TIGIT-PVR信號(hào)通路對(duì)NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的調(diào)控：機(jī)制與影響一、引言1.1研究背景免疫系統(tǒng)是人體抵御病原體入侵和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵防線，其中自然殺傷細(xì)胞（NaturalKillercells，NK細(xì)胞）作為固有免疫系統(tǒng)的重要成員，發(fā)揮著不可或缺的作用。NK細(xì)胞無需預(yù)先致敏，就能非特異性地直接殺傷某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞，構(gòu)成了機(jī)體抗腫瘤、抗感染的第一道免疫防線。同時(shí)，NK細(xì)胞還能分泌多種細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子（TNF）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等，這些細(xì)胞因子不僅參與了NK細(xì)胞自身的活化過程，還能激活和調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，進(jìn)而構(gòu)建起一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的免疫網(wǎng)絡(luò)，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。在腫瘤免疫治療領(lǐng)域，NK細(xì)胞因其獨(dú)特的殺傷機(jī)制和強(qiáng)大的細(xì)胞因子分泌能力，成為繼T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞之后的又一研究熱點(diǎn)，如何充分利用和增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗腫瘤活性，已成為未來腫瘤免疫治療領(lǐng)域的重要研究方向。細(xì)胞因子是一類由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，它們?cè)诿庖呒?xì)胞的活化、增殖、分化以及免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)等過程中扮演著關(guān)鍵角色。在NK細(xì)胞的免疫功能中，細(xì)胞因子起著至關(guān)重要的作用。IFN-γ作為NK細(xì)胞分泌的一種關(guān)鍵細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的抗病毒、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)活性。它可以增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性，同時(shí)激活巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞，共同參與免疫防御和免疫監(jiān)視過程。TNF同樣具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，它能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)免疫細(xì)胞的趨化和活化，進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。因此，深入了解NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于揭示免疫系統(tǒng)的工作原理以及開發(fā)新型免疫治療策略具有重要意義。近年來，隨著對(duì)免疫系統(tǒng)研究的不斷深入，TIGIT-PVR信號(hào)通路逐漸成為免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。TIGIT（TcellimmunoreceptorwithIgandITIMdomains）是免疫球蛋白Ig超家族的一種膜受體，屬于CD28/CTLA-4家族，其外顯子結(jié)構(gòu)包含一個(gè)信號(hào)肽、一個(gè)IgV樣區(qū)、一個(gè)連續(xù)的IgC2樣區(qū)、一個(gè)胞質(zhì)ITIM（ImmunoreceptorTyrosinebasedInhibitoryMotif）區(qū)域以及一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)短的胞質(zhì)區(qū)域。PVR（poliovirusreceptor）則是TIGIT的配體之一（PVR、CD155和CD112都可以與TIGIT結(jié)合），是一種胞膜蛋白，包含一個(gè)N端的IgV樣區(qū)、一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)C端的IgC2樣區(qū)。研究表明，TIGIT-PVR信號(hào)通路在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，尤其是對(duì)NK細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。在正常生理狀態(tài)下，TIGIT在NK細(xì)胞表面表達(dá)較低，但在腫瘤、病毒感染等病理情況下，其表達(dá)水平會(huì)顯著增加。與此同時(shí)，PVR在某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞上的表達(dá)量也會(huì)相應(yīng)上升，使得TIGIT與PVR的相互作用增強(qiáng)，進(jìn)而對(duì)NK細(xì)胞的功能產(chǎn)生重要影響。TIGIT與PVR結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，最終導(dǎo)致NK細(xì)胞功能的抑制，表現(xiàn)為干擾細(xì)胞趨化、降低細(xì)胞殺傷能力以及減少細(xì)胞因子的分泌等。在腫瘤微環(huán)境中，TIGIT-PVR信號(hào)通路的激活可促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸，降低NK細(xì)胞的殺傷活性和細(xì)胞因子分泌水平，從而有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。因此，深入研究TIGIT-PVR信號(hào)對(duì)NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的調(diào)控作用及分子機(jī)制，不僅有助于我們更深入地理解NK細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制，揭示腫瘤免疫逃逸和病毒感染等病理過程的分子基礎(chǔ)，還能為開發(fā)新型免疫治療策略提供重要的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2TIGIT與PVR的結(jié)構(gòu)與功能TIGIT作為免疫球蛋白Ig超家族的關(guān)鍵成員，在免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域扮演著舉足輕重的角色。從結(jié)構(gòu)層面來看，TIGIT的基因位于染色體3q13.31，所編碼的蛋白質(zhì)包含244個(gè)氨基酸，是一種典型的跨膜蛋白。其結(jié)構(gòu)可細(xì)分為三個(gè)主要部分：細(xì)胞外免疫球蛋白可變（IgV）結(jié)構(gòu)域、I型跨膜結(jié)構(gòu)域以及高度保守的胞內(nèi)抑制結(jié)構(gòu)域。其中，IgV結(jié)構(gòu)域如同一個(gè)精密的信號(hào)接收器，負(fù)責(zé)識(shí)別外來信號(hào)，它與配體之間的特異性結(jié)合是后續(xù)免疫調(diào)節(jié)過程的關(guān)鍵起始步驟；I型跨膜結(jié)構(gòu)域則像一座橋梁，將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，確保信息交流的順暢；胞內(nèi)抑制結(jié)構(gòu)域含有免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）和免疫球蛋白酪氨酸尾樣（ITT）基序，這兩個(gè)基序是TIGIT發(fā)揮免疫抑制功能的核心元件，它們通過與下游信號(hào)分子的相互作用，精準(zhǔn)調(diào)控免疫細(xì)胞的活化與功能。TIGIT的表達(dá)具有顯著的細(xì)胞特異性，主要集中在活化的T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、記憶性T細(xì)胞以及NK細(xì)胞表面，在初始T細(xì)胞和NK細(xì)胞表面的表達(dá)水平則相對(duì)較低。在腫瘤微環(huán)境中，TIGIT在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）上呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，這一現(xiàn)象與腫瘤的免疫逃逸密切相關(guān)，成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。PVR作為TIGIT的重要配體之一，同樣在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不可或缺的作用。PVR屬于細(xì)胞黏附分子，由PVR基因編碼，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞表面，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞等。其蛋白結(jié)構(gòu)包含一個(gè)N端的IgV樣區(qū)、一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)C端的IgC2樣區(qū)。N端的IgV樣區(qū)是PVR與TIGIT相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，它通過與TIGIT的IgV結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，啟動(dòng)TIGIT-PVR信號(hào)通路；跨膜區(qū)負(fù)責(zé)將PVR錨定在細(xì)胞膜上，維持其穩(wěn)定的空間位置；C端的IgC2樣區(qū)則參與了PVR與其他細(xì)胞表面分子的相互作用，進(jìn)一步拓展了PVR在細(xì)胞間通訊和免疫調(diào)節(jié)中的功能。PVR不僅在正常生理過程中參與細(xì)胞間的黏附與信號(hào)傳遞，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，其表達(dá)水平的變化也對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響。在某些腫瘤中，PVR的高表達(dá)能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用，為腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視創(chuàng)造條件。TIGIT與PVR的相互作用是一個(gè)高度特異性且精細(xì)調(diào)控的過程。當(dāng)TIGIT與PVR相遇時(shí)，它們的IgV結(jié)構(gòu)域會(huì)像兩塊精準(zhǔn)匹配的拼圖一樣緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。這種結(jié)合不僅在空間上改變了TIGIT和PVR的構(gòu)象，還引發(fā)了一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。在NK細(xì)胞中，TIGIT-PVR結(jié)合會(huì)促使TIGIT胞內(nèi)抑制結(jié)構(gòu)域中的ITIM和ITT基序發(fā)生磷酸化，進(jìn)而招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白，如SHP-1和SHP-2等。這些蛋白通過對(duì)下游信號(hào)分子的去磷酸化修飾，抑制NK細(xì)胞的活化信號(hào)通路，最終導(dǎo)致NK細(xì)胞功能的抑制，包括細(xì)胞因子分泌減少、細(xì)胞毒性降低以及趨化能力減弱等。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的PVR與NK細(xì)胞表面的TIGIT結(jié)合，使得NK細(xì)胞無法有效發(fā)揮抗腫瘤作用，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散提供了有利條件。1.3NK細(xì)胞及其細(xì)胞因子分泌概述NK細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)的核心成員，在機(jī)體免疫防御中占據(jù)著舉足輕重的地位。它起源于骨髓造血干細(xì)胞，在骨髓中發(fā)育成熟后，進(jìn)入外周血和淋巴組織，時(shí)刻履行著免疫監(jiān)視的職責(zé)。NK細(xì)胞的獨(dú)特之處在于，它無需預(yù)先接觸抗原，就能迅速對(duì)靶細(xì)胞展開攻擊，這種非特異性的殺傷能力使其成為抵御病原體入侵和腫瘤發(fā)生的第一道防線。在病毒感染初期，NK細(xì)胞能夠迅速識(shí)別并殺傷被病毒感染的細(xì)胞，限制病毒的復(fù)制和擴(kuò)散，為后續(xù)特異性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)爭(zhēng)取寶貴時(shí)間。當(dāng)機(jī)體受到流感病毒侵襲時(shí)，NK細(xì)胞可在數(shù)小時(shí)內(nèi)被激活，釋放穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒性物質(zhì)，誘導(dǎo)被感染細(xì)胞凋亡，有效遏制病毒的傳播。NK細(xì)胞的表型特征是其功能的重要基礎(chǔ)，其表面表達(dá)多種標(biāo)志性分子，其中CD56和CD16是最為關(guān)鍵的標(biāo)識(shí)。根據(jù)CD56表達(dá)水平的差異，NK細(xì)胞可分為CD56dim和CD56bright兩個(gè)主要亞群，這兩個(gè)亞群在功能和分布上存在顯著差異。CD56dim亞群約占外周血NK細(xì)胞的90%，其細(xì)胞表面CD16表達(dá)水平較高，具備強(qiáng)大的細(xì)胞毒活性，主要通過釋放穿孔素和顆粒酶直接殺傷靶細(xì)胞，在抗腫瘤和抗病毒感染中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤免疫監(jiān)視過程中，CD56dimNK細(xì)胞能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面異常表達(dá)的分子，與之緊密結(jié)合后，釋放穿孔素在腫瘤細(xì)胞膜上形成小孔，隨后顆粒酶通過這些小孔進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。CD56bright亞群則主要分布于淋巴組織，其CD16表達(dá)水平較低，但分泌細(xì)胞因子的能力更為突出，在免疫調(diào)節(jié)中扮演著重要角色。細(xì)胞因子是NK細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的重要介質(zhì)，NK細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答的各個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。干擾素-γ（IFN-γ）是NK細(xì)胞分泌的一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，它不僅能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞自身的殺傷活性，還能激活巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞，促進(jìn)它們對(duì)病原體和腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。IFN-γ可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮等殺菌物質(zhì)，增強(qiáng)其吞噬和殺傷病原體的能力；同時(shí)，IFN-γ還能促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。腫瘤壞死因子（TNF）同樣是NK細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子之一，它能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，在抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不可或缺的作用。TNF可與腫瘤細(xì)胞表面的TNF受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡；在炎癥反應(yīng)中，TNF能夠招募和激活免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）也是NK細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子之一，它能夠刺激骨髓造血干細(xì)胞向粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化，促進(jìn)這些細(xì)胞的增殖和成熟，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。GM-CSF還能激活巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，增強(qiáng)它們的抗原呈遞能力，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖，進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。白細(xì)胞介素-10（IL-10）是一種具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子，NK細(xì)胞在特定條件下也能分泌IL-10，它可以抑制其他免疫細(xì)胞的活性，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，防止過度免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。在炎癥反應(yīng)后期，IL-10的分泌可以抑制炎癥細(xì)胞的活化，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)。1.4研究目的與意義本研究旨在深入探究TIGIT-PVR信號(hào)對(duì)NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的調(diào)控作用及分子機(jī)制，為揭示免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制以及開發(fā)新型免疫治療策略提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。具體研究目的如下：明確TIGIT-PVR信號(hào)對(duì)NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的調(diào)控作用：通過體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物模型，系統(tǒng)研究TIGIT-PVR信號(hào)通路的激活或阻斷對(duì)NK細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF、GM-CSF等關(guān)鍵細(xì)胞因子的影響，精確測(cè)定細(xì)胞因子的分泌水平和動(dòng)態(tài)變化，明確TIGIT-PVR信號(hào)在NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌調(diào)控中的關(guān)鍵作用。解析TIGIT-PVR信號(hào)調(diào)控NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的分子機(jī)制：深入研究TIGIT與PVR結(jié)合后引發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，包括TIGIT胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的磷酸化、下游信號(hào)分子的招募和激活等過程，揭示其如何通過影響轉(zhuǎn)錄因子的活性和基因表達(dá)，調(diào)控NK細(xì)胞細(xì)胞因子的合成和分泌，從而從分子層面闡明TIGIT-PVR信號(hào)調(diào)控NK細(xì)胞功能的內(nèi)在機(jī)制。探索TIGIT-PVR信號(hào)作為免疫治療靶點(diǎn)的潛力：基于對(duì)TIGIT-PVR信號(hào)調(diào)控NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌機(jī)制的深入理解，評(píng)估靶向TIGIT-PVR信號(hào)通路在腫瘤免疫治療和免疫疾病治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值，為開發(fā)新型免疫治療藥物和策略提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。本研究具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值：科學(xué)意義：TIGIT-PVR信號(hào)通路作為免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)途徑，對(duì)NK細(xì)胞功能的調(diào)控機(jī)制尚未完全明晰。深入研究TIGIT-PVR信號(hào)對(duì)NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的調(diào)控作用及分子機(jī)制，有助于填補(bǔ)這一領(lǐng)域的知識(shí)空白，進(jìn)一步完善我們對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為后續(xù)相關(guān)研究提供重要的理論基礎(chǔ)。此外，本研究還將為理解腫瘤免疫逃逸和病毒感染等病理過程提供新的視角，揭示這些疾病發(fā)生發(fā)展過程中免疫調(diào)節(jié)失衡的分子基礎(chǔ)，為深入研究疾病的發(fā)病機(jī)制提供關(guān)鍵線索。臨床應(yīng)用價(jià)值：在腫瘤治療領(lǐng)域，腫瘤細(xì)胞常通過激活TIGIT-PVR信號(hào)通路來逃避NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷，導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。通過研究TIGIT-PVR信號(hào)對(duì)NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的調(diào)控作用，有望開發(fā)出針對(duì)該信號(hào)通路的新型免疫治療策略，如TIGIT阻斷抗體或PVR拮抗劑等。這些治療手段可以解除TIGIT-PVR信號(hào)對(duì)NK細(xì)胞的抑制作用，增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗腫瘤活性，促進(jìn)其分泌更多的細(xì)胞因子，從而激活和調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞，共同發(fā)揮抗腫瘤作用，為腫瘤患者提供更有效的治療方法，改善患者的預(yù)后和生存質(zhì)量。在免疫疾病治療方面，TIGIT-PVR信號(hào)通路的異常激活或抑制與多種免疫疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，在自身免疫性疾病中，TIGIT-PVR信號(hào)的失衡可能導(dǎo)致NK細(xì)胞功能異常，過度分泌細(xì)胞因子，引發(fā)自身免疫反應(yīng)，對(duì)機(jī)體組織造成損傷。通過深入了解TIGIT-PVR信號(hào)對(duì)NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的調(diào)控機(jī)制，我們可以為自身免疫性疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略，通過調(diào)節(jié)TIGIT-PVR信號(hào)通路，糾正NK細(xì)胞功能異常，控制細(xì)胞因子的分泌水平，從而減輕自身免疫反應(yīng)，緩解疾病癥狀，為免疫疾病患者帶來新的治療希望。二、TIGIT-PVR信號(hào)通路與NK細(xì)胞的關(guān)聯(lián)2.1TIGIT在NK細(xì)胞上的表達(dá)情況TIGIT在NK細(xì)胞上的表達(dá)情況是理解TIGIT-PVR信號(hào)通路對(duì)NK細(xì)胞功能調(diào)控的重要基礎(chǔ)。在正常生理狀態(tài)下，TIGIT在NK細(xì)胞表面呈低水平表達(dá)。這一現(xiàn)象表明，在機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)維持過程中，TIGIT對(duì)NK細(xì)胞功能的抑制作用相對(duì)較弱，NK細(xì)胞能夠保持較高的活性，有效履行其免疫監(jiān)視和防御職責(zé)。通過對(duì)健康個(gè)體外周血NK細(xì)胞的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TIGIT陽性的NK細(xì)胞比例較低，且其平均熒光強(qiáng)度也相對(duì)較弱，這進(jìn)一步證實(shí)了TIGIT在正常NK細(xì)胞上的低表達(dá)狀態(tài)。然而，當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)時(shí)，TIGIT在NK細(xì)胞上的表達(dá)會(huì)發(fā)生顯著變化。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放一系列免疫抑制因子和代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)會(huì)對(duì)NK細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈刺激，導(dǎo)致TIGIT在NK細(xì)胞表面的表達(dá)明顯上調(diào)。研究表明，在多種腫瘤患者中，如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等，腫瘤浸潤(rùn)NK細(xì)胞（TINK）上TIGIT的表達(dá)水平相較于外周血NK細(xì)胞顯著升高。這種升高使得TIGIT-PVR信號(hào)通路更容易被激活，進(jìn)而抑制NK細(xì)胞的功能，為腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸創(chuàng)造了條件。在非小細(xì)胞肺癌患者中，TINK細(xì)胞上TIGIT的表達(dá)水平與腫瘤的分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，腫瘤分期越晚、轉(zhuǎn)移程度越高，TIGIT的表達(dá)水平也越高。這表明TIGIT在NK細(xì)胞上的高表達(dá)可能參與了腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程。病毒感染也是導(dǎo)致TIGIT在NK細(xì)胞上表達(dá)改變的重要因素。在慢性病毒感染過程中，如HIV、HBV、HCV等病毒感染，持續(xù)的病毒抗原刺激會(huì)使NK細(xì)胞處于高度活化狀態(tài)，進(jìn)而誘導(dǎo)TIGIT的表達(dá)上調(diào)。以HIV感染為例，研究發(fā)現(xiàn)HIV感染者外周血NK細(xì)胞上TIGIT的表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組，且TIGIT的表達(dá)與NK細(xì)胞功能受損程度呈正相關(guān)。隨著HIV感染的進(jìn)展，NK細(xì)胞上TIGIT的表達(dá)逐漸增加，同時(shí)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌能力逐漸下降，這表明TIGIT的高表達(dá)可能在HIV感染導(dǎo)致的NK細(xì)胞功能抑制中發(fā)揮重要作用。TIGIT在NK細(xì)胞亞群中的表達(dá)也存在差異。根據(jù)CD56表達(dá)水平的不同，NK細(xì)胞可分為CD56dim和CD56bright兩個(gè)亞群。CD56dimNK細(xì)胞主要發(fā)揮細(xì)胞毒作用，而CD56brightNK細(xì)胞則在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究表明，TIGIT在CD56dimNK細(xì)胞上的表達(dá)水平相對(duì)較高，而在CD56brightNK細(xì)胞上的表達(dá)水平相對(duì)較低。在腫瘤微環(huán)境中，CD56dimTINK細(xì)胞上TIGIT的表達(dá)顯著升高，而CD56brightTINK細(xì)胞上TIGIT的表達(dá)變化相對(duì)較小。這種亞群特異性的表達(dá)差異可能導(dǎo)致不同NK細(xì)胞亞群對(duì)TIGIT-PVR信號(hào)通路的敏感性不同，進(jìn)而影響它們?cè)诿庖邞?yīng)答中的功能發(fā)揮。2.2PVR在相關(guān)細(xì)胞上的表達(dá)變化PVR作為TIGIT的重要配體，其在相關(guān)細(xì)胞上的表達(dá)變化對(duì)TIGIT-PVR信號(hào)通路的激活以及NK細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)具有重要影響。在正常生理狀態(tài)下，PVR在大多數(shù)細(xì)胞表面呈低水平表達(dá)，維持著細(xì)胞間的正常通訊和免疫穩(wěn)態(tài)。在正常上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及部分免疫細(xì)胞表面，PVR的表達(dá)量較低，這使得TIGIT-PVR信號(hào)通路處于相對(duì)抑制狀態(tài)，NK細(xì)胞能夠保持正常的功能活性，有效地發(fā)揮免疫監(jiān)視和防御作用。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，PVR在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)會(huì)發(fā)生顯著上調(diào)。研究表明，在多種實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤中，如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、急性髓系白血病等，腫瘤細(xì)胞表面PVR的表達(dá)水平明顯高于正常組織細(xì)胞。在非小細(xì)胞肺癌組織中，PVR的表達(dá)量與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。隨著腫瘤分期的增加和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，腫瘤細(xì)胞表面PVR的表達(dá)水平逐漸升高，而高表達(dá)PVR的患者往往預(yù)后較差。這種高表達(dá)現(xiàn)象可能是腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視的一種重要機(jī)制。腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)PVR的表達(dá)，增強(qiáng)與NK細(xì)胞表面TIGIT的結(jié)合，從而激活TIGIT-PVR信號(hào)通路，抑制NK細(xì)胞的活性，包括細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒性，使得腫瘤細(xì)胞能夠在體內(nèi)得以生長(zhǎng)和擴(kuò)散。病毒感染同樣會(huì)導(dǎo)致PVR在感染細(xì)胞上的表達(dá)改變。一些病毒在感染宿主細(xì)胞后，會(huì)利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制，促進(jìn)PVR的表達(dá)。在HIV感染過程中，HIV病毒可通過其編碼的蛋白與宿主細(xì)胞的信號(hào)通路相互作用，誘導(dǎo)PVR在免疫細(xì)胞表面的表達(dá)上調(diào)。這種上調(diào)不僅有助于病毒的感染和傳播，還會(huì)對(duì)NK細(xì)胞的功能產(chǎn)生抑制作用。PVR表達(dá)上調(diào)后的免疫細(xì)胞與NK細(xì)胞相互作用時(shí)，TIGIT-PVR信號(hào)通路被激活，NK細(xì)胞的抗病毒活性受到抑制，從而使得病毒能夠在體內(nèi)持續(xù)復(fù)制和感染。PVR在不同細(xì)胞類型上表達(dá)變化的機(jī)制較為復(fù)雜。在腫瘤細(xì)胞中，致癌信號(hào)通路的激活是導(dǎo)致PVR表達(dá)上調(diào)的重要原因之一。例如，RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)通路的異常激活，可通過激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1，使其與PVR啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而促進(jìn)PVR基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。腫瘤微環(huán)境中的多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子也能調(diào)節(jié)PVR的表達(dá)。腫瘤細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）可以通過激活Smad信號(hào)通路，上調(diào)PVR在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸能力。在病毒感染細(xì)胞中，病毒感染引發(fā)的宿主細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)以及病毒自身編碼蛋白的作用，都可能導(dǎo)致PVR表達(dá)的改變。某些病毒感染后，會(huì)引起宿主細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活相關(guān)的信號(hào)通路，從而促進(jìn)PVR的表達(dá)，為病毒的感染和傳播創(chuàng)造有利條件。2.3TIGIT-PVR信號(hào)通路的激活機(jī)制TIGIT-PVR信號(hào)通路的激活是一個(gè)涉及多個(gè)分子相互作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜過程，其核心起始步驟是TIGIT與PVR的特異性結(jié)合。當(dāng)TIGIT與PVR相遇時(shí)，它們之間的結(jié)合具有高度特異性，這一過程主要依賴于兩者的IgV結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。TIGIT的IgV結(jié)構(gòu)域與PVR的IgV樣區(qū)精確匹配，如同鎖與鑰匙的關(guān)系，這種特異性結(jié)合為后續(xù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件奠定了基礎(chǔ)。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的PVR與NK細(xì)胞表面的TIGIT相遇并結(jié)合，開啟了TIGIT-PVR信號(hào)通路的激活過程。TIGIT與PVR結(jié)合后，TIGIT的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生一系列關(guān)鍵變化，其中酪氨酸磷酸化是最為重要的事件之一。TIGIT的胞內(nèi)段含有免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）和免疫球蛋白酪氨酸尾樣（ITT）基序，當(dāng)TIGIT與PVR結(jié)合后，這些基序中的酪氨酸殘基會(huì)被Src家族激酶磷酸化。以ITIM基序?yàn)槔浔Ｊ匦蛄袨門xYxxL（T為蘇氨酸，Y為酪氨酸，L為亮氨酸，x為任意氨基酸），在TIGIT-PVR結(jié)合的刺激下，ITIM基序中的酪氨酸會(huì)被磷酸化，形成pYxxL結(jié)構(gòu)，這種磷酸化修飾改變了ITIM基序的空間構(gòu)象，使其能夠招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白，從而啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白是TIGIT-PVR信號(hào)通路激活的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。磷酸化后的TIGITITIM和ITT基序能夠特異性地招募SHP-1（Srchomology2domain-containingproteintyrosinephosphatase1）和SHP-2等含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白。SHP-1和SHP-2通過其SH2結(jié)構(gòu)域與TIGIT胞內(nèi)段磷酸化的酪氨酸殘基緊密結(jié)合，這種結(jié)合不僅穩(wěn)定了蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，還激活了SHP-1和SHP-2的磷酸酶活性。在NK細(xì)胞中，SHP-1和SHP-2與磷酸化的TIGIT結(jié)合后，會(huì)被招募到NK細(xì)胞的活化信號(hào)通路附近，對(duì)通路中的關(guān)鍵分子進(jìn)行去磷酸化修飾，從而抑制NK細(xì)胞的活化信號(hào)傳導(dǎo)。激活的SHP-1和SHP-2通過對(duì)下游信號(hào)分子的去磷酸化修飾，抑制NK細(xì)胞的活化信號(hào)通路，最終導(dǎo)致NK細(xì)胞功能的抑制。在NK細(xì)胞的活化信號(hào)通路中，PI3K（Phosphatidylinositol-3-kinase）/Akt和MAPK（Mitogen-activatedproteinkinase）等信號(hào)通路起著關(guān)鍵作用。SHP-1和SHP-2可以作用于這些信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，如PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85和MAPK通路中的MEK（Mitogen-activatedproteinkinasekinase）等。SHP-1通過其磷酸酶活性去除p85上的磷酸基團(tuán)，使PI3K失去活性，進(jìn)而抑制Akt的磷酸化和激活，阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的傳導(dǎo)，抑制NK細(xì)胞的增殖、存活和細(xì)胞因子分泌等功能。SHP-2同樣可以對(duì)MEK進(jìn)行去磷酸化修飾，抑制MEK對(duì)ERK（Extracellularsignal-regulatedkinase）的磷酸化激活，阻斷MAPK信號(hào)通路，導(dǎo)致NK細(xì)胞的活化受阻，細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌能力下降。三、TIGIT-PVR信號(hào)對(duì)NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的調(diào)控作用3.1體外實(shí)驗(yàn)研究3.1.1NK細(xì)胞的分離與培養(yǎng)本研究采用密度梯度離心結(jié)合免疫磁珠分選的方法，從健康人外周血或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物（如小鼠、大鼠等）的脾臟、骨髓等組織中分離NK細(xì)胞。以人外周血為例，具體操作如下：首先，采集新鮮的外周血樣本，置于含有抗凝劑（如肝素鈉或EDTA）的無菌采血管中，輕輕顛倒混勻，防止血液凝固。將采集的外周血用等體積的無菌PBS緩沖液稀釋，使血液與PBS充分混合，以降低血液的黏稠度，便于后續(xù)的離心分離操作。將稀釋后的血液緩慢疊加到淋巴細(xì)胞分離液（如Ficoll-Hypaque密度梯度離心液）的液面上，形成清晰的分層。注意操作過程要輕柔，避免血液與分離液混合，影響細(xì)胞分離效果。將裝有血液和分離液的離心管放入水平離心機(jī)中，在室溫條件下，以2000-2500rpm的轉(zhuǎn)速離心20-30分鐘。離心過程中，由于不同細(xì)胞的密度差異，會(huì)在離心管中形成不同的分層。離心結(jié)束后，小心取出離心管，可見離心管中從上到下依次為血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層（白膜層）、淋巴細(xì)胞分離液層和紅細(xì)胞層。用無菌吸管小心吸取位于血漿層與分離液層之間的白膜層，即富含NK細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中。加入適量的無菌PBS緩沖液，將吸取的單個(gè)核細(xì)胞重懸，充分洗滌，以去除殘留的血漿和分離液。在室溫下，以1500-2000rpm的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘，棄去上清液，重復(fù)洗滌2-3次，確保細(xì)胞純度。為進(jìn)一步提高NK細(xì)胞的純度，采用免疫磁珠分選技術(shù)。根據(jù)NK細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物（如CD56、CD16等），選擇相應(yīng)的免疫磁珠試劑盒（如MiltenyiBiotec公司的NK細(xì)胞分離試劑盒）。按照試劑盒說明書的操作步驟，將洗滌后的單個(gè)核細(xì)胞與偶聯(lián)有抗CD56或抗CD16抗體的免疫磁珠孵育。在孵育過程中，免疫磁珠會(huì)與NK細(xì)胞表面的特異性標(biāo)志物結(jié)合，形成細(xì)胞-磁珠復(fù)合物。將孵育后的細(xì)胞懸液通過裝有磁性分離柱的磁場(chǎng)中，由于細(xì)胞-磁珠復(fù)合物具有磁性，會(huì)被吸附在分離柱上，而其他非NK細(xì)胞則會(huì)隨液體流出分離柱。用適量的緩沖液沖洗分離柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)細(xì)胞。然后，將分離柱從磁場(chǎng)中取出，用洗脫緩沖液洗脫吸附在柱上的NK細(xì)胞，收集洗脫液，即得到高純度的NK細(xì)胞。將分離得到的NK細(xì)胞接種于含有合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中進(jìn)行體外培養(yǎng)。常用的培養(yǎng)基為含有10%-20%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基，同時(shí)添加適量的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-15（IL-15）等，以促進(jìn)NK細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和活化。IL-2和IL-15是NK細(xì)胞生長(zhǎng)和活化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它們可以與NK細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)其細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌能力。將接種有NK細(xì)胞的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞因子，維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。在培養(yǎng)過程中，注意保持培養(yǎng)環(huán)境的無菌和穩(wěn)定，避免細(xì)胞受到污染和外界因素的干擾。3.1.2TIGIT-PVR信號(hào)的干預(yù)為了深入研究TIGIT-PVR信號(hào)對(duì)NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的調(diào)控作用，本研究采用多種手段對(duì)TIGIT-PVR信號(hào)進(jìn)行干預(yù)。利用抗TIGIT抗體和抗PVR抗體來阻斷TIGIT與PVR的結(jié)合，從而抑制TIGIT-PVR信號(hào)通路的激活。選擇高親和力、高特異性的商業(yè)化抗體，如BioLegend公司的抗人TIGIT抗體和抗人PVR抗體。在實(shí)驗(yàn)中，將分離培養(yǎng)的NK細(xì)胞與不同濃度的抗TIGIT抗體或抗PVR抗體孵育，設(shè)置不同的抗體濃度梯度（如1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml等），以確定最佳的阻斷濃度。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，加入等量的同型對(duì)照抗體（如鼠IgG1同型對(duì)照抗體），以排除非特異性抗體結(jié)合的影響。孵育時(shí)間通常為30分鐘至1小時(shí)，在37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行，使抗體能夠充分與細(xì)胞表面的TIGIT或PVR結(jié)合，阻斷其相互作用。使用小分子抑制劑也是干預(yù)TIGIT-PVR信號(hào)的有效手段。一些小分子化合物能夠特異性地抑制TIGIT-PVR信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟。例如，某些小分子可以抑制TIGIT胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的磷酸化，從而阻斷下游信號(hào)的傳導(dǎo)。在實(shí)驗(yàn)中，選擇合適的小分子抑制劑，如根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道或前期預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選得到的有效抑制劑。將小分子抑制劑溶解于合適的溶劑中（如DMSO），配制成不同濃度的工作液。將分離培養(yǎng)的NK細(xì)胞與不同濃度的小分子抑制劑孵育，設(shè)置濃度梯度（如1μM、5μM、10μM等），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，加入等量的溶劑（如DMSO），以排除溶劑對(duì)細(xì)胞的影響。孵育時(shí)間根據(jù)小分子抑制劑的作用機(jī)制和細(xì)胞對(duì)其的反應(yīng)情況而定，一般為1-2小時(shí)，在37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行，使小分子抑制劑能夠充分發(fā)揮作用，抑制TIGIT-PVR信號(hào)通路。構(gòu)建過表達(dá)或敲低TIGIT、PVR的細(xì)胞模型也是研究TIGIT-PVR信號(hào)的重要方法。利用基因工程技術(shù)，將TIGIT或PVR的編碼基因克隆到合適的表達(dá)載體中（如慢病毒載體、腺病毒載體等），通過轉(zhuǎn)染或感染的方法將表達(dá)載體導(dǎo)入NK細(xì)胞中，使NK細(xì)胞過表達(dá)TIGIT或PVR。在過表達(dá)TIGIT的實(shí)驗(yàn)中，將構(gòu)建好的TIGIT過表達(dá)慢病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，進(jìn)行病毒包裝。收集包裝好的慢病毒上清，感染分離培養(yǎng)的NK細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，感染空載體慢病毒。感染后，通過嘌呤霉素篩選等方法，獲得穩(wěn)定過表達(dá)TIGIT的NK細(xì)胞株。通過CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲低NK細(xì)胞中TIGIT或PVR的表達(dá)。設(shè)計(jì)針對(duì)TIGIT或PVR基因的sgRNA序列，構(gòu)建到CRISPR-Cas9載體中，通過轉(zhuǎn)染或感染的方法將載體導(dǎo)入NK細(xì)胞中，利用Cas9核酸酶對(duì)TIGIT或PVR基因進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)基因敲低。通過流式細(xì)胞術(shù)、Westernblot等方法檢測(cè)TIGIT或PVR的表達(dá)水平，驗(yàn)證過表達(dá)或敲低效果。3.1.3細(xì)胞因子分泌的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）定量檢測(cè)NK細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的含量。根據(jù)所要檢測(cè)的細(xì)胞因子種類（如IFN-γ、TNF、GM-CSF等），選擇相應(yīng)的ELISA試劑盒，如R&DSystems公司的人IFN-γELISA試劑盒、人TNFELISA試劑盒等。按照試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。首先，將捕獲抗體包被在ELISA板的微孔中，4℃過夜孵育，使抗體牢固結(jié)合在微孔表面。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液（如PBST）洗滌微孔3-5次，以去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)。加入封閉液（如含有5%脫脂奶粉的PBST），室溫孵育1-2小時(shí)，封閉微孔表面的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景信號(hào)。棄去封閉液，再次用洗滌緩沖液洗滌微孔3-5次。將收集的NK細(xì)胞培養(yǎng)上清加入到微孔中，同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和空白對(duì)照孔。標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入不同濃度的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出樣品中細(xì)胞因子的含量。空白對(duì)照孔中加入等量的培養(yǎng)基，用于檢測(cè)背景信號(hào)。將ELISA板置于37℃孵育1-2小時(shí)，使細(xì)胞因子與捕獲抗體充分結(jié)合。棄去培養(yǎng)上清，用洗滌緩沖液洗滌微孔3-5次，去除未結(jié)合的細(xì)胞因子。加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，室溫孵育1小時(shí)，使檢測(cè)抗體與結(jié)合在捕獲抗體上的細(xì)胞因子特異性結(jié)合。棄去檢測(cè)抗體，用洗滌緩沖液洗滌微孔3-5次，去除未結(jié)合的檢測(cè)抗體。加入親和素-辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合物，室溫孵育30分鐘，使HRP與生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。棄去結(jié)合物，用洗滌緩沖液洗滌微孔3-5次，去除未結(jié)合的HRP。加入底物溶液（如TMB底物），室溫避光孵育15-30分鐘，HRP催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。加入終止液（如2MH?SO?）終止反應(yīng)，藍(lán)色產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中細(xì)胞因子的濃度。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)情況，該方法可以同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)胞因子，并分析不同亞群NK細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)差異。將分離培養(yǎng)的NK細(xì)胞與刺激物（如PMA、離子霉素等）共孵育，刺激NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。在孵育過程中，加入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（如莫能菌素或布雷菲德菌素A），阻止細(xì)胞因子的分泌，使其在細(xì)胞內(nèi)積累，便于后續(xù)檢測(cè)。孵育結(jié)束后，收集細(xì)胞，用含有0.5%BSA和2mMEDTA的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，去除未結(jié)合的刺激物和雜質(zhì)。將細(xì)胞重懸于固定液（如4%多聚甲醛）中，室溫固定15-30分鐘，使細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)成分固定，便于后續(xù)染色操作。固定結(jié)束后，用洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，去除固定液。加入破膜劑（如含有0.1%皂素的PBS緩沖液），室溫孵育10-15分鐘，使細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜通透性增加，便于抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞因子結(jié)合。破膜結(jié)束后，用洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，去除破膜劑。加入熒光標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體（如FITC標(biāo)記的抗IFN-γ抗體、PE標(biāo)記的抗TNF抗體等），4℃避光孵育30-60分鐘，使抗體與細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，用洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，去除未結(jié)合的抗體。將細(xì)胞重懸于含有1%多聚甲醛的PBS緩沖液中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀上，通過設(shè)置合適的熒光通道和補(bǔ)償參數(shù)，采集細(xì)胞的熒光信號(hào)，分析不同細(xì)胞亞群中細(xì)胞因子的表達(dá)水平和陽性細(xì)胞比例。3.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證3.2.1動(dòng)物模型的建立為了更深入地研究TIGIT-PVR信號(hào)對(duì)NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的調(diào)控作用在體內(nèi)的真實(shí)情況，本研究構(gòu)建了腫瘤和病毒感染兩種動(dòng)物模型。在構(gòu)建腫瘤動(dòng)物模型時(shí)，選用免疫缺陷小鼠（如裸鼠、NOD-SCID小鼠等）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，因?yàn)檫@些小鼠的免疫系統(tǒng)存在缺陷，對(duì)腫瘤細(xì)胞的排斥反應(yīng)較弱，能夠更好地模擬腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)和發(fā)展過程。以裸鼠為例，具體構(gòu)建步驟如下：首先，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞系（如肺癌A549細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞等），用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，并使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板準(zhǔn)確計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，將細(xì)胞濃度調(diào)整至合適范圍（如1×10?個(gè)/ml）。隨后，用1ml注射器吸取適量的腫瘤細(xì)胞懸液，在無菌條件下，將小鼠固定，對(duì)其腋窩或腹股溝部位進(jìn)行75%酒精消毒，然后將注射器針頭以45度角斜插入皮下，緩慢注射腫瘤細(xì)胞懸液（每只小鼠注射0.1ml，含1×10?個(gè)腫瘤細(xì)胞）。注射完成后，用左手食指輕壓針孔約1分鐘，防止細(xì)胞懸液溢出，之后將小鼠放回飼養(yǎng)籠中，側(cè)放于墊料上，避免其不適嘔吐時(shí)嘔吐物誤入呼吸道引起窒息。注射后，每天密切觀察小鼠的一般狀況，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等，同時(shí)使用游標(biāo)卡尺定期測(cè)量腫瘤的大小，按照公式V=0.5×長(zhǎng)×寬2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，以監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況。在構(gòu)建病毒感染動(dòng)物模型時(shí)，根據(jù)研究目的和病毒類型選擇合適的動(dòng)物，如小鼠常用于構(gòu)建流感病毒、乙肝病毒等感染模型，豚鼠常用于構(gòu)建呼吸道合胞病毒感染模型。以小鼠流感病毒感染模型為例，具體步驟如下：首先，將流感病毒（如甲型流感病毒H1N1株）用無菌PBS緩沖液稀釋至合適的感染滴度（如1×10?TCID??/ml，TCID??即半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）。然后，將小鼠輕度麻醉，使用移液器將稀釋后的病毒液緩慢滴入小鼠鼻腔（每側(cè)鼻腔滴入25μl，共50μl），使病毒能夠充分接觸呼吸道黏膜，從而實(shí)現(xiàn)感染。感染后，每天觀察小鼠的臨床癥狀，包括體溫、體重變化、呼吸狀況、精神狀態(tài)等，并做好詳細(xì)記錄。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)（如第3天、第5天、第7天等），采集小鼠的血液、肺組織等樣本，用于后續(xù)的檢測(cè)和分析，如檢測(cè)血液中的病毒抗體水平、肺組織中的病毒載量以及免疫細(xì)胞的變化情況等。3.2.2信號(hào)通路阻斷與激活實(shí)驗(yàn)在腫瘤動(dòng)物模型中，為了阻斷TIGIT-PVR信號(hào)通路，采用腹腔注射抗TIGIT抗體或抗PVR抗體的方法。將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組8-10只小鼠。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射抗TIGIT抗體（如BioLegend公司的抗小鼠TIGIT抗體，劑量為5mg/kg）或抗PVR抗體（如R&DSystems公司的抗小鼠PVR抗體，劑量為5mg/kg），每周注射2-3次，連續(xù)注射2-3周；對(duì)照組小鼠則腹腔注射等量的同型對(duì)照抗體（如鼠IgG1同型對(duì)照抗體）。在注射過程中，嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)范進(jìn)行，避免感染。注射后，密切觀察小鼠的反應(yīng)，包括有無過敏、腹瀉、精神萎靡等不良反應(yīng)。同時(shí)，定期測(cè)量腫瘤體積，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，評(píng)估阻斷TIGIT-PVR信號(hào)通路對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。為了激活TIGIT-PVR信號(hào)通路，采用瘤內(nèi)注射重組PVR蛋白的方法。將重組PVR蛋白（如ProSpec公司的小鼠PVR重組蛋白）用無菌PBS緩沖液稀釋至合適濃度（如100μg/ml）。在無菌條件下，將小鼠麻醉后固定，用碘伏消毒腫瘤部位，然后用1ml注射器將稀釋后的重組PVR蛋白緩慢注射到腫瘤組織內(nèi)（每只小鼠注射0.1ml，含10μg重組PVR蛋白），每周注射1-2次，連續(xù)注射2-3周。對(duì)照組小鼠則瘤內(nèi)注射等量的無菌PBS緩沖液。注射后，同樣密切觀察小鼠的反應(yīng)和腫瘤生長(zhǎng)情況，定期測(cè)量腫瘤體積，分析激活TIGIT-PVR信號(hào)通路對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。在病毒感染動(dòng)物模型中，阻斷TIGIT-PVR信號(hào)通路的方法與腫瘤模型類似，通過腹腔注射抗TIGIT抗體或抗PVR抗體來實(shí)現(xiàn)。在小鼠流感病毒感染模型中，感染病毒后的第1天開始腹腔注射抗TIGIT抗體或抗PVR抗體，劑量和注射頻率與腫瘤模型相同。觀察小鼠的臨床癥狀改善情況，如體溫恢復(fù)正常的時(shí)間、體重增長(zhǎng)情況、呼吸狀況等，并與對(duì)照組進(jìn)行比較。同時(shí)，在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)采集小鼠的血液、肺組織等樣本，檢測(cè)病毒載量、細(xì)胞因子水平以及免疫細(xì)胞的變化，評(píng)估阻斷TIGIT-PVR信號(hào)通路對(duì)病毒感染的治療效果。激活TIGIT-PVR信號(hào)通路則通過鼻腔滴注重組TIGIT蛋白來實(shí)現(xiàn)。將重組TIGIT蛋白（如Abcam公司的小鼠TIGIT重組蛋白）用無菌PBS緩沖液稀釋至合適濃度（如50μg/ml）。在小鼠感染流感病毒后的第1天，將小鼠輕度麻醉，使用移液器將稀釋后的重組TIGIT蛋白緩慢滴入小鼠鼻腔（每側(cè)鼻腔滴入25μl，共50μl），每周滴注1-2次，連續(xù)滴注2-3周。對(duì)照組小鼠則鼻腔滴注等量的無菌PBS緩沖液。觀察小鼠的臨床癥狀變化，采集樣本進(jìn)行檢測(cè)，分析激活TIGIT-PVR信號(hào)通路對(duì)病毒感染進(jìn)程的影響。3.2.3細(xì)胞因子水平與免疫功能評(píng)估在腫瘤動(dòng)物模型中，采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清和腫瘤組織勻漿中NK細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的水平。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將小鼠麻醉后，通過心臟采血收集血液樣本，室溫靜置30分鐘后，3000rpm離心15分鐘，分離血清，保存于-80℃冰箱備用。同時(shí)，取出腫瘤組織，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)，然后將腫瘤組織剪成小塊，放入組織勻漿器中，加入適量的含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液，在冰上充分勻漿，使組織完全裂解。將勻漿液在4℃下12000rpm離心15分鐘，取上清液，保存于-80℃冰箱備用。根據(jù)所要檢測(cè)的細(xì)胞因子種類（如IFN-γ、TNF、GM-CSF等），選擇相應(yīng)的ELISA試劑盒（如R&DSystems公司的小鼠IFN-γELISA試劑盒、小鼠TNFELISA試劑盒等），按照試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中細(xì)胞因子的濃度。采用流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟和腫瘤組織中NK細(xì)胞的比例和功能狀態(tài)。取出小鼠的脾臟和腫瘤組織，將脾臟剪成小塊，用70μm細(xì)胞篩網(wǎng)研磨，制成單細(xì)胞懸液；將腫瘤組織用剪刀剪碎后，加入含有膠原酶和DNaseI的消化液，37℃消化30-60分鐘，期間輕輕振蕩，使組織充分消化，然后通過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液用PBS緩沖液洗滌2-3次，去除雜質(zhì)和死細(xì)胞，然后用含有0.5%BSA和2mMEDTA的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?個(gè)/ml。取適量細(xì)胞懸液，加入熒光標(biāo)記的抗NK細(xì)胞表面標(biāo)志物抗體（如抗CD3、抗CD56、抗NKp46等抗體），4℃避光孵育30-60分鐘，使抗體與細(xì)胞表面的標(biāo)志物特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，去除未結(jié)合的抗體，然后將細(xì)胞重懸于含有1%多聚甲醛的PBS緩沖液中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。通過分析不同熒光通道的信號(hào)，確定NK細(xì)胞的比例和表型特征，同時(shí)還可以檢測(cè)NK細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子（如IFN-γ、TNF等）的表達(dá)情況，評(píng)估NK細(xì)胞的功能狀態(tài)。在病毒感染動(dòng)物模型中，同樣采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清和肺組織勻漿中NK細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的水平。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，如第3天、第5天、第7天等，將小鼠麻醉后心臟采血收集血液樣本，處理方法與腫瘤模型相同。同時(shí)，取出肺組織，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)，然后將肺組織剪成小塊，放入組織勻漿器中，加入適量的含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液，在冰上充分勻漿，使組織完全裂解。將勻漿液在4℃下12000rpm離心15分鐘，取上清液，保存于-80℃冰箱備用。選擇相應(yīng)的ELISA試劑盒，按照說明書操作步驟檢測(cè)細(xì)胞因子濃度。采用流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟和肺組織中NK細(xì)胞的比例和功能狀態(tài)。取出小鼠的脾臟和肺組織，將脾臟制成單細(xì)胞懸液的方法與腫瘤模型相同。將肺組織用剪刀剪碎后，加入含有膠原酶和DNaseI的消化液，37℃消化30-60分鐘，期間輕輕振蕩，使組織充分消化，然后通過70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液。后續(xù)的細(xì)胞洗滌、抗體標(biāo)記和流式細(xì)胞儀檢測(cè)步驟與腫瘤模型一致。通過分析不同熒光通道的信號(hào)，確定NK細(xì)胞的比例和表型特征，檢測(cè)NK細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)情況，評(píng)估NK細(xì)胞在病毒感染過程中的功能變化。四、TIGIT-PVR信號(hào)調(diào)控NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的分子機(jī)制4.1基于ITIM結(jié)構(gòu)域的信號(hào)傳導(dǎo)TIGIT的ITIM結(jié)構(gòu)域在TIGIT-PVR信號(hào)調(diào)控NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的分子機(jī)制中起著核心作用。ITIM結(jié)構(gòu)域作為一種保守的氨基酸序列，廣泛存在于多種免疫抑制性受體中，其特征性的序列為TxYxxL（T代表蘇氨酸，Y代表酪氨酸，L代表亮氨酸，x代表任意氨基酸）。在TIGIT的胞內(nèi)段，ITIM結(jié)構(gòu)域的存在賦予了TIGIT抑制NK細(xì)胞活化的關(guān)鍵功能。當(dāng)TIGIT與PVR結(jié)合時(shí)，TIGIT的構(gòu)象發(fā)生改變，這一變化激活了Src家族激酶，使得ITIM結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸殘基（Y）發(fā)生磷酸化。磷酸化后的ITIM結(jié)構(gòu)域在后續(xù)的信號(hào)傳導(dǎo)過程中扮演著至關(guān)重要的角色，它成為了下游含有SH2結(jié)構(gòu)域蛋白的特異性結(jié)合位點(diǎn)。含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白在TIGIT-PVR信號(hào)傳導(dǎo)中起著橋梁的作用，它們通過其SH2結(jié)構(gòu)域與磷酸化的ITIM結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，從而被招募到TIGIT的信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物中。SHP-1和SHP-2是這類蛋白中的典型代表，它們?cè)贜K細(xì)胞中廣泛表達(dá)，并且在TIGIT-PVR信號(hào)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用。以SHP-1為例，它是一種非受體蛋白酪氨酸磷酸酶，當(dāng)它被招募到磷酸化的TIGIT附近時(shí)，其磷酸酶活性被激活，能夠?qū)K細(xì)胞活化信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子進(jìn)行去磷酸化修飾。在NK細(xì)胞的活化過程中，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路起著重要的調(diào)節(jié)作用。PI3K能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3進(jìn)而激活A(yù)kt，促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖、存活和細(xì)胞因子分泌等功能。然而，當(dāng)TIGIT-PVR信號(hào)通路被激活時(shí)，SHP-1被招募到TIGIT附近，它可以作用于PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85，去除p85上的磷酸基團(tuán)，使PI3K失去活性，無法催化PIP2生成PIP3，從而阻斷了PI3K/Akt信號(hào)通路的傳導(dǎo)，抑制了NK細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路也是NK細(xì)胞活化的重要信號(hào)途徑，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多個(gè)分支。在正常情況下，這些信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的分泌。當(dāng)TIGIT-PVR信號(hào)通路激活后，SHP-1和SHP-2能夠?qū)APK信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子進(jìn)行去磷酸化修飾，抑制信號(hào)傳導(dǎo)。SHP-2可以作用于MEK，使其去磷酸化，MEK是ERK的上游激酶，MEK的失活導(dǎo)致ERK無法被激活，從而阻斷了MAPK信號(hào)通路，抑制了NK細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌。通過對(duì)這些關(guān)鍵信號(hào)通路的抑制，TIGIT的ITIM結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)最終導(dǎo)致NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的減少，使得NK細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能受到抑制，在腫瘤免疫逃逸和病毒感染等病理過程中，這一機(jī)制為病原體和腫瘤細(xì)胞的生存和發(fā)展提供了有利條件。4.2SHP-1/SHP-2磷酸酶的參與SHP-1和SHP-2磷酸酶在TIGIT-PVR信號(hào)調(diào)控NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，它們是TIGIT-PVR信號(hào)通路下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子。SHP-1，全稱Srchomology2domain-containingproteintyrosinephosphatase1，是一種非受體蛋白酪氨酸磷酸酶，由PTPN6基因編碼，主要表達(dá)于造血系統(tǒng)細(xì)胞，包括NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等。其結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)磷酸酶催化結(jié)構(gòu)域，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了SHP-1特異性識(shí)別和結(jié)合磷酸化酪氨酸殘基的能力，以及對(duì)底物進(jìn)行去磷酸化修飾的活性。SHP-2同樣屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族，由PTPN11基因編碼，在多種細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)。它也含有兩個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)磷酸酶結(jié)構(gòu)域，雖然與SHP-1在結(jié)構(gòu)上有相似之處，但在底物特異性和生物學(xué)功能上存在一定差異。當(dāng)TIGIT與PVR結(jié)合后，TIGIT胞內(nèi)段的ITIM結(jié)構(gòu)域發(fā)生磷酸化，磷酸化的ITIM結(jié)構(gòu)域成為了SHP-1和SHP-2的招募位點(diǎn)。SHP-1和SHP-2通過其SH2結(jié)構(gòu)域與磷酸化的ITIM緊密結(jié)合，被招募到TIGIT信號(hào)復(fù)合物附近，從而參與到TIGIT-PVR信號(hào)傳導(dǎo)過程中。研究表明，在NK細(xì)胞中，SHP-1和SHP-2與磷酸化TIGIT的結(jié)合具有時(shí)間和劑量依賴性。在TIGIT-PVR信號(hào)激活初期，SHP-1和SHP-2迅速與磷酸化TIGIT結(jié)合，且結(jié)合量隨著TIGIT-PVR信號(hào)強(qiáng)度的增加而增多。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)可以清晰地觀察到，在TIGIT-PVR信號(hào)激活后，SHP-1和SHP-2與TIGIT形成穩(wěn)定的復(fù)合物，這種復(fù)合物的形成是SHP-1和SHP-2發(fā)揮功能的前提條件。被招募的SHP-1和SHP-2通過對(duì)下游信號(hào)分子的去磷酸化修飾，抑制NK細(xì)胞的活化信號(hào)通路，進(jìn)而減少NK細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌。在NK細(xì)胞的活化過程中，多個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路參與其中，如PI3K/Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路等。PI3K/Akt信號(hào)通路在NK細(xì)胞的存活、增殖和細(xì)胞因子分泌中起著重要作用。PI3K能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使Akt募集到細(xì)胞膜上，并在其他激酶的作用下發(fā)生磷酸化激活。激活的Akt可以進(jìn)一步激活下游的mTOR等分子，促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子分泌。當(dāng)TIGIT-PVR信號(hào)通路激活后，SHP-1被招募到TIGIT附近，它能夠特異性地作用于PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85，去除p85上的磷酸基團(tuán)，使PI3K失去活性，無法催化PIP2生成PIP3。這就導(dǎo)致Akt無法被激活，下游的mTOR等分子也無法發(fā)揮作用，從而抑制了NK細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子分泌。MAPK信號(hào)通路包括ERK、JNK和p38MAPK等多個(gè)分支，在NK細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌中也發(fā)揮著重要作用。以ERK信號(hào)通路為例，當(dāng)NK細(xì)胞受到刺激時(shí)，上游的Ras蛋白被激活，激活的Ras與Raf蛋白結(jié)合，使Raf蛋白活化。活化的Raf進(jìn)一步磷酸化激活MEK，MEK再磷酸化激活ERK。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)NK細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌。當(dāng)TIGIT-PVR信號(hào)通路激活后，SHP-2被招募到TIGIT附近，它能夠作用于MEK，使其去磷酸化，MEK的失活導(dǎo)致ERK無法被激活。這就阻斷了MAPK信號(hào)通路，抑制了NK細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌。通過對(duì)這些關(guān)鍵信號(hào)通路的抑制，SHP-1和SHP-2在TIGIT-PVR信號(hào)調(diào)控NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的過程中發(fā)揮了重要的負(fù)調(diào)控作用。4.3與其他信號(hào)通路的交互作用TIGIT-PVR信號(hào)通路并非孤立存在，而是與其他多種信號(hào)通路相互交織、協(xié)同作用，共同調(diào)控NK細(xì)胞的功能。其中，與核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路的交互作用尤為關(guān)鍵。NF-κB是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡等過程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。在NK細(xì)胞中，NF-κB信號(hào)通路的激活通常會(huì)促進(jìn)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，增強(qiáng)NK細(xì)胞的免疫活性。當(dāng)NK細(xì)胞受到病原體或腫瘤細(xì)胞刺激時(shí)，細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（PRRs）會(huì)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）或腫瘤相關(guān)抗原，激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)分子，如MyD88、TRAF6等，進(jìn)而激活I(lǐng)KK復(fù)合體。IKK復(fù)合體磷酸化IκB蛋白，使其降解，釋放出NF-κB二聚體，后者進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)IFN-γ、TNF等細(xì)胞因子的合成和分泌，增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗病毒和抗腫瘤能力。TIGIT-PVR信號(hào)通路的激活會(huì)對(duì)NF-κB信號(hào)通路產(chǎn)生抑制作用，從而影響NK細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌。當(dāng)TIGIT與PVR結(jié)合后，通過招募SHP-1和SHP-2磷酸酶，抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。研究表明，SHP-1和SHP-2可以作用于NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，如IKK復(fù)合體和IκB蛋白等。SHP-1能夠使IKK復(fù)合體中的IKKα和IKKβ去磷酸化，抑制其激酶活性，從而阻斷IκB蛋白的磷酸化和降解，使NF-κB二聚體無法釋放并進(jìn)入細(xì)胞核，抑制了細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，減少了NK細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的PVR與NK細(xì)胞表面的TIGIT結(jié)合，激活TIGIT-PVR信號(hào)通路，導(dǎo)致SHP-1和SHP-2對(duì)NF-κB信號(hào)通路的抑制作用增強(qiáng)，使得NK細(xì)胞無法有效分泌細(xì)胞因子，腫瘤細(xì)胞得以逃避NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路也是與TIGIT-PVR信號(hào)通路密切相關(guān)的重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑。MAPK信號(hào)通路包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多個(gè)分支，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡以及免疫應(yīng)答等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在NK細(xì)胞中，MAPK信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)細(xì)胞因子的合成和分泌，增強(qiáng)NK細(xì)胞的免疫功能。當(dāng)NK細(xì)胞受到刺激時(shí)，上游的Ras蛋白被激活，激活的Ras與Raf蛋白結(jié)合，使Raf蛋白活化?；罨腞af進(jìn)一步磷酸化激活MEK，MEK再磷酸化激活ERK。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)NK細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌。TIGIT-PVR信號(hào)通路與MAPK信號(hào)通路之間存在復(fù)雜的交互作用。當(dāng)TIGIT-PVR信號(hào)通路激活后，SHP-1和SHP-2被招募到TIGIT附近，它們能夠作用于MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，抑制信號(hào)傳導(dǎo)。SHP-2可以作用于MEK，使其去磷酸化，MEK的失活導(dǎo)致ERK無法被激活。這就阻斷了MAPK信號(hào)通路，抑制了NK細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌。在病毒感染過程中，病毒感染細(xì)胞表面表達(dá)的PVR與NK細(xì)胞表面的TIGIT結(jié)合，激活TIGIT-PVR信號(hào)通路，通過抑制MAPK信號(hào)通路，降低NK細(xì)胞分泌IFN-γ等抗病毒細(xì)胞因子的能力，使得病毒能夠在體內(nèi)持續(xù)感染和復(fù)制。TIGIT-PVR信號(hào)通路與NF-κB、MAPK等信號(hào)通路的交互作用，共同調(diào)節(jié)著NK細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌，對(duì)機(jī)體的免疫平衡和免疫應(yīng)答產(chǎn)生重要影響。五、TIGIT-PVR信號(hào)調(diào)控NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的臨床意義5.1在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用前景腫瘤免疫治療旨在激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來對(duì)抗腫瘤，近年來取得了顯著進(jìn)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如腫瘤的免疫逃逸和治療耐藥性等問題。TIGIT-PVR信號(hào)通路在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，因此，阻斷該信號(hào)通路有望成為增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤活性的新策略，為腫瘤免疫治療帶來新的希望。研究表明，腫瘤細(xì)胞常通過上調(diào)PVR的表達(dá)，與NK細(xì)胞表面的TIGIT結(jié)合，激活TIGIT-PVR信號(hào)通路，抑制NK細(xì)胞的活性，包括細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒性，從而逃避NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷。在多種腫瘤中，如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤等，腫瘤細(xì)胞表面PVR的高表達(dá)與NK細(xì)胞功能抑制以及患者預(yù)后不良密切相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌患者中，腫瘤組織中PVR的表達(dá)水平與NK細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，高表達(dá)PVR的腫瘤患者，其NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌能力明顯降低，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加，患者的總生存期縮短。基于上述發(fā)現(xiàn)，阻斷TIGIT-PVR信號(hào)通路成為增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤活性的重要研究方向。通過使用抗TIGIT抗體或抗PVR抗體，可以阻斷TIGIT與PVR的結(jié)合，解除TIGIT-PVR信號(hào)對(duì)NK細(xì)胞的抑制作用，從而增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗腫瘤活性。臨床前研究已經(jīng)證實(shí)，抗TIGIT抗體或抗PVR抗體能夠顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，促進(jìn)NK細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF等細(xì)胞因子，激活和調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞，共同發(fā)揮抗腫瘤作用。在小鼠腫瘤模型中，給予抗TIGIT抗體治療后，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng)，腫瘤組織中IFN-γ和TNF的表達(dá)水平顯著升高，腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，小鼠的生存期明顯延長(zhǎng)。目前，多項(xiàng)針對(duì)TIGIT-PVR信號(hào)通路的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，旨在評(píng)估其在腫瘤免疫治療中的安全性和有效性。這些試驗(yàn)涵蓋了多種腫瘤類型，包括非小細(xì)胞肺癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤等，治療方案主要包括TIGIT抗體單藥治療、TIGIT抗體與其他免疫治療藥物（如PD-1/PD-L1抑制劑、CTLA-4抑制劑等）聯(lián)合治療，以及TIGIT抗體與化療、放療等傳統(tǒng)治療方法聯(lián)合治療等。羅氏公司的Tiragolumab是一種抗TIGIT單克隆抗體，在一項(xiàng)針對(duì)PD-L1高表達(dá)的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者的II期臨床試驗(yàn)中，Tiragolumab聯(lián)合阿替利珠單抗（一種PD-L1抑制劑）治療，與阿替利珠單抗單藥治療相比，客觀緩解率（ORR）顯著提高（69%vs24%），無進(jìn)展生存期（PFS）也明顯延長(zhǎng)。雖然該聯(lián)合療法在III期臨床試驗(yàn)中部分結(jié)果未達(dá)預(yù)期，但仍為TIGIT-PVR信號(hào)通路在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用提供了重要的參考依據(jù)。除了抗體治療，小分子抑制劑也在TIGIT-PVR信號(hào)通路的研究中展現(xiàn)出潛力。一些小分子化合物能夠特異性地抑制TIGIT-PVR信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟，從而阻斷信號(hào)傳導(dǎo)，增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗腫瘤活性。與抗體藥物相比，小分子抑制劑具有分子量小、易于合成、生產(chǎn)成本低、組織穿透性好等優(yōu)點(diǎn)，有望成為腫瘤免疫治療的新選擇。目前，針對(duì)TIGIT-PVR信號(hào)通路的小分子抑制劑仍處于研發(fā)階段，需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證其有效性和安全性。5.2在病毒感染性疾病中的研究?jī)r(jià)值病毒感染性疾病嚴(yán)重威脅人類健康，從常見的流感病毒、乙肝病毒到近年來肆虐全球的新冠病毒，這些病毒感染引發(fā)的疾病給社會(huì)和個(gè)人帶來了沉重負(fù)擔(dān)。在病毒感染過程中，NK細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)的重要成員，發(fā)揮著至關(guān)重要的抗病毒作用。NK細(xì)胞能夠迅速識(shí)別并殺傷被病毒感染的細(xì)胞，同時(shí)分泌多種細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF等，這些細(xì)胞因子不僅可以直接抑制病毒的復(fù)制，還能激活其他免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫應(yīng)答。在乙肝病毒感染中，NK細(xì)胞分泌的IFN-γ可以抑制乙肝病毒的復(fù)制，同時(shí)激活T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞對(duì)被感染肝細(xì)胞的殺傷作用，從而有效控制病毒感染。TIGIT-PVR信號(hào)通路在病毒感染過程中對(duì)NK細(xì)胞的功能產(chǎn)生重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，在慢性病毒感染中，如HIV、HBV、HCV等病毒感染，TIGIT在NK細(xì)胞表面的表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)病毒感染細(xì)胞表面的PVR表達(dá)也增加，導(dǎo)致TIGIT-PVR信號(hào)通路激活。這種激活會(huì)抑制NK細(xì)胞的功能，包括細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒性，使得病毒能夠逃避NK細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷，在體內(nèi)持續(xù)感染和復(fù)制。在HIV感染中，HIV病毒感染的免疫細(xì)胞表面PVR表達(dá)上調(diào)，與NK細(xì)胞表面的TIGIT結(jié)合，激活TIGIT-PVR信號(hào)通路，導(dǎo)致NK細(xì)胞分泌IFN-γ等抗病毒細(xì)胞因子的能力下降，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性也受到抑制，使得HIV能夠在體內(nèi)持續(xù)感染，破壞免疫系統(tǒng)。阻斷TIGIT-PVR信號(hào)通路為病毒感染性疾病的治療提供了新的策略。通過使用抗TIGIT抗體或抗PVR抗體阻斷TIGIT-PVR信號(hào)通路，可以解除對(duì)NK細(xì)胞的抑制，增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗病毒活性，促進(jìn)NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，從而有效控制病毒感染。臨床前研究表明，在小鼠流感病毒感染模型中，給予抗TIGIT抗體治療后，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng)，肺組織中IFN-γ和TNF的表達(dá)水平顯著升高，病毒載量明顯降低，小鼠的臨床癥狀得到明顯改善。這表明阻斷TIGIT-PVR信號(hào)通路能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗病毒能力，減輕病毒感染對(duì)機(jī)體的損傷。在新冠病毒感染中，TIGIT-PVR信號(hào)通路也可能發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，新冠病毒感染患者的NK細(xì)胞表面TIGIT表達(dá)上調(diào)，且TIGIT的表達(dá)與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。重癥新冠患者的NK細(xì)胞表面TIGIT表達(dá)水平明顯高于輕癥患者，同時(shí)NK細(xì)胞的功能受到抑制，細(xì)胞因子分泌減少。這提示阻斷TIGIT-PVR信號(hào)通路可能成為治療新冠病毒感染的新方法。目前，雖然針對(duì)新冠病毒感染的TIGIT-PVR信號(hào)通路阻斷治療的臨床試驗(yàn)尚未廣泛開展，但已有研究團(tuán)隊(duì)開始進(jìn)行相關(guān)探索，有望為新冠病毒感染的治療提供新的思路和方法。5.3潛在的治療策略與挑戰(zhàn)基于對(duì)TIGIT-PVR信號(hào)調(diào)控NK細(xì)胞細(xì)胞因子分泌機(jī)制的深入研究，開發(fā)針對(duì)該信號(hào)通路的靶向治療藥物成為極具潛力的治療策略。目前，抗體類藥物在這一領(lǐng)域展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)?？筎IGIT抗體能夠特異性地與TIGIT結(jié)合，阻斷TIGIT與PVR的相互作用，從而解除TIGIT-PVR信號(hào)對(duì)NK細(xì)胞的抑制作用。如羅氏公司開發(fā)的Tiragolumab，在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中被用于治療非小細(xì)胞肺癌等腫瘤。在早期的臨床試驗(yàn)中，Tiragolumab聯(lián)合PD-L1抗體阿替利珠單抗治療PD-L1高表達(dá)的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者，相較于阿替利珠單抗單藥治療，客觀緩解率（ORR）顯著提高，達(dá)到了69%，而單藥治療組僅為24%，這表明抗TIGIT抗體在增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤活性方面具有顯著效果。除了抗TIGIT抗體，抗PVR抗體同樣可以通過阻斷PVR與TIGIT的結(jié)合，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。在病毒感染性疾病的研究中，抗PVR抗體能夠阻斷TIGIT-PVR信號(hào)通路，增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗病毒活性，促進(jìn)NK細(xì)胞分泌IFN-γ等抗病毒細(xì)胞因子，從而有效控制病毒感染。在小鼠流感病毒感染模型中，給予抗PVR抗體治療后，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng)，肺組織中IFN-γ的表達(dá)水平顯著升高，病毒載量明顯降低，小鼠的臨床癥狀得到明顯改善。小分子抑制劑也是TIGIT-PVR信號(hào)通路靶向治療的重要方向。小分子抑制劑能夠特異性地抑制TIGIT-PVR信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟，具有分子量小、易于合成、生產(chǎn)成本低、組織穿透性好等優(yōu)點(diǎn)。一些小分子可以抑制TIGIT胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的磷酸化，阻斷下游信號(hào)的傳導(dǎo)，從而增強(qiáng)NK細(xì)胞的功能。目前，針對(duì)TIGIT-PVR信號(hào)通路的小分子抑制劑仍處于研發(fā)階段，需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證其有效性和安全性。聯(lián)合治療策略也是未來TIGIT-PVR信號(hào)通路治療的重要發(fā)展方向。將針對(duì)TIGIT-PVR信號(hào)通路的治療與其他免疫治療方法（如PD-1/PD-L1抑制劑、CTLA-4抑制劑等）聯(lián)合應(yīng)用，可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)免疫治療效果。在腫瘤治療中，TIGIT抗體與PD-1抑制劑聯(lián)合使用，可以同時(shí)阻斷兩條免疫抑制信號(hào)通路，更全面地激活免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)NK細(xì)胞和T細(xì)胞的抗腫瘤活性。在病毒感染性疾病治療中，聯(lián)合治療策略可以綜合發(fā)揮不同藥物的作用，提高治療效果。在新冠病毒感染的治療探索中，將TIGIT-PVR信號(hào)通路阻斷劑與抗病毒藥物聯(lián)合使用，有望增強(qiáng)抗病毒效果，減輕病毒感染對(duì)機(jī)體的損傷。然而，靶向TIGIT-PVR信號(hào)通路的治療策略在臨床應(yīng)用中也面臨諸多挑戰(zhàn)。TIGIT-PVR信號(hào)通路在免疫系統(tǒng)中具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，阻斷該信號(hào)通路可能會(huì)導(dǎo)致免疫激活過度，引發(fā)自身免疫性疾病等不良反應(yīng)。在一些臨床試驗(yàn)中，使用抗TIGIT抗體治療的患者出現(xiàn)了不同程度的免疫相關(guān)不良事件，如皮疹、甲狀腺功能異常、結(jié)腸炎等。TIGIT-PVR信號(hào)通路的激活和調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，不同個(gè)體之間存在差異，這可能導(dǎo)致治療效果的個(gè)體差異較大。腫瘤患者的腫瘤微環(huán)境、免疫狀態(tài)以及基因背景等因素都可能影響TIGIT-PVR信號(hào)通路的活性和治療反應(yīng)，如何準(zhǔn)確篩選出能夠從治療