ICS65.020.30

CCSB40/49

DB51

四川省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB51/T3011—2023

山羊胚胎生產(chǎn)與冷凍保存技術(shù)規(guī)范

2023-02-07發(fā)布2023-04-08實(shí)施

四川省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB51/T3011—2023

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義.........................................................................1

4胚胎生產(chǎn)...........................................................................1

5胚胎質(zhì)量檢測(cè).......................................................................4

6胚胎冷凍保存.......................................................................4

7解凍...............................................................................5

附錄A（資料性）各種液體配制.........................................................6

附錄B（資料性）胚胎裝管示意圖.......................................................8

附錄C（資料性）檢胚記錄表...........................................................9

I

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出、歸口和解釋。

本文件主要起草單位：四川省畜牧總站、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)。

本文件主要起草人：楊舒慧、張明、張紅平、李強(qiáng)、王小強(qiáng)、曹偉、周光斌、曾長(zhǎng)軍、程蓮、洪寧、

王莉娟、張勇。

本次為首次發(fā)布。

II

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山羊胚胎生產(chǎn)與冷凍保存技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了山羊胚胎生產(chǎn)與冷凍保存的術(shù)語(yǔ)和定義、胚胎生產(chǎn)、質(zhì)量檢測(cè)、冷凍及解凍的技術(shù)要

求。

本文件適用山羊胚胎生產(chǎn)與冷凍保存。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

NY/T1571羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程

NY/T1674牛羊胚胎質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

超數(shù)排卵Superovulation

利用外源性促性腺激素誘發(fā)母羊卵巢多個(gè)卵泡發(fā)育，并排出多個(gè)具有受精能力的卵子的方法。

3.2

體外受精I(xiàn)nvitrofertilization

山羊的精子和卵子在人工控制的體外環(huán)境中完成受精過(guò)程。

3.3

玻璃化冷凍Vitrification

利用含有高濃度的滲透性抗凍保護(hù)劑溶液處理胚胎，然后將胚胎裝入冷凍載體并直接投入液氮快速

降溫，使液體形成玻璃態(tài)，可有效減少冷凍過(guò)程中有害冰晶的形成，使胚胎所受物理性傷害大大降低的

一種胚胎冷凍方法。

3.4

慢速降溫冷凍Slow-freezing

利用含有低濃度的滲透性抗凍保護(hù)劑溶液處理胚胎，然后將胚胎裝入冷凍載體并按照一定程序于程

序冷凍儀中植冰和降溫，最后置于液氮中保存的一種冷凍方法。

3.5

體外受精胚invitro-fertilizedembryo

通過(guò)體外受精獲得的胚胎。

4胚胎生產(chǎn)

1

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4.1超數(shù)排卵胚生產(chǎn)

4.1.1藥品與器械的準(zhǔn)備

孕酮陰道栓（CIDR）、氯前列烯醇（PGF2α）、促卵泡素（FSH）、人絨毛膜促性腺激素（HCG）

（或促黃體素（LH），或促排3號(hào)）、青霉素、鏈霉素、復(fù)合麻醉劑、PBS液（附錄A1）、沖胚液

（附錄A2）、胚胎操作液（附錄A3）、生理鹽水、75%酒精、碘酊；手術(shù)臺(tái)、植栓槍、羊用沖胚

管、滯留針（18G）、手術(shù)剪、手術(shù)刀、止血鉗、縫針（圓針、三棱針）、外科手術(shù)縫線、注射器、

體視顯微鏡、恒溫臺(tái)、檢胚皿、培養(yǎng)皿

4.1.2供體母羊選擇

所選用供體母羊必須符合品種要求或標(biāo)準(zhǔn)（有國(guó)標(biāo)或地標(biāo)的品種，參照品種標(biāo)準(zhǔn)），連續(xù)三代內(nèi)系

譜清楚、健康無(wú)病，發(fā)育到性成熟后，繁殖機(jī)能正常的個(gè)體。

4.1.3飼養(yǎng)管理

保持飼養(yǎng)環(huán)境適宜、衛(wèi)生、溫度穩(wěn)定，避免應(yīng)激；制定合理的供體羊日糧配方，保證蛋白質(zhì)、能量、

維生素和微量元素等營(yíng)養(yǎng)平衡，保持中等膘情；供給清潔飲水，適當(dāng)運(yùn)動(dòng)。

4.1.4超數(shù)排卵

用植栓槍將CIDR（含孕酮300mg～500mg）放入供體母羊陰道內(nèi)，放置CIDR之日為0d，第9d第二次補(bǔ)

栓，第15d起早晚間隔12h肌肉注射FSH，注射總量100IU～200IU（或10mg～15mg），每天按照總量的5:3:2

遞減連續(xù)注射3d，第16d上午注射完FSH后立即撤CIDR，同時(shí)注射氯前列烯醇2ml。孕酮、FSH具體計(jì)量見(jiàn)

下表：孕酮、FSH具體計(jì)量見(jiàn)表1。

表1孕酮、FSH具體計(jì)量

CIDR中孕酮FSH

體型品種

地方品種培育品種地方品種培育品種

大型500mg400mg200IU/15mg150IU/13mg

中型450mg350mg175IU/13.5mg125IU/11.5mg

小型400mg300mg150IU/12mg100IU/10mg

4.1.5發(fā)情鑒定與誘導(dǎo)排卵

注射完FSH后，觀察母羊發(fā)情情況。對(duì)有發(fā)情征兆的母羊，采用公羊試情，以供體母羊愿意接受試

情公羊爬跨，判斷為發(fā)情。做好發(fā)情時(shí)間記錄，同時(shí)靜脈注射HCG500IU～800IU，或肌注LH50IU～100IU，

或肌注促排3號(hào)10μg～20μg。誘導(dǎo)排卵激素具體劑量見(jiàn)下表：

誘導(dǎo)排卵激素具體劑量見(jiàn)表1。

表2誘導(dǎo)排卵激素具體劑量

HCGLH促排3號(hào)

體型品種

地方品種培育品種地方品種培育品種地方品種培育品種

大型800IU700IU100IU80IU20μg16μg

中型700IU600IU85IU65IU18μg14μg

小型600IU500IU70IU50IU16μg10μg

2

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4.1.6配種

可采用自然交配或人工授精進(jìn)行發(fā)情母羊的配種。自然交配配種2次，人工授精輸精3次。發(fā)情

時(shí)立即配種1次，每間隔12h再配第2或第3次。人工授精，可使用鮮精或凍精，鮮精活力≥0.7以上，

凍精解凍后活力≥0.3，每次輸精有效精子數(shù)不低于3×107個(gè)，輸精容積0.5ml～1ml。

4.1.7手術(shù)沖胚

采用NY/T1571中5.1部分。

4.2體外受精胚生產(chǎn)

4.2.1藥品和器械的準(zhǔn)備

超數(shù)排卵藥品、消毒藥品、外科手術(shù)器械和常用器械見(jiàn)4.1.1。肝素、卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液、

體外受精液、早期胚胎體外培養(yǎng)液；CO2培養(yǎng)箱、CO2鋼瓶、超凈工作臺(tái)。

4.2.2卵母細(xì)胞收集

4.2.2.1活體取卵

按照4.1.2選擇供體母羊，按照4.1.4對(duì)供體母羊進(jìn)行超數(shù)排卵處理。在第6次注射FSH前12h禁食，

最后1次FSH注射12h，參見(jiàn)NY/T1571中5.1中外科手術(shù)方法暴露卵巢，用生理鹽水浸潤(rùn)的紗布包裹

卵巢，用預(yù)吸有抽卵液（附錄A4），用帶12號(hào)針頭的5ml注射器抽吸卵巢上所有直徑3mm～6mm

的有腔卵泡中的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）和卵泡液，抽吸完后將抽吸物盛在直徑60mm的培

養(yǎng)皿中。

4.2.2.2屠宰場(chǎng)收集卵巢

選擇符合品種要求、系譜清楚的淘汰母羊，屠宰后收集卵巢，放入含有1000IU/ml青霉素和

1000μg/ml鏈霉素的生理鹽水或PBS液的保溫瓶中，4h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，然后參見(jiàn)4.2.2.1中的方法抽

吸卵母細(xì)胞。

4.2.3卵母細(xì)胞體外成熟

用卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液（附錄A5）于直徑35mm培養(yǎng)皿中制作60μl～80μl微滴，覆蓋礦物油

將，在CO2培養(yǎng)箱中平衡至少2h。將收集的COCs用卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液洗滌2次后移入微滴，每個(gè)

微滴放15枚～20枚COCs，然后轉(zhuǎn)入38.5℃、100%濕度和5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，經(jīng)透明質(zhì)

酸酶處理脫去卵丘細(xì)胞，于體視顯微鏡下觀察，排出第一極體者為成熟卵母細(xì)胞。

4.2.4精液收集與準(zhǔn)備

在體外受精前30min收集新鮮精液或冷凍精液，精液來(lái)源公羊系譜清楚，且鮮精活力≥0.7以上，

凍精解凍后活力≥0.3。將精子洗滌液（附錄A6）與精液按照1:1的比例緩慢加入精液，混勻后1000

rpm×5min離心洗滌2次，然后將精子的密度用精子獲能與體外受精液（附錄A7）調(diào)至4×106個(gè)/ml～

6×106個(gè)/ml。

4.2.5獲能與體外受精

3

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將20個(gè)～30個(gè)成熟的卵母細(xì)胞移入用50μl精子獲能與體外受精液（附錄A7）制成的受精液滴

中，然后加入2μl調(diào)節(jié)好密度的精液到每個(gè)液滴，在38.5℃、100%濕度和5%的CO2的條件下精卵

孵育18h～22h。

4.2.6早期胚胎培養(yǎng)

將與精子孵育后的卵子（假定的受精卵）在SOF液中洗滌２次后，移入預(yù)先在培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)先平

衡了2h的早期胚胎培養(yǎng)液（附錄A8）制成的滴內(nèi)。將20枚～25枚受精卵分別移入100μl的發(fā)育培

養(yǎng)液，在38.5℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4d～8d至桑椹胚或囊胚階段。

5胚胎質(zhì)量檢測(cè)

按照NY/T1674的規(guī)定執(zhí)行。

6胚胎冷凍保存

將質(zhì)量檢測(cè)為A級(jí)的胚胎進(jìn)行冷凍保存,低于A級(jí)的作為鮮胚進(jìn)行移植。對(duì)于沒(méi)有胚胎處理實(shí)驗(yàn)

室的生產(chǎn)場(chǎng)采用慢速降溫冷凍保存，對(duì)于擁有胚胎處理實(shí)驗(yàn)室的生產(chǎn)場(chǎng)和其他機(jī)構(gòu)，采用玻璃化冷

凍保存。

6.1慢速降溫冷凍保存

6.1.1藥品與器械的準(zhǔn)備

0.5mol/L的蔗糖溶液（附錄A9）、1.6mol/L的乙二醇冷凍保存液（慢速冷凍保存液）（附錄A10）；

細(xì)管、細(xì)管塞、檢胚針、裝管器、液氮罐、程控降溫儀，以及解剖顯微鏡。

6.1.2裝管

將胚胎移入慢速冷凍保存液制成的液滴中，平衡10min后，用0.25ml細(xì)管采用三段或五段裝管

法（附錄B）裝管，胚胎裝在中間段的冷凍保存液中，兩邊的液體是0.5mol/L的蔗糖溶液。

6.1.3冷凍

將裝有胚胎的細(xì)管放入程控降溫儀；從室溫（20℃）經(jīng)10min降溫到0℃，經(jīng)過(guò)15min降到-8℃；

平衡10min，經(jīng)過(guò)45min從-8℃緩慢降溫到-30℃；平衡10min，從-30℃經(jīng)10min降溫到-35℃；平衡

5min后直接投入液氮中保存。

6.2玻璃化冷凍保存

6.2.1藥品與器械的準(zhǔn)備

0.5mol/L的蔗糖溶液（附錄A9）、10%乙二醇PBS液（附錄A11）、EFS30冷凍保存液（附錄A12），

細(xì)管、細(xì)管塞、檢胚針、裝管器、液氮罐，以及解剖顯微鏡。

6.2.2細(xì)管玻璃化冷凍

將胚胎移入10%乙二醇冷凍液平衡5min，然后移入EFS30冷凍保存液中平衡1min后，迅速按照

附錄B2示意圖裝管、封口后，迅速直接投入液氮中。

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6.3包裝要求

將冷凍胚胎裝塑料指形管，在塑料指形管上標(biāo)記供體母羊號(hào)、數(shù)量、與配公羊號(hào)（或凍精號(hào)）

及生產(chǎn)日期。

7解凍

7.1慢速冷凍保存胚胎的解凍

將冷凍胚胎細(xì)管在空氣中停留10s，放入35℃水浴鍋解凍10s，拔去細(xì)管塞在解凍后1min～5min

內(nèi)完成移植。

7.2玻璃化冷凍解凍

將細(xì)管從液氮罐取出，在空氣中停留5s；放入30℃水浴鍋中直至蔗糖溶液段由白色變?yōu)闊o(wú)色時(shí)

取出細(xì)管用力甩動(dòng)，使細(xì)管中液體充分混合；拔去細(xì)管塞，將胚胎在1min～5min內(nèi)完成移植。

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A

A

附錄A

（資料性）

各種液體配制

A.1PBS液（磷酸鹽緩沖液）

8mg/mlNaCl,0.20mg/mlKCl,1.14mg/mlNa2HPO4,0.2mg/mlKH2PO4，配制好后0.22μm濾膜過(guò)濾

4℃保存。

A.2沖胚液

0.1mg/ml聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+0.025mg/ml卡拉霉素的PBS溶液，配制好后0.22μm濾膜過(guò)濾4℃保

存。臨用時(shí)維持在35～37℃。

A.3胚胎操作液

M199*+5mg/ml4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)+5%（v/v）胎牛血清(FBS)+100IU/ml青霉素+100μg/ml

鏈霉素,然后0.22μm濾膜過(guò)濾4℃保存。臨用時(shí)維持在35～37℃。

*M199：通用型商品化的細(xì)胞培養(yǎng)液Medium199。

A.4卵母細(xì)胞抽吸液

M199+10%（v/v）FBS+25IU/ml肝素+50μg/ml硫酸慶大霉素。

A.5卵母細(xì)胞成熟液

M199+0.12mg/ml丙酮酸鈉+10μg/ml促卵泡素(FSH)+20μg/ml促黃體生成素(LH)+1μg/ml雌二醇

(E2)+10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)+10%發(fā)情山羊血清(EGS)+100IU/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素，然后

0.22μm濾膜過(guò)濾4℃保存。制成培養(yǎng)液滴臨用前培養(yǎng)箱中平衡2h。

A.6精子洗滌液（SOF液）

6.30mg/mlNaCl+0.53mg/mlKCl+0.16mg/mlKH2PO4+2.11mg/mlNaHCO3+0.25mg/mlCaCl2·2H2O+0.1mg/

mlMgCl2·6H2O+0.642ml60%(w/v)的乳酸鈉+0.036mg/ml丙酮酸鈉+0.27mg/ml葡萄糖+3mg/ml牛血清白蛋

白(BSA)+100IU/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素，然后0.22μm濾膜過(guò)濾4℃保存。

A.7獲能與體外受精液

SOF+10%發(fā)情山羊血清（EGS）+5μg/ml肝素+4μg/ml慶大霉素

A.8早期胚胎培養(yǎng)液

SOF+0.2mM丙酮酸鈉+8mg/ml牛血清白蛋白(BSA)+20μL/mlMEM*+10μL/mlBME*+100IU/ml青霉素

+100ug/ml鏈霉素，然后用0.22μm濾膜過(guò)濾4℃保存。

*商品化培養(yǎng)液：MEM：MinimumEssentialMedium液；BME：BasalMediumEagle’s液。

A.90.5mol/L的蔗糖溶液

將17.15g蔗糖溶解于100ml的PBS液中，4℃保存，臨用前平衡到室溫。

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A.101.6mol/L的乙二醇冷凍保存液（慢速冷凍保存液）

A.1110%乙二醇PBS液

按照體積比配制10%的乙二醇PBS液，然后用0.22μm濾膜過(guò)濾4℃保存，臨用前平衡到室溫。

A.12EFS30液（玻璃化冷凍保存液）

首先用0.5mol/L的蔗糖溶液，配制30%（w/v）Ficoll70000(聚蔗糖)溶液作為FS液，然后在取70ml

的FS液中加入30ml乙二醇,制成EFS30液，4℃保存，臨用前平衡到室溫。

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B

B

附錄B

（資料性）

胚胎裝管示意圖

慢速冷凍裝管示意圖見(jiàn)圖B.1。

圖B.1慢速冷凍裝管示意圖

①棉線，②聚乙烯粉末，③0.5mol/L的蔗糖溶液，④空氣，⑤帶胚胎的冷凍保存液，⑥細(xì)管塞

玻璃化冷凍裝管示意圖見(jiàn)圖B.2。

圖B.2玻璃化冷凍裝管示意圖

①棉線，②聚乙烯粉末，③空氣（長(zhǎng)度0.5cm），④帶胚胎的EFS30液（長(zhǎng)度：0.6cm），⑤EFS30

液（長(zhǎng)度：0.4cm），⑥0.5mol/L的蔗糖溶液（長(zhǎng)度：7.5cm）,⑦細(xì)管塞

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F

C

附錄C

（資料性）

檢胚記錄表

胚胎記錄表見(jiàn)表C.1。

表C.1胚胎記錄表

品種：日期：記錄人：

供體號(hào)母羊：公羊：

超排情況黃體數(shù)：左側(cè)右側(cè)卵泡數(shù)：左側(cè)右側(cè)其他：

可用胚胎數(shù)不可用胚胎數(shù)未

等2-8退受

鮮胚總數(shù)EMMCMEBBLEXB總數(shù)

級(jí)細(xì)胞化精

獲卵數(shù)

質(zhì)量A

評(píng)定B