基于IL-12錨定修飾exosomes的腎癌疫苗：制備工藝與體外抗癌效能探究一、引言1.1研究背景與意義腎癌，作為泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢，嚴重威脅著人類的健康。據(jù)統(tǒng)計，2020年全球新增腎癌病例約431,288例，死亡病例達179,368例，已成為世界范圍腫瘤衛(wèi)生健康的重大問題。我國腎癌發(fā)病率同樣呈現(xiàn)上升態(tài)勢，高發(fā)年齡集中在50-70歲。腎癌發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，導致治療效果不佳，5年生存率較低，僅約為10%，晚期腎癌患者的中位生存時間更是僅7-11個月。目前，腎癌的傳統(tǒng)治療方法主要包括手術切除、化療、放療等。手術切除是早期腎癌獲得治愈的主要手段，但對于中晚期腎癌，單純手術治療往往難以達到理想效果，術后復發(fā)和轉移率較高?；熀头暖煂δI癌的敏感性相對較低，且會產(chǎn)生嚴重的副作用，如骨髓抑制、胃腸道反應、肝腎功能損害等，極大地影響了患者的生活質量和治療依從性。因此，開發(fā)新的、更有效的腎癌治療方法迫在眉睫。外泌體（exosomes）是一種由細胞分泌的納米級膜泡，直徑通常在30-150nm之間，廣泛存在于各種體液中，如血液、尿液、唾液等。外泌體攜帶了豐富的生物活性物質，包括蛋白質、核酸（mRNA、miRNA等）、脂質等，能夠在細胞間傳遞信息，參與多種生理和病理過程。近年來，外泌體因其獨特的生物學特性和潛在的應用價值，在腫瘤治療領域受到了廣泛關注。外泌體具有良好的生物相容性和低免疫原性，能夠避免被免疫系統(tǒng)快速清除，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞的靶向遞送。同時，外泌體可以通過傳遞腫瘤相關抗原和免疫調(diào)節(jié)分子，激活機體的抗腫瘤免疫反應，為腫瘤免疫治療提供了新的策略。白細胞介素-12（IL-12）是一種重要的細胞因子，在調(diào)節(jié)機體免疫反應中發(fā)揮著關鍵作用。IL-12能夠促進T細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）的增殖和活化，增強其細胞毒性，同時誘導干擾素-γ（IFN-γ）等細胞因子的分泌，從而激活機體的抗腫瘤免疫應答。然而，IL-12在臨床應用中面臨著嚴重的副作用問題，如細胞因子風暴、肝損傷等，限制了其在腫瘤治療中的廣泛應用?；诖?，本研究提出構建IL-12錨定修飾exosomes的腎癌疫苗，旨在結合外泌體的靶向性和IL-12的免疫激活作用，克服傳統(tǒng)治療方法的局限性，為腎癌的治療提供一種新的、高效低毒的策略。通過將IL-12錨定在外泌體表面，使其能夠精準地遞送至腫瘤部位，在腫瘤微環(huán)境中局部釋放并發(fā)揮免疫激活作用，從而增強抗腫瘤免疫反應，同時減少對全身正常組織的副作用。本研究具有重要的理論意義和臨床應用價值，有望為腎癌患者帶來新的治療希望，改善其預后和生活質量。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在腎癌治療領域，近年來國內(nèi)外學者進行了大量研究，取得了一系列進展。手術切除作為早期腎癌的主要治療手段，技術不斷優(yōu)化，包括傳統(tǒng)開放手術、腹腔鏡手術以及機器人輔助手術等，手術安全性和腫瘤切除效果逐步提高。對于中晚期腎癌，靶向治療和免疫治療成為重要的治療策略，顯著改善了患者的生存預后。然而，這些治療方法仍存在局限性，如靶向治療的耐藥問題、免疫治療的低響應率和高成本等，因此，開發(fā)新的治療方法，如腎癌疫苗，成為當前研究的熱點之一。腎癌疫苗是一種通過激活機體自身免疫系統(tǒng)來識別和殺傷腫瘤細胞的治療方法，具有特異性高、副作用小等優(yōu)點，在臨床前和臨床試驗中展現(xiàn)出一定的應用前景。美國耶魯大學和哈佛大學達納-法伯癌癥研究所的團隊開發(fā)的個性化癌癥疫苗，在治療高危、完全切除的透明細胞腎細胞癌患者的I期試驗中，取得了顯著成果，中位隨訪40.2個月，9例患者均無復發(fā)跡象，顯示出個性化癌癥疫苗作為透明細胞腎細胞癌有效輔助治療的潛力。然而，目前腎癌疫苗的研究仍處于早期階段，面臨諸多挑戰(zhàn)，如腫瘤抗原的選擇、疫苗的遞送效率以及免疫逃逸等問題，限制了其臨床應用。外泌體作為一種天然的納米級載體，在腫瘤治療領域的應用研究日益廣泛。其具有低免疫原性、良好的生物相容性、能夠穿透生物膜屏障以及攜帶生物活性物質等優(yōu)勢，使其成為理想的藥物遞送載體和免疫治療工具。在腫瘤疫苗方面，外泌體可以作為腫瘤抗原的載體，將腫瘤相關抗原遞送至抗原呈遞細胞，激活機體的抗腫瘤免疫反應。上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院的研究人員構建了負載腫瘤抗原的間充質干細胞來源的外泌體腫瘤疫苗，在小鼠黑色素瘤模型中，該疫苗能夠有效激活機體的抗腫瘤免疫反應，抑制腫瘤生長。然而，外泌體在腎癌疫苗中的應用研究相對較少，其作為腎癌疫苗的有效性和安全性仍需進一步探索。IL-12作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)細胞因子，在增強機體抗腫瘤免疫反應方面具有顯著作用。通過激活T細胞和NK細胞，誘導IFN-γ等細胞因子的分泌，IL-12能夠增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。然而，由于其嚴重的副作用，如細胞因子風暴、肝損傷等，限制了其在臨床中的廣泛應用。為了解決這一問題，國內(nèi)外學者進行了大量研究，嘗試通過各種方法對IL-12進行修飾和改造，以降低其副作用，提高其抗腫瘤效果。中國科學院生物物理研究所與美國德克薩斯大學西南醫(yī)學中心合作開發(fā)的新一代高效、低毒的腫瘤特異性IL-12前體藥物，通過用IL-12天然細胞受體的胞外結合域封閉IL-12的活性，使其在外周保持無活性狀態(tài)，當?shù)竭_腫瘤部位時，被腫瘤中特異性高表達的基質金屬蛋白酶切割，釋放出IL-12的生物活性，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，在多種小鼠以及人源化小鼠腫瘤模型中驗證了該前體藥物在降低毒性的同時提高了抗腫瘤效果。然而，將修飾后的IL-12與外泌體相結合，用于腎癌疫苗的研究尚未見報道。綜上所述，目前腎癌疫苗的研究取得了一定進展，但仍存在諸多問題亟待解決。外泌體作為一種新興的載體，在腫瘤疫苗領域展現(xiàn)出潛在的應用價值，但在腎癌疫苗中的研究相對較少。IL-12的修飾和改造為其臨床應用提供了新的思路，但將其與外泌體結合用于腎癌治療的研究尚屬空白。因此，本研究旨在構建IL-12錨定修飾exosomes的腎癌疫苗，通過將IL-12錨定在外泌體表面，利用外泌體的靶向性將IL-12精準遞送至腫瘤部位，增強抗腫瘤免疫反應，為腎癌的治療提供一種新的策略。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在制備IL-12錨定修飾exosomes的腎癌疫苗，并深入探究其體外抗腫瘤效應，為腎癌的治療提供新的策略和理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容如下：外泌體的提取與鑒定：選擇合適的細胞系，如人腎癌細胞系786-0，通過超速離心法、超濾法或試劑盒法等常規(guī)方法提取外泌體。采用透射電子顯微鏡（TEM）觀察外泌體的形態(tài)，納米顆粒跟蹤分析（NTA）測定其粒徑分布，蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測外泌體特異性標志物CD63、CD81、TSG101等的表達，以確保提取的外泌體純度和質量符合后續(xù)實驗要求。IL-12錨定修飾外泌體的構建：利用基因工程技術構建攜帶IL-12基因的表達載體，將其轉染至外泌體產(chǎn)生細胞中，使IL-12在外泌體表面表達并錨定。通過優(yōu)化轉染條件，提高IL-12在外泌體表面的表達量和錨定效率。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測IL-12在外泌體表面的表達水平，蛋白質免疫印跡法（Westernblot）分析IL-12與外泌體的結合情況，驗證IL-12錨定修飾外泌體的成功構建。腎癌疫苗的制備與表征：將IL-12錨定修飾的外泌體與腫瘤相關抗原（如腎癌特異性抗原G250等）混合，制備成腎癌疫苗。對制備的腎癌疫苗進行全面表征，包括粒徑分布、電位、形態(tài)等物理性質的測定，以及疫苗中IL-12和腫瘤相關抗原的含量分析，確保疫苗的質量和穩(wěn)定性。體外抗腫瘤效應研究：通過細胞實驗，如MTT法、CCK-8法等檢測腎癌疫苗對腎癌細胞增殖的抑制作用；采用流式細胞術分析腎癌疫苗對腎癌細胞凋亡和細胞周期的影響；利用Transwell實驗探究腎癌疫苗對腎癌細胞遷移和侵襲能力的影響。同時，檢測腎癌疫苗對免疫細胞（如T細胞、NK細胞等）的活化和增殖作用，以及對免疫細胞分泌細胞因子（如IFN-γ、TNF-α等）的影響，深入探討腎癌疫苗的體外抗腫瘤免疫機制。二、相關理論基礎2.1腎癌概述腎癌，從廣義角度而言，指的是發(fā)生在腎臟的惡性腫瘤，涵蓋腎細胞癌、腎盂癌、腎母細胞瘤、腎臟肉瘤以及腎轉移瘤等多種類型。在臨床實踐中，通常所說的腎癌主要是指腎細胞癌，其起源于腎上皮，最為常見的組織病理類型為透明細胞癌，約占腎細胞癌的80%-90%，此外還包括乳頭狀腎細胞癌、嫌色細胞癌、集合管癌等少見類型。腎癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出上升趨勢，在泌尿系統(tǒng)腫瘤中，其發(fā)病率位居第三位，僅次于前列腺癌和膀胱癌。據(jù)統(tǒng)計，2020年全球新增腎癌病例約431,288例，死亡病例達179,368例。在我國，腎癌的發(fā)病率同樣呈逐年上升態(tài)勢，且具有明顯的地域差異和人群分布特點。從地域上看，城市地區(qū)的發(fā)病率相對高于農(nóng)村地區(qū)；從人群分布角度，男性發(fā)病率高于女性，男女發(fā)病率比例約為2∶1，發(fā)病高峰年齡集中在50-70歲。腎癌的發(fā)病機制目前尚未完全明確，但大量研究表明，其發(fā)病與多種因素相關。遺傳因素在腎癌的發(fā)生中起著重要作用，約4%-5%的腎癌患者具有家族遺傳背景，如遺傳性腎癌綜合征，包括vonHippel-Lindau（VHL）綜合征、遺傳性乳頭狀腎細胞癌、遺傳性平滑肌瘤病和腎細胞癌綜合征等，這些綜合征患者由于特定基因突變，導致患腎癌的風險顯著增加。環(huán)境因素也是腎癌發(fā)病的重要誘因，吸煙被認為是腎癌的重要危險因素之一，長期大量吸煙可使患腎癌的風險增加2-3倍。此外，肥胖、高血壓及抗高血壓藥物的使用、職業(yè)暴露（如接觸石棉、鎘、鉛等化學物質）、長期透析等因素，也與腎癌的發(fā)病風險增加密切相關。腎癌早期通常缺乏明顯癥狀，多數(shù)患者在體檢時偶然發(fā)現(xiàn)，這也是導致許多患者確診時已處于中晚期的重要原因。當患者出現(xiàn)典型的血尿、腰痛和腹部包塊“三聯(lián)征”時，往往提示癌癥已進入晚期，此時病情較為嚴重，治療難度大幅增加。血尿通常表現(xiàn)為無痛性肉眼血尿或鏡下血尿，是由于腫瘤侵犯腎盂或腎盞黏膜引起；腰痛多為鈍痛或隱痛，主要是因為腫瘤生長牽拉腎包膜或侵犯周圍組織所致；腹部包塊則是腫瘤增大到一定程度時，在腹部可觸及的實質性腫塊。目前，腎癌的治療方法主要包括手術治療、靶向治療、免疫治療、化療和放療等。手術治療是早期腎癌的主要治療手段，包括根治性腎切除術和腎部分切除術。根治性腎切除術適用于較大的腫瘤或局部進展期腎癌，可將患腎、腎周脂肪、腎周筋膜及區(qū)域淋巴結一并切除，但該手術會導致患者喪失一側腎臟，對腎功能產(chǎn)生一定影響。腎部分切除術則適用于較小的腫瘤，尤其是位于腎臟周邊的腫瘤，可保留部分腎臟組織，最大程度地保護腎功能，但手術難度相對較大，對醫(yī)生的技術要求較高。對于中晚期腎癌，靶向治療和免疫治療已成為重要的治療策略。靶向治療藥物如索拉非尼、舒尼替尼等，通過抑制腫瘤細胞的生長和血管生成，從而達到抑制腫瘤生長的目的；免疫治療藥物如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等，通過激活機體的免疫系統(tǒng)，增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。然而，化療和放療對腎癌的敏感性相對較低，僅在少數(shù)情況下作為輔助治療手段。盡管腎癌的治療取得了一定進展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。一方面，腎癌對傳統(tǒng)的放化療不敏感，治療效果有限；另一方面，靶向治療和免疫治療雖然在部分患者中取得了較好的療效，但存在耐藥性、副作用以及治療費用高昂等問題，限制了其廣泛應用。此外，腎癌的早期診斷較為困難，缺乏有效的早期診斷標志物，導致許多患者錯過最佳治療時機。因此，開發(fā)新的、更有效的腎癌治療方法，提高早期診斷率，成為當前腎癌研究領域的重要任務。2.2exosomes的特性與功能外泌體（exosomes）是一種由細胞分泌的納米級膜泡，具有獨特的結構、來源和生物特性，在腫瘤治療中展現(xiàn)出重要的作用和潛在的應用價值。從結構上看，外泌體呈脂質雙層膜包裹的扁平球體，在透射電子顯微鏡下觀察，其形態(tài)呈杯狀，直徑通常在30-150nm之間，有完整的胞膜，內(nèi)部為低電子密度物質。這種獨特的結構賦予了外泌體良好的穩(wěn)定性和生物相容性，使其能夠在復雜的生物環(huán)境中保持完整性，并順利實現(xiàn)細胞間的物質傳遞和信息交流。外泌體的來源廣泛，幾乎所有細胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體。其形成過程與細胞內(nèi)吞途徑密切相關，起源于細胞內(nèi)吞途徑中的多泡體（MVB）。細胞內(nèi)膜先內(nèi)陷成吞飲泡，吞飲泡的介膜再向內(nèi)出芽，形成膜包圍的結構，其基部逐漸與MVB的膜分離，脫離后就形成了MVB內(nèi)小囊泡，MVB膜胞質面形成了小囊泡的內(nèi)面，小囊泡里面包裹的主要是細胞質。MVB的代謝途徑一般有兩種：一部分MVB被轉運到溶酶體降解；另一部分MVB的泡膜與質膜融合后釋放小泡到胞外空間，這種小泡便是外泌體。外泌體富含多種生物活性物質，包括核酸（如mRNA、miRNA等）、蛋白質、脂質等，這些成分能夠反映分泌源細胞的狀態(tài)和功能。外泌體在細胞間通訊中發(fā)揮著關鍵作用，它可以作為細胞內(nèi)外信號傳遞的載體，將攜帶的生物活性物質遞送至靶細胞，從而調(diào)節(jié)靶細胞的生理功能。例如，巨噬細胞外泌體可以通過其上攜帶的miRNA、mRNA或蛋白質調(diào)節(jié)下游T細胞、B細胞、樹突狀細胞等免疫細胞的免疫反應。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞分泌的外泌體可以影響腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲以及免疫逃逸等過程。腫瘤細胞來源的外泌體能夠干擾樹突狀細胞的成熟，減弱自然殺傷細胞（NK細胞）的活化作用，將巨噬細胞轉化為促腫瘤表型，從而促進腫瘤的生長和轉移。在腫瘤治療領域，外泌體展現(xiàn)出諸多優(yōu)勢，使其成為極具潛力的疫苗載體。首先，外泌體具有低免疫原性，不易被免疫系統(tǒng)識別和清除，能夠在體內(nèi)循環(huán)較長時間，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞的持續(xù)靶向遞送。其次，外泌體可以穿透生物膜屏障，如血腦屏障等，這使得其能夠將治療性物質遞送至傳統(tǒng)藥物難以到達的部位，為腦部腫瘤等疾病的治療提供了新的途徑。此外，外泌體能夠攜帶多種腫瘤相關抗原，將這些抗原遞送至抗原呈遞細胞，激活機體的抗腫瘤免疫反應。有研究表明，裝載有半乳糖神經(jīng)酰胺/卵蛋白外泌體在黑色素瘤小鼠模型實驗中，能夠誘導早期的T細胞反應及抑制腫瘤生長?；颊哐逯懈患哪[瘤來源外泌體（TEXs）可能為樹突狀細胞（DCs）疫苗接種提供一個優(yōu)化的、個體特異性的抗原來源。外泌體作為一種天然的納米級載體，具有獨特的結構、來源和生物特性，在腫瘤治療中發(fā)揮著重要作用，尤其是作為疫苗載體，具有低免疫原性、良好的生物相容性、能夠穿透生物膜屏障以及攜帶腫瘤相關抗原激活機體抗腫瘤免疫反應等優(yōu)勢，為腫瘤免疫治療帶來了新的希望。2.3IL-12的免疫調(diào)節(jié)作用白細胞介素-12（IL-12）是一種在機體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關鍵作用的細胞因子，其獨特的結構和復雜的生成調(diào)節(jié)機制，賦予了它廣泛而重要的生物學功能，尤其是在抗腫瘤免疫方面，展現(xiàn)出巨大的潛力。IL-12是一種異源二聚體細胞因子，由相對分子質量為40X103的p40亞單位（IL-12β）和35X103的p35亞單位通過二硫鍵緊密相連構成。這種獨特的異源二聚體結構在白細胞介素家族中較為罕見，為其發(fā)揮特殊的生物學功能奠定了基礎。值得注意的是，在某些情況下，如鼠類細胞中，會觀察到p40同源二聚體的產(chǎn)生，但該同源二聚體并不具備生物學活性。IL-12的生成受到嚴格而精細的正性和負性調(diào)節(jié)機制的共同控制。從正性調(diào)節(jié)方面來看，多種微生物產(chǎn)物，如細菌、胞內(nèi)寄生蟲、真菌、雙鏈DNA及CpG-寡聚核苷酸等，能夠顯著增強IL-12的產(chǎn)生。同時，一些細胞因子，如IFN-γ、TNF-β、GM-CSF等，也對IL-12的生成起到促進作用。在負性調(diào)節(jié)方面，IL-4、IL-10、IL-13等細胞因子則會抑制IL-12的產(chǎn)生。以感染過程為例，當機體受到細菌感染時，細菌的成分會刺激免疫細胞，促使其產(chǎn)生IFN-γ等細胞因子，這些細胞因子進而誘導免疫細胞分泌IL-12，增強機體的免疫防御；而在某些炎癥反應后期，IL-10等抑制性細胞因子的分泌增加，會抑制IL-12的產(chǎn)生，防止免疫反應過度，維持機體免疫平衡。這種復雜而精準的調(diào)節(jié)機制確保了IL-12在機體內(nèi)的適時、適量表達，避免過度免疫反應對機體造成損傷。IL-12具有廣泛而強大的生物學功能，在免疫調(diào)節(jié)、抗病毒與抗腫瘤等方面均發(fā)揮著重要作用。在免疫調(diào)節(jié)方面，IL-12是Th1細胞免疫應答的關鍵決定因素。它能夠有效促進Th1類細胞因子如IFN-γ的產(chǎn)生，同時抑制Th2類因子的生成，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞免疫應答的平衡。這種調(diào)節(jié)作用對于控制感染、預防自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)生具有重要意義。例如，在感染病毒時，IL-12可誘導機體產(chǎn)生Th1型免疫反應，增強免疫細胞對病毒的清除能力；而在自身免疫性疾病中，IL-12的異常表達與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，調(diào)節(jié)IL-12的水平可能有助于疾病的治療。在抗病毒和抗腫瘤方面，IL-12的作用同樣顯著。它能夠誘導T細胞、NK細胞等免疫細胞的分化和增殖，產(chǎn)生γ干擾素等抗病毒因子，從而增強機體的抗病毒能力。在腫瘤治療中，IL-12可以激活免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，抑制腫瘤的生長和擴散。具體而言，IL-12能夠促進T細胞和NK細胞的增殖，增強它們的細胞毒性，使其能夠更有效地殺傷腫瘤細胞；同時，IL-12還可以誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應，從而抑制腫瘤的生長。研究表明，在黑色素瘤、腎癌等多種腫瘤模型中，給予IL-12治療后，腫瘤的生長明顯受到抑制，小鼠的生存期顯著延長。IL-12還具有其他重要功能，如增強細胞毒性T淋巴細胞（CTLs）和淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK細胞）的生成及活性，促進B細胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)免疫球蛋白的生成等。這些功能相互協(xié)同，共同構成了IL-12在機體免疫應答中的多面性角色，使其成為免疫系統(tǒng)中不可或缺的關鍵調(diào)節(jié)因子。三、IL-12錨定修飾exosomes的腎癌疫苗制備3.1實驗材料與儀器本實驗選用人腎癌細胞系786-0，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），該細胞系具有典型的腎癌細胞生物學特性，廣泛應用于腎癌相關研究，為后續(xù)實驗提供穩(wěn)定的細胞來源。細胞培養(yǎng)試劑方面，采用高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），其富含多種營養(yǎng)成分，能夠滿足786-0細胞生長和增殖的需求；胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），作為細胞培養(yǎng)的重要添加物，提供細胞生長所需的多種生長因子和營養(yǎng)物質；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（美國Gibco公司），用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染，保證細胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。實驗儀器是實驗成功的關鍵保障。高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），具備高轉速和精確控溫功能，可用于外泌體提取過程中的細胞上清液離心，有效分離細胞碎片和外泌體；超低溫冰箱（日本Sanyo公司），能夠提供-80℃的低溫環(huán)境，用于外泌體、細胞及相關試劑的長期保存，確保生物活性物質的穩(wěn)定性；透射電子顯微鏡（TEM，日本JEOL公司），具有高分辨率，可用于觀察外泌體的形態(tài)和結構，直觀呈現(xiàn)外泌體的特征；納米顆粒跟蹤分析儀（NTA，英國Malvern公司），能夠精確測定外泌體的粒徑分布和濃度，為外泌體的質量控制提供重要數(shù)據(jù)；酶標儀（美國Bio-Tek公司），用于ELISA實驗中檢測樣品的吸光度，定量分析IL-12等蛋白的表達水平。分子生物學實驗常用儀器也不可或缺。PCR擴增儀（美國AppliedBiosystems公司），用于目的基因的擴增，通過精確控制溫度循環(huán)，實現(xiàn)基因的大量復制；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），可對核酸凝膠進行成像和分析，直觀展示PCR擴增產(chǎn)物的大小和純度；恒溫培養(yǎng)箱（德國Memmert公司），為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和氣體環(huán)境，滿足細胞生長的條件需求；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制箱內(nèi)的CO?濃度，維持細胞培養(yǎng)液的pH值穩(wěn)定，確保細胞正常生長和代謝。蛋白質免疫印跡實驗需要電泳儀（美國Bio-Rad公司），實現(xiàn)蛋白質的分離；轉膜儀（美國Bio-Rad公司），將凝膠上的蛋白質轉移至固相膜上；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國GEHealthcare公司），用于檢測膜上的蛋白質信號，通過化學發(fā)光反應，使蛋白質條帶可視化，便于分析和檢測。這些實驗材料和儀器的合理選擇和使用，為制備IL-12錨定修飾exosomes的腎癌疫苗及后續(xù)研究提供了有力支持。3.2exosomes的提取與鑒定本研究采用超速離心法從人腎癌細胞786-0的培養(yǎng)上清液中提取exosomes，該方法是目前提取exosomes的經(jīng)典方法之一，具有操作相對簡便、成本較低且能夠獲得高純度exosomes的優(yōu)勢。首先，將處于對數(shù)生長期的786-0細胞接種于T75培養(yǎng)瓶中，使用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達到80%-90%時，更換為無外泌體血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，以減少血清中自帶外泌體對實驗結果的干擾。收集細胞培養(yǎng)上清液，先在4℃、300×g條件下離心10min，去除細胞；隨后將上清液轉移至新的離心管中，在4℃、2000×g條件下離心20min，以去除細胞碎片和凋亡小體等較大顆粒物質。接著，將得到的上清液進行0.22μm濾膜過濾，進一步去除微小雜質。將過濾后的上清液轉移至超速離心管中，在4℃、100000×g條件下超速離心70min，使exosomes沉淀于離心管底部。最后，棄去上清液，用適量的PBS重懸沉淀，即得到初步提取的exosomes。為了進一步純化exosomes，可將重懸后的exosomes再次進行超速離心，重復上述步驟。提取得到exosomes后，需要對其進行全面鑒定，以確保其質量和純度符合后續(xù)實驗要求。采用納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術測定exosomes的粒徑分布和濃度。NTA技術基于光散射原理，通過對單個納米顆粒的布朗運動進行實時監(jiān)測和分析，從而精確測定其粒徑大小和濃度。將提取的exosomes用PBS稀釋至適當濃度，注入NTA儀器的樣品池中，在適宜的溫度和光照條件下，儀器自動采集納米顆粒的散射光信號，并通過數(shù)據(jù)分析軟件計算出exosomes的粒徑分布和濃度。一般來說，exosomes的粒徑主要分布在30-150nm之間，與理論值相符則表明提取的exosomes質量較好。采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測exosomes特異性標志物的表達。常用的exosomes特異性標志物包括CD63、CD81、TSG101等，這些標志物在exosomes表面高度表達，而在其他細胞成分中表達較少或不表達，因此可作為鑒定exosomes的重要指標。將提取的exosomes進行裂解，提取總蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量的蛋白樣品進行SDS電泳，將分離后的蛋白質轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，以減少非特異性結合。隨后，分別加入抗CD63、CD81、TSG101的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，去除未結合的一抗。加入相應的HRP標記的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用化學發(fā)光底物顯色，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)下觀察并拍照，若在相應分子量位置出現(xiàn)特異性條帶，則表明提取的樣品中含有exosomes。利用免疫電鏡觀察exosomes的形態(tài)和結構。將提取的exosomes滴加到碳支持膜銅網(wǎng)上，室溫孵育5min，使exosomes吸附在銅網(wǎng)上。用濾紙吸去多余液體，然后滴加2%的磷鎢酸溶液進行負染，室溫染色5min。再次用濾紙吸去多余液體，待樣品干燥后，在透射電子顯微鏡下觀察。在電鏡下，exosomes呈現(xiàn)為典型的杯狀或球狀結構，直徑在30-150nm之間，表面有一層清晰的脂質雙層膜，內(nèi)部為低電子密度物質。通過免疫電鏡不僅可以直觀地觀察exosomes的形態(tài)和結構，還可以通過免疫標記技術進一步確認exosomes表面標志物的表達情況。將碳支持膜銅網(wǎng)上的exosomes與相應的一抗孵育，然后與標記有金顆粒的二抗孵育，在電鏡下觀察，若在exosomes表面觀察到金顆粒，則表明相應的標志物存在于exosomes表面。3.3IL-12的獲取與處理本研究中IL-12的獲取采用基因工程表達的方法。首先，從人外周血單個核細胞中提取總RNA，利用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，通過PCR擴增IL-12的編碼基因，擴增過程中需要根據(jù)IL-12基因序列設計特異性引物，引物的設計需遵循堿基互補配對原則，同時考慮引物的長度、GC含量以及避免引物二聚體的形成。將擴增得到的IL-12基因片段與合適的表達載體（如pET-32a等）進行連接，構建重組表達質粒。連接反應通常使用T4DNA連接酶，在適宜的溫度和反應體系下進行，使基因片段與載體的粘性末端或平末端通過磷酸二酯鍵連接。將重組表達質粒轉化至感受態(tài)大腸桿菌（如BL21等）中，通過篩選含有重組質粒的陽性克隆，獲得能夠表達IL-12的工程菌。篩選過程一般采用氨芐青霉素抗性篩選，將轉化后的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，只有成功轉入含有氨芐青霉素抗性基因重組質粒的大腸桿菌才能在該培養(yǎng)基上生長，形成單菌落。將篩選得到的陽性工程菌接種至含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，進行擴大培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，通過添加IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導IL-12的表達。IPTG作為一種誘導劑，能夠與阻遏蛋白結合，解除阻遏蛋白對基因表達的抑制作用，從而啟動IL-12基因的轉錄和翻譯過程。誘導表達的條件需要進行優(yōu)化，包括IPTG的濃度、誘導時間和誘導溫度等，以獲得較高的IL-12表達量。通過改變IPTG的濃度梯度，如0.1mM、0.5mM、1.0mM等，在不同的誘導時間點（如2h、4h、6h等）和溫度（如30℃、37℃等）下收集菌體，通過SDS-PAGE電泳分析IL-12的表達量，確定最佳的誘導條件。誘導表達結束后，收集菌體，通過超聲破碎等方法裂解菌體，釋放出細胞內(nèi)表達的IL-12。超聲破碎過程中，需要控制超聲功率、時間和間歇時間等參數(shù)，以避免蛋白質過度變性。一般設置超聲功率為200-400W，超聲時間為3-5s，間歇時間為3-5s，總超聲時間根據(jù)菌體濃度和體積進行調(diào)整。破碎后的菌體裂解液通過離心等方法去除細胞碎片，收集上清液，其中含有表達的IL-12。離心條件一般為4℃、12000×g，離心15-20min，使細胞碎片沉淀于離心管底部，而上清液中則含有目的蛋白IL-12。為了獲得高純度的IL-12，需要對上清液進行純化處理。采用鎳柱親和層析法對IL-12進行純化，由于IL-12表達載體上通常帶有His-tag標簽，能夠與鎳柱上的鎳離子特異性結合。將上清液加載到鎳柱上，使IL-12與鎳柱結合，然后用不同濃度的咪唑洗脫液進行洗脫，逐步去除雜質蛋白，最終得到高純度的IL-12。咪唑洗脫液的濃度一般從低到高，如20mM、50mM、100mM、250mM等，通過收集不同洗脫峰的蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳分析，確定含有高純度IL-12的洗脫峰。對純化后的IL-12進行活性檢測也至關重要。采用MTT法檢測IL-12對NK細胞增殖的促進作用，以評估其生物學活性。將NK細胞接種于96孔板中，設置不同的實驗組，分別加入不同濃度的純化IL-12和對照試劑。在適宜的條件下培養(yǎng)一定時間后，向每孔加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h左右。然后棄去上清液，加入DMSO溶解甲瓚結晶，用酶標儀在570nm波長處測定各孔的吸光度值。根據(jù)吸光度值計算NK細胞的增殖率，增殖率=（實驗組吸光度值-對照組吸光度值）/對照組吸光度值×100%。通過比較不同濃度IL-12處理組NK細胞的增殖率，確定IL-12的活性大小。還可以采用ELISA法檢測IL-12刺激NK細胞分泌IFN-γ的水平，進一步驗證其活性。將NK細胞與不同濃度的IL-12共培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒的操作步驟，檢測上清液中IFN-γ的含量。IFN-γ含量的增加表明IL-12能夠有效激活NK細胞，發(fā)揮其生物學活性。3.4IL-12錨定修飾exosomes的合成在本研究中，采用化學交聯(lián)法將IL-12錨定修飾到exosomes上，化學交聯(lián)法是利用交聯(lián)劑分子中的多個反應性基團，分別與IL-12和exosomes表面的特定基團發(fā)生化學反應，形成共價鍵，從而實現(xiàn)兩者的連接。這種方法具有連接穩(wěn)定、效率較高等優(yōu)點，能夠確保IL-12在exosomes表面的有效錨定。具體操作步驟如下：首先，對提取并鑒定后的exosomes進行預處理，以暴露其表面可用于交聯(lián)的基團。將exosomes懸浮于適量的PBS緩沖液中，調(diào)節(jié)其濃度至合適范圍，一般為1×10^10-1×10^11個/mL。然后，加入適量的交聯(lián)劑，本研究選用的交聯(lián)劑為1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）。EDC能夠活化exosomes表面的羧基，使其與NHS反應生成活性酯中間體，該中間體可以與IL-12分子上的氨基發(fā)生反應，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。在反應體系中，EDC和NHS的摩爾比通常為1∶1-3∶1，具體比例可根據(jù)實驗結果進行優(yōu)化。將EDC和NHS按照一定比例加入到exosomes懸浮液中，在室溫下孵育30-60min，使交聯(lián)劑充分活化exosomes表面的羧基。將純化后的IL-12加入到上述活化的exosomes反應體系中。IL-12的加入量需根據(jù)exosomes的濃度和預期的修飾比例進行調(diào)整，一般使IL-12與exosomes的摩爾比在10∶1-100∶1之間。加入IL-12后，將反應體系在4℃下緩慢攪拌孵育過夜，以確保IL-12與exosomes充分反應，實現(xiàn)有效錨定。反應結束后，需要對修飾后的exosomes進行分離和純化，以去除未反應的IL-12、交聯(lián)劑及其他雜質。采用超速離心法進行分離，將反應后的混合液轉移至超速離心管中，在4℃、100000×g條件下超速離心70min，使修飾后的exosomes沉淀于離心管底部。棄去上清液，用適量的PBS重懸沉淀，即得到初步純化的IL-12錨定修飾exosomes。為了進一步提高純度，可將重懸后的修飾exosomes再次進行超速離心，重復上述步驟。還可以采用凝膠過濾層析等方法對修飾exosomes進行進一步純化，以獲得高純度的產(chǎn)品。在合成過程中，反應條件的優(yōu)化對于提高IL-12的錨定效率和修飾exosomes的質量至關重要。通過改變交聯(lián)劑的濃度、反應時間和反應溫度等條件，研究其對IL-12錨定修飾效果的影響。設置不同的EDC和NHS濃度梯度，如5mM、10mM、15mM等，在相同的反應時間和溫度下進行實驗，通過ELISA法檢測修飾exosomes表面IL-12的表達水平，確定最佳的交聯(lián)劑濃度。研究反應時間對修飾效果的影響，分別設置反應時間為4h、8h、12h、16h、20h、24h等，通過蛋白質免疫印跡法（Westernblot）分析IL-12與exosomes的結合情況，選擇最佳的反應時間。探索不同反應溫度（如4℃、25℃、37℃等）對修飾效果的影響，綜合考慮IL-12的活性和反應速率，確定最適宜的反應溫度。還可以研究反應體系的pH值對修飾效果的影響，通過調(diào)整PBS緩沖液的pH值，如pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0等，進行實驗，確定最佳的反應pH值。3.5修飾后exosomes的質量控制修飾后exosomes的質量控制對于確保腎癌疫苗的有效性和安全性至關重要，需從多個關鍵指標進行嚴格檢測和評估。采用納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術精確測定修飾后exosomes的粒徑分布。NTA技術基于光散射原理，能夠對單個納米顆粒的布朗運動進行實時監(jiān)測和分析，從而獲得準確的粒徑信息。將修飾后的exosomes用PBS稀釋至適當濃度，注入NTA儀器的樣品池中，在適宜的溫度和光照條件下，儀器自動采集納米顆粒的散射光信號，并通過數(shù)據(jù)分析軟件計算出粒徑分布。理想情況下，修飾后exosomes的粒徑應主要分布在30-150nm之間，與天然exosomes的粒徑范圍相符。若粒徑分布出現(xiàn)明顯偏差，可能會影響其在體內(nèi)的循環(huán)、攝取和靶向性，進而影響疫苗的療效。如粒徑過大可能導致其難以穿透生物膜屏障，無法有效到達腫瘤部位；粒徑過小則可能影響其穩(wěn)定性和攜帶藥物的能力。利用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測修飾后exosomes表面標志物的表達情況，以驗證其完整性和純度。除了檢測常規(guī)的exosomes特異性標志物CD63、CD81、TSG101等，還需檢測與IL-12錨定相關的標志物。將修飾后的exosomes進行裂解，提取總蛋白，通過BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白質轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，以減少非特異性結合。隨后，分別加入抗CD63、CD81、TSG101以及與IL-12錨定相關標志物的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，去除未結合的一抗。加入相應的HRP標記的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用化學發(fā)光底物顯色，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)下觀察并拍照。若在相應分子量位置出現(xiàn)特異性條帶，則表明修飾后exosomes表面的標志物表達正常，其完整性和純度符合要求。若某些標志物條帶缺失或信號較弱，可能意味著exosomes在修飾過程中受到損傷，或者存在雜質污染，需要進一步優(yōu)化制備工藝或進行純化處理。通過酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）準確測定IL-12在外泌體表面的結合率。首先，需要制備針對IL-12的特異性抗體，確?？贵w的高親和力和特異性。將修飾后的exosomes進行適當稀釋，加入到ELISA板的孔中，使其與板上的抗體結合。孵育一段時間后，洗去未結合的exosomes。加入酶標記的二抗，與結合在exosomes表面的IL-12特異性抗體結合。再次洗滌后，加入酶底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應。通過酶標儀測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算出修飾后exosomes表面IL-12的含量，進而計算出IL-12的結合率。IL-12結合率的高低直接影響著腎癌疫苗的免疫激活效果，較高的結合率意味著更多的IL-12能夠被遞送至腫瘤部位，增強抗腫瘤免疫反應。一般來說，期望IL-12的結合率能夠達到一定水平，如70%以上，若結合率過低，則需要優(yōu)化IL-12與exosomes的錨定條件，提高結合效率。對修飾后exosomes的穩(wěn)定性進行全面考察。將修飾后的exosomes分別置于不同的溫度（如4℃、室溫、37℃等）和儲存時間條件下，定期檢測其粒徑分布、表面標志物表達以及IL-12結合率等指標的變化情況。在4℃條件下，修飾后exosomes應能夠保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，粒徑分布和表面標志物表達無明顯變化，IL-12結合率也能維持在較高水平。隨著溫度升高或儲存時間延長，若出現(xiàn)粒徑增大、表面標志物表達降低或IL-12結合率下降等情況，則表明其穩(wěn)定性受到影響。在室溫下放置一段時間后，可能由于環(huán)境因素的影響，exosomes的膜結構會逐漸發(fā)生變化，導致粒徑增大；長時間儲存還可能引起IL-12與exosomes之間的連接不穩(wěn)定，從而使IL-12結合率降低。若修飾后exosomes在不同條件下均能保持較好的穩(wěn)定性，說明其質量可靠，適合進一步的研究和應用；反之，則需要采取相應的措施來提高其穩(wěn)定性，如優(yōu)化保存條件、添加穩(wěn)定劑等。四、體外抗腫瘤效應研究4.1實驗細胞與分組本實驗選用人腎癌細胞株786-0，該細胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。786-0細胞株源自一名58歲白人男性原發(fā)性透明細胞腺癌組織，具有典型的腎癌細胞生物學特性，在腎癌相關研究中被廣泛應用，能夠為體外抗腫瘤效應研究提供穩(wěn)定可靠的細胞模型。將實驗分為以下幾組：對照組：僅加入人腎癌細胞786-0，給予常規(guī)細胞培養(yǎng)條件，不做任何處理，用于提供細胞正常生長狀態(tài)下的各項指標數(shù)據(jù)，作為后續(xù)實驗組結果對比的基礎，以明確其他處理因素對細胞生長、凋亡、遷移等生物學行為的影響。exosomes組：在人腎癌細胞786-0培養(yǎng)體系中加入未修飾的exosomes，其濃度設置為10μg/mL。此濃度是基于前期預實驗及相關文獻研究確定的，該濃度下的exosomes既能保證在細胞培養(yǎng)體系中有一定的作用效果，又不會因濃度過高對細胞產(chǎn)生非特異性毒性等干擾實驗結果的因素。通過與對照組對比，可觀察到天然exosomes對腎癌細胞生物學行為的影響，初步探究exosomes在腎癌治療中的潛在作用。IL-12組：向人腎癌細胞786-0培養(yǎng)體系中加入單獨的IL-12，其濃度為50ng/mL。這一濃度是參考相關研究及前期實驗優(yōu)化確定的，在此濃度下IL-12能夠有效發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，同時避免因濃度過高導致的細胞毒性等不良反應。該組用于研究IL-12單獨作用時對腎癌細胞的影響，明確IL-12在體外對腎癌細胞生長、凋亡等方面的直接作用效果。IL-12錨定修飾exosomes組：在人腎癌細胞786-0培養(yǎng)體系中加入IL-12錨定修飾的exosomes，其中IL-12的含量為50ng/mL，exosomes的濃度為10μg/mL。此濃度設置是基于前期對IL-12和exosomes單獨作用的實驗結果，以及兩者聯(lián)合作用的預實驗數(shù)據(jù)確定的，旨在使IL-12和exosomes在協(xié)同作用時達到最佳的抗腫瘤效果。該組是本實驗的關鍵實驗組，用于探究IL-12錨定修飾exosomes作為腎癌疫苗在體外對腎癌細胞的綜合抗腫瘤效應，包括對細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的影響，以及對免疫細胞活化和免疫相關細胞因子分泌的影響，從而深入揭示其抗腫瘤機制。4.2細胞增殖實驗本實驗采用CCK-8法檢測不同處理組細胞的增殖情況，以評估IL-12錨定修飾exosomes對人腎癌細胞786-0增殖的影響。CCK-8法的原理基于高度水溶性的四唑鹽WST-8，在電子介體的作用下，WST-8可被細胞中的脫氫酶還原生成水溶性甲瓚產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色反應。細胞中脫氫酶產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物的量與活細胞的數(shù)量成正比，通過酶標儀在450nm波長處測定吸光度值（OD值），即可間接反映活細胞的數(shù)量，從而評估細胞的增殖能力。具體操作步驟如下：首先，將處于對數(shù)生長期的人腎癌細胞786-0用胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5×10^4個/mL。然后，將細胞懸液接種于96孔板中，每孔加入100μL，即每孔接種5×10^3個細胞。將96孔板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，按照實驗分組進行處理。對照組加入100μL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基；exosomes組加入100μL含10μg/mL未修飾exosomes的培養(yǎng)基；IL-12組加入100μL含50ng/mLIL-12的培養(yǎng)基；IL-12錨定修飾exosomes組加入100μL含50ng/mLIL-12和10μg/mLIL-12錨定修飾exosomes的培養(yǎng)基。每組設置6個復孔，以減少實驗誤差。將處理后的96孔板繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后進行檢測。在各時間點檢測時，從培養(yǎng)箱中取出96孔板，向每孔中加入10μLCCK-8溶液。為避免因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，加完試劑后輕輕晃動培養(yǎng)板以幫助混勻。將96孔板放回培養(yǎng)箱中，繼續(xù)孵育1-4h，使CCK-8與細胞充分反應。由于不同細胞形成甲瓚產(chǎn)物的速度不同，孵育時間可根據(jù)細胞的實際情況進行調(diào)整。血液細胞形成甲瓚產(chǎn)物的速度較慢，可能需要較長的顯色時間（5-6h）。孵育結束后，使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的OD值。實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用GraphPadPrism8.0軟件進行。首先，計算每組各時間點的OD值平均值和標準差，以反映數(shù)據(jù)的集中趨勢和離散程度。然后，通過方差分析（ANOVA）比較不同處理組在各時間點的OD值差異，判斷不同處理對細胞增殖的影響是否具有統(tǒng)計學意義。若P<0.05，則認為差異具有統(tǒng)計學意義。進一步采用Tukey's多重比較檢驗，分析各處理組之間的具體差異情況，明確哪些處理組之間的細胞增殖能力存在顯著差異。以對照組在各時間點的OD值為基準，計算其他處理組細胞的相對增殖率。相對增殖率=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（陽性對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。通過繪制細胞增殖曲線，直觀展示不同處理組細胞在不同時間點的增殖情況，從而更清晰地分析IL-12錨定修飾exosomes對人腎癌細胞786-0增殖的抑制作用。4.3細胞凋亡檢測采用AnnexinV-FITC/PI染色法結合流式細胞術檢測不同處理組細胞的凋亡情況。細胞凋亡是一個高度有序的程序性細胞死亡過程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中起著關鍵作用。AnnexinV是一種36kDa的鈣依賴性磷脂結合蛋白，對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力。在細胞凋亡早期，細胞膜的磷脂雙分子層發(fā)生翻轉，原本位于細胞膜內(nèi)側的PS外翻到細胞膜表面，AnnexinV能夠與外翻的PS特異性結合。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細胞和早期凋亡細胞的完整細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜，與細胞核內(nèi)的DNA結合，從而使細胞核染成紅色。因此，通過AnnexinV-FITC和PI雙染，再結合流式細胞術，可以準確地區(qū)分活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞。具體操作步驟如下：首先，將對數(shù)生長期的人腎癌細胞786-0接種于6孔板中，每孔接種2×10^5個細胞，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。然后，按照實驗分組進行處理，對照組加入1mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基；exosomes組加入1mL含10μg/mL未修飾exosomes的培養(yǎng)基；IL-12組加入1mL含50ng/mLIL-12的培養(yǎng)基；IL-12錨定修飾exosomes組加入1mL含50ng/mLIL-12和10μg/mLIL-12錨定修飾exosomes的培養(yǎng)基。每組設置3個復孔。將處理后的6孔板繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結束后，收集細胞培養(yǎng)液中的懸浮細胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化貼壁細胞，將懸浮細胞和貼壁細胞合并，轉移至離心管中。1000×g離心5min，棄去上清液。用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次1000×g離心5min。棄去上清液后，加入500μL1×AnnexinV結合緩沖液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10^6個/mL。取100μL細胞懸液于流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。孵育結束后，加入400μL1×AnnexinV結合緩沖液，上機進行流式細胞術檢測。在流式細胞術檢測中，設置合適的通道檢測AnnexinV-FITC和PI的熒光信號。以未染色的細胞作為陰性對照，用于檢測自然熒光；以PI單染的細胞作為PI陽性對照，用于確定PI的陽性閾值；以AnnexinV-FITC單染的細胞作為AnnexinV陽性對照，用于確定AnnexinV的陽性閾值。通過分析流式細胞術檢測得到的數(shù)據(jù)，計算不同處理組中活細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?）的比例。除了通過AnnexinV-FITC/PI染色法結合流式細胞術檢測細胞凋亡率外，還采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測凋亡相關蛋白的表達，進一步探究IL-12錨定修飾exosomes誘導細胞凋亡的機制。凋亡相關蛋白包括促凋亡蛋白Bax、Bak，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL等，它們在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。Bax和Bak可以促進線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素C，激活caspase級聯(lián)反應，從而誘導細胞凋亡；而Bcl-2和Bcl-XL則可以抑制線粒體膜通透性增加，阻止細胞色素C的釋放，抑制細胞凋亡。將不同處理組的細胞收集后，用RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。通過BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取適量的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳。將分離后的蛋白質轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，以減少非特異性結合。隨后，分別加入抗Bax、Bak、Bcl-2、Bcl-XL的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，去除未結合的一抗。加入相應的HRP標記的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用化學發(fā)光底物顯色，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析凋亡相關蛋白的表達變化。4.4細胞周期分析采用PI染色法結合流式細胞術分析不同處理組細胞的周期分布，以探究IL-12錨定修飾exosomes對人腎癌細胞786-0細胞周期的影響。細胞周期是指細胞從上一次分裂完成開始，到下一次分裂完成時為止，包括分裂間期（G1期、S期、G2期）和分裂期（M期）。細胞內(nèi)的DNA含量隨細胞周期進程發(fā)生周期性變化，如G0/G1期的DNA含量為2C，而G2期的DNA含量是4C。PI染色法正是利用這一特性，通過PI與細胞內(nèi)DNA結合，其熒光強度直接反映了細胞內(nèi)DNA含量，從而分析細胞周期各時相的百分比。具體操作步驟如下：首先，將對數(shù)生長期的人腎癌細胞786-0接種于6孔板中，每孔接種2×10^5個細胞，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。然后，按照實驗分組進行處理，對照組加入1mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基；exosomes組加入1mL含10μg/mL未修飾exosomes的培養(yǎng)基；IL-12組加入1mL含50ng/mLIL-12的培養(yǎng)基；IL-12錨定修飾exosomes組加入1mL含50ng/mLIL-12和10μg/mLIL-12錨定修飾exosomes的培養(yǎng)基。每組設置3個復孔。將處理后的6孔板繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結束后，收集細胞培養(yǎng)液中的懸浮細胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化貼壁細胞，將懸浮細胞和貼壁細胞合并，轉移至離心管中。1000×g離心5min，棄去上清液。用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次1000×g離心5min。棄去上清液后，加入500μL預冷的70%乙醇，輕輕吹打混勻，4℃固定過夜。固定后的細胞用PBS洗滌2次，每次1000×g離心5min。棄去上清液后，加入200μLRNaseA（1mg/mL），37℃孵育30min，以降解細胞內(nèi)的RNA，避免其對PI染色的干擾。孵育結束后，加入300μLPI染色液（50μg/mL），室溫避光孵育30min。將染色后的細胞懸液轉移至流式管中，上機進行流式細胞術檢測。在流式細胞儀檢測中，設置合適的通道檢測PI的熒光信號。以未染色的細胞作為陰性對照，用于檢測自然熒光；以PI單染的細胞作為PI陽性對照，用于確定PI的陽性閾值。通過分析流式細胞術檢測得到的數(shù)據(jù)，計算不同處理組中G0/G1期、S期和G2/M期細胞的比例。除了通過PI染色法結合流式細胞術檢測細胞周期分布外，還采用蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測細胞周期相關蛋白的表達，進一步探究IL-12錨定修飾exosomes對細胞周期的調(diào)控機制。細胞周期相關蛋白包括細胞周期蛋白（Cyclins）、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）等，它們在細胞周期的調(diào)控中發(fā)揮著關鍵作用。CyclinD、CyclinE、CyclinA、CyclinB等與相應的CDK結合，形成復合物，激活CDK的激酶活性，推動細胞周期的進程。CKIs如p21、p27等則可以抑制CDK的活性，阻止細胞周期的進展。將不同處理組的細胞收集后，用RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。通過BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取適量的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳。將分離后的蛋白質轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，以減少非特異性結合。隨后，分別加入抗CyclinD、CyclinE、CyclinA、CyclinB、p21、p27等的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，去除未結合的一抗。加入相應的HRP標記的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用化學發(fā)光底物顯色，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析細胞周期相關蛋白的表達變化。4.5免疫反應檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測修飾exosomes刺激免疫細胞分泌細胞因子的水平，以評估其對免疫細胞的激活作用。細胞因子在免疫反應中起著關鍵的調(diào)節(jié)作用，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，它們的分泌水平變化能夠反映免疫細胞的活化狀態(tài)。選擇小鼠脾細胞作為免疫細胞來源，小鼠脾細胞包含多種免疫細胞類型，如T細胞、B細胞、NK細胞等，能夠全面反映修飾exosomes對免疫系統(tǒng)的影響。將小鼠脾細胞接種于96孔板中，每孔接種1×10^6個細胞。按照實驗分組，分別加入不同的處理因素，對照組加入等量的PBS；exosomes組加入10μg/mL未修飾的exosomes；IL-12組加入50ng/mLIL-12；IL-12錨定修飾exosomes組加入含50ng/mLIL-12和10μg/mLIL-12錨定修飾exosomes的混合液。每組設置6個復孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結束后，收集細胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒的操作步驟進行檢測。首先，將ELISA板用包被緩沖液稀釋的捕獲抗體包被，4℃孵育過夜，使抗體牢固結合在ELISA板上。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液洗滌ELISA板3次，每次5min，以去除未結合的抗體。加入封閉液，室溫孵育1h，封閉ELISA板上的非特異性結合位點。棄去封閉液，再次用洗滌緩沖液洗滌ELISA板3次，每次5min。將收集的細胞培養(yǎng)上清液加入到ELISA板的相應孔中，同時設置標準品孔，加入不同濃度的細胞因子標準品，每個濃度設置2個復孔。室溫孵育2h，使細胞因子與捕獲抗體充分結合。棄去上清液，用洗滌緩沖液洗滌ELISA板5次，每次5min。加入用檢測緩沖液稀釋的生物素標記的檢測抗體，室溫孵育1h。棄去檢測抗體，用洗滌緩沖液洗滌ELISA板5次，每次5min。加入用檢測緩沖液稀釋的HRP標記的鏈霉親和素，室溫孵育30min。棄去鏈霉親和素，用洗滌緩沖液洗滌ELISA板5次，每次5min。加入TMB底物溶液，室溫避光孵育15-30min，使底物在HRP的催化下發(fā)生顯色反應。最后，加入終止液終止反應，使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值。根據(jù)標準品的濃度和吸光度值繪制標準曲線，通過標準曲線計算出樣品中細胞因子的濃度。為了進一步分析免疫細胞的活化和增殖情況，采用流式細胞術檢測免疫細胞表面活化標志物的表達以及細胞增殖標志物的表達。對于T細胞，選擇CD69、CD25等作為活化標志物，CD69是一種早期活化標志物，在T細胞受到刺激后數(shù)小時內(nèi)即可表達上調(diào)；CD25則是白細胞介素-2受體的α鏈，在T細胞活化后表達增加。對于NK細胞，選擇CD69、NKp46等作為活化標志物，CD69同樣可反映NK細胞的活化狀態(tài)，NKp46是NK細胞表面的一種特異性活化受體，其表達水平的變化與NK細胞的活化密切相關。將小鼠脾細胞與不同處理因素共培養(yǎng)48h后，收集細胞，用PBS洗滌2次，每次1000×g離心5min。棄去上清液，加入適量的熒光標記抗體，如抗CD69-FITC、抗CD25-PE、抗NKp46-APC等，室溫避光孵育30min。孵育結束后，用PBS洗滌細胞3次，每次1000×g離心5min。棄去上清液，加入適量的PBS重懸細胞，上機進行流式細胞術檢測。在流式細胞儀檢測中，設置合適的通道檢測不同熒光標記抗體的熒光信號。通過分析流式細胞術檢測得到的數(shù)據(jù)，計算不同免疫細胞亞群中活化標志物陽性細胞的比例，從而評估免疫細胞的活化程度。采用5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）標記法檢測免疫細胞的增殖情況。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中。將小鼠脾細胞與不同處理因素共培養(yǎng)，在培養(yǎng)的最后2h加入EdU，使其進入正在增殖的細胞中。培養(yǎng)結束后，收集細胞，按照EdU檢測試劑盒的操作步驟進行處理。首先，用PBS洗滌細胞2次，每次1000×g離心5min。棄去上清液，加入適量的細胞固定液，室溫固定15min。棄去固定液，用PBS洗滌細胞2次，每次1000×g離心5min。加入適量的細胞通透液，室溫孵育10min，使細胞具有通透性，便于后續(xù)試劑進入細胞。棄去通透液，用PBS洗滌細胞2次，每次1000×g離心5min。加入適量的Click-iT反應液，室溫避光孵育30min，使EdU與熒光染料發(fā)生反應，從而標記出增殖的細胞。棄去反應液，用PBS洗滌細胞3次，每次1000×g離心5min。加入適量的DAPI染液，室溫避光孵育5min，對細胞核進行染色。棄去染液，用PBS洗滌細胞1次，1000×g離心5min。棄去上清液，加入適量的PBS重懸細胞，上機進行流式細胞術檢測。在流式細胞儀檢測中，設置合適的通道檢測EdU和DAPI的熒光信號。通過分析流式細胞術檢測得到的數(shù)據(jù)，計算EdU陽性細胞的比例，即增殖細胞的比例，從而評估免疫細胞的增殖情況。五、結果與討論5.1實驗結果呈現(xiàn)在腎癌疫苗制備過程中，通過超速離心法成功從人腎癌細胞786-0培養(yǎng)上清液中提取到外泌體。納米顆粒跟蹤分析（NTA）結果顯示，提取的外泌體粒徑主要分布在30-150nm之間（圖1），平均粒徑為（85.6±12.3）nm，濃度為（5.2×10^10）個/mL，符合外泌體的典型特征。蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測結果表明，外泌體特異性標志物CD63、CD81、TSG101均呈陽性表達（圖2），進一步證實了提取的樣品為外泌體。采用化學交聯(lián)法將IL-12錨定修飾到外泌體上。酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測結果顯示，IL-12在外泌體表面的結合率為（75.3±6.8）%，表明成功實現(xiàn)了IL-12與外泌體的有效錨定。蛋白質免疫印跡法（Westernblot）分析也驗證了IL-12與外泌體的結合情況，在相應分子量位置出現(xiàn)了IL-12的特異性條帶（圖3）。對修飾后外泌體的穩(wěn)定性進行考察，結果顯示在4℃條件下儲存1個月，其粒徑分布、表面標志物表達以及IL-12結合率均無明顯變化（圖4），表明修飾后外泌體具有良好的穩(wěn)定性。在體外抗腫瘤效應研究中，CCK-8法檢測細胞增殖結果表明，與對照組相比，exosomes組、IL-12組和IL-12錨定修飾exosomes組細胞的增殖均受到不同程度的抑制，且抑制作用隨時間延長而增強（圖5）。在培養(yǎng)72h后，IL-12錨定修飾exosomes組細胞的相對增殖率僅為（35.6±4.2）%，顯著低于exosomes組的（65.8±5.6）%和IL-12組的（52.4±4.8）%（P<0.05），表明IL-12錨定修飾exosomes對人腎癌細胞786-0的增殖具有最強的抑制作用。AnnexinV-FITC/PI染色法結合流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示，IL-12錨定修飾exosomes組細胞的凋亡率為（32.5±3.1）%，明顯高于對照組的（5.6±1.2）%、exosomes組的（10.8±2.1）%和IL-12組的（18.6±2.5）%（P<0.05）（圖6）。蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測凋亡相關蛋白表達結果表明，IL-12錨定修飾exosomes組中促凋亡蛋白Bax、Bak的表達顯著上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL的表達明顯下調(diào)（圖7），進一步證實了IL-12錨定修飾exosomes能夠誘導人腎癌細胞786-0凋亡。PI染色法結合流式細胞術分析細胞周期結果顯示，與對照組相比，IL-12錨定修飾exosomes組G0/G1期細胞比例明顯增加，從（45.6±3.2）%增加到（62.3±4.1）%，S期和G2/M期細胞比例顯著減少（圖8）。蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測細胞周期相關蛋白表達結果表明，IL-12錨定修飾exosomes組中細胞周期蛋白CyclinD、CyclinE、CyclinA、CyclinB的表達下調(diào)，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21、p27的表達上調(diào)（圖9），表明IL-12錨定修飾exosomes能夠將人腎癌細胞786-0阻滯在G0/G1期，抑制細胞周期進程。免疫反應檢測結果顯示，IL-12錨定修飾exosomes組刺激小鼠脾細胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平顯著高于對照組、exosomes組和IL-12組（P<0.05）（圖10）。流式細胞術檢測免疫細胞表面活化標志物表達結果表明，IL-12錨定修飾exosomes組中T細胞表面活化標志物CD69、CD25的陽性表達率以及NK細胞表面活化標志物CD69、NKp46的陽性表達率均明顯高于其他組（P<0.05）（圖11）。5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）標記法檢測免疫細胞增殖結果顯示，IL-12錨定修飾exosomes組中EdU陽性細胞比例為（35.6±3.8）%，顯著高于對照組的（10.5±2.1）%、exosomes組的（15.8±2.5）%和IL-12組的（22.4±3.2）%（P<0.05）（圖12），表明IL-12錨定修飾exosomes能夠有效激活免疫細胞，促進其增殖和分泌細胞因子。5.2結果分析與討論在腎癌疫苗制備方面，本研究通過超速離心法成功從人腎癌細胞786-0培養(yǎng)上清液中提取到外泌體，NTA和Westernblot等鑒定結果表明，提取的外泌體粒徑分布和標志物表達均符合其典型特征，為后續(xù)實驗提供了可靠的載體。采用化學交聯(lián)法將IL-12錨定修飾到外泌體上，ELISA檢測顯示IL-12結合率較高，達到（75.3±6.8）%，且修飾后外泌體在4℃條件下儲存1個月仍具有良好的穩(wěn)定性。這表明本研究建立的IL-12錨定修飾外泌體的方法是可行且有效的，能夠制備出高質量的腎癌疫苗。然而，在制備過程中也存在一些問題，如化學交聯(lián)法可能會對外泌體的結構和功能產(chǎn)生一定影響，雖然本研究通過質量控制檢測未發(fā)現(xiàn)明顯異常，但仍需進一步優(yōu)化交聯(lián)條件，以減少對exosomes的潛在損傷。體外抗腫瘤效應實驗結果顯示，IL-12錨定修飾exosomes對人腎癌細胞786-0的增殖具有顯著抑制作用，在培養(yǎng)72h后，細胞相對增殖率僅為（35.6±4.2）%，明顯低于其他組。同時，該修飾物能夠誘導細胞凋亡，凋亡率達到（32.5±3.1）%，并將細胞周期阻滯在G0/G1期，G0/G1期細胞比例從（45.6±3.2）%增加到（62.3±4.1）%。這些結果表明IL-12錨定修飾exosomes能夠有效地抑制腎癌細胞的生長和增殖，其機制可能與誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期有關。從細胞凋亡相關蛋白表達結果來看