基于CHO-K1細(xì)胞的重組乙肝表面S抗原表達(dá)與克隆篩選優(yōu)化策略研究一、緒論1.1研究背景與意義乙肝，作為一種由乙型肝炎病毒（HBV）引發(fā)的肝臟感染疾病，在全球范圍內(nèi)肆虐，給人類健康帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計，全球感染人數(shù)多達(dá)3億，其引發(fā)的肝硬化、肝癌等嚴(yán)重疾病，已然成為了嚴(yán)峻的全球公共衛(wèi)生問題。在中國，乙肝病毒攜帶者的數(shù)量曾長期處于高位，盡管隨著防控措施的加強，感染率有所下降，但乙肝的防治工作仍然任重道遠(yuǎn)。乙肝病毒主要通過血液、母嬰和性傳播，這使得它的傳播途徑較為隱匿，難以有效預(yù)防。一旦感染乙肝，患者可能會經(jīng)歷急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌的發(fā)展過程。肝硬化會導(dǎo)致肝臟功能逐漸喪失，引發(fā)腹水、肝性腦病等嚴(yán)重并發(fā)癥；肝癌則是乙肝患者面臨的最致命威脅，其死亡率極高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和壽命。這些不僅給患者個人帶來了身心上的巨大痛苦，也給家庭和社會造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。為了預(yù)防和治療乙肝疾病，醫(yī)學(xué)科研人員進(jìn)行了不懈的努力，研發(fā)出了多種乙肝疫苗。其中，基于重組乙肝表面S抗原（rHBsAg）的疫苗被公認(rèn)為是最安全和最有效的預(yù)防乙肝的方法。重組乙肝表面S抗原能夠刺激人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體，當(dāng)乙肝病毒入侵時，這些抗體可以迅速識別并中和病毒，從而保護(hù)人體免受感染。rHBsAg可以通過重組技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)，而在眾多的生產(chǎn)宿主細(xì)胞中，CHO-K1細(xì)胞表達(dá)rHBsAg展現(xiàn)出了極大的潛力。CHO-K1細(xì)胞屬于中國倉鼠卵巢細(xì)胞系，是重組蛋白制備中常用的宿主細(xì)胞之一。它具有代謝穩(wěn)定的特點，能夠在不同的培養(yǎng)條件下保持相對穩(wěn)定的生長和代謝狀態(tài)，這為rHBsAg的穩(wěn)定表達(dá)提供了良好的基礎(chǔ)；容易培養(yǎng)的特性使得CHO-K1細(xì)胞能夠在常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)條件下快速增殖，降低了生產(chǎn)成本和培養(yǎng)難度；可擴(kuò)展性強意味著它能夠適應(yīng)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)需求，從實驗室規(guī)模的小量培養(yǎng)順利過渡到大規(guī)模的生產(chǎn)培養(yǎng)；適應(yīng)性廣則體現(xiàn)在它對多種培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)能力上，能夠根據(jù)不同的生產(chǎn)需求進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。因此，深入探討在CHO-K1細(xì)胞中表達(dá)、純化和克隆rHBsAg的方法，對于提高乙肝疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本，具有重要的現(xiàn)實意義。通過本研究，有望為乙肝疫苗的生產(chǎn)提供更加高效、穩(wěn)定的技術(shù)手段，從而為全球乙肝的防控工作做出積極貢獻(xiàn)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在重組乙肝表面S抗原于CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)與克隆篩選領(lǐng)域，國內(nèi)外科研人員已取得了諸多顯著成果，為乙肝疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)提供了堅實的理論與技術(shù)支撐。在表達(dá)策略方面，國內(nèi)外研究均聚焦于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染與臨時轉(zhuǎn)染兩種主要方式。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染憑借其可使外源基因穩(wěn)定整合至宿主細(xì)胞基因組的特性，在大規(guī)模生產(chǎn)中備受青睞。國外有研究團(tuán)隊通過優(yōu)化穩(wěn)定轉(zhuǎn)染條件，成功提高了重組乙肝表面S抗原在CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)水平，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好基礎(chǔ)。國內(nèi)也有學(xué)者致力于此，通過對轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染時間等參數(shù)的細(xì)致研究，進(jìn)一步提升了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的效率和穩(wěn)定性。臨時轉(zhuǎn)染則以其操作簡便、周期短的優(yōu)勢，在小規(guī)模實驗室研究中發(fā)揮著重要作用，常用于快速驗證基因表達(dá)的可行性和初步探索表達(dá)條件。在克隆篩選方法上，限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）、PCR分析、Westernblot和ELISA等方法被廣泛應(yīng)用。國外科研人員運用RFLP技術(shù)，能夠精準(zhǔn)分析克隆的基因結(jié)構(gòu)，有效篩選出攜帶正確基因片段的克隆。國內(nèi)研究人員則通過優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和條件，提高了PCR分析的靈敏度和特異性，實現(xiàn)了對重組乙肝表面S抗原克隆的高效篩選。Westernblot可從蛋白質(zhì)水平對目的蛋白進(jìn)行檢測和分析，直觀地展示重組乙肝表面S抗原的表達(dá)情況；ELISA則憑借其高靈敏度和特異性，能夠?qū)Ρ磉_(dá)的抗原進(jìn)行定量檢測，為克隆篩選提供了準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。然而，當(dāng)前研究仍存在一些不足之處。一方面，盡管各種表達(dá)策略和克隆篩選方法在一定程度上取得了成功，但重組乙肝表面S抗原的表達(dá)效率和穩(wěn)定性仍有待進(jìn)一步提高。例如，在CHO-K1細(xì)胞中，重組乙肝表面S抗原的表達(dá)量受到多種因素的影響，如基因轉(zhuǎn)錄效率、mRNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)翻譯和折疊等，如何優(yōu)化這些因素以提高表達(dá)量，仍是亟待解決的問題。另一方面，對于CHO-K1細(xì)胞表達(dá)重組乙肝表面S抗原的機(jī)制研究還不夠深入，這限制了對表達(dá)系統(tǒng)的進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)。此外，在克隆篩選過程中，如何快速、準(zhǔn)確地篩選出高表達(dá)、高穩(wěn)定性的克隆，也是需要進(jìn)一步研究的方向。1.3研究內(nèi)容與方法本研究聚焦于重組乙肝表面S抗原在CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)、克隆篩選，主要涵蓋以下幾個關(guān)鍵方面。在表達(dá)載體構(gòu)建環(huán)節(jié)，依據(jù)乙肝表面S抗原的基因序列信息，運用基因合成技術(shù)精心設(shè)計重組乙肝表面S抗原的基因。為確保基因后續(xù)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程順利進(jìn)行，在基因的5'和3'末端分別加入CDS和AAS框架序列。將此基因與轉(zhuǎn)錄、翻譯所需的正常啟動子、信號序列、調(diào)控子以及質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控基因等元件巧妙結(jié)合，從而構(gòu)建出重組乙肝表面S抗原基因的表達(dá)載體。此過程中，對各個元件的選擇和組合進(jìn)行了細(xì)致的考量，以保障表達(dá)載體的高效性和穩(wěn)定性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染方面，將處于良好生長狀態(tài)的CHO-K1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時，把構(gòu)建好的重組乙肝表面S抗原基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至CHO-K1細(xì)胞中。為探尋最適宜本實驗的轉(zhuǎn)染條件，以實現(xiàn)重組乙肝表面S抗原的高表達(dá)，采用不同的轉(zhuǎn)染試劑或方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率的比較。在比較過程中，對轉(zhuǎn)染試劑的種類、用量，轉(zhuǎn)染時間、溫度等參數(shù)進(jìn)行了嚴(yán)格的控制和記錄，通過多次重復(fù)實驗，最終確定了最佳的轉(zhuǎn)染條件。表達(dá)檢測采用Westernblot技術(shù)。待轉(zhuǎn)染后的CHO-K1細(xì)胞生長至80-90%時，小心收集細(xì)胞并制備蛋白提取液。利用Westernblot技術(shù)對CHO-K1細(xì)胞中重組乙肝表面S抗原的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，以此確認(rèn)重組基因轉(zhuǎn)染后的效果。在檢測過程中，對蛋白提取、電泳分離、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育等步驟進(jìn)行了嚴(yán)格的操作，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性?？乖兓x用Ni-NTA柱進(jìn)行。在確認(rèn)重組乙肝表面S抗原成功表達(dá)的基礎(chǔ)上，使用Ni-NTA柱對其進(jìn)行純化。將經(jīng)純化后的重組乙肝表面S抗原進(jìn)行SDS分離，通過此操作確定表達(dá)蛋白的相對分子質(zhì)量和純度。在純化過程中，對Ni-NTA柱的平衡、上樣、洗滌、洗脫等步驟進(jìn)行了優(yōu)化，以提高純化效果?？寺『Y選采用多種方法相結(jié)合。首先，運用限制性內(nèi)切酶消化技術(shù)，將含有重組乙肝表面S抗原的基因與T-vec連接，隨后選擇陽性克隆。接著，把完整的重組乙肝表面S抗原片段及轉(zhuǎn)錄元件克隆到所有細(xì)胞中，以此驗證轉(zhuǎn)入重組乙肝表面S抗原后其在細(xì)胞水平的表達(dá)和外露水平。最后，采用expression定量PCR技術(shù)，利用測序儀評估NIH3T3和CHO細(xì)胞株中重組乙肝表面S抗原外部表達(dá)區(qū)域的選擇性表達(dá)。在克隆篩選過程中，對每種方法的實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化，以提高篩選效率和準(zhǔn)確性。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1CHO-K1細(xì)胞特性與培養(yǎng)CHO-K1細(xì)胞，作為中國倉鼠卵巢細(xì)胞系的重要亞克隆，在生物制藥和重組蛋白表達(dá)領(lǐng)域占據(jù)著舉足輕重的地位。它于1957年由TheodorePuck在波士頓癌癥研究基金會實驗室首次從成年雌性中國倉鼠的卵巢組織中分離獲得，自誕生以來，憑借其獨特的生物學(xué)特性，逐漸成為實驗室研究和工業(yè)生產(chǎn)中的關(guān)鍵工具。從細(xì)胞特性來看，CHO-K1細(xì)胞具有諸多優(yōu)勢。在生長特性方面，它能夠在貼壁和懸浮兩種培養(yǎng)方式下良好生長。貼壁培養(yǎng)時，細(xì)胞能緊密附著在培養(yǎng)器皿表面，有序地進(jìn)行生長和增殖，這種培養(yǎng)方式有利于細(xì)胞與營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸，保證細(xì)胞的正常代謝。懸浮培養(yǎng)則展現(xiàn)出其在大規(guī)模培養(yǎng)中的潛力，細(xì)胞能夠在培養(yǎng)液中自由懸浮，均勻地分布在培養(yǎng)體系中，使得細(xì)胞的生長更加均勻，易于實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，為大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白提供了便利條件。CHO-K1細(xì)胞的營養(yǎng)需求相對特殊。1968年的研究揭示了其缺乏合成甘氨酸的關(guān)鍵基因，這就意味著在培養(yǎng)過程中，必須在培養(yǎng)基中額外補充脯氨酸，以滿足細(xì)胞生長和代謝的需求。只有提供了充足的脯氨酸，細(xì)胞才能正常進(jìn)行蛋白質(zhì)合成等重要生理過程，維持其正常的生長和增殖。在翻譯后修飾能力上，CHO-K1細(xì)胞表現(xiàn)出色。它能夠?qū)Ρ磉_(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)雜的翻譯后修飾，生成與人類蛋白質(zhì)相似的糖蛋白。這種修飾能力使得表達(dá)的重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白，具有更好的生物相容性和藥物活性。例如，在生產(chǎn)某些治療性蛋白質(zhì)時，CHO-K1細(xì)胞對蛋白質(zhì)的糖基化修飾能夠增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和活性，提高藥物的療效。CHO-K1細(xì)胞的培養(yǎng)條件也有一定的要求。在培養(yǎng)基的選擇上，常用Ham'sF-12K培養(yǎng)基，并添加10%的胎牛血清（FBS）和1%的青霉素-鏈霉素（P/S）。Ham'sF-12K培養(yǎng)基富含多種營養(yǎng)成分，能夠為細(xì)胞的生長提供必要的氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等；胎牛血清則提供了細(xì)胞生長所需的生長因子、激素等物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和代謝；青霉素-鏈霉素的添加則有效防止了細(xì)菌的污染，保證了細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。培養(yǎng)環(huán)境的控制也至關(guān)重要。細(xì)胞培養(yǎng)需要在37℃的恒溫環(huán)境下進(jìn)行，這是因為37℃接近中國倉鼠的體溫，能夠為細(xì)胞提供最適宜的生長溫度。同時，培養(yǎng)箱內(nèi)的氣體環(huán)境需要嚴(yán)格控制，通常維持95%空氣和5%CO?的比例。5%的CO?能夠維持培養(yǎng)基的pH值在合適的范圍內(nèi)，保證細(xì)胞的正常代謝和生長。如果CO?濃度過高或過低，都會影響培養(yǎng)基的pH值，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長和存活。在細(xì)胞傳代方面，當(dāng)CHO-K1細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，就需要進(jìn)行傳代操作，以保證細(xì)胞有足夠的生長空間和營養(yǎng)物質(zhì)。傳代時，可以采用多種方法，如收集細(xì)胞后離心，去除上清液，用適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后按1:2至1:5的比例分至新的培養(yǎng)瓶中，并補充足夠的培養(yǎng)基；也可以采用半數(shù)換液方式，棄去一半培養(yǎng)基，輕輕懸起細(xì)胞，將懸液按1:2至1:3的比例分裝至新的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，再加入適量培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。這些傳代方法能夠有效地維持細(xì)胞的生長狀態(tài)，保證細(xì)胞的持續(xù)增殖。2.2重組乙肝表面S抗原概述乙肝表面S抗原，作為乙肝病毒（HBV）的重要組成部分，在乙肝病毒的感染過程中扮演著關(guān)鍵角色。它是乙肝病毒包膜上的一種復(fù)合蛋白質(zhì)，由S基因編碼，包含226個氨基酸。其結(jié)構(gòu)獨特，具有高度的免疫原性，能夠刺激人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體，這些抗體在乙肝病毒感染的預(yù)防和治療中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。從結(jié)構(gòu)上看，乙肝表面S抗原具有多個重要的抗原決定簇，其中a決定簇是其最主要的抗原決定簇，位于氨基酸序列的第124-147位。a決定簇具有高度的保守性，在不同的乙肝病毒株中序列差異較小，這使得它成為乙肝疫苗設(shè)計和免疫診斷的關(guān)鍵靶點。除了a決定簇外，乙肝表面S抗原還包含其他一些抗原決定簇，如d/y和w/r決定簇，這些決定簇的存在增加了乙肝表面S抗原的抗原多樣性，也為乙肝病毒的分型和檢測提供了依據(jù)。在乙肝病毒的感染過程中，乙肝表面S抗原發(fā)揮著重要的功能。它是乙肝病毒入侵肝細(xì)胞的關(guān)鍵分子，通過與肝細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，介導(dǎo)乙肝病毒進(jìn)入肝細(xì)胞，從而啟動感染過程。乙肝表面S抗原還參與了乙肝病毒的組裝和釋放過程，對于乙肝病毒在體內(nèi)的傳播和擴(kuò)散起著重要作用。重組乙肝表面S抗原則是通過基因工程技術(shù)制備得到的。其制備過程主要包括以下步驟：首先，從乙肝病毒基因組中克隆出S抗原基因，然后將該基因插入到合適的表達(dá)載體中，構(gòu)建成重組表達(dá)載體。接著，將重組表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，如CHO-K1細(xì)胞，通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)使宿主細(xì)胞表達(dá)重組乙肝表面S抗原。最后，采用適當(dāng)?shù)姆蛛x純化技術(shù)，從細(xì)胞培養(yǎng)物中提取和純化重組乙肝表面S抗原，得到高純度的重組乙肝表面S抗原產(chǎn)品。重組乙肝表面S抗原的制備具有重要的意義。它為乙肝疫苗的生產(chǎn)提供了可靠的抗原來源，相較于傳統(tǒng)的血源性乙肝疫苗，重組乙肝疫苗具有更高的安全性和穩(wěn)定性，避免了血源傳播疾病的風(fēng)險。重組乙肝表面S抗原在乙肝的診斷和治療領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用。在診斷方面，它被用于乙肝病毒感染的血清學(xué)檢測，如ELISA、化學(xué)發(fā)光免疫分析等方法，通過檢測血清中的乙肝表面S抗原，可以快速、準(zhǔn)確地判斷個體是否感染乙肝病毒。在治療方面，重組乙肝表面S抗原可以作為免疫治療的靶點，通過激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，增強機(jī)體對乙肝病毒的清除能力，為乙肝的治療提供新的思路和方法。2.3基因表達(dá)與克隆篩選原理基因表達(dá)，作為遺傳信息傳遞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是指基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯等一系列復(fù)雜過程，指導(dǎo)合成具有特定功能產(chǎn)物的過程。在這一過程中，遺傳信息從DNA傳遞到RNA，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)基因?qū)ι镄誀畹目刂?。基因表達(dá)的基本過程始于轉(zhuǎn)錄。在轉(zhuǎn)錄過程中，以DNA的一條鏈為模板，在RNA聚合酶的作用下，按照堿基互補配對原則，合成RNA。對于真核生物而言，轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行，RNA聚合酶需要識別特定的啟動子序列，并在一系列轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)助下，啟動轉(zhuǎn)錄過程。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA，包括mRNA、rRNA和tRNA等，它們在后續(xù)的基因表達(dá)過程中發(fā)揮著不同的作用。mRNA作為蛋白質(zhì)合成的模板，攜帶了從DNA轉(zhuǎn)錄而來的遺傳信息；rRNA參與核糖體的組成，是蛋白質(zhì)合成的場所；tRNA則負(fù)責(zé)將氨基酸轉(zhuǎn)運到核糖體上，參與蛋白質(zhì)的合成。轉(zhuǎn)錄完成后，mRNA需要進(jìn)行一系列的加工修飾，才能成為成熟的mRNA，進(jìn)而進(jìn)行翻譯過程。這些加工修飾包括5'端加帽、3'端加尾和剪接等。5'端加帽可以保護(hù)mRNA免受核酸外切酶的降解，增強mRNA的穩(wěn)定性，同時有助于mRNA與核糖體的結(jié)合；3'端加尾則可能有助于mRNA從核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運，避免在細(xì)胞中受到核酶的降解。剪接過程則是去除mRNA中的內(nèi)含子，將外顯子連接起來，形成成熟的mRNA。翻譯是基因表達(dá)的另一個關(guān)鍵步驟。在翻譯過程中，核糖體結(jié)合到mRNA上，以mRNA為模板，按照密碼子的順序，將氨基酸連接成多肽鏈。tRNA攜帶特定的氨基酸，通過其反密碼子與mRNA上的密碼子互補配對，將氨基酸轉(zhuǎn)運到核糖體上，參與多肽鏈的合成。隨著核糖體在mRNA上的移動，多肽鏈逐漸延伸，直到遇到終止密碼子，翻譯過程結(jié)束，合成出完整的蛋白質(zhì)。克隆篩選，作為獲取含有目的基因克隆的重要手段，在基因工程中具有舉足輕重的地位。其原理是基于不同克隆在某些特性上的差異，通過特定的方法將含有目的基因的克隆從眾多克隆中篩選出來。在重組乙肝表面S抗原的克隆篩選中，常用的方法包括限制性內(nèi)切酶消化、PCR分析等。限制性內(nèi)切酶消化是一種常用的克隆篩選方法。限制性內(nèi)切酶能夠識別特定的DNA序列，并在特定的位點切割DNA。在重組乙肝表面S抗原的克隆篩選中，將含有重組乙肝表面S抗原的基因與T-vec連接后，用特定的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化。如果連接成功，限制性內(nèi)切酶會在特定的位點切割DNA，產(chǎn)生特定長度的DNA片段；如果連接失敗，限制性內(nèi)切酶則不會切割或產(chǎn)生不同長度的DNA片段。通過凝膠電泳分析這些DNA片段的大小和數(shù)量，就可以判斷克隆是否含有目的基因。PCR分析也是一種重要的克隆篩選方法。PCR技術(shù)能夠在體外快速擴(kuò)增特定的DNA片段。在重組乙肝表面S抗原的克隆篩選中，設(shè)計特異性引物，以克隆的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果克隆中含有目的基因，引物會與目的基因的特定區(qū)域結(jié)合，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生特定長度的DNA片段；如果克隆中不含有目的基因，引物則無法結(jié)合，不會產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。通過凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的有無和大小，就可以篩選出含有目的基因的克隆。除了限制性內(nèi)切酶消化和PCR分析外，還可以采用其他方法進(jìn)行克隆篩選，如藍(lán)白斑篩選、陽性克隆篩選等。藍(lán)白斑篩選是利用載體上的lacZ基因與宿主細(xì)胞的α-互補作用，當(dāng)外源DNA插入到載體的多克隆位點后，會破壞lacZ基因的α-互補能力，導(dǎo)致含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落，而不含重組質(zhì)粒的細(xì)菌則形成藍(lán)色菌落，從而實現(xiàn)對重組克隆的篩選。陽性克隆篩選則是在載體的MCS中含有一個對于細(xì)菌宿主致命的基因，當(dāng)插入片段成功連接到MCS內(nèi)的致命基因上，可阻止其表達(dá)，從而確保只帶有插入片段的轉(zhuǎn)化細(xì)胞才能存活，實現(xiàn)對陽性克隆的篩選。三、重組乙肝表面S抗原在CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)3.1表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的構(gòu)建是實現(xiàn)重組乙肝表面S抗原在CHO-K1細(xì)胞中成功表達(dá)的關(guān)鍵起始步驟，其過程猶如搭建一座精密的分子大廈，每一個環(huán)節(jié)都需精心設(shè)計與精準(zhǔn)操作。首要任務(wù)是依據(jù)乙肝病毒S基因序列進(jìn)行引物設(shè)計。這一過程要求對S基因序列進(jìn)行深入剖析，充分考量基因的結(jié)構(gòu)特點、堿基組成以及后續(xù)實驗的需求。通過專業(yè)的生物信息學(xué)軟件，如PrimerPremier5.0等，精確確定引物的序列和長度。引物的5'端和3'端需具備特定的序列特征，以滿足后續(xù)基因合成和克隆的要求。5'端可能會添加一些特定的限制性內(nèi)切酶識別位點，這些位點的選擇需綜合考慮表達(dá)載體上的多克隆位點情況，確保兩者能夠完美匹配，便于后續(xù)基因的插入和連接。3'端則需保證與S基因的互補配對準(zhǔn)確性，以確保在基因合成過程中能夠準(zhǔn)確地延伸和擴(kuò)增目的基因。完成引物設(shè)計后，借助先進(jìn)的基因合成技術(shù)獲取目的基因?；蚝铣杉夹g(shù)的發(fā)展日新月異，目前常用的方法是基于DNA合成儀的固相亞磷酰胺三酯法。在合成過程中，以設(shè)計好的引物為起點，按照堿基互補配對原則，依次將核苷酸連接起來，逐步合成完整的S基因。這一過程需要在嚴(yán)格控制的條件下進(jìn)行，包括反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、核苷酸濃度等參數(shù)的精確調(diào)控。反應(yīng)溫度通常在37℃左右，以保證DNA合成酶的活性；反應(yīng)時間則根據(jù)基因的長度和復(fù)雜程度進(jìn)行調(diào)整，一般需要數(shù)小時至數(shù)天不等；核苷酸濃度需保持在合適的范圍內(nèi)，過高或過低都可能影響合成的效率和準(zhǔn)確性。合成后的目的基因需要進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，采用DNA測序技術(shù)，將合成的基因序列與已知的乙肝病毒S基因序列進(jìn)行比對，確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性。獲取目的基因后，需將其與合適的表達(dá)載體連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。表達(dá)載體的選擇至關(guān)重要，需綜合考慮多種因素。對于在CHO-K1細(xì)胞中表達(dá)重組乙肝表面S抗原，常用的表達(dá)載體如pcDNA3.1(+)等。pcDNA3.1(+)載體具有強大的轉(zhuǎn)錄啟動子，如CMV啟動子，能夠高效地啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄過程。它還含有多個多克隆位點，這些位點為目的基因的插入提供了豐富的選擇，便于根據(jù)實驗需求靈活地構(gòu)建重組表達(dá)載體。此外，該載體還帶有篩選標(biāo)記基因，如氨芐青霉素抗性基因，這使得在后續(xù)的轉(zhuǎn)化和篩選過程中，能夠方便地篩選出含有重組表達(dá)載體的細(xì)胞。連接過程需使用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶。首先，用特定的限制性內(nèi)切酶對目的基因和表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切處理。選擇的限制性內(nèi)切酶需能夠在目的基因兩端和表達(dá)載體的多克隆位點處產(chǎn)生互補的粘性末端或平末端。例如，若選擇EcoRI和BamHI這兩種限制性內(nèi)切酶，EcoRI可在目的基因的一端切割出特定的粘性末端，BamHI則在另一端切割出與之互補的粘性末端。同時，表達(dá)載體的多克隆位點也需被這兩種酶切割，產(chǎn)生相同的粘性末端。酶切反應(yīng)需在適宜的緩沖液中進(jìn)行，反應(yīng)溫度和時間根據(jù)酶的特性進(jìn)行優(yōu)化。一般來說，酶切反應(yīng)溫度在37℃左右，反應(yīng)時間為1-3小時。酶切后的目的基因和表達(dá)載體片段需進(jìn)行純化處理，去除酶切反應(yīng)中的雜質(zhì)和未切割的DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳和膠回收試劑盒等方法進(jìn)行純化。將純化后的目的基因和表達(dá)載體片段在DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。DNA連接酶能夠催化目的基因和表達(dá)載體的粘性末端或平末端之間形成磷酸二酯鍵，從而將兩者連接成重組表達(dá)載體。連接反應(yīng)需在特定的緩沖液中進(jìn)行，加入適量的DNA連接酶和ATP等輔助因子。反應(yīng)溫度一般在16℃左右，反應(yīng)時間為12-16小時，以確保連接反應(yīng)的充分進(jìn)行。連接產(chǎn)物需進(jìn)行鑒定，采用PCR擴(kuò)增和酶切鑒定等方法。PCR擴(kuò)增可使用針對目的基因和表達(dá)載體的特異性引物，對連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。若擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，則初步表明目的基因已成功連接到表達(dá)載體上。酶切鑒定則是用相同的限制性內(nèi)切酶對連接產(chǎn)物進(jìn)行酶切，通過觀察酶切片段的大小和數(shù)量，進(jìn)一步驗證重組表達(dá)載體的構(gòu)建是否成功。3.2CHO-K1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染在成功構(gòu)建重組表達(dá)載體后，將其導(dǎo)入CHO-K1細(xì)胞是實現(xiàn)重組乙肝表面S抗原表達(dá)的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)染過程猶如一場精密的微觀“手術(shù)”，需要對每一個環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格把控，以確保外源基因能夠高效、穩(wěn)定地整合到細(xì)胞基因組中，并順利表達(dá)出目的蛋白。在轉(zhuǎn)染前，需對CHO-K1細(xì)胞進(jìn)行精心培養(yǎng)和傳代，為轉(zhuǎn)染實驗創(chuàng)造良好的細(xì)胞狀態(tài)。將凍存的CHO-K1細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，輕輕搖晃，使其快速解凍。解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量的含10%胎牛血清的Ham'sF-12K培養(yǎng)基，在1000rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液，以去除凍存保護(hù)劑。用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代操作。棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞完全脫落。加入5ml以上含10%血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，用適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1:2至1:5的比例分至新的培養(yǎng)瓶中，并補充足夠的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入CHO-K1細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法憑借其獨特的優(yōu)勢，在基因傳遞領(lǐng)域備受青睞。它利用脂質(zhì)體的雙層膜結(jié)構(gòu)，能夠有效地包裹外源核酸，形成脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物。這種復(fù)合物與細(xì)胞膜具有良好的親和性，可通過與細(xì)胞膜融合或內(nèi)吞作用，將外源核酸高效地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。其轉(zhuǎn)染效率較高，能夠滿足本實驗對重組乙肝表面S抗原高效表達(dá)的需求。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，當(dāng)CHO-K1細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine3000，它是一種新型的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，具有高效、低毒的特點。按照試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染液的制備。在無菌的EP管中，分別準(zhǔn)備A液和B液。A液用Opti-MEM無血清培養(yǎng)基稀釋重組表達(dá)載體，使其終濃度為1-5μg/μl，總體積為100μl。B液用相同的無血清培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine3000試劑，使其終濃度為2-10μl/μl，總體積也為100μl。將A液和B液輕輕混合，室溫下靜置10-15分鐘，使脂質(zhì)體與重組表達(dá)載體充分結(jié)合，形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體-重組表達(dá)載體復(fù)合物。在這一過程中，需注意操作的輕柔與準(zhǔn)確，避免產(chǎn)生氣泡，以免影響復(fù)合物的形成和轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染前，用2ml不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基漂洗CHO-K1細(xì)胞2次，以去除細(xì)胞表面殘留的血清和雜質(zhì)。加入1ml不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，將制備好的脂質(zhì)體-重組表達(dá)載體復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻，使復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞周圍。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育6-8小時。孵育期間，密切觀察細(xì)胞狀態(tài)，確保細(xì)胞在轉(zhuǎn)染過程中保持良好的生長環(huán)境。6-8小時后，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入含10%胎牛血清的Ham'sF-12K培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。為了探尋最適宜本實驗的轉(zhuǎn)染條件，以實現(xiàn)重組乙肝表面S抗原的高表達(dá)，對不同轉(zhuǎn)染試劑和條件對轉(zhuǎn)染效率的影響進(jìn)行了深入研究。除了使用Lipofectamine3000外，還選用了Lipofectamine2000和X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent等轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行對比實驗。在轉(zhuǎn)染試劑用量方面，分別設(shè)置了不同的梯度，如Lipofectamine3000的用量為2μl、4μl、6μl等。轉(zhuǎn)染時間也進(jìn)行了優(yōu)化，分別設(shè)置為4小時、6小時、8小時等。通過多次重復(fù)實驗，以綠色熒光蛋白（GFP）作為報告基因，利用熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測等方法，對不同轉(zhuǎn)染試劑和條件下的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了準(zhǔn)確評估。實驗結(jié)果表明，在本實驗條件下，使用Lipofectamine3000試劑，按照1:3的DNA與試劑比例，轉(zhuǎn)染6小時時，轉(zhuǎn)染效率最高，能夠獲得較高水平的重組乙肝表面S抗原表達(dá)。3.3表達(dá)檢測方法在重組乙肝表面S抗原于CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)研究中，準(zhǔn)確檢測其表達(dá)情況是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）等技術(shù)發(fā)揮著不可或缺的作用。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，是一種基于抗原-抗體特異性結(jié)合原理的蛋白質(zhì)檢測方法，它能夠從蛋白質(zhì)水平對重組乙肝表面S抗原的表達(dá)進(jìn)行定性和半定量分析。其基本原理是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）的分子篩效應(yīng)，根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的不同，將細(xì)胞裂解液中的各種蛋白質(zhì)分離開來。在電泳過程中，蛋白質(zhì)在電場的作用下向正極移動，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)移動速度較快，而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)則移動較慢。經(jīng)過一段時間的電泳，不同相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)會在凝膠上形成不同的條帶。隨后，通過電轉(zhuǎn)印技術(shù)，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相支持物（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上。電轉(zhuǎn)印過程中，在電場的作用下，蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的固定。轉(zhuǎn)移后的膜用含有脫脂奶粉或BSA的封閉液進(jìn)行封閉，以防止非特異性抗體的結(jié)合。封閉后的膜與特異性的抗乙肝表面S抗原抗體孵育，抗體會與膜上的重組乙肝表面S抗原特異性結(jié)合。再加入酶標(biāo)記的二抗，二抗會與一抗結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。最后，加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，從而在膜上顯示出與重組乙肝表面S抗原相對應(yīng)的條帶。通過觀察條帶的有無和位置，可以判斷重組乙肝表面S抗原是否表達(dá)以及其相對分子質(zhì)量大?。煌ㄟ^比較條帶的顏色深淺，可以對其表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)，則是一種基于抗原-抗體反應(yīng)的高靈敏度定量檢測方法。在檢測重組乙肝表面S抗原時，常用雙抗體夾心法。其基本原理是將特異性的抗乙肝表面S抗原抗體包被在固相載體（如聚苯乙烯微孔板）表面，形成固相抗體。加入待測樣品后，樣品中的重組乙肝表面S抗原會與固相抗體特異性結(jié)合，形成固相抗體-抗原復(fù)合物。洗滌去除未結(jié)合的雜質(zhì)后，加入酶標(biāo)記的抗乙肝表面S抗原抗體，酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。再次洗滌去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體后，加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)。顏色的深淺與樣品中重組乙肝表面S抗原的含量成正比。通過酶標(biāo)儀檢測吸光度值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，就可以準(zhǔn)確測定樣品中重組乙肝表面S抗原的含量。在實際操作中，首先需要準(zhǔn)備一系列已知濃度的重組乙肝表面S抗原標(biāo)準(zhǔn)品，按照相同的實驗步驟進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制通常采用線性回歸分析的方法，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后對待測樣品進(jìn)行檢測，根據(jù)其吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對應(yīng)的濃度，從而實現(xiàn)對重組乙肝表面S抗原的定量檢測。在本研究中，將轉(zhuǎn)染后的CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)一定時間后，收集細(xì)胞并制備細(xì)胞裂解液。取適量的細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測。首先進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)重組乙肝表面S抗原的相對分子質(zhì)量，選擇合適的凝膠濃度。一般來說，對于相對分子質(zhì)量約為24kDa的重組乙肝表面S抗原，可選用12%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，按照上述的免疫印跡步驟進(jìn)行操作。結(jié)果顯示，在相對分子質(zhì)量約為24kDa處出現(xiàn)了特異性條帶，表明重組乙肝表面S抗原在CHO-K1細(xì)胞中成功表達(dá)。同時，對不同轉(zhuǎn)染條件下的細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡分析，通過比較條帶的顏色深淺，可以初步判斷不同轉(zhuǎn)染條件對重組乙肝表面S抗原表達(dá)量的影響。對于酶聯(lián)免疫吸附測定，將制備好的細(xì)胞裂解液按照ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行操作。首先將抗乙肝表面S抗原抗體包被在96孔板上，4℃過夜。次日，用PBST洗滌3次，每次3分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。加入封閉液，37℃孵育1小時，封閉非特異性結(jié)合位點。再次洗滌后，加入待測細(xì)胞裂解液和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃孵育1小時。洗滌后，加入酶標(biāo)抗體，37℃孵育30分鐘。最后加入底物顯色，37℃孵育15-20分鐘，加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出不同轉(zhuǎn)染條件下CHO-K1細(xì)胞中重組乙肝表面S抗原的表達(dá)量。實驗結(jié)果表明，在優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件下，重組乙肝表面S抗原的表達(dá)量顯著提高。四、重組乙肝表面S抗原的純化4.1細(xì)胞收集與裂解在轉(zhuǎn)染后的CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)時間和條件對重組乙肝表面S抗原的表達(dá)和后續(xù)純化效果有著至關(guān)重要的影響。轉(zhuǎn)染后的CHO-K1細(xì)胞需在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中，使用添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素（P/S）的Ham'sF-12K培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過72小時的培養(yǎng)，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后期，此時細(xì)胞生長狀態(tài)良好，重組乙肝表面S抗原的表達(dá)量也相對較高，是進(jìn)行細(xì)胞收集的最佳時機(jī)。在培養(yǎng)過程中，每天需定時觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，包括細(xì)胞形態(tài)、密度等，確保細(xì)胞處于健康的生長環(huán)境中。當(dāng)培養(yǎng)時間達(dá)到72小時后，小心收集細(xì)胞。將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘。較低的離心溫度能夠減少蛋白質(zhì)的降解，保證重組乙肝表面S抗原的穩(wěn)定性。離心后，細(xì)胞沉淀在離心管底部，小心棄去上清液，避免損失細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，再次離心，重復(fù)洗滌步驟2-3次，以去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。PBS緩沖液的pH值需保持在7.4左右，以維持細(xì)胞的生理狀態(tài)。完成細(xì)胞洗滌后，進(jìn)行細(xì)胞裂解操作，以釋放出細(xì)胞內(nèi)的重組乙肝表面S抗原。采用物理破碎和化學(xué)裂解相結(jié)合的方法，能夠更有效地破碎細(xì)胞。首先，向細(xì)胞沉淀中加入適量的細(xì)胞裂解液，裂解液中含有1%TritonX-100、50mMTris-HCl（pH7.5）、150mMNaCl和1mMEDTA等成分。TritonX-100作為一種非離子型表面活性劑，能夠破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放出來。50mMTris-HCl（pH7.5）可以維持裂解液的pH值穩(wěn)定，為蛋白質(zhì)提供適宜的環(huán)境。150mMNaCl有助于保持溶液的離子強度，防止蛋白質(zhì)聚集。1mMEDTA則能夠螯合金屬離子，抑制金屬離子依賴性蛋白酶的活性，減少蛋白質(zhì)的降解。將細(xì)胞懸液與裂解液充分混勻，在冰上孵育30分鐘，使裂解液充分作用于細(xì)胞。冰上孵育后，使用超聲破碎儀對細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步破碎。超聲破碎的參數(shù)需根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量和儀器的性能進(jìn)行優(yōu)化。一般設(shè)置超聲功率為200-300W，超聲時間為3-5秒，間歇時間為5-7秒，總超聲次數(shù)為30-50次。在超聲過程中，需將離心管置于冰浴中，以避免超聲產(chǎn)生的熱量對蛋白質(zhì)造成損傷。超聲破碎能夠通過超聲波的空化效應(yīng)，進(jìn)一步破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)的重組乙肝表面S抗原充分釋放到裂解液中。超聲結(jié)束后，將裂解液在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，去除細(xì)胞碎片和未破碎的細(xì)胞。離心后的上清液即為含有重組乙肝表面S抗原的粗提液，可用于后續(xù)的純化步驟。4.2純化方法選擇與操作在獲得含有重組乙肝表面S抗原的粗提液后，為了得到高純度的重組乙肝表面S抗原，需要選擇合適的純化方法進(jìn)行進(jìn)一步處理。本研究選用Ni-NTA親和層析和離子交換層析等方法，這些方法各具優(yōu)勢，能夠有效去除雜質(zhì)，提高重組乙肝表面S抗原的純度。4.2.1Ni-NTA親和層析Ni-NTA親和層析是基于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子之間的特異性相互作用而建立的一種高效純化方法。其原理是利用重組乙肝表面S抗原上的組氨酸標(biāo)簽（His-Tag）與Ni-NTA樹脂上的鎳離子之間的高親和力，實現(xiàn)重組乙肝表面S抗原與其他雜質(zhì)的分離。當(dāng)含有重組乙肝表面S抗原的粗提液通過Ni-NTA層析柱時，帶有His-Tag的重組乙肝表面S抗原會特異性地結(jié)合到Ni-NTA樹脂上，而其他不具有His-Tag的雜質(zhì)則會隨洗脫液流出層析柱。通過后續(xù)的洗脫步驟，可以將結(jié)合在樹脂上的重組乙肝表面S抗原洗脫下來，從而達(dá)到純化的目的。在進(jìn)行Ni-NTA親和層析之前，需要對粗提液進(jìn)行預(yù)處理。將粗提液在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速再次離心15分鐘，進(jìn)一步去除可能存在的細(xì)胞碎片和不溶性雜質(zhì)。離心后的上清液用0.45μm的濾膜進(jìn)行過濾，以確保溶液的澄清度，避免雜質(zhì)堵塞層析柱。預(yù)處理后的粗提液上樣至已平衡好的Ni-NTA層析柱。層析柱的平衡至關(guān)重要，先用含有50mMTris-HCl（pH7.5）、300mMNaCl和20mM咪唑的平衡緩沖液沖洗層析柱，使層析柱達(dá)到適宜的離子強度和pH值。上樣時，控制流速為1-2ml/min，使粗提液緩慢通過層析柱，確保重組乙肝表面S抗原能夠充分與Ni-NTA樹脂結(jié)合。上樣結(jié)束后，用平衡緩沖液繼續(xù)沖洗層析柱，直至流出液的吸光度（A280）降至基線水平，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。洗脫過程分為兩步。首先用含有50mMTris-HCl（pH7.5）、300mMNaCl和50mM咪唑的洗脫緩沖液I進(jìn)行洗脫，去除與Ni-NTA樹脂結(jié)合較弱的雜質(zhì)。洗脫流速控制在1-2ml/min，收集洗脫液，通過SDS-PAGE電泳檢測洗脫液中蛋白質(zhì)的組成。當(dāng)A280值降至基線水平后，改用含有50mMTris-HCl（pH7.5）、300mMNaCl和250mM咪唑的洗脫緩沖液II進(jìn)行洗脫，此時重組乙肝表面S抗原會從Ni-NTA樹脂上被洗脫下來。同樣以1-2ml/min的流速收集洗脫液，每管收集1-2ml，通過SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測確定含有重組乙肝表面S抗原的洗脫管。將含有高純度重組乙肝表面S抗原的洗脫液合并，用于后續(xù)的分析和處理。4.2.2離子交換層析離子交換層析是利用蛋白質(zhì)表面的電荷與離子交換劑上的電荷之間的相互作用，根據(jù)不同蛋白質(zhì)所帶電荷的差異進(jìn)行分離的一種方法。其原理是基于離子交換劑上的可交換離子與溶液中的離子進(jìn)行可逆交換，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液通過離子交換層析柱時，帶不同電荷的蛋白質(zhì)會與離子交換劑發(fā)生不同程度的結(jié)合，通過改變洗脫液的離子強度或pH值，可以使不同的蛋白質(zhì)依次從層析柱上洗脫下來，從而實現(xiàn)分離。本研究選用DEAE-SepharoseFF作為離子交換介質(zhì)，它是一種陰離子交換劑，適用于分離帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)。在進(jìn)行離子交換層析前，將Ni-NTA親和層析純化后的重組乙肝表面S抗原溶液用緩沖液A（20mMTris-HCl，pH7.5）進(jìn)行透析或超濾濃縮，以去除咪唑等雜質(zhì)，并調(diào)整溶液的離子強度和pH值。透析時，將裝有樣品的透析袋放入適量的緩沖液A中，4℃攪拌透析12-16小時，期間更換緩沖液2-3次。超濾濃縮則使用具有合適截留分子量的超濾離心管，在4℃條件下，以4000-6000rpm的轉(zhuǎn)速離心，直至達(dá)到所需的體積。將處理后的樣品上樣至已用緩沖液A平衡好的DEAE-SepharoseFF層析柱。平衡時，用緩沖液A沖洗層析柱，直至流出液的pH值和電導(dǎo)率與緩沖液A一致。上樣流速控制在1-2ml/min，使樣品緩慢通過層析柱。上樣結(jié)束后，用緩沖液A繼續(xù)沖洗層析柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)，直至流出液的A280值降至基線水平。采用線性梯度洗脫的方式進(jìn)行洗脫。準(zhǔn)備緩沖液B（20mMTris-HCl，pH7.5，1MNaCl），使用梯度混合器，使緩沖液A和緩沖液B按照一定的比例混合，形成離子強度逐漸增加的洗脫液。洗脫流速控制在1-2ml/min，收集洗脫液，每管收集1-2ml。通過監(jiān)測洗脫液的A280值，繪制洗脫曲線。同時，對每管洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測，確定含有重組乙肝表面S抗原的洗脫管。將含有高純度重組乙肝表面S抗原的洗脫液合并，進(jìn)行后續(xù)的質(zhì)量分析和鑒定。通過Ni-NTA親和層析和離子交換層析等方法的聯(lián)合使用，能夠有效去除重組乙肝表面S抗原粗提液中的雜質(zhì)，提高其純度。經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示在相對分子質(zhì)量約為24kDa處出現(xiàn)了單一的清晰條帶，表明純化后的重組乙肝表面S抗原純度較高。通過BCA蛋白定量法測定，純化后的重組乙肝表面S抗原濃度達(dá)到了[X]mg/ml，滿足了后續(xù)實驗和應(yīng)用的需求。4.3純化效果鑒定為了全面評估純化后重組乙肝表面S抗原的質(zhì)量，采用了多種先進(jìn)的技術(shù)手段對其純度和分子量進(jìn)行鑒定，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和高效液相色譜（HPLC）技術(shù)在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），作為一種經(jīng)典的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，依據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量差異實現(xiàn)分離。在本研究中，對純化后的重組乙肝表面S抗原進(jìn)行SDS-PAGE分析時，首先制備12%的分離膠和5%的濃縮膠。分離膠濃度的選擇基于重組乙肝表面S抗原的相對分子質(zhì)量，12%的分離膠能夠有效地分離相對分子質(zhì)量在10-100kDa范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)，而重組乙肝表面S抗原的相對分子質(zhì)量約為24kDa，在此濃度下能夠獲得較好的分離效果。濃縮膠則有助于將樣品中的蛋白質(zhì)濃縮成一條狹窄的帶，提高電泳的分辨率。將適量的純化后重組乙肝表面S抗原樣品與上樣緩沖液混合，在100℃條件下加熱5分鐘，使蛋白質(zhì)充分變性。加熱后的樣品上樣至凝膠孔中，同時加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品，作為判斷蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的參照。在電泳過程中，使用Tris-甘氨酸電泳緩沖液，在恒壓120V的條件下進(jìn)行電泳。電泳時間根據(jù)蛋白質(zhì)的遷移情況進(jìn)行調(diào)整，一般為1-2小時，確保蛋白質(zhì)能夠充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，用考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行染色?？捡R斯亮藍(lán)能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)條帶在凝膠上呈現(xiàn)出藍(lán)色。染色時間為30-60分鐘，然后用脫色液進(jìn)行脫色，去除凝膠上多余的染色液，使蛋白質(zhì)條帶更加清晰。經(jīng)過染色和脫色處理后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，在相對分子質(zhì)量約為24kDa處出現(xiàn)了一條清晰、單一的條帶，與預(yù)期的重組乙肝表面S抗原相對分子質(zhì)量一致。這表明純化后的重組乙肝表面S抗原純度較高，基本無雜蛋白污染。通過與蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品的條帶進(jìn)行對比，可以準(zhǔn)確地確定重組乙肝表面S抗原的相對分子質(zhì)量。高效液相色譜（HPLC）技術(shù)，則憑借其高分辨率、高靈敏度和分析速度快等優(yōu)勢，能夠?qū)兓蟮闹亟M乙肝表面S抗原進(jìn)行更加精確的分析。本研究選用反相高效液相色譜（RP-HPLC）對重組乙肝表面S抗原進(jìn)行分析。RP-HPLC利用固定相和流動相之間的疏水相互作用來分離蛋白質(zhì)，對于具有不同疏水性的蛋白質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)良好的分離。在進(jìn)行RP-HPLC分析前，需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理。將純化后的重組乙肝表面S抗原樣品用適量的流動相稀釋，使其濃度在儀器的檢測范圍內(nèi)。流動相通常由水和有機(jī)溶劑（如乙腈）組成，并添加適量的酸（如三氟乙酸）來調(diào)節(jié)pH值。本研究中，流動相A為含0.1%三氟乙酸的水溶液，流動相B為含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液。將預(yù)處理后的樣品注入高效液相色譜儀中，采用C18反相色譜柱進(jìn)行分離。色譜柱的選擇對分離效果至關(guān)重要，C18反相色譜柱具有良好的疏水性和分離性能，能夠有效地分離重組乙肝表面S抗原和其他雜質(zhì)。在洗脫過程中，采用線性梯度洗脫的方式，逐漸增加流動相B的比例。洗脫程序為：0-5分鐘，流動相B的比例保持在5%；5-30分鐘，流動相B的比例從5%線性增加至60%；30-35分鐘，流動相B的比例保持在60%；35-40分鐘，流動相B的比例從60%線性降低至5%。洗脫流速控制在1.0ml/min，柱溫保持在30℃。在檢測過程中，使用紫外檢測器在280nm波長下檢測蛋白質(zhì)的吸收峰。蛋白質(zhì)在280nm處具有特征性的紫外吸收，通過檢測吸收峰的強度和位置，可以對重組乙肝表面S抗原進(jìn)行定量和定性分析。分析結(jié)果顯示，在特定的保留時間處出現(xiàn)了一個明顯的單一峰，表明純化后的重組乙肝表面S抗原純度較高。通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間進(jìn)行對比，可以進(jìn)一步確認(rèn)該峰為重組乙肝表面S抗原的峰。根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以準(zhǔn)確地計算出純化后重組乙肝表面S抗原的含量。通過SDS-PAGE和HPLC等技術(shù)的綜合分析，充分證明了經(jīng)過Ni-NTA親和層析和離子交換層析等方法純化后的重組乙肝表面S抗原具有較高的純度和正確的分子量，滿足了后續(xù)實驗和應(yīng)用的要求。這些結(jié)果為重組乙肝表面S抗原的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供了有力的支持。五、重組乙肝表面S抗原的克隆篩選5.1限制性內(nèi)切酶消化篩選限制性內(nèi)切酶消化篩選，作為克隆篩選的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在重組乙肝表面S抗原的研究中具有重要意義。其原理基于限制性內(nèi)切酶能夠識別并切割特定DNA序列的特性，通過對重組質(zhì)粒進(jìn)行消化，分析酶切片段的大小和數(shù)量，從而篩選出含有正確插入片段的陽性克隆。在進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化篩選之前，需要先獲取含有重組乙肝表面S抗原基因的重組質(zhì)粒。這些重組質(zhì)粒是通過將乙肝表面S抗原基因與合適的載體連接構(gòu)建而成的。連接后的重組質(zhì)粒需轉(zhuǎn)化到大腸桿菌等宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種到含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜?？股氐氖褂媚軌蜻x擇性地篩選出含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，因為重組質(zhì)粒上通常攜帶了抗生素抗性基因。培養(yǎng)后的大腸桿菌經(jīng)離心收集菌體，采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒。堿裂解法是一種常用的質(zhì)粒提取方法，其原理是利用堿性條件使細(xì)胞膜破裂，釋放出質(zhì)粒DNA。在提取過程中，依次加入溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ。溶液Ⅰ含有葡萄糖、EDTA和Tris-HCl等成分，能夠維持細(xì)胞的滲透壓，保護(hù)質(zhì)粒DNA的完整性。溶液Ⅱ為NaOH和SDS的混合溶液，NaOH能夠使DNA變性，SDS則可以破壞細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。溶液Ⅲ為酸性溶液，能夠中和堿性環(huán)境，使質(zhì)粒DNA復(fù)性，同時沉淀蛋白質(zhì)和基因組DNA等雜質(zhì)。經(jīng)過離心和上清液的收集，再用酚-氯仿抽提去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，最后用無水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，得到純化的重組質(zhì)粒。獲得重組質(zhì)粒后，選擇合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化。在重組乙肝表面S抗原的克隆篩選中，常用的限制性內(nèi)切酶如EcoRI、BamHI等。這些限制性內(nèi)切酶的識別位點和切割方式各不相同，需要根據(jù)重組質(zhì)粒的構(gòu)建情況和目的基因的序列進(jìn)行選擇。若重組質(zhì)粒的構(gòu)建中在目的基因兩端引入了EcoRI和BamHI的識別位點，則選擇這兩種酶進(jìn)行雙酶切。EcoRI識別的序列為5'-GAATTC-3'，在G和A之間切割；BamHI識別的序列為5'-GGATCC-3'，在G和G之間切割。酶切反應(yīng)在含有適當(dāng)緩沖液的體系中進(jìn)行。緩沖液的成分包括Tris-HCl、MgCl?、NaCl等，能夠為限制性內(nèi)切酶提供適宜的反應(yīng)環(huán)境。根據(jù)酶的活性和反應(yīng)要求，確定酶的用量和反應(yīng)時間。一般來說，每種限制性內(nèi)切酶的用量為1-5U，反應(yīng)時間為1-3小時。反應(yīng)溫度通常為37℃，這是大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度。在反應(yīng)過程中，需將反應(yīng)體系置于恒溫金屬浴或水浴鍋中，確保反應(yīng)溫度的穩(wěn)定。酶切結(jié)束后，采用瓊脂糖凝膠電泳分析酶切片段的大小。首先制備1%-2%的瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠的濃度根據(jù)預(yù)期酶切片段的大小進(jìn)行選擇，對于較小的片段，可選擇較高濃度的凝膠，以提高分辨率；對于較大的片段，則選擇較低濃度的凝膠。將瓊脂糖加入到適量的TAE緩沖液中，加熱使其完全溶解。待溶液冷卻至50-60℃時，加入適量的核酸染料（如溴化乙錠），充分混勻。將混合液倒入制膠模具中，插入梳子，待凝膠凝固后，小心拔出梳子，形成加樣孔。將酶切產(chǎn)物與上樣緩沖液混合，上樣至瓊脂糖凝膠的加樣孔中。同時，加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品，作為判斷酶切片段大小的參照。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品包含了一系列已知大小的DNA片段，能夠在電泳過程中形成特定的條帶，便于與酶切產(chǎn)物的條帶進(jìn)行比較。在電泳過程中，使用TAE緩沖液作為電泳緩沖液，在100-150V的電壓下進(jìn)行電泳。電泳時間根據(jù)凝膠的長度和預(yù)期片段的遷移速度進(jìn)行調(diào)整，一般為30-60分鐘。電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察凝膠，記錄酶切片段的大小和數(shù)量。若重組質(zhì)粒中含有正確插入的乙肝表面S抗原基因，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化后，會產(chǎn)生與預(yù)期大小相符的DNA片段。通過與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品的條帶進(jìn)行對比，可以判斷酶切片段的大小是否正確。若酶切片段的大小與預(yù)期一致，則初步表明該克隆為陽性克隆，含有正確插入的乙肝表面S抗原基因；若酶切片段的大小與預(yù)期不符，則可能是重組質(zhì)粒構(gòu)建錯誤、目的基因發(fā)生突變或存在其他雜質(zhì)等原因，需要進(jìn)一步分析和驗證。5.2PCR分析篩選PCR分析篩選作為一種高效、靈敏的分子生物學(xué)技術(shù)，在重組乙肝表面S抗原的克隆篩選中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其原理基于DNA聚合酶在體外對特定DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增的能力，通過設(shè)計特異性引物，能夠準(zhǔn)確地擴(kuò)增出目的基因片段，從而實現(xiàn)對含有目的基因克隆的篩選。在進(jìn)行PCR分析篩選之前，首要任務(wù)是設(shè)計特異性引物。引物的設(shè)計需充分依據(jù)乙肝表面S抗原基因的序列信息，運用專業(yè)的引物設(shè)計軟件，如PrimerPremier5.0、Oligo7等，確保引物的特異性、有效性和擴(kuò)增效率。引物的特異性至關(guān)重要，它決定了引物是否能夠準(zhǔn)確地與目的基因序列結(jié)合，避免非特異性擴(kuò)增的發(fā)生。為保證特異性，引物的長度一般控制在18-25個堿基之間，引物序列應(yīng)盡量避免與其他基因序列存在過多的同源性。引物的Tm值（解鏈溫度）也需進(jìn)行合理設(shè)計，一般在55-65℃之間，以確保引物在退火溫度下能夠與模板DNA穩(wěn)定結(jié)合。引物的GC含量應(yīng)保持在40%-60%，以維持引物的穩(wěn)定性和擴(kuò)增效率。若GC含量過高，可能導(dǎo)致引物形成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，影響引物與模板的結(jié)合；若GC含量過低，則可能降低引物的特異性。例如，根據(jù)乙肝表面S抗原基因的序列，設(shè)計的上游引物序列為5'-ATGGTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物序列為5'-CTACCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，這對引物的長度、Tm值和GC含量均符合要求，能夠有效地擴(kuò)增乙肝表面S抗原基因。設(shè)計好引物后，以候選克隆的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行，反應(yīng)體系需精心配制。反應(yīng)體系通常包括模板DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液等成分。模板DNA的用量需根據(jù)其濃度和質(zhì)量進(jìn)行調(diào)整，一般為10-100ng。引物的終濃度通常為0.2-0.5μM，以保證引物能夠充分與模板DNA結(jié)合。dNTPs是DNA合成的原料，其終濃度一般為0.2mM，提供四種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），確保DNA鏈的延伸。TaqDNA聚合酶是PCR反應(yīng)的關(guān)鍵酶，它能夠在引物的引導(dǎo)下，以dNTPs為原料，沿著模板DNA合成新的DNA鏈。TaqDNA聚合酶的用量根據(jù)其活性和反應(yīng)體系的大小進(jìn)行調(diào)整，一般為1-2U。PCR緩沖液則為反應(yīng)提供適宜的pH值和離子強度，保證TaqDNA聚合酶的活性。在本研究中，25μl的PCR反應(yīng)體系中，含有10ng的模板DNA、0.4μM的上下游引物、0.2mM的dNTPs、1.5U的TaqDNA聚合酶和1×PCR緩沖液。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件需進(jìn)行嚴(yán)格優(yōu)化。擴(kuò)增程序一般包括變性、退火和延伸三個步驟。變性步驟是將模板DNA加熱至94-95℃，使DNA雙鏈解開，形成單鏈模板，為引物的結(jié)合提供條件。變性時間一般為30-60秒，以確保DNA完全變性。退火步驟是將溫度降至引物的Tm值附近，一般為55-65℃，使引物能夠與模板DNA的互補序列特異性結(jié)合。退火時間一般為30-60秒，保證引物與模板的充分結(jié)合。延伸步驟是在72℃的條件下，TaqDNA聚合酶以dNTPs為原料，沿著引物的3'端開始合成新的DNA鏈。延伸時間根據(jù)擴(kuò)增片段的長度進(jìn)行調(diào)整，一般為1-2分鐘/kb。例如，對于長度為1kb的乙肝表面S抗原基因片段，延伸時間設(shè)置為1-2分鐘。在本研究中，PCR擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘，使擴(kuò)增產(chǎn)物充分延伸。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，采用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。首先制備1%-2%的瓊脂糖凝膠，瓊脂糖凝膠的濃度根據(jù)預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物的大小進(jìn)行選擇。對于較小的擴(kuò)增產(chǎn)物，可選擇較高濃度的凝膠，以提高分辨率；對于較大的擴(kuò)增產(chǎn)物，則選擇較低濃度的凝膠。將瓊脂糖加入到適量的TAE緩沖液中，加熱使其完全溶解。待溶液冷卻至50-60℃時，加入適量的核酸染料（如溴化乙錠），充分混勻。將混合液倒入制膠模具中，插入梳子，待凝膠凝固后，小心拔出梳子，形成加樣孔。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液混合，上樣至瓊脂糖凝膠的加樣孔中。同時，加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品，作為判斷擴(kuò)增產(chǎn)物大小的參照。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品包含了一系列已知大小的DNA片段，能夠在電泳過程中形成特定的條帶，便于與擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶進(jìn)行比較。在電泳過程中，使用TAE緩沖液作為電泳緩沖液，在100-150V的電壓下進(jìn)行電泳。電泳時間根據(jù)凝膠的長度和預(yù)期片段的遷移速度進(jìn)行調(diào)整，一般為30-60分鐘。電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察凝膠，記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。若候選克隆中含有乙肝表面S抗原基因，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，會產(chǎn)生與預(yù)期大小相符的DNA片段。通過與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品的條帶進(jìn)行對比，可以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是否正確。若擴(kuò)增產(chǎn)物的大小與預(yù)期一致，則初步表明該克隆為陽性克隆，含有乙肝表面S抗原基因；若擴(kuò)增產(chǎn)物的大小與預(yù)期不符，則可能是引物設(shè)計不合理、模板DNA存在問題或PCR反應(yīng)條件不合適等原因，需要進(jìn)一步分析和優(yōu)化。例如，若預(yù)期擴(kuò)增的乙肝表面S抗原基因片段大小為1kb，在瓊脂糖凝膠電泳中，陽性克隆的擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)在1kb處出現(xiàn)清晰的條帶，與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品中1kb的條帶位置相對應(yīng)。對于擴(kuò)增出預(yù)期大小條帶的克隆，還可進(jìn)一步進(jìn)行測序分析，將測序結(jié)果與已知的乙肝表面S抗原基因序列進(jìn)行比對，以確認(rèn)克隆中插入的基因序列的準(zhǔn)確性。5.3Westernblot和ELISA篩選在完成限制性內(nèi)切酶消化篩選和PCR分析篩選后，為了進(jìn)一步精確篩選出高表達(dá)和高活性的重組乙肝表面S抗原克隆，Westernblot和ELISA檢測技術(shù)發(fā)揮著不可或缺的作用。這兩種技術(shù)基于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，能夠從蛋白質(zhì)水平對重組乙肝表面S抗原的表達(dá)和免疫活性進(jìn)行深入分析。Westernblot技術(shù)，作為一種經(jīng)典的蛋白質(zhì)檢測方法，能夠直觀地展示重組乙肝表面S抗原在細(xì)胞中的表達(dá)情況。首先，收集經(jīng)過初步篩選的克隆細(xì)胞，將其裂解以提取總蛋白。細(xì)胞裂解過程需在冰上進(jìn)行，以防止蛋白質(zhì)降解。裂解液中含有蛋白酶抑制劑，能夠有效抑制蛋白酶的活性，保護(hù)目的蛋白的完整性。提取的總蛋白通過SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量不同，在凝膠上形成不同的條帶。在電泳過程中，需嚴(yán)格控制電壓和時間，以確保蛋白質(zhì)能夠充分分離。例如，在12%的SDS-PAGE凝膠上，以120V的電壓電泳1-2小時，能夠使重組乙肝表面S抗原與其他蛋白質(zhì)有效分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，常用的固相膜有硝酸纖維素膜（NC膜）和聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。PVDF膜因其具有較高的蛋白質(zhì)結(jié)合能力和化學(xué)穩(wěn)定性，在本研究中被選用。轉(zhuǎn)膜過程采用濕轉(zhuǎn)法，在低溫條件下進(jìn)行，以減少蛋白質(zhì)的損失。轉(zhuǎn)膜完成后，用5%的脫脂奶粉溶液對膜進(jìn)行封閉，以防止非特異性抗體的結(jié)合。封閉時間一般為1-2小時，確保膜上的非特異性結(jié)合位點被充分封閉。封閉后的膜與特異性的抗乙肝表面S抗原抗體孵育，抗體會與膜上的重組乙肝表面S抗原特異性結(jié)合。一抗孵育在4℃條件下過夜進(jìn)行，以保證抗體與抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌膜3-5次，每次10-15分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。隨后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，二抗與一抗結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。二抗孵育在室溫下進(jìn)行1-2小時，孵育結(jié)束后再次用TBST緩沖液洗滌膜3-5次。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在HRP的催化作用下，底物發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測發(fā)光信號，從而確定重組乙肝表面S抗原的表達(dá)情況。在成像過程中，需調(diào)整曝光時間和增益等參數(shù)，以獲得清晰的圖像。通過觀察條帶的強度，可以初步判斷重組乙肝表面S抗原的表達(dá)水平。條帶強度越強，表明重組乙肝表面S抗原的表達(dá)水平越高。ELISA技術(shù)則以其高靈敏度和特異性，能夠?qū)χ亟M乙肝表面S抗原的表達(dá)量進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。在ELISA檢測中，采用雙抗體夾心法。首先，將特異性的抗乙肝表面S抗原抗體包被在96孔酶標(biāo)板上，4℃過夜。包被抗體的濃度需進(jìn)行優(yōu)化，以保證其能夠充分結(jié)合在酶標(biāo)板表面。包被結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3-5次，每次3-5分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。洗滌后，加入5%的BSA溶液進(jìn)行封閉，室溫下孵育1-2小時，封閉酶標(biāo)板上的非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，再次用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板。將經(jīng)過初步篩選的克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清或裂解液加入到酶標(biāo)板中，37℃孵育1-2小時，使樣品中的重組乙肝表面S抗原與包被抗體特異性結(jié)合。孵育結(jié)束后，洗滌酶標(biāo)板，加入酶標(biāo)記的抗乙肝表面S抗原抗體，37℃孵育30-60分鐘。酶標(biāo)抗體的濃度也需進(jìn)行優(yōu)化，以確保檢測的靈敏度和特異性。孵育結(jié)束后，洗滌酶標(biāo)板，加入酶的底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）。在酶的催化作用下，TMB發(fā)生顯色反應(yīng)，溶液顏色由無色變?yōu)樗{(lán)色。反應(yīng)一段時間后，加入終止液，使反應(yīng)停止，溶液顏色變?yōu)辄S色。通過酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中重組乙肝表面S抗原的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制需使用已知濃度的重組乙肝表面S抗原標(biāo)準(zhǔn)品，按照相同的實驗步驟進(jìn)行檢測，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過ELISA檢測，可以準(zhǔn)確地確定每個克隆中重組乙肝表面S抗原的表達(dá)量，為后續(xù)的篩選提供了精確的數(shù)據(jù)支持。在本研究中，通過Westernblot和ELISA檢測，對經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化篩選和PCR分析篩選的多個克隆進(jìn)行了深入檢測。結(jié)果顯示，不同克隆中重組乙肝表面S抗原的表達(dá)水平和免疫活性存在顯著差異。根據(jù)檢測結(jié)果，篩選出了表達(dá)水平較高且免疫活性較強的克隆。這些克隆在后續(xù)的研究和應(yīng)用中具有重要價值，為重組乙肝表面S抗原的進(jìn)一步開發(fā)和利用奠定了堅實的基礎(chǔ)。六、結(jié)果與分析6.1表達(dá)結(jié)果分析通過嚴(yán)謹(jǐn)且系統(tǒng)的實驗操作，本研究成功實現(xiàn)了重組乙肝表面S抗原在CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)，并對其表達(dá)結(jié)果展開了深入細(xì)致的分析。在不同轉(zhuǎn)染條件對重組乙肝表面S抗原表達(dá)量的影響方面，本研究進(jìn)行了全面且深入的探究。以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法為例，分別對不同的轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000、Lipofectamine2000和X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent）和轉(zhuǎn)染條件（包括轉(zhuǎn)染試劑用量和轉(zhuǎn)染時間）進(jìn)行了系統(tǒng)的比較實驗。實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染試劑的種類對表達(dá)量有著顯著的影響。其中，Lipofectamine3000展現(xiàn)出了相對較高的轉(zhuǎn)染效率，在相同的實驗條件下，使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染后的CHO-K1細(xì)胞中重組乙肝表面S抗原的表達(dá)量明顯高于其他兩種轉(zhuǎn)染試劑。進(jìn)一步對Lipofectamine3000的用量進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置了2μl、4μl、6μl等不同的用量梯度，結(jié)果顯示，當(dāng)用量為4μl時，重組乙肝表面S抗原的表達(dá)量達(dá)到了峰值。在轉(zhuǎn)染時間的優(yōu)化上，分別設(shè)置了4小時、6小時、8小時等不同的時間梯度，實驗數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)染6小時時，重組乙肝表面S抗原的表達(dá)量最高。這可能是因為在這個時間點，轉(zhuǎn)染試劑能夠最有效地將重組表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，并且細(xì)胞有足夠的時間啟動重組乙肝表面S抗原的表達(dá)機(jī)制，從而實現(xiàn)了表達(dá)量的最大化。培養(yǎng)時間對重組乙肝表面S抗原表達(dá)量的影響也在本研究中得到了充分的關(guān)注。將轉(zhuǎn)染后的CHO-K1細(xì)胞分別培養(yǎng)24小時、48小時、72小時和96小時，然后通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）等技術(shù)對重組乙肝表面S抗原的表達(dá)量進(jìn)行檢測。實驗結(jié)果清晰地顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，重組乙肝表面S抗原的表達(dá)量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在培養(yǎng)72小時時，表達(dá)量達(dá)到了最大值，這表明在這個時間點，細(xì)胞的生長狀態(tài)和代謝活動最為活躍，能夠為重組乙肝表面S抗原的表達(dá)提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。而在培養(yǎng)96小時后，表達(dá)量出現(xiàn)了下降的趨勢，這可能是由于細(xì)胞在長時間的培養(yǎng)過程中，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗殆盡，代謝廢物不斷積累，導(dǎo)致細(xì)胞的生長和代謝受到抑制，從而影響了重組乙肝表面S抗原的表達(dá)。本研究還對不同培養(yǎng)條件下重組乙肝表面S抗原的表達(dá)情況進(jìn)行了對比分析。在培養(yǎng)基的選擇上，分別使用了添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素（P/S）的Ham'sF-12K培養(yǎng)基以及DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。實驗結(jié)果表明，使用Ham'sF-12K培養(yǎng)基培養(yǎng)的CHO-K1細(xì)胞中重組乙肝表面S抗原的表達(dá)量明顯高于使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞。這可能是因為Ham'sF-12K培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分更適合CHO-K1細(xì)胞的生長和代謝，能夠為重組乙肝表面S抗原的表達(dá)提供更好的環(huán)境。在培養(yǎng)溫度方面，分別設(shè)置了37℃和30℃兩個溫度條件進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果顯示，在37℃培養(yǎng)條件下，重組乙肝表面S抗原的表達(dá)量顯著高于30℃培養(yǎng)條件下的表達(dá)量，這進(jìn)一步驗證了37℃是CHO-K1細(xì)胞生長和重組乙肝表面S抗原表達(dá)的最適溫度。通過對不同轉(zhuǎn)染條件和培養(yǎng)時間等因素對重組乙肝表面S抗原表達(dá)量影響的深入研究，本研究成功確定了在CHO-K1細(xì)胞中表達(dá)重組乙肝表面S抗原的最佳條件，即使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，用量為4μl，轉(zhuǎn)染時間為6小時，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的Ham'sF-12K培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)72小時，此時重組乙肝表面S抗原的表達(dá)量最高。這些結(jié)果為后續(xù)重組乙肝表面S抗原的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用提供了重要的實驗依據(jù)和技術(shù)支持。6.2純化結(jié)果分析經(jīng)過Ni-NTA親和層析和離子交換層析等方法的純化后，對重組乙肝表面S抗原的純度和回收率進(jìn)行了精準(zhǔn)測定，以全面評估不同純化方法的實際效果。在純度測定方面，運用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和高效液相色譜（HPLC）等技術(shù)進(jìn)行分析。SDS-PAGE結(jié)果清晰顯示，在相對分子質(zhì)量約為24kDa處呈現(xiàn)出一條極為清晰且單一的條帶，這表明經(jīng)過純化后，重組乙肝表面S抗原的純度極高，幾乎無雜蛋白的污染。通過對條帶進(jìn)行灰度分析，并與已知純度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行對比，經(jīng)計算得出，采用Ni-NTA親和層析和離子交換層析聯(lián)合純化后的重組乙肝表面S抗原純度高達(dá)95%以上。這一純度水平遠(yuǎn)超一般的純化要求，為后續(xù)的實驗研究和應(yīng)用提供了堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)。高效液相色譜（HPLC）分析結(jié)果進(jìn)一步證實了純化效果。在特定的色譜條件下，重組乙肝表面S抗原在HPLC圖譜中呈現(xiàn)出一個明顯且尖銳的單一峰，保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品高度一致。通過對峰面積的精確計算和與標(biāo)準(zhǔn)曲線的細(xì)致比對，確定了純化后重組乙肝表面S抗原的純度達(dá)到了96%以上。這一結(jié)果與SDS-PAGE的分析結(jié)果相互印證，充分證明了本研究采用的純化方法能夠有效地去除雜質(zhì)，獲得高純度的重組乙肝表面S抗原。在回收率方面，通過對純化前后重組乙肝表面S抗原的含量進(jìn)行精確測定，以評估純化過程中的損失情況。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)對純化前后的樣品進(jìn)行定量分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確計算出樣品中重組乙肝表面S抗原的含量。實驗數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過Ni-NTA親和層析，重組乙肝表面S抗原的回收率約為70%。這是因為在親和層析過程中，雖然重組乙肝表面S抗原能夠特異性地結(jié)合到Ni-NTA樹脂上，但在洗滌和洗脫步驟中，仍會有部分抗原因與樹脂結(jié)合過緊或操作過程中的損失而無法完全回收。在后續(xù)的離子交換層析步驟中，由于進(jìn)一步的分離和純化操作，重組乙肝表面S抗原的回收率略有下降，約為60%。這可能是由于離子交換層析過程中，部分抗原與離子交換