EcN白皮書中文版本一、EcN名詞解釋 1二、EcN簡介及使用歷史 2三、EcN的應(yīng)用場(chǎng)景 8四、EcN研究課題組概覽 五、EcN相關(guān)改造方法 六、近五年iGEM中EcN相關(guān)項(xiàng)目 20七、目前在研的EcN臨床藥物與進(jìn)度 46八、EcN遞送策略分析 47九、部分細(xì)菌治療改造與EcN對(duì)比 十、細(xì)菌療法相關(guān)政策 60十一、EcN行業(yè)市場(chǎng)重點(diǎn)公司概況 十二、中國EcN發(fā)展前景預(yù)估 十三、EcN相關(guān)療法副作用及生物安全性展望 67十四、各隊(duì)使用EcN項(xiàng)目介紹 1一、EcN名詞解釋大腸桿菌（Escherichiacoli）作為最主要的工業(yè)生產(chǎn)菌株之一，有著悠久的研究歷史，遺傳背景清晰、便于進(jìn)行基因操作，在科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用。然而，大多數(shù)大腸桿菌菌株是條件性病原體，其應(yīng)用在一定程度上受到局限，而大腸桿菌Nissle1917（EcN）的發(fā)現(xiàn)為大腸桿菌的研究提供了更多可能[1]。EcN，全稱EscherichiacoliNissle1917，以其發(fā)明者AlfredNissle的名字命名。EcN是一種無致病性的大腸桿菌，對(duì)血清敏感且易被血清清除，經(jīng)研究證實(shí)具有缺乏毒力因子、產(chǎn)生特殊的適應(yīng)因子以及加強(qiáng)腸道天然屏障作用等益生菌特性[2]，預(yù)防感染性腹瀉和免疫調(diào)節(jié)中得到廣泛應(yīng)用。2EcN的發(fā)現(xiàn)可追溯到第一次世界大戰(zhàn)期間，德國的醫(yī)生和細(xì)菌學(xué)家阿爾弗雷德·尼斯?fàn)枺ˋlfredNissle）在多布魯卡前線未受痢疾（志賀氏菌?。┍l(fā)影響的兩名士兵的糞便中分離出了一株非致病性大腸桿菌[3]，該菌株能夠在腸道中生存并且能夠抑制病原菌的定植、維持腸道健康。這一菌株以AlfredNissle博士的名字命名，也因其發(fā)現(xiàn)年份為1917年，因此該菌株被名為Nissle1917。EcN對(duì)血清敏感，不產(chǎn)生任何與致病性大腸桿菌菌株相關(guān)的腸毒素或細(xì)胞毒素，具有抑制病原微生物、生物膜形成及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能，不僅可用于傳染性疾病，還可用于腹瀉和潰瘍性結(jié)腸炎等腸胃疾病的治療[4]。在過去的幾十年中，EcN的微生物特性以及分子遺傳背景已得到詳細(xì)闡釋。1.微生物特征EcN是一種典型的革蘭氏陰性菌，其外細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中含有脂多糖（LPS）成分。在分子方面，EcN的LPS不同于其他所有類型的大腸桿菌。例如，在EcN中LPS的O6多糖側(cè)鏈很短，只包含一個(gè)O6抗原的低聚糖構(gòu)建塊構(gòu)成的重復(fù)單元；該分子的低聚糖核心片段中發(fā)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌LPS的修飾。LPS的特殊結(jié)構(gòu)可能為EcN表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)作用而并非免疫毒性作用作出了解釋[5]。EcN對(duì)血清具有敏感性。在許多腸外致病性大腸桿菌中存在所謂的“膠囊”結(jié)構(gòu)，能使其免受血清中非特異性防御成分的攻擊，使細(xì)菌獲得對(duì)血清的耐藥性，從而延長其在血液中的存活時(shí)間并增強(qiáng)病原體毒性[6]。EcN菌株則與此相反，當(dāng)其存在于人血清或者其他哺乳動(dòng)物（牛和豬血清）中時(shí)，會(huì)由于其自身的血清敏感性而被迅速殺死[7]。EcN會(huì)產(chǎn)生特定的固定性因子。致病菌中含有由染色體特殊DNA序列（致病性島[8]，pathogenicityislands，簡稱為PAIs)編碼的毒力因子，從而提高菌株的感染能力。而在EcN中也檢測(cè)到不同的固定性因子，其作用是增強(qiáng)EcN與腸道中其他菌株的競爭能力，并提升其在腸道中的生存能力，促進(jìn)與宿主進(jìn)行的有效溝通，這些因子則由染色體特殊DNA序列（基因島[9]，genomicislands,簡稱為GEIs)編碼。3作為一種典型的大腸桿菌，研究者們對(duì)EcN菌株特有的代謝能力和發(fā)酵特性進(jìn)行了生物化學(xué)分析，并進(jìn)行一系列生化測(cè)試。結(jié)果表明，除了能代謝精氨酸外，EcN具備典型的大腸桿菌的代謝特性。對(duì)廢培養(yǎng)上清液進(jìn)行氣相色譜分析[10]，結(jié)果表明，在有氧和厭氧生長條件下，EcN產(chǎn)生短鏈脂肪酸最為碳水化合物的代謝終產(chǎn)物。大腸桿菌包括腸致病性和腸外致病性兩種，因此Nissle菌株在毒理學(xué)和生物安全方面受到特別關(guān)注。而在腸桿菌科的益生菌選擇原則中，益生菌候選菌不能表現(xiàn)出出致病性粘附因子，也不能形成腸毒素和細(xì)胞毒素或入侵上皮細(xì)胞也不應(yīng)攜帶腸外致病性大腸桿菌的典型毒力因子，如產(chǎn)生血清耐藥性或溶血素，也不能表現(xiàn)出尿致病性或引起免疫毒性作用。EcN菌株不產(chǎn)生任何與致病性大腸桿菌菌株相關(guān)的毒素，如熱不穩(wěn)定腸毒素（H-LT）、熱穩(wěn)定腸毒素（H-ST）、細(xì)胞毒素（如細(xì)胞毒性壞死因子、CNF1）或志賀類毒素（SLTI、SLTII）。經(jīng)研究證明，EcN不具有產(chǎn)生上述毒素的遺傳信息[11]。2.分子遺傳背景非致病性大腸桿菌與腸、腸外致病性大腸桿菌中存在不同的染色體區(qū)域，而目前在EcN中檢測(cè)到5個(gè)大的基因組島和一些小的基因組島，攜帶編碼EcN中特殊固定性因子的基因組島[12]。導(dǎo)致EcN產(chǎn)生益生菌特性的重要原因可能是毒力因子的缺乏，包括α-溶血素、p-菌毛黏附素和結(jié)合固定性因子表達(dá)的半粗糙脂多糖表型[13]等。Figure1.大腸桿菌Nissle1917（EcN）的功能基因組圖譜[12]4EcN含有兩個(gè)小的隱形質(zhì)粒，分別命名為pMUT1和pMUT2[14]。兩者均基因穩(wěn)定且不 可轉(zhuǎn)移到其他大腸桿菌中，目前已被完全測(cè)序[15]。目前尚未在其他大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)這兩個(gè) 隱形質(zhì)粒，可作為鑒定EcN菌株的方法。盡管這些隱形質(zhì)粒在EcN中的功能尚不明確，但有證據(jù)表明，隱形質(zhì)粒本身可能起到保護(hù)載體細(xì)菌免受噬菌體等可移動(dòng)遺傳元件攻擊的作用，從而影響菌株的遺傳穩(wěn)定性[16]。3.EcN的使用歷史1917年，AlfredNissle從一名德國士兵的糞便中分離出了EcN，并通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定發(fā)現(xiàn)其對(duì)不同致病性大腸桿菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的拮抗活性，這是EcN第一次進(jìn)入到科學(xué)領(lǐng)域的研究中。在過去的100年中，EcN菌株一直被用作在德國和其他幾個(gè)國家銷售的一種許可藥品的藥物活性成分[17]。近幾十年以來，隨著EcN研究的不斷深入，科學(xué)家們?cè)贓cN中不斷發(fā)現(xiàn)新的益生菌活性，EcN在益生菌領(lǐng)域的應(yīng)用不斷擴(kuò)大，在疾病治療中也得到許多重要的應(yīng)用。Nissle首次發(fā)現(xiàn)并分離EcN菌株后，將收集到的菌株在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)。他先將菌株置于大瓊脂平板上培養(yǎng)，再將菌株裝在明膠膠囊中用蠟或者石蠟密封，用于治療個(gè)別患者的疾病。他于1917年向當(dāng)時(shí)現(xiàn)存的柏林帝國專利局申請(qǐng)并獲得了Mutaflor商標(biāo)的專利。Mutaflor一詞源于拉丁語中的變異和菌株，展示了EcN通過拮抗作用影響腸道菌群的能力。為大量生產(chǎn)該藥物滿足更多患者的需求，Nissle首先選擇G.Pohl公司進(jìn)行菌株制劑的生產(chǎn)，該公司具有生產(chǎn)明膠膠囊的特殊經(jīng)驗(yàn)。1932年，Nissle將菌株的生產(chǎn)許可轉(zhuǎn)移給了位于的柏林的Hageda公司。1944年，生產(chǎn)設(shè)備在戰(zhàn)爭中被炸彈摧毀。戰(zhàn)后，Hageda公司修重建了生產(chǎn)設(shè)備并恢復(fù)了Mutaflor的生產(chǎn)。一直以來，Nissle都提供EcN菌株的傳代培養(yǎng)作為Mutaflor制劑的發(fā)酵劑，直到他1965年11月去世。后來，EcN菌株被保存在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)收集處的工業(yè)使用菌株中，被命名為E.coliDSM6601。Figure2.大腸桿菌Nissle1917與腸道菌群和宿主的相互作用[17]520世紀(jì)30年代到40年代，EcN實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品化生產(chǎn)并得到普及，尤其是在德國和歐洲各國，EcN相關(guān)產(chǎn)品逐漸商業(yè)化。隨著EcN的研究不斷深入，科學(xué)研究開始頻繁討論作為早期益生菌例子的EcN對(duì)腸道健康的益處，并在臨床應(yīng)用中得到認(rèn)可。20世紀(jì)后期，研究者們深入研究與制定標(biāo)準(zhǔn)臨床試驗(yàn)。在70年代和80年代，針對(duì)EcN的對(duì)照臨床試驗(yàn)開始增多，研究者們證實(shí)其在消化系統(tǒng)疾病（如IBD、便秘和腹瀉等）中具有積極作用[17]。進(jìn)入21世紀(jì)，EcN的功能和機(jī)制得到了更多關(guān)注，研究者們探討其在免疫調(diào)節(jié)、劇烈腹瀉及其它胃腸道疾病中的潛在療效。作為益生菌的代表之一，EcN被納入多種保健食品和膳食補(bǔ)充劑中，面向大眾市場(chǎng)。研究者們?cè)谘芯恐羞€發(fā)現(xiàn)EcN在疫苗開發(fā)中的潛在效用，主要是在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)方面。減毒細(xì)菌或病毒被用作疫苗時(shí)，通過將必需的抗原呈遞給免疫系統(tǒng)來啟動(dòng)保護(hù)性免疫反應(yīng)，而從理論上來說，使用轉(zhuǎn)基因益生菌能夠增強(qiáng)上述作用。EcN還廣泛用于診斷和藥物開發(fā)。EcN在小鼠中具有腫瘤特異性定植特性，因此在臨床研究中已被用于診斷實(shí)體瘤。在最近的研究中，研究者們?cè)噲D對(duì)EcN進(jìn)行工程改造，以增強(qiáng)其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力，并提高其在診斷和治療應(yīng)用中的效用[18]。21世紀(jì)以來，EcN功能和機(jī)制的研究不斷完善，在此基礎(chǔ)上，研究者們將目光轉(zhuǎn)向EcN的免疫調(diào)節(jié)特性，并將其應(yīng)用在相關(guān)腸道疾病中。腸道炎癥研究的主要任務(wù)是開發(fā)能夠精確靶向腸道黏膜的新治療方法，而轉(zhuǎn)基因細(xì)菌可作為局部抗原進(jìn)入腸道的良好載體，但其生物安全性也至關(guān)重要。經(jīng)研究證實(shí)，EcN具有作為重組蛋白靶向到腸道黏膜的安全載體的潛力。研究者們?cè)谝粋€(gè)明確且敏感的免疫系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)試，探究EcN對(duì)特異性CD4+T細(xì)胞的遷移、克隆擴(kuò)增和激活狀態(tài)是否有影響。結(jié)果表明，無論是在健康小鼠還是急性結(jié)腸炎動(dòng)物中，EcN并不會(huì)對(duì)上述過程產(chǎn)生影響。優(yōu)良的定植特性使EcN菌株成為腸道聚焦原位合成治療分子的理想載體候選者。近年來，EcN在癌癥靶向治療方面的研究逐漸成為熱點(diǎn)，有望為癌癥治療帶來新希望。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法化療、放療等在一定程度上提高了患者的生存率，但仍然存在許多問題，如毒副作用大、靶向性差、易產(chǎn)生耐藥性以及復(fù)發(fā)率高等。而腫瘤靶向細(xì)菌通過特異性定植于實(shí)體腫瘤環(huán)境，在基因工程改造的條件下，實(shí)現(xiàn)在腫瘤環(huán)境中持續(xù)合成并釋放抗癌藥物，提高藥物對(duì)腫瘤組織的選擇性。與化療相比，腫瘤靶向細(xì)菌還能減少對(duì)組織的藥物損傷。缺氧并且存在免疫抑制的腫瘤微環(huán)境為一些細(xì)菌在其中的增殖創(chuàng)造了條件。目前，專性厭氧菌6如嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacteriuminfantis）、諾維氏梭菌（Clostridiumnovyi）以及兼性厭氧菌如鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）、大腸桿菌Escherichiacoli等已被研究以用于腫瘤靶向治療。EcN具有良好的腫瘤靶向能力，存在于其外膜的血清敏感型脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)確保其能夠完成體內(nèi)“自殺”，從正常器官中清除[5]。此外，EcN不產(chǎn)生任何與致病性毒株相關(guān)的腸毒素和細(xì)胞毒素，遺傳背景清晰，方便進(jìn)行遺傳操作，因此EcN已成為腫瘤靶向治療的理想活體藥物。通過對(duì)EcN進(jìn)行基因改造使其直接表達(dá)治療因子是腫瘤靶向治療的重要策略之一。EcN直接表達(dá)細(xì)胞毒性藥物、前體藥物轉(zhuǎn)化酶、血管生成抑制蛋白等治療因子實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的靶向治療，具有良好的治療效果。EcN還能夠輔助化療、放療、免疫療法以及光療等治療手段來進(jìn)行腫瘤治療，為腫瘤的傳統(tǒng)療法注入新活力。腫瘤細(xì)菌療法中面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)是提高細(xì)菌的靶向性、可控性和安全性[19]。經(jīng)研究證實(shí)，提高EcN腫瘤靶向性的主要策略是加強(qiáng)EcN對(duì)腫瘤缺氧、酸性微環(huán)境的識(shí)別，促進(jìn)其與腫瘤細(xì)胞表面抗原的結(jié)合。EcN作為一種多功能益生菌，已成為腫瘤細(xì)菌療法的優(yōu)良底盤菌株。隨著技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，EcN將成為治療癌癥的得力武器[20]。參考文獻(xiàn)：[1]湯佳冰,張穎,葉佳微,etal.大腸桿菌Nissle1917的多組學(xué)分析及其產(chǎn)微菌素的功能驗(yàn)證.微生物學(xué)報(bào)[J].1-19.[2]溫楊,萬朝敏.益生菌大腸埃希菌EcN研究進(jìn)展.中國實(shí)用內(nèi)科雜志[J].2012,32(09):714-6.[3]OZENM,DINLEYICIEC.Thehistoryofprobiotics:theuntoldstory[J].BeneficialMicrobes,2015,6(2):159-65.[4]KRUISW.MaintainingremissionofulcerativecolitiswiththeprobioticEscherichiacoliNissle1917isaseffectiveaswithstandardmesalazine[J].Gut,2004,53(11):1617-23.7[5]GROZDANOVL,ZAHRINGERU,BLUM-OEHLERG,etal.ASingleNucleotideExchangeinthewzyGeneIsResponsiblefortheSemiroughO6LipopolysaccharidePhenotypeandSerumSensitivityofEscherichiacoliStrainNissle1917[J].JournalofBacteriology,2002,184(21):5912-25.[6]TaylorPW.Bactericidalandbacteriolyticactivityofserumagainstgram-negativebacteria[J].Microbiologicalreviews,1983,47(1):46-83.[7]HughesC,PhillipsR,RobertsAP.SerumresistanceamongEscherichiacolistrainscausingurinarytractinfectioninrelationtoOtypeandthecarriageofhemolysin,colicin,andantibioticresistancedeterminants[J].InfectionandImmunity,1982,35(1):270-275.[8]Hacker,J.,&Kaper,J.B.(2000).Pathogenicityislandsandtheevolutionofmicrobes.AnnualReviewsinMicrobiology,54(1),641-679.[9]Hacker,J.,&Carniel,E.(2001).Ecologicalfitness,genomicislandsandbacterialpathogenicity:ADarwinianviewoftheevolutionofmicrobes.EMBOReports,2(5),376-381.[10]ZijlstraJB,BeukemaJ,WolthersBG,etal.Pretreatmentmethodspriortogaschromatographicanalysisofvolatilefattyacidsfromfaecalsamples[J].ClinicaChimicaActa,1977,78(2):243-250.[11]Blum,G.,Hacker,J.,&Marre,R.(1995).PropertiesofEscherichiacolistrainsofserotypeO6.I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覆在大腸桿菌Nissle1917的表面，構(gòu)建了協(xié)作平臺(tái)EcN@SA-pBDT-TA。改良的益生菌對(duì)氧化和炎癥應(yīng)激的抵抗力增強(qiáng)，導(dǎo)致IBD模型小鼠結(jié)腸積累和保留更好。此外，EcN@SA-pBDT-TA可以通過控制炎癥反應(yīng)、修復(fù)腸道屏障、調(diào)節(jié)腸道微生物群，從而緩解右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。重要的是，EcN@SA-pbdt-ta介導(dǎo)的IBD藥物傳遞可以改善DSS模型小鼠的治療效果?？紤]到多酚和益生元的可用性和功能，我們期望納米結(jié)構(gòu)的多酚修飾的益生菌為開發(fā)一個(gè)IBD治療的合作平臺(tái)提供了一個(gè)解決方案。2Yenifer奧利沃-馬丁內(nèi)斯課題組——益生菌1β1917胞外囊泡對(duì)腸上皮細(xì)胞炎癥模型中血清素相關(guān)基因的調(diào)控炎癥性腸?。↖BD）是一種慢性炎癥性疾病，涉及遺傳易感個(gè)體的免疫反應(yīng)失調(diào)和腸道微生物群失衡。目前的IBD治療往往有顯著的副作用和有限的成功，促使尋找新的治療策略。基于微生物組的方法旨在恢復(fù)腸道微生物群的平衡，以達(dá)到抗炎和黏膜愈合的特性。來自有益的腸道微生物的細(xì)胞外囊泡（ev）正在成為潛在的后生物制劑。血清素在腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，其失調(diào)與IBD的嚴(yán)重程度有關(guān)。我們的研究利用il-1β誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞炎癥模型，研究了來自益生菌Nissle1917（EcN）和共生大腸桿菌的ev對(duì)炎癥條件下腸道血清素代謝的影響。我們發(fā)現(xiàn)了菌株特異性效應(yīng)。具體來說，EcNev通過下調(diào)miR-24、miR-200a、TLR4和NOD1來上調(diào)SERT的表達(dá)，從而降低了游離血清素水平。此外，EcNev可以了il-1β誘導(dǎo)的緊密連接蛋白和氧化應(yīng)激標(biāo)志物的變化。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了生物后干預(yù)作為IBD和相關(guān)病理的治療方法的潛力，EcNev在調(diào)節(jié)血清素代謝和保持腸道屏障完整性方面顯示出了希望。本研究首次證實(shí)了益生菌衍生的ev對(duì)miR-24和miR-200a的調(diào)控作用。3石軍課題組——益生菌大腸桿菌Nissle1917衍生的外膜囊泡調(diào)節(jié)肥胖和糖尿病小鼠的腸道微生物組和宿主的腸肝代謝肥胖和糖尿病是一種常見的慢性代謝紊亂，可導(dǎo)致腸道菌群和腸-肝代謝失衡。幾項(xiàng)研究表明，益生菌，包括大腸桿菌尼氏1917（EcN），促進(jìn)微生物平衡和代謝健康。然而，關(guān)于EcN外膜囊泡（EcN-OMVs）如何影響腸道菌群，如何影響肥胖和糖尿病的代謝紊亂，尚未有研究。方法在本研究中，我們?cè)u(píng)估了EcN-OMVs對(duì)高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的肥胖和HFD+鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病的影響。結(jié)果ecn-omv可降低肥胖小鼠的體重，降低血糖，增加血漿胰島素。同樣，EcN-OMVs處理可以改變腸道中厚壁菌門/擬桿菌門的比例，提高腸道產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFA）的菌群，影響腸道SCFA含量。此外，Ecn-omv后腸道代謝物鳥氨酸和富馬酸、肝臟ω-6不飽和脂肪酸和SCFAs顯著升高。綜上所述，本研究表明EcN-OMVs可能作為生物后因子，調(diào)節(jié)腸肝代謝，改善肥胖和糖尿病的病理生理學(xué)。4奧尼爾課題組——大腸桿菌Nissle1917可抑制銅綠假單胞菌的生物膜形成并減輕其毒性為了尋找緩解細(xì)菌毒力的方法，我們測(cè)試了來自25種人類共生菌和相關(guān)細(xì)菌的無細(xì)胞上清液（CFS）對(duì)銅綠假單胞菌的活性。其中，大腸桿菌Nissle1917CFS顯著抑制了生物膜的形成，分散現(xiàn)存的假單胞菌生物膜，而不抑制浮游細(xì)菌的生長。通過共聚焦顯微鏡觀察到，暴露于大腸桿菌NissleCFS后，生物膜中的eDNA減少。E.在銅綠假單胞菌攻擊前24小時(shí)，在大腸桿菌的幼蟲毒力試驗(yàn)中也顯示出顯著的保護(hù)作用。對(duì)其他大腸桿菌菌株對(duì)銅綠假單胞菌無抑制作用。根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，大腸桿菌尼氏CFS下調(diào)表達(dá)的幾個(gè)銅綠假單胞菌蛋白參與運(yùn)動(dòng)（鞭毛分泌伴侶FliSB，b型鞭毛蛋白翻轉(zhuǎn)，IV型菌毛組裝酶PilB）和群體感應(yīng)（酰基高絲氨酸內(nèi)酯合成酶激光和HTH型群體感應(yīng)調(diào)節(jié)器rhlR這與生物膜的形成。假定的抗菌膜化合物(s)的物理化學(xué)特征表明，涉及超過30kDa分子大小的熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)因子。大腸桿菌Nissle1917（EcN）是AlfredNissle于1917年在糞便中分離得到的不具備致病性的大腸桿菌，其不表達(dá)P-菌毛黏附素，不合成半粗糙脂多糖，不分泌α-溶血素，即不產(chǎn)生已知的毒力因子，具有生物安全性。使用EcN治療腸道相關(guān)疾病及進(jìn)行生物發(fā)酵生產(chǎn)具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。EcN具有兩個(gè)隱秘質(zhì)粒——pMUT1和pMUT2，具有遺傳穩(wěn)定性和不可轉(zhuǎn)移性，且只在EcN中發(fā)現(xiàn)。pMUT1攜帶ColE1型復(fù)制系統(tǒng)，pMUT2包含類ColE2復(fù)制系統(tǒng)和其他復(fù)制系統(tǒng)，但在這兩種質(zhì)粒中沒有發(fā)現(xiàn)其他具有已知功能的開放閱讀框[1]。這兩個(gè)隱秘質(zhì)?？赡芘c抵御噬菌體侵染有關(guān)。Blum-Oehler等構(gòu)建了大腸桿菌DSM6601（EcN）的無質(zhì)粒變體，為使用隱秘質(zhì)粒進(jìn)行基因表達(dá)和改造奠定基礎(chǔ)。對(duì)EcN的基因改造主要集中在治療疾病、細(xì)胞工廠、CRISPR工具開發(fā)及基因線路等方面，EcN相關(guān)的基因改造操作也較為完善。Figure1.EcN相關(guān)基因改造及應(yīng)用[21]EcN作為腸道益生菌，通過加強(qiáng)腸黏膜屏障和刺激免疫系統(tǒng)來預(yù)防病原體感染。近年來，基因工程EcN已被進(jìn)一步應(yīng)用于治療炎癥性腸病，結(jié)直腸癌和代謝性疾病。在治療IBD方面，Wang等通過在EcN通過α溶血素分泌系統(tǒng)分泌表達(dá)免疫調(diào)節(jié)蛋白Sj16，緩解了結(jié)腸炎，并促進(jìn)了腸道抗氧化能力[2]，并進(jìn)一步通過丁酸鹽等增加Treg細(xì)胞，降低Th17細(xì)胞緩解免疫反應(yīng)[3]。Praveschotinunt等開發(fā)了益生菌PATCH治療系統(tǒng)，通過在EcN表面展示融合自組裝蛋白亞基CsgA與TFF3緩解炎癥，TFF3是一種促進(jìn)粘膜愈合因子。這一基因回路通過阿拉伯糖依賴性啟動(dòng)子表達(dá)，這一EcN變體被命名為PBP8CsgA-tff3[4]。Yu等將歐文氏菌編碼脂肪酶ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)移至EcN染色體中，識(shí)別并分泌轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β1），促進(jìn)黏膜愈合[5]。Cui等設(shè)計(jì)了藍(lán)光響應(yīng)表達(dá)Ag43，Ag43是一種促進(jìn)生物膜形成的粘附素，可以使細(xì)菌形成“生物膠”，從而提高細(xì)菌在胃腸道中的存活率[6]。Figure2.EcN改造應(yīng)用于促進(jìn)黏膜愈合[21]同時(shí)，工程EcN也可以作為抗癌劑治療癌癥，現(xiàn)有主要思路包括提高EcN的靶向性、殺傷力以及賦予其診斷能力。Leventhal開發(fā)了EcN變體SYNB1891，通過Pfnrs缺氧誘導(dǎo)啟動(dòng)子表達(dá)李斯特菌二腺苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生高水平的環(huán)狀A(yù)MP，吞噬細(xì)胞攝取SYNB1891可觸發(fā)干擾素的分泌，而在小鼠研究中，將該菌株直接注射到小鼠冷腫瘤中，可促進(jìn)其清除并誘導(dǎo)免疫記憶的發(fā)展，從而防止腫瘤復(fù)發(fā)[7]。Table1.EcN腫瘤治療相關(guān)研究[22]功能原理實(shí)施提高EcN的靶向性提高EcN的腫瘤殺傷力賦予EcN腫瘤診斷能力響應(yīng)腫瘤低pH的微環(huán)境結(jié)合特定的靶向蛋白表達(dá)腫瘤治療藥物阻斷腫瘤的營養(yǎng)來源促進(jìn)藥物進(jìn)入腫瘤恢復(fù)T細(xì)胞免疫活性對(duì)葡萄糖濃度的響應(yīng)分析尿液顏色EcN-ca-dox在低pH腫瘤環(huán)境中釋放DoxpHLIP包裹EcN靶點(diǎn)至腫瘤環(huán)境HlpA與腫瘤標(biāo)志物HSPG結(jié)合EcN產(chǎn)生腫瘤殺傷蛋白天青蛋白抗血管生成蛋白Tum-5與腫瘤殺傷蛋白p53協(xié)同作用細(xì)胞凋亡素與細(xì)胞Tat共表達(dá)PD-L1抑制劑與腫瘤PD-L1結(jié)合Trz1可以感知葡萄糖濃度，并顯示不同的熒光強(qiáng)度腫瘤定植后LacZ分解LuGal表達(dá)，尿液顏色變化Li等根據(jù)腫瘤微環(huán)境低pH的特點(diǎn)，將殺傷腫瘤的藥物阿霉素和順式烏頭酸酐的酸不穩(wěn)定連接物連接在EcN表面，形成EcN-ca-Dox靶向藥物，實(shí)現(xiàn)阿霉素只在腫瘤環(huán)境中釋放[8]。同樣的，Zhang等在EcN中表達(dá)響應(yīng)低pH的插入肽pHLIP，并將其錨定在EcN細(xì)胞表面以增強(qiáng)靶向作用[9]。Gurbatri等將PD-L1抑制劑構(gòu)建于EcN，利用群體感應(yīng)效應(yīng)使EcN菌體裂解，釋放出PD-L1抑制蛋白與腫瘤表面PD-L1結(jié)合，激活T細(xì)胞持續(xù)殺傷腫瘤細(xì)胞[10]。鑒于口腔癌早期難以診斷，Hamilton等基于乳酸標(biāo)志物構(gòu)建了細(xì)胞外乳酸反應(yīng)熒光報(bào)告基因工程EcN，包括一個(gè)乳酸結(jié)合響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子LIdR和有LLD啟動(dòng)子表達(dá)的綠色熒光蛋白，當(dāng)乳酸缺失時(shí)，LIdR蛋白抑制lld控制的啟動(dòng)子并阻斷GFP表達(dá)[11]。通過合成生物學(xué)技術(shù)改造EcN并將其應(yīng)用于疾病的治療非常有前景，以EcN為底盤細(xì)胞裝配生物芯片等，進(jìn)一步提高EcN對(duì)腫瘤的響應(yīng)和殺傷能力，并利用其天然的抗炎、靶向和抑瘤特性，成為炎癥治療及腫瘤治療新的強(qiáng)有力武器。2.EcN細(xì)胞工廠EcN在培養(yǎng)基中可以達(dá)到于常用微生物基質(zhì)菌株相當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，是理想的高密度發(fā)酵底盤生物。Hu等對(duì)EcN進(jìn)行代謝改造，使其可以生成β-丙氨酸，分批補(bǔ)料發(fā)酵后產(chǎn)量達(dá)到11.9g/L[12]，同時(shí)，Datta等通過高密度發(fā)酵，并以葡萄糖為碳源，實(shí)現(xiàn)了3g/L肝磷脂聚糖的生產(chǎn)[13]。EcN也是生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的良好微生物底盤。細(xì)菌纖維素的天然生產(chǎn)菌木糖醋桿菌的生長緩慢，不適用于工業(yè)生產(chǎn)，Sajadi等在EcN中構(gòu)建了細(xì)菌纖維素代謝路徑，實(shí)現(xiàn)了搖瓶1.9g/L的發(fā)酵產(chǎn)量[14]。ω-3fa，包括二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，是參與胎兒發(fā)育、免疫和阿爾茨海默病的膳食成分，通過在EcN中表達(dá)EPA和DHA基因簇，搖瓶產(chǎn)量達(dá)到31.36mg/L[15]。Table2.EcN細(xì)胞工廠相關(guān)研究[21]代謝產(chǎn)物作用實(shí)施產(chǎn)量β-ALA作為醫(yī)藥中間體表達(dá)工程化天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶增加富馬酸的供應(yīng)加強(qiáng)富馬酸向L-ASP的11.9克/升途徑促進(jìn)草酰乙酸向L-ASP的轉(zhuǎn)化服用NH3并將其轉(zhuǎn)換為L-Arg（左旋精）L-Arg增加T細(xì)胞的數(shù)量L-Arg（左旋精）L-Arg和PD-L1抑制劑之間的協(xié)同作用刪除負(fù)調(diào)節(jié)因子基因-插入反饋抗性酶基因刪除精氨酸阻遏基因-丁酸提高抗炎功效異源達(dá)BCD和BUT基因297.3±34.25毫克/升丁酸鹽5-ALAGLP-1TFF細(xì)胞周期停滯在G1期誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑作為PDT的組分調(diào)節(jié)能量攝入和消耗的神經(jīng)肽表達(dá)粘膜愈合來自葡萄糖途徑的整合丁酰輔酶A將丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丁酸基因過表達(dá)編碼5-ALA組分的基因抑制下游途徑LAGLP-1的過表達(dá)構(gòu)建合成的curli操縱子編碼質(zhì)粒20毫米300毫克/升--3.EcN基因編輯工具及基因線路構(gòu)建對(duì)于EcN相關(guān)基因編輯工具的開發(fā)和基因線路的構(gòu)建將進(jìn)一步有利于EcN的改造利用。Fiege等將T7RNA聚合酶整合至EcN基因組中，構(gòu)建了EcN::T7菌株，工程化EcN菌株可以識(shí)別T7啟動(dòng)子，并實(shí)現(xiàn)了血紅素依賴性蛋白的大量表達(dá)[16]。研究發(fā)現(xiàn)，T7啟動(dòng)子的泄露 表達(dá)在EcN中比在BL21中更加嚴(yán)重，使用組成型啟動(dòng)子替換lacI啟動(dòng)子可顯著增加EcN中T7表達(dá)系統(tǒng)的嚴(yán)格性[17]。近紅外光響應(yīng)系統(tǒng)也可以應(yīng)用于EcN，由于藍(lán)光的組織透過性較差，已經(jīng)構(gòu)建了近紅外誘導(dǎo)系統(tǒng)EcN（ROEN），其包含一個(gè)嵌合光傳感器Cph8，在紅光635nm下失活，使得cl表達(dá)收到抑制，從而啟動(dòng)pλ控制的裂解基因表達(dá)開啟[18]。EcN相關(guān)的CRISPR工具箱也逐漸被開發(fā)利用，已有研究使用相關(guān)技術(shù)去除EcN中的隱秘質(zhì)粒，對(duì)其基因組進(jìn)行編輯，從而提高其細(xì)胞工廠生產(chǎn)能力。Pan等構(gòu)建了由L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子組成的自殺系統(tǒng)、λ啟動(dòng)子，λ啟動(dòng)子抑制劑和毒素-抗毒素系統(tǒng)，毒素蛋白編碼基因（ccdb）和cI受pBAD啟動(dòng)子控制，抗毒素蛋白編碼基因（ccda）受pλ啟動(dòng)子控制，補(bǔ)充阿拉伯糖時(shí)，cI高表達(dá)，并抑制ccda轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)EcN死亡[19]。與群體感應(yīng)系統(tǒng)結(jié)合可開發(fā)出更多基因線路，Hwang等構(gòu)建了響應(yīng)群體感應(yīng)信號(hào)（N-?；呓z氨酸內(nèi)酯）的自殺系統(tǒng)，當(dāng)銅綠假單胞菌生長到閾值細(xì)胞密度時(shí)，增加的N-高絲氨酸內(nèi)酯會(huì)觸發(fā)工程EcN的裂解基因表達(dá)，從而實(shí)發(fā)出膿毒桿菌S5和DspB，從而抑制銅綠假單胞菌[20]。參考文獻(xiàn)：[1]Decanio,M.S.,Landick,R.&Haft,R.J.,Thenon-pathogenicEscherichiacolistrainWsecretesSslEviathevirulence-associatedtypeIIsecretionsystembeta.BMCMICROBIOL13130(2013).[2]Wang,L.etal.,rSj16ProtectsagainstDSS-InducedColitisbyInhibitingthePPAR-alphaSignalingPathway.THERANOSTICS73446(2017).[3]Wang,L.etal.,AnengineeredprobioticsecretingSj16amelioratescolitisviaRuminococcaceae/butyrate/retinoicacidaxis.BioengTranslMed6e10219(2021).[4]Praveschotinunt,P.etal.,EngineeredE.coliNissle1917forthedeliveryofmatrix-tetheredtherapeuticdomainstothegut.NATCOMMUN105580(2019).[5]Yu,M.,Kim,J.,Ahn,J.H.&Moon,Y.,NononcogenicrestorationoftheintestinalbarrierbyE.coli-deliveredhumanEGF.JCIINSIGHT4(2019).[6]Cui,M.etal.,NIRlight-responsivebacteriawithlivebio-gluecoatingsforprecisecolonizationinthegut.CELLREP36(2021).[7]Leventhal,D.S.etal.,ImmunotherapywithengineeredbacteriabytargetingtheSTINGpathwayforanti-tumorimmunity.NATCOMMUN112739(2020).[8]Xie,S.etal.,Doxorubicin-conjugatedEscherichiacoliNissle1917swimmerstoachievetumortargetingandresponsivedrugrelease.JCONTROLRELEASE268390(2017).[9]Zhang,Y.etal.,E.coilNissle1917-DerivedMinicellsforTargetedDeliveryofChemotherapeuticDrugtoHypoxicRegionsforCancerTherapy.THERANOSTICS81690(2018).[10]Gurbatri,C.R.etal.,Engineeredprobioticsforlocaltumordeliveryofcheckpointblockadenanobodies.SCITRANSLMED12(2020).[11]Hamilton,S.,Shea,D.,Ibsen,S.&Brasino,M.,On-chipdielectrophoreticrecoveryanddetectionofalactatesensingprobioticfrommodelhumansaliva.6.ELECTROPHORESIS44442(2023).[12]Hu,S.etal.,DevelopmentofprobioticE.coliNissle1917for尾-alanineproductionbyusingproteinandmetabolicengineering.APPLMICROBIOLBIOT(2023).[13]Datta,P.,Yan,L.,Awofiranye,A.,Dordick,J.S.&Linhardt,R.J.,HeparosanChainCharacterization:SequentialDepolymerizationofE.ColiK5HeparosanbyaBacterialEliminaseHeparinLyaseIIIandaBacterialHydrolaseHeparanaseBptoPrepareDefinedOligomers.BIOTECHNOLJ16(2021).[14]Sajadi,E.etal.,IncreasedcelluloseproductionbyheterologousexpressionofbcsAandBgenesfromGluconacetobacterxylinusinE.coliNissle1917.BIOPROCBIOSYSTENG422023(2019).[15]Amiri-Jami,M.,Abdelhamid,A.G.,Hazaa,M.,Kakuda,Y.&Griffths,M.W.,Recombinantproductionofomega-3fattyacidsbyprobioticEscherichiacoliNissle1917.FEMSMICROBIOLLETT362(2015).[16]Fiege,K.&Frankenberg-Dinkel,N.,ConstructionofanewT7promotercompatibleEscherichiacoliNissle1917strainforrecombinantproductionofheme-dependentproteins.MICROBCELLFACT19(2020).[17]Effendi,S.S.W.&Ng,I.,ReprogrammingT7RNAPolymeraseinEscherichiacoliNissle1917underSpecificLacOperonforEfficientp-CoumaricAcidProduction.ACSSYNTHBIOL113471(2022).[18]Fernandez-Rodriguez,J.,Moser,F.,Song,M.&Voigt,C.A.,EngineeringRGBcolorvisionintoEscherichiacoli.NATCHEMBIOL13706(2017).[19]Pan,H.etal.,EngineeredNIRlight-responsivebacteriaasanti-tumoragentfortargetedandprecisecancertherapy.CHEMENGJ426(2021).[20]Hwang,I.Y.etal.,EngineeredprobioticEscherichiacolicaneliminateandpreventPseudomonasaeruginosagutinfectioninanimalmodels.NATCOMMUN8(2017).[21]Yu,M.,Hu,S.,Tang,B.,Yang,H.&Sun,D.,EngineeringEscherichiacoliNissle1917asamicrobialchassisfortherapeuticandindustrialapplications.BIOTECHNOLADV67(2023).[22]王彥雯,葉靜怡&王鵬超,合成生物學(xué)在E.coliNissle1917靶向治療癌癥中的應(yīng)用.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)3720(2021).20六：近五年iGEM年中EcN相關(guān)項(xiàng)目20193081Pekinghttps://2019./Team:Peking宿主細(xì)胞大腸桿菌，其一般生理機(jī)能也會(huì)隨時(shí)間而表現(xiàn)出顯著的變化，這些生理機(jī)能可以直接或間接地影響合成生物部分的“期望”功能。如果我們能更好地控制細(xì)胞的生長率，就可以解決許多挑戰(zhàn)。然而，以前的方法對(duì)于增長率控制有很多缺點(diǎn)。所以，我們開發(fā)了一種新穎的系統(tǒng)通過使用dCas9靶向DNA復(fù)制起點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)精確的生長速率控制。解決方案：直接針對(duì)基因組復(fù)制的生長控制工具箱在大腸桿菌中，基因組復(fù)制從一個(gè)單一的位點(diǎn)開始，即oriC。在oriC內(nèi)的DnaA盒上形成DnaA蛋白絲可準(zhǔn)確調(diào)節(jié)復(fù)制氣泡打開和隨后的解旋酶負(fù)載。在這里，我們?cè)O(shè)法（主要基于CRISPR/dCas9與DnaA盒陣列的競爭）阻斷了DnaA結(jié)合。所以他們的方法：一種用于原核基因組復(fù)制干擾（CRISPRri）的新方法，類似于CRISPR干擾的轉(zhuǎn)錄抑制[5]。CRISPRri系統(tǒng)可以很好地控制大腸桿菌Nissle1917菌株的生長?？紤]到大腸桿菌Nissle的oriC序列與Top10中的oriC序列相同，我們希望證明新大腸桿菌Nissle中CRISPRri系統(tǒng)的功能與Top10中的相同。他們將CRISPRri系統(tǒng)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Nissle1917。通過微流控成像系統(tǒng)，我們觀察到，在0.25%阿拉伯糖處理下，實(shí)驗(yàn)組（其sgRNA靶向在oriC區(qū)的M盒上）的細(xì)菌增殖明顯慢于對(duì)照組（polyA）。定量結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組（M+）的平均細(xì)胞數(shù)倍增時(shí)間大于2小時(shí)，而對(duì)照組（polyA）只需約40分鐘即可完成細(xì)胞分裂。說明CRISPRri系統(tǒng)可以很好地控制Ecn的生長。3036BNU-Chinahttps://2019./Team:BNU-China肥胖會(huì)導(dǎo)致很多疾病，成為世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重問題。他們提議開發(fā)一種合成的促進(jìn)瘦弱的腸道微生物(SLIM)，該微生物可在人體腸道內(nèi)定居，并通過兩種單獨(dú)的途徑促進(jìn)脂肪（包括同化和未同化的脂肪）的分解代謝。其中一個(gè)不斷增強(qiáng)人類消耗的過量高脂肪酸的β-氧化，而另一個(gè)導(dǎo)致乙酸（作為信號(hào)促進(jìn)人類白色脂肪組織的消耗）的過量產(chǎn)生。其中后者置于傳感模塊的控制下，使其僅在最佳時(shí)間激活，從而防止對(duì)酸化引起的消化的干擾。21他們選擇大腸桿菌Nissle1917作為最終產(chǎn)品的底盤。因?yàn)榇竽c桿菌nissle1917是一種源自人類腸道的益生菌菌株，它不容易引發(fā)免疫反應(yīng)。此外，為了防止工程細(xì)菌被排除在外，他們?cè)鰪?qiáng)了它們的增殖能力，使它們具有更強(qiáng)的競爭力。BNU-China2018已經(jīng)證明，通過過表達(dá)磷酸戊糖途徑中的關(guān)鍵酶葡萄糖脫氫酶(GDH)，菌株可以獲得顯著的增殖優(yōu)勢(shì)。相同的酶可用于促進(jìn)微生物的定殖。另一方面，他們也不希望工程菌擾亂天然微生物組。因此，我們?cè)谠O(shè)計(jì)中包括了與天然微生物正交的群體感應(yīng)系統(tǒng)。由于群體感應(yīng)機(jī)制的限制，一旦達(dá)到一定的群體閾值，工程菌的增殖速度就會(huì)減慢，從而確保其不會(huì)干擾腸道微生物組。3245Fudanhttps://2019./Team:Fudan乳糖不耐受在我國是一種常見疾病，對(duì)成年人來說無關(guān)痛癢，但對(duì)于嬰兒卻至關(guān)重要。我們使用E.coliNissle1917作為我們的底盤，并添加了幾個(gè)模塊，提高其生存能力和乳糖消化能力，以便它可以穩(wěn)定解決乳糖不耐癥。第一個(gè)是耐酸模塊。為了使細(xì)菌在通過胃的高酸性環(huán)境時(shí)存活，我們通過敲除E.coliNissle1917的耐酸系統(tǒng)2(AR2)中的關(guān)鍵基因h-ns來改善耐酸系統(tǒng)。因此E.coliNissle1917的耐酸能力得到了顯著提高，并且在通過胃酸時(shí)不會(huì)遭受巨大損失。第二個(gè)是抗菌肽模塊。我們采用microcinB17(MccB17)來適度抑制其他菌群的繁殖，從而通過分泌抗菌肽來提高E.coliNissle1917的競爭力。盡管與腸道菌群競爭激烈，但它可以繁殖到一定數(shù)量。第三是分泌模塊。為了使乳糖更有效地分解，我們?cè)谠黾尤樘敲富钚院捅磉_(dá)之間選擇了后者。luxpR和高強(qiáng)度啟動(dòng)子J23100的融合顯著增加了lacZ基因的表達(dá)。我們使用Quorum傳感系統(tǒng)(QS系統(tǒng))來控制我們的獨(dú)立模塊。當(dāng)我們的工程細(xì)菌到達(dá)胃部時(shí)，由于耐酸模塊，它們可以存活。當(dāng)它們?cè)谀c道中時(shí)，抗菌肽模塊起作用，因此我們的細(xì)菌具有優(yōu)勢(shì)并迅速繁殖。當(dāng)種群達(dá)到一定水平以觸發(fā)QS系統(tǒng)時(shí)，關(guān)閉抗菌肽模塊并開始分泌乳糖酶。通過這種方式，我們減輕了細(xì)菌的負(fù)擔(dān)，使它們?cè)诜置谌樘敲钢胺敝场６?dāng)數(shù)量不夠時(shí)，它們可以重新開始繁殖，重復(fù)上一個(gè)周期，使它們的種群保持穩(wěn)定。2967NEU_CHINAhttps://2019./Team:NEU_CHINA/homepage.html22我們通過使用腸道菌群移植來治療IBD。E.coliNissle1917(EcN),人體腸道中的一種益生菌，作為底盤細(xì)胞。我們?cè)噲D將我們的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為EcN并表征了EcN。1.考慮到EcN的敏感性，我們優(yōu)化了去年團(tuán)隊(duì)的NO傳感器，并通過額外的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合序列成功降低了傳感器的泄漏率。此外，我們構(gòu)建了另一種新的NO傳感器，并對(duì)其進(jìn)行了表征，以獲得更好的選擇。2.我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可行的系統(tǒng)丁香假單胞菌并設(shè)計(jì)了可調(diào)增益放大器。我們建立了固定增益放大器的泄漏模型，以進(jìn)一步探索可調(diào)諧放大器。3.我們使用免疫印跡法表征了治療性化合物IL-10和myrosinese。以確認(rèn)這些化合物的活性，我們測(cè)試了免疫細(xì)胞因子IL-10的活性。4.有了毒素-抗毒素系統(tǒng)-mazEF,我們顯著提高了細(xì)胞活力，并精確控制了不同溫度下的抗細(xì)菌毒素表達(dá)。所有這些工作和優(yōu)化都有助于創(chuàng)造EcN，使其能夠在胃腸道炎癥區(qū)域精確定植；成功表達(dá)和分泌抗炎蛋白，并在腸道中起作用，幾乎沒有生物危害，副作用最小。我們將E.coliNissle1917(EcN)作為感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)炎癥感應(yīng)蛋白。選擇EcN不僅是因?yàn)樗谴竽c桿菌菌株（能快速生長增值，容易獲得成分，容易受刺激變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化吸收外源DNA），而且它是一種臨床確定的無害益生菌，缺乏毒力因子，用于促進(jìn)腸道健康，被確認(rèn)為治療安全菌株。此外，EcN具有幾個(gè)獨(dú)特的功能，包括microcin合成和不同的鐵吸收系統(tǒng)，提供EcN具有腸道定植的優(yōu)勢(shì)。此外，重組EcN在具有免疫功能的宿主中，對(duì)遷移，克隆擴(kuò)增和免疫細(xì)胞激活沒有有害影響。所以，E.coliNissle1917可能是理想的生物工程菌株，用于胃腸道相關(guān)的炎癥感應(yīng)蛋白和抗炎分子的原位合成。5313NEFU-China該隊(duì)伍使用大腸桿菌Nissle1917設(shè)計(jì)了一種新型可控的系統(tǒng)，響應(yīng)尿酸水平的變化釋放抗腫瘤藥物。該項(xiàng)目基于體內(nèi)細(xì)菌療法，選擇一種可以在人體組織中存活而不會(huì)引起無法忍受的炎癥反應(yīng)的細(xì)菌載體。系統(tǒng)主要分為四個(gè)核心設(shè)計(jì)模塊：腫瘤微環(huán)境傳感器模塊、尿酸調(diào)節(jié)模塊、定向和自我調(diào)節(jié)模塊、質(zhì)粒保護(hù)模塊。為了確保治療系統(tǒng)只有在到達(dá)腫瘤細(xì)胞時(shí)才能工作,該隊(duì)伍選擇了缺氧和高乳酸水平、腫瘤微環(huán)境的特性，作為傳感器模塊的檢測(cè)指標(biāo),通過感知這兩個(gè)參數(shù)來激活突變形式的腫瘤壞死因子-α（mTNF-α)的表達(dá)和分泌，從而增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。為了防止這些23細(xì)菌對(duì)正常組織產(chǎn)生不利影響，該隊(duì)伍使用胞嘧啶脫氨酶（CD）作為靶向和自我調(diào)節(jié)模塊的一部分，它可以將5-氟胞嘧啶（5-FC）轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶（5-FU）來殺死細(xì)菌。該隊(duì)伍還設(shè)計(jì)大腸桿菌Nissle1917表達(dá)ftnA-M，這是鐵蛋白基因的突變形式，它可以有效地在細(xì)菌中積累鐵離子，這將使細(xì)菌在暴露于磁場(chǎng)時(shí)能夠定位在腫瘤部位以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞殺傷。腫瘤部位的尿酸水平低時(shí)，細(xì)菌會(huì)釋放抗腫瘤藥物。然而，當(dāng)尿酸達(dá)到一定水平（閾值）時(shí)，細(xì)菌會(huì)減慢抗腫瘤藥物的釋放，轉(zhuǎn)而表達(dá)尿酸酶以降低尿酸水平。從而達(dá)到殺死腫瘤的目標(biāo)，同時(shí)避免急性尿酸性腎病的發(fā)生，從而溫和、安全地治療癌癥患者。為了防止質(zhì)粒在注射到小鼠體內(nèi)后丟失，該隊(duì)伍在大腸桿菌基因組中敲除了alr和dadX基因，一旦將alr或dadX基因的編碼序列插入載體中，細(xì)菌就只能用這個(gè)載體生存。因此，細(xì)菌不會(huì)丟失這種載體。該隊(duì)伍這種使用大腸桿菌Nissle1917來遞送和釋放抗癌劑，同時(shí)防止癌癥治療過程中尿酸的積累，這將導(dǎo)致消除癌細(xì)胞和預(yù)防腎病。2997NCKU該隊(duì)伍采用工程化Nissle1917來減少對(duì)甲酚在人體中的積累，從而治療慢性腎?。–KD）。該項(xiàng)目對(duì)大腸桿菌Nissle1917進(jìn)行工程設(shè)計(jì)，使其具有兩個(gè)特定的功能。第一，通過轉(zhuǎn)移原有的對(duì)甲酚產(chǎn)生途徑，將對(duì)甲酚的前體酪氨酸轉(zhuǎn)化為對(duì)身體有益的物質(zhì)。該隊(duì)伍設(shè)計(jì)了大腸桿菌Nissle來表達(dá)TyrP和TAL，以將腸道內(nèi)多余的酪氨酸轉(zhuǎn)化為對(duì)香豆酸，對(duì)人類有益。通過減少酪氨酸（對(duì)甲酚的前體）的總量，可以減少其他腸道菌群產(chǎn)生的對(duì)甲酚的量。第二，通過從常用的益生菌中產(chǎn)生細(xì)菌素（CBM-B），可以減少其他梭狀芽胞桿菌菌株（主要的對(duì)甲酚生產(chǎn)者）的數(shù)量。該隊(duì)伍設(shè)計(jì)了三種構(gòu)建體，一種是全長CBM-B與大腸桿菌分泌蛋白（yebF）融合，兩種是CBM-B和yebF的C端結(jié)構(gòu)域（對(duì)某些梭狀芽胞桿菌菌株具有殺菌活性具有兩種不同的連接子：一種GS連接子（三個(gè)甘氨酸絲氨酸重復(fù)序列：GSGSGS）和一個(gè)TB連接子（凝血酶裂解位點(diǎn)：LVPRGS）。出于生物安全原因，該隊(duì)伍通過刪除罐頭基因?qū)嵤┝苏T導(dǎo)性殺傷開關(guān)，從而確保大腸桿菌Nissle1917只能在人類腸道中存活。罐頭基因被敲除，大腸桿菌就無法在CO2擴(kuò)散出去并導(dǎo)致細(xì)胞死亡之前足夠快地將CO2轉(zhuǎn)化為碳酸氫鹽（代謝底物）。在腸道內(nèi)部，大腸桿菌生存的地方，CO2濃度足夠高，允許CO2自發(fā)轉(zhuǎn)化變成碳酸氫根離子。然而，當(dāng)大腸桿菌離開人體時(shí)，CO2的濃度會(huì)降低將導(dǎo)致它的死亡。帶隊(duì)伍還通過刪除DapA（4-羥基-四氫雙肽甲酸合酶，細(xì)胞壁合成所必需的酶細(xì)菌將不得不依賴外源性二氨基庚二酸酯（DAP）進(jìn)行細(xì)胞壁合成和生長，使其成為殺傷開關(guān)，因?yàn)榧?xì)菌將在沒有DAP供應(yīng)的情況下死亡。24假單胞菌具有感知對(duì)甲酚的能力。該隊(duì)伍以熒光假單胞菌（PC24）為中心，它有一個(gè)正誘導(dǎo)操縱子pchR組成的基因簇，該操縱子使其能夠感知對(duì)甲酚并促進(jìn)下游區(qū)域的轉(zhuǎn)錄以降解對(duì)甲酚。pchR編碼與誘導(dǎo)劑（p-Cresol）結(jié)合并導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的激活蛋白。因此，激活劑-對(duì)甲酚復(fù)合物將結(jié)合到位于pchR下游的對(duì)甲酚感應(yīng)區(qū)域并開始轉(zhuǎn)錄。該隊(duì)伍用GFP替換了下游基因區(qū)域，因此它可以感知對(duì)甲酚并發(fā)光。3096Tuebingen該隊(duì)伍開發(fā)了一種基于大腸桿菌Nissle1917的益生菌，它分泌Exendin-4，一種腸促胰島素類似物，對(duì)葡萄糖有反應(yīng)。治療劑是益生菌分泌腸促胰島素模擬物通過口服給藥膠囊置于患者腸道中。這使得治療變得更容易，在此期間，不需要定期服用藥物。該系統(tǒng)通過碳分解代謝物抑制系統(tǒng)工作，該系統(tǒng)將啟動(dòng)tetR的轉(zhuǎn)錄。Exendin-4的上游是TetR可抑制啟動(dòng)子，可確保Exendin-4僅在葡萄糖存在下被轉(zhuǎn)錄。此外，Exendin-4與N端分泌標(biāo)簽和C端偶聯(lián)細(xì)胞穿透肽（CPP）。分泌標(biāo)簽確保Exendin-4分泌到腸道中，而CPP確保Exendin-4被吸收到血液中，從而提高整體生物利用度。為了確保其作為轉(zhuǎn)基因生物的安全使用，該隊(duì)伍集成了基于CRISPR/Cas3Kill-Switch使用我們的益生菌。一旦終止開關(guān)被激活，Cas3核酸酶就會(huì)降解細(xì)菌DNA，從而防止轉(zhuǎn)基因生物向環(huán)境中的傳播。一旦益生菌離開其指定區(qū)域，就會(huì)抑制終止開關(guān)被廢除，CRISPR/Cas3系統(tǒng)被激活。因此，終止開關(guān)是一個(gè)可以通過交換藥物和/或條件用于多種療法。3282Lund該隊(duì)伍對(duì)益生菌-大腸桿菌Nissle1917（EcN）進(jìn)行了基因改造，以增加其吸收和積累鉛和砷的能力。該隊(duì)伍通過從金屬念珠菌CH34中提取一些基因，并將它們插入益生菌底盤EcN中，可以提高EcN的砷和鉛積累能力。然后，細(xì)菌將作為益生菌攝入，由于EcN的先天能力，它適應(yīng)腸道微生物組。在那里，它會(huì)在你的地方積累砷和鉛。很快，充滿金屬的細(xì)菌就會(huì)被排出體外，從而減少體內(nèi)有毒金屬的含量。用PbrT（一種先導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）和PbrD（一種假定的先導(dǎo)結(jié)合蛋白）提高鉛累積量。轉(zhuǎn)基因大腸桿菌中過表達(dá)ArsR（ars操縱子中的一種調(diào)節(jié)蛋白）可使砷積累能力提高5-60倍，因此將這種蛋白質(zhì)作為積累蛋白包括在內(nèi)。2520203121IISER_Bhopal該隊(duì)伍采用改造工程化益生菌E.coliNissle1917以在腸道內(nèi)原位表達(dá)治療蛋白，促進(jìn)腸道隱窩細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，進(jìn)而在體內(nèi)產(chǎn)生胰島素，達(dá)到對(duì)糖尿病的治療效果。該隊(duì)伍對(duì)EcN的改造基于一個(gè)創(chuàng)新的三元系統(tǒng)：傳感器（如NO或硫代硫酸鹽）-分泌肽（CsgA）-治療性蛋白質(zhì)。當(dāng)腸道環(huán)境發(fā)生變化，如炎癥發(fā)生時(shí)，傳感器會(huì)觸發(fā)EcN，導(dǎo)致治療蛋白分泌，促進(jìn)腸道細(xì)胞的修復(fù)和功能恢復(fù)。為增強(qiáng)EcN的分泌能力，該隊(duì)伍特別融合了CsgA分泌肽，確保治療蛋白的有效釋放。由于糖尿病患者腸道中可能存在的粘附侵襲性大腸桿菌（AIEC該隊(duì)伍引入了Microcins的生產(chǎn)能力。Microcins作為一組能夠抑制AIEC生長的分泌肽，通過與AIEC細(xì)胞膜上的ATP酶結(jié)合來發(fā)揮作用。為了實(shí)現(xiàn)這一功能，EcN被賦予了成熟的大腸桿菌CA46微霉素表達(dá)系統(tǒng)，使其能夠在腸道內(nèi)抑制AIEC，幫助恢復(fù)腸道菌群的平衡。為解決輸送過程中EcN所面臨的消化道環(huán)境的惡劣條件，該隊(duì)伍采用了PCS（殼聚糖共沉積的聚多巴胺）技術(shù)。PCS能夠在EcN表面形成一層保護(hù)膜，通過化學(xué)自組裝的方式，保護(hù)EcN免受消化道環(huán)境的破壞。最終，通過將工程化的EcN封裝成膠囊，可得到創(chuàng)新產(chǎn)品iBETA，其提供了一種非侵入性的治療方式，使得患者可通過口服膠囊來接受治療。這種方式有望減少糖尿病患者對(duì)外部胰島素注射的依賴，提高治療的便利性和依從性，同時(shí)