0.3~0.8ml/cm2。[0013]優(yōu)選的，所述冷凍干燥處理包括以下階段：冷凍階段：溫度-45~-40℃,維持15~60min;第一干燥階段：溫度-20~-15℃,維持140~220min,真空度0.2bar;第二干燥階段：溫度-15~-10℃,維持280~460min,真空度0.2bar;第三干燥階段：溫度-5~5℃,維持1100~1520min,真空度0.2bar;第四干燥階段：溫度10~20℃,維持240~300min。[0014]本發(fā)明還提供了通過上述制備方法制得的膠原蛋白生長因子復(fù)合材料。[0015]本發(fā)明還提供了上述膠原蛋白生長因子復(fù)合材料在制備促軟組織修復(fù)材料中的應(yīng)用。[0016]本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的制備方法能夠優(yōu)化膠原-bFGF復(fù)合材料產(chǎn)品的力學(xué)性能，使其在使6滿足組織再生要求；以及能夠加強(qiáng)與bFGF的結(jié)合，延長緩釋周期。由于過濾除菌后傾向于聚集的膠原纖維更多被去除，得到的都是膠原蛋白分子，通過纖維化誘導(dǎo)，可以加強(qiáng)膠原海綿支架的強(qiáng)度，延長產(chǎn)品降解時(shí)間，同時(shí)延長FGF緩釋周期；本發(fā)明膠原纖維化后采用了梯度清洗換液的方法，降低無機(jī)鹽濃度，調(diào)整溶液pH值的纖維狀態(tài)，最終促進(jìn)膠原和bFGF的結(jié)合延長緩釋周期。本發(fā)明通過加入抗氧化劑、利用優(yōu)先與氧化自由基結(jié)合的機(jī)制，在凍干以及儲(chǔ)存過程中提升bFGF穩(wěn)定性；采用急速預(yù)凍方式，減小形成冰晶尺寸，減緩局部pH或離子強(qiáng)度的劇烈變化，進(jìn)而保護(hù)bFGF的活性。在無菌工藝應(yīng)用場景中，本發(fā)明的制備方法采用梯度清洗換液步驟，與常規(guī)透析步驟(設(shè)備操作繁雜)具體實(shí)施方式[0017]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。[0018]實(shí)施例取濃度為1-10mg/ml的膠原蛋白溶液經(jīng)0.45μm、0.2μm兩級過濾，達(dá)到過濾除菌目向膠原蛋白溶液中加入誘導(dǎo)溶液，誘導(dǎo)膠原蛋白自組裝成纖維。[0020]誘導(dǎo)溶液包括磷酸鹽及氯化鈉組成，其中磷酸鹽種類包括磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀，溶液中磷酸鹽物質(zhì)的量濃度為0.1-0.4M,氯化鈉物質(zhì)的量濃度為0-2.0M,膠原與誘導(dǎo)溶液混合的比例為4:1至19:1,混合后調(diào)整pH值至6.0-8.0范圍內(nèi)，25-37℃,誘導(dǎo)反應(yīng)1.0-36.0h。纖維化后的膠原溶液離心去上清，第一次清洗加入10倍重量的磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HC1緩沖溶液，磷酸鹽緩沖溶液中磷酸鹽物質(zhì)的量濃度為10-25mM,pH值為7.5-8.0,Tris-HCl緩沖溶液物質(zhì)的量濃度為5-10mM,pH值為7.5-9.5.混合均勻后離心去上清。[0022]第二次清洗加入10倍重量的磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液，緩沖溶液與第一次清洗液相同，含量為第一次清洗液的1/2.混合均勻后離心去上清。[0023]第三次清洗加入10倍重量的磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液，緩沖溶液與第二次清洗液相同，含量為第二次清洗液的1/2.混合均勻后離心去上清。根據(jù)膠原蛋白含量加入一定量的磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液，至膠原蛋白濃度為8mg/g,緩沖溶液與第三次清洗液相同，含量為第三次清洗液的1/2。[0025]加入bFGF和抗氧化劑，bFGF添加比例為300-600IU/ml(以膠原蛋白溶液用量計(jì))。7按0.5ml/cm2上樣進(jìn)行冷凍干燥，凍干工藝如下。[0028]在以上方案基礎(chǔ)上，分別改動(dòng)以下技術(shù)手段，得到實(shí)施例和對比例，如下表1~2所表1實(shí)施例設(shè)置方案8段實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3過濾除菌液濃度纖維化誘導(dǎo)膠原與比例混合后值度反應(yīng)時(shí)間420mM磷酸鹽緩沖液15mM磷酸鹽緩沖液配制劑0.05M甘油;20℃,時(shí)間：200mi冷凍階段，溫度：43℃,時(shí)間：60mi20℃,時(shí)間：150冷凍階段，溫度：-40℃,時(shí)間：20mi18℃,時(shí)間：2209;10℃,時(shí)間：300mi;5℃,時(shí)間：12000min,真空度：0.2b度：15℃,時(shí)間：214℃,時(shí)間：330度：0℃,時(shí)間：1320min,真空度：10℃,時(shí)間：400度：2℃,時(shí)間：1[0029]表2對比例設(shè)置方案對比例1對比例3過濾除菌濃度同實(shí)施例1同實(shí)施例1同實(shí)施例1纖維化誘導(dǎo)調(diào)整pH值至7.0,25℃,半小時(shí)后同實(shí)施例1同實(shí)施例1導(dǎo)溶液混合比例混合后調(diào)誘導(dǎo)溫度反應(yīng)時(shí)間同實(shí)施例1導(dǎo)率<300同實(shí)施例1配制同實(shí)施例1抗氧化劑不添加抗氧化劑5℃,時(shí)間：60min;溫度：-15℃,時(shí)間：60min;溫度：-25℃,時(shí)間：60min;溫度：-35℃,時(shí)間：60min;溫度：-42℃,時(shí)間：60min;20℃,時(shí)間：200min,真空度：0.2bar;1110℃,時(shí)間：300min,真空度：0.2bar;5℃,時(shí)間：12000min,真空度：0.2bar;第四干燥階段，溫度：15℃,時(shí)間：240min。參照YY/T0500-2004中8.3.3.1方法，取產(chǎn)品用7.3cm2的圓環(huán)夾持器，以100cm3/min的體積增長速度進(jìn)行檢測，記錄產(chǎn)品脹破時(shí)的脹破壓力，測試無樣品時(shí)膜片的壓力兩者差即為產(chǎn)品的脹破強(qiáng)度。為2的1%胃蛋白酶溶液中37℃環(huán)境下酶解，每1分鐘觀察一次產(chǎn)品狀態(tài)，記錄產(chǎn)品完全降解的時(shí)間，以3個(gè)平行樣的平均時(shí)間記錄為產(chǎn)品的降解時(shí)間。表3力學(xué)性能和降解時(shí)間結(jié)果組別降解時(shí)間min實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3對比例1對比例2對比例