HIV樣品采集和處理第1頁，共33頁。HIV樣品采集和處理第2頁，共33頁。主要內(nèi)容1各種檢測的基本知識2樣品采集的種類3操作步驟4影響因素第3頁，共33頁。基本知識

HIV檢測方法

抗體檢測、抗原檢測、核酸檢測、耐藥檢測、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞測定、HIV分離培養(yǎng)

樣品的種類

全血、血清、血漿、細(xì)胞、唾液、尿液、濾紙干血斑

支持性文件:《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》(2009)、《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴細(xì)胞檢測質(zhì)量保證指南》(2006)、《HIV-1病毒載量測定及質(zhì)量保證指南》(2008)、《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》(衛(wèi)生部45號令，2006)第4頁，共33頁?；局Rstep4step3step2step1檢測方法樣品種類采集處理保存運(yùn)輸樣品采集處理選擇策略檢測方法：依據(jù)檢驗?zāi)康倪x擇。樣品種類：實驗方法、檢測試劑和儀器要求。采集處理：采血方法、抗凝管的選擇、采血量、離心分離、多項檢測保存運(yùn)輸：溫度、時限、容器第5頁，共33頁。樣品種類

HIV抗體檢測：全血、血清、血漿、唾液、尿液、DBS

CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞測定：抗凝全血

病毒載量檢測：血漿耐藥、基因型檢測：血漿、DBS核酸定性檢測：全血、血漿、淋巴細(xì)胞、DBS分離培養(yǎng)：全血、淋巴細(xì)胞第6頁，共33頁?？共《局委煹哪繕?biāo)病毒學(xué)目標(biāo)：最大程度地減少病毒載量，將其維持在不可檢測水平的時間越長越好免疫學(xué)目標(biāo)：維持免疫功能，獲得免疫功能重建和/或部分免疫重建終極目標(biāo)：延長生命并提高生活質(zhì)量第7頁，共33頁。病毒載量與CD4+T計數(shù)

HIVinfectionJ.Coffin,XIInternationalConf.onAIDS,Vancouver,1996AIDS病程：一列迫近懸崖的列車病毒載量=火車的速度CD4+T計數(shù)=離懸崖的距離抗病毒治療：制動火車的外力第8頁，共33頁。病毒載量與CD4+T計數(shù)第9頁，共33頁。病毒載量與CD4+T計數(shù)

CD4細(xì)胞(cell/mm3）800400

急性感染期

無癥狀期

艾滋病前期和艾滋病期

CD4

病毒載量抗HIV的CTLHIV抗體第10頁，共33頁。HAART的目標(biāo)UltimateGoalofHAARTRelativeLevelsMonthsYearsAfterHIVInfectionCD4+T-cellsPlasmaHIVViremiaAcuteHIVinfectionSymptomLimitofdetection第11頁，共33頁。HIV-1病毒載量檢測代表的是病毒的負(fù)荷，即體內(nèi)復(fù)制的病毒的數(shù)量體內(nèi)復(fù)制的病毒的數(shù)量是不能直接測量的，一般用血漿中RNA的拷貝數(shù)代表HIV的病毒載量簡單來講是通過測量從而顯示每毫升血液里病毒的數(shù)量定量機(jī)體內(nèi)游離病毒的含量第12頁，共33頁。病毒載量檢測的意義急性HIV感染，窗口期復(fù)制高峰每毫升血液RNA拷貝可達(dá)9×107，一年以后仍然可達(dá)2-4×104判定病人疾病的進(jìn)程和進(jìn)展。血漿中病毒水平是病毒增殖和免疫清除機(jī)制共同作用的結(jié)果，CD4+T細(xì)胞越少顯示病毒載量水平越高第13頁，共33頁。病毒載量檢測的意義監(jiān)測與指導(dǎo)抗病毒治療過程，ART早期HIVRNA水平快速下降，并在相當(dāng)長的一段時間維持在一個比較平緩的水平，大部分患者可以下降到檢測不出的水平觀察耐藥性第14頁，共33頁。HIV-1病毒載量檢測方法病毒載量檢測主要有三種方法：bDNA、RT-PCR及NASBANASBA檢測是通過核酸釋放、提取、核酸擴(kuò)增(NASBA擴(kuò)增)及核酸檢測來完成對血漿中HIV病毒RNA的定量測定生物梅里埃公司將NASBA核酸擴(kuò)增技術(shù)與實驗時(real-time)檢測技術(shù)結(jié)合起來，“分子信標(biāo)實時擴(kuò)增檢測技術(shù)”，能夠?qū)z測進(jìn)行實時監(jiān)控，即稱為“EasyQ”第15頁，共33頁。病毒載量檢測樣品采集運(yùn)輸保存HIV-1，血漿樣品EDTA抗凝真空無菌采血管全血5ml或3ml*2,采集的樣品量應(yīng)盡可能與定量采血管的刻度一致，采集量過多或不足，會造成血液凝固或被稀釋。采集血液后，立即輕輕上下顛倒抗凝管約10次，使血液與抗凝劑充分混勻，避免劇烈振蕩導(dǎo)致溶血第16頁，共33頁。病毒載量檢測樣品采集運(yùn)輸保存務(wù)必在采集全血的4小時內(nèi)分離血漿，室溫下1500-3000r/min離心15分鐘送檢血漿2管，每管>1ml，冷凍(藏)運(yùn)輸血漿樣本3天內(nèi)送檢可在2-8℃暫時保存，1個月以內(nèi)應(yīng)凍存于-20℃以下，1年以內(nèi)應(yīng)置于-70℃以下血漿樣品凍融不應(yīng)超過3次第17頁，共33頁。病毒載量檢測結(jié)果的解釋單位：copies/ml檢測限：20cps/ml(0.5ml)；10cps/ml(1ml);100cps/ml(0.1ml)結(jié)果舉例：

＜20copies/ml(檢測到HIV核酸，但是低于方法檢測下限，無法定量)TND(未檢出，使用現(xiàn)有的檢測方法對本次樣本未檢測到HIV核酸)第18頁，共33頁。樣品處理對病毒載量結(jié)果的影響一般地講，血漿中病毒載量水平比血清中的要高出30％～80％用EDTA抗凝劑的采血管采集全血后分離血漿樣本，其HIVRNA含量比ACD和肝素抗凝管相應(yīng)含量多10％～15％及20％～25％第19頁，共33頁。樣品處理對病毒載量結(jié)果的影響采集全血后的3-6小時RNA丟失量最大，血漿樣本RNA丟失低于全血樣本。1小時以內(nèi)，EDTA抗凝管RNA丟失約10％，ACD抗凝管丟失約20％；6小時以內(nèi)，肝素抗凝管RNA丟失約30％。第20頁，共33頁。樣品處理對病毒載量結(jié)果的影響血漿樣本在-20℃冰柜保存3-14個月，與起始病毒載量水平值(0月)相比，3個月時變化沒有顯著性差異；6個月后下降值明顯，有隨著保存時間延長病毒載量水平下降幅度越大的趨勢。在-20℃冰柜內(nèi)保存6個月，樣本病毒載量水平已不能真實反映樣本采集之初的水平，對疾病進(jìn)展和療效評價，尤其對回顧性研究已無指導(dǎo)意義。第21頁，共33頁。樣品處理對病毒載量結(jié)果的影響-20℃條件下凍融3次比凍融1次HIVRNA降低約20％。許多研究者用多種檢測方法和不同人群樣本的研究結(jié)果證實，技術(shù)和生物因素對樣本RNA水平的影響是持續(xù)的和可預(yù)測的，大約在0.3-0.6log/ml之間。第22頁，共33頁。CD4+T淋巴細(xì)胞測定進(jìn)行性且選擇性地消耗CD4細(xì)胞是HIV感染的特征。CD4細(xì)胞減少與機(jī)會感染增高相結(jié)合并且在個體感染HIV后病情呈進(jìn)行性。CD4細(xì)胞殘余數(shù)在臨床預(yù)后治療監(jiān)測和新型抗逆轉(zhuǎn)錄病毒以及疫苗的臨床試驗入選標(biāo)準(zhǔn)工作中是最經(jīng)常利用的實驗室測量項目第23頁，共33頁。CD4+T淋巴細(xì)胞測定準(zhǔn)確及時地對殘留CD4細(xì)胞計數(shù)，不僅是評價性試驗，也是對存活的HIV感染者實施治療與關(guān)懷的一部分CD4細(xì)胞減少與機(jī)會感染增加和病情發(fā)展相聯(lián)系

CD4細(xì)胞計數(shù)為HIV感染臨床分期、疾病進(jìn)展監(jiān)測、機(jī)會性感染的風(fēng)險評估、抗病毒治療適應(yīng)癥選擇及療效評價的實驗室指標(biāo)第24頁，共33頁。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)FCM是以流式細(xì)胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。FALSSensorLaser第25頁，共33頁。流式細(xì)胞術(shù)特點(diǎn)單細(xì)胞的流動的活細(xì)胞的定量的多參數(shù)的高統(tǒng)計學(xué)精度的分選細(xì)胞第26頁，共33頁。CD4+T淋巴細(xì)胞測定的方法CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞計數(shù)的方法分為兩大類，一類是應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定法，另一類是非流式細(xì)胞儀測定法常用的淋巴細(xì)胞計數(shù)檢測方法為自動檢測方法，包括流式細(xì)胞儀（主要有多平臺法和單平臺法）和專門的細(xì)胞計數(shù)儀第27頁，共33頁。雙平臺法雙平臺方法是一種細(xì)胞群體的絕對計數(shù)方法，利用血球計數(shù)儀檢測淋巴細(xì)胞數(shù)量，再根據(jù)流式細(xì)胞儀得到的細(xì)胞群體百分比，計算得到每微升的淋巴細(xì)胞數(shù)量。雙平臺法需要兩種儀器，由于儀器有系統(tǒng)誤差，計算結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性影響因素較多，導(dǎo)致不同實驗室計數(shù)結(jié)果差異很大。最大的缺點(diǎn)在于操作步驟復(fù)雜，操作人員多、費(fèi)時，因此很難將變異水平減小到最低。第28頁，共33頁。單平臺法應(yīng)用三色、四色流式試劑配以內(nèi)參絕對計數(shù)微球，加上流式細(xì)胞儀淋巴細(xì)胞亞群獲取和分析軟件，一步即可獲得T細(xì)胞亞群的相對數(shù)(百分比)和絕對數(shù)。單平臺法最大程度地減少了多個儀器檢測帶來的檢測誤差，細(xì)胞絕對計數(shù)結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性都得到了良好的保證。第29頁，共33頁。CD4細(xì)胞計數(shù)樣品的采集運(yùn)輸抗凝全血K2EDTA/K3EDTA抗凝真空無菌采血管采樣量：成人采集靜脈血5ml，采集兒童靜脈血樣品建議用兒童型注射器和小試管(2ml)，采集嬰兒樣品較為困難，用小試管采集0.5-1ml即可樣品混勻：采集的靜脈血注入抗凝管后，立即輕輕顛倒抗凝管6-8次，使血液與抗凝劑充分混勻，防止血液凝固，避免劇烈振蕩導(dǎo)致溶血第30頁，共33頁。CD4細(xì)胞計數(shù)樣品的采集運(yùn)輸采血時間：鑒于CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)日間自然變化的個體差異，每一病人采樣時間應(yīng)盡可能集中在某個相同的時段運(yùn)輸條件：37℃以上的溫度會破壞細(xì)胞，使血液學(xué)和流式儀的檢測結(jié)果受到影響。因此應(yīng)在室溫(18-25℃)保存和運(yùn)輸樣品，避免極端溫度(結(jié)冰或大于37℃)。高溫季節(jié)，需用隔熱容器盛裝