第2章細胞工程

一、利用植物細胞工程培育新植株

細胞工程

1.定義：以細胞生物學和分子生物學為基礎，結合現(xiàn)代工程技術手段，在細胞或

亞細胞水平、組織水平上進行設計與操作，是構建優(yōu)良細胞、組織、器官以及生物體

的綜合性生物工程。

2.分類：

植物細胞工程：植物組織培養(yǎng)技術、植物細胞培養(yǎng)、植物體細胞雜交技術

動物細胞工程：動物細胞培養(yǎng)技術、動物細胞融合技術、核移植技術、干細胞技

術

1.植物組織培養(yǎng)技術可將離體器官、組織或細胞再生為完整植株

1、細胞的全能性

①定義：離體的植物細胞在合適的條件下能夠發(fā)育成為完整的植株。

②物質基礎：細胞中具有本生物的全套遺傳信息。

③表達條件：含有全套遺傳信息的活細胞；處于離體狀態(tài)；提供適宜的營養(yǎng)和環(huán)

境條件。

④全能性大小：分億程度越高，全能性越低

2、植物組織培養(yǎng)

①定義：將離體的植物細胞、組織或器官（外植體）在適宜的培養(yǎng)條件下經(jīng)脫分

化形成愈傷組織，然后經(jīng)過再分化，形成芽、根并最終發(fā)育成完整植株,這一過程稱

為植物組織培養(yǎng)。

②原理：植物細胞的全能性

③條件：離體、適宜的營養(yǎng)物質、植物激素、無菌、溫度、濕度、光照、氧氣。

④相關概念

脫分化在一定條件下，分化后的細胞重新獲得類似于胚胎細胞一樣的分裂和分

化能力的過程。

愈傷組織脫分化后的細胞經(jīng)過細胞分裂，會形成無組織結構的、松散的細胞團。

再分化愈傷組織在一定條件下可以重新分化為各種類型的細胞，并進一步發(fā)育

成完整的植株。

影響脫分化和再分億倆步驟的原因：多種內部因素和外部因素

⑤過程：

a.取材與消毒：取離體的植物器官、組織或細胞進行消毒

b.接種：將外植體插入MS培養(yǎng)基中（不要倒插）。

c.培養(yǎng)：外植體（記得消毒）

I脫分億

愈傷組織

I再分億（需光，利于葉綠素合成）

芽、根

I

植物體

d.移栽：先煉苗，再移栽。

影響脫分化和再分億倆步驟的原因：多種內部因素（如植物遺傳性狀和生理狀況

等）和外部因素（如營養(yǎng)和環(huán)境條件等）

生長素和細胞分裂素的濃度比對愈傷組織的生長和分化產(chǎn)生不同的影響。

⑥植物激素的濃度控制：（使用順序）

細出芽出傷組織生長

胞

分

裂

泰

濃

度余傷組織不生長出根

根與外共同生長

低

低生長索濃度A

生長素的濃度〉細胞分裂素，有利于誘導植物報的生成；

生長素的濃度V細胞分裂素，有利于誘導植物差的生成：

生長素的濃度心細胞分裂素且都較高時，（外植體脫分化形成愈傷組織）有利

于愈傷組織的形成。

1.1月季的快速繁殖

1.選材與消毒

選取枝條中具腋芽的月季嫩莖作為外植體。將外植體用自來水沖洗干凈,分裝到

燒杯中，然后放在超凈工作臺上。加入75%酒精,預消毒0.5~lmin；棄酒精，加入9%^10%

的次氯酸鈣，消毒lOmin；棄次氯酸鈣溶液，加入無菌水清洗4~5次,用無菌濾紙吸

盡多余水分備用。（防雜菌污染）

2.接種

將外植體剪成T2cm帶腋芽的莖段,用鏡子夾取、插入US培養(yǎng)基中（插入時應注

意方向，不要倒插）。每瓶接種6?8塊外植體。接種后，用封口膜重新將培養(yǎng)瓶封口。

3.培養(yǎng)

（1）誘導芽分化:將外植體長出腋芽后，將其轉至芽分化培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2.0

mg/L6BA+0.02mg/LNAA）,誘導芽分化，置于培養(yǎng)間培養(yǎng)（光周期12h光照：12h

黑暗，20°C,濕度85%以上）。每周更換培養(yǎng)基，約5飛周后，形成許多從生芽。

（2）誘導生根:將上述從生芽接種于生根培養(yǎng)基11/2MS培養(yǎng)基+0.05mg/LNAA）

上，置于培養(yǎng)間培養(yǎng)（培養(yǎng)條件同上）。每周更換培養(yǎng)基，約3周后長出數(shù)條根，形

成幼苗。

4.移栽

幼苗出瓶前煉苗（即采取放風、降溫、適當控水等措施對幼苗進行鍛煉，先打開

蓋練一練）2~3天。出瓶后洗去黏附的培養(yǎng)基，栽植至營養(yǎng)土中，置于溫度20℃、濕

度85%以上、適當遮陰且通風的環(huán)境中種植，定期用0.1因的多菌靈噴霧保苗。

3.植物組織培養(yǎng)的應用:

①植物快速繁殖：將優(yōu)良植株的莖尖或葉片等器官進行離體培養(yǎng)，在短時間內可

以獲得大量遺傳性狀一致的植株，這種技術稱為植物快速繁殖技術。

優(yōu)點：a.因為是無性繁殖技術，可以保持優(yōu)良品種的遺傳特性。

b.使用材料少（幾個細胞就可以了），培養(yǎng)周期短，繁殖率高，便于自動化管埋。

（D）紫杉加250mg/nf）對聊事物的抑制作用（C）次生代第產(chǎn)物紫杉郵

2.植物體細胞雜交技術可創(chuàng)造新植株

植物體細胞雜交（植物原生質體融合，實質：細胞核的融合）：指將不同來源的

植物細胞在一定條件下融合形成雜合細胞，并使之分化再生，最終形成新植物體的技

術。

（1）原理：細胞膜一定的流動性、植物細胞的全能性

（2）意義：克服生殖隔離，產(chǎn)生新物種。

（3）過程：

①原生質體的制備：去除細胞壁以制備原生質體（即去除了細胞壁的細胞）（動物

細胞沒有細胞壁，本身就是原生質體）。

方法：機械分裂或酶解分離（纖維素酶和果膠酶）

②原生質體誘導融合的方法：

物理法：電融合法

化學法：聚乙二醇（PEG）

③篩選和鑒定：由丁誘導操作對于細胞融合沒有選擇性且融合效率并不高，因此，

除了形成不同類型的融合細胞外，還會存在大量未融合的細胞，這就需要使用一系列

的方法將發(fā)生了融合的雜合細胞篩選出來，并對其進行細胞學和生化分析鑒定。

④植物體細胞雜交成功的標志：雜種細胞再生細胞壁

補充：植物組織培養(yǎng)和植物細胞培養(yǎng)的比較

比較

植物組織培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)

項目

目的獲得植物體獲得細胞產(chǎn)物

原理植物細胞的全能性細胞增殖

外植體綱用且愈傷蛆織

過程再分化

坳苗———芽、根

細胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)，如紫草寧、

應用快速繁殖、作物脫毒、單倍體育種等

人參皂甘、紫杉醇等

二、利用動物細胞工程改良動物細胞

1.動物細胞培養(yǎng)技術是動物細胞工程的基礎

植物是組織培養(yǎng)，而動物是細胞培養(yǎng)

動物細胞培養(yǎng)：從動物體內取出組織或細胞（讓它分散成單個細胞）,在體外模

擬體內的生理條件，使之得以生存和生長并維持其結構與功能的技術。

（1）原理：細胞的增殖和生長

（2）過程；

動物組織（動物胚胎或幼齡動物的器官或組織）

力機械法、消化法

單個細胞

原代培養(yǎng)：首次細胞培養(yǎng)

十分離稀釋

傳代培養(yǎng)

4.細胞培養(yǎng)的結果：是細胞，而不是個體

在培養(yǎng)過程中，動物細胞非常容易受到各種微生物的污染，因此，必須要在嚴格

無菌的環(huán)境下進行細胞培養(yǎng)，并在培養(yǎng)液中加入?定量的抗生素）以防污染。同時，

動物細胞培養(yǎng)對適宜的外界環(huán)境設定和維持也有嚴苛的要求。

5.動物細胞培養(yǎng)的條件：必需的營養(yǎng)物質、無菌（加一定量的抗生素）、適宜的

溫度（如哺乳動物細胞和禽類細胞的適宜溫度為36.5±0.5℃）、pH（7.2?7.4）

是、控制培養(yǎng)液滲透壓、95%空氣和5%C02（保持培養(yǎng)液pH的穩(wěn)定）混合氣體（既維持合

適的溶解氧（溶解氧的水平會直接影響細胞的生長和代謝），又維持培養(yǎng)液中pH值的

穩(wěn)定）、定期更換培養(yǎng)液（及時清除代謝產(chǎn)物）。

6.植物組織培養(yǎng)與動物細胞培養(yǎng)的比較

植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)

原理細胞全能性細胞增殖和生長

培養(yǎng)基物理狀態(tài)周沐培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基

培養(yǎng)結果植物體細胞

培養(yǎng)目的快速繁殖、培育無病毒擅拉等獲得細胞或細胞產(chǎn)物

外植體動物的組織

1脫分化1機械法或酶

愈傷組織單個細胞

過程1再分化1

芽、根或胚狀體原代培養(yǎng)

1生長發(fā)育1

植物體傳代培養(yǎng)

①兩技術于段培養(yǎng)過程中都進行有絲分裂，都不涉及減數(shù)分裂；

相同點

②均需要無菌操作、無菌培養(yǎng)，需要適宜的溫度、pH等條件

2.動物細胞融合是單克隆抗體制備的關鍵技術

受精過程是牛.殖細胞之間的自然融合。

細胞融合（體細胞雜交）：在離體條件下，用人工方法將不同生物或同種生物不

同類型的單細胞融合成一個雜合細胞。細胞融合技術可以使人們按照預先的設計使不

同的細胞融合，創(chuàng)造出新的雜合細胞。

融合方法：使兩個甚至多個動物細胞融合形成一個細胞。

①物理法：電融合（高壓脈沖電場的作用下，細胞膜表面會形成大量微膜孔,進

而發(fā)生細胞融合現(xiàn)象）；

②化學法：PEG或其衍牛.物（具有比仙臺病毒高數(shù)百倍的促細胞融合效率）；

⑤生物法：火活的病毒，如仙臺病毒可以誘發(fā)細胞融合形成多核細胞。

\:6兩個完整的凝

雜交細胞

滅活的病蠡’6逢富

.細胞分裂］

⑤^-儂

（2）原理：質膜的半流動性

（3）結果：雜合細胞

（4）用途：制備單克隆抗體

制備單克降抗體的原因:抗體是機體免疫應答的一個重要組成部分，可以特異性

識別抗原。但.絕大部分的抗原擁有多個不同的抗原決定簇（即抗原分子中決定抗原特

異性并刺激B淋巴細胞分化為漿細胞的特定區(qū)域），會同時刺激多個不同的B淋巴細

胞形成克隆群。所以，針對同一個抗原（多為蛋白質，是一個龐大的分子），機體往

往會產(chǎn)生多種抗體。這樣形成的抗體通常存在特異性不強、質最不穩(wěn)定等問題,且經(jīng)

抗原激活后的B淋巴細胞也無法在體外長時間培養(yǎng)。

①單克隆抗體：無限增殖的雜交瘤細胞，能持續(xù)分泌高度均一、僅針對某一特定

抗原決定簇的抗體。

②特點：，度特異性（靈敏度高,可以大量制備）

③單克隆抗體制備過程：

“4步曲”：對動物進行免疫

一漿細胞（在促融劑的作用下）和骨髓瘤細胞融合

一篩走選出抗體分泌陽性的雜交瘤細胞

一克隆培養(yǎng)生產(chǎn)單克隆抗體

綿羊紅細胞作為抗原刺激小鼠脾臟的B淋巴細胞，獲得了能產(chǎn)生抗體的漿細胞,

后者在促融劑的作用下與小鼠骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成了雜交瘤細胞。通過選擇培

養(yǎng)基篩選出抗體分泌陽性的雜交瘤細胞，并對?其進行克隆培養(yǎng)。這樣獲得的雜交瘤細

胞既能無限增殖，又能持續(xù)分泌高度均一、僅針對某一特定抗原決定簇的抗體，即單

克隆抗體。

補充:

項目第一次篩選第二次篩選

由于小鼠在生活中還受到其他抗原的

誘導融合后會得到多種雜交細胞，另

篩選原因刺激，所以經(jīng)選擇培養(yǎng)獲得的雜交瘤細

外還有未融合的細胞

胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細胞

用特定的選擇培養(yǎng)基篩選;未融合的

用多孔培養(yǎng)皿培養(yǎng)，在每個孔只有一個

細胞和融合的具有同種核的細胞（"B

雜交瘤細胞的情況下開始克隆化培養(yǎng)

篩選方法-B”細胞、“瘤一瘤”細胞）都會死

和抗體檢測，經(jīng)多次篩選得到能產(chǎn)生特

亡，只有融合的雜交瘤細胞（“B—瘤”

異性抗體的細胞群

細胞）才能生長

篩選目的得到雜交瘤細胞得到能分泌所需抗體的雜交瘤細胞

④應用：鑒定抗原以及疾病的診斷、治療以及生理過程的檢測具有重要價值。

①利用單克隆抗體的靶向作用，可將針對某一腫瘤抗原的單克隆抗體與化療藥物

或放療物質連接，將其攜帶至靶器官，直接殺傷靶細胞，降低對健康組織與細胞的傷

害（即靶向性治療）O

②早孕檢測試紙可通過尿液快速檢測出受孕婦女胎盤中產(chǎn)生的人絨毛膜促性腺激

素O

補充：植物體細胞雜交和動物細胞融合

項目植物體細胞雜交動物細胞融合

原理細胞膜的流動性、細胞的全能性細胞膜的流動性、細胞增殖

融合

除去細胞壁使細胞分散開

前處理

相關酶纖維素酶和果膠能膚蛋白酶或膠原蛋白能

牧理法；電融合法；

物理法：電融合法、離心法；

誘導化學法：聚乙二醇（PEG）融合法；

化學法：聚乙二醇（PEG）融合法、高

方法生物法：滅活病毒誘導法（動物病毒

Ca?+—高pH融合法

不能侵染植物的）

結果雜種植株雜交細胞

應用培育植物新品種主要用于制備單克隆抗體

意義突破遠緣雜交不親和的障礙，打破了生殖隔離，擴展了雜交的親本組合

動物細胞融合與植物原生質體融合的基本原理相同，誘導動物細胞融合的方

相同點

法與植物原生質體融合的方法相似

3.細胞核移植技術是克隆動物的關鍵技術體外培養(yǎng)

卵母細胞供體

A戕體細版

細胞核移植:將一種動物細胞的細胞核

移植至去核的卵母細胞中，并使重組細胞發(fā)

體細胞，卵母細胞

育成新胚胎，繼而發(fā)育成動物個體的過程。?一一.

去核卵母細胞

（1）方法：顯微注射（將供體細胞的克隆胚胎i激活

\胚胎移植

核移入去核的卵母細胞中，經(jīng)過人工活化和

克隆后代

受體動物

體外培養(yǎng)后，再移植入代孕母體內，使其發(fā)“中中”和“華華'

育成為含有與供體細胞相同遺傳物質的個

體）

（2）生殖方式：無性生殖

（3）克隆：指分子、細胞或個體的無性繁殖系，如從一

個分子復制成一組分子稱為分子克隆;從一個細胞分裂生成一

群細胞稱為細胞克隆:動植物個體的無性繁殖就是仝隹克隆。

（4）原理：動物體細胞核具有全能性（哺乳動物高度分化的體細胞核能夠在卵母

細胞細胞質的作用下恢復其全能性）

克隆技術的應用:

農(nóng)牧業(yè)可將具有特殊期望性狀的動物通過克隆產(chǎn)生更多的畜群

基因完全相同的動物（同卵雙生概率較低，可以通過克隆技術實現(xiàn)）

科學研究

可為有關實驗提供最佳的“對照動物”

前景

制藥行業(yè)人們正在嘗試用克隆動物生產(chǎn)具有潛在醫(yī)療用途的產(chǎn)品

野生物種保

可利用克隆技術繁殖瀕危物種，為生態(tài)保護帶來了無限希望

護

①成功率非常低；

問題

②絕大多數(shù)克隆動物存在健康問題，表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷。

補充：1.受體細胞為什么選用卵母細胞？體積大，易操作：去核時易于同時吸走

第一極體：含有激發(fā)細胞核全能性的物質。

2.為什么不是取供體細胞核進行核移植操作，而是將供體細胞整個注入去核卵母

細胞中？保證供核不被破壞，使克隆動物更像供體動物，操作也方便。

3.在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細胞

的核？為使核移植的胚胎或動物的核遺傳物質全部來白有重:要利用價值的動物提供的

體細胞，在供體細胞的紐胞核移至受體細胞之前，必須將受體細胞的核遺傳物質去掉

或將其破壞。

4.從多莉的產(chǎn)生過程可以看出多莉有三個親本，探究多莉的性狀表現(xiàn)與三個親本

的關系并分析原因。①大多數(shù)性狀與母羊A（體細胞核供體）相同，因基因型與母羊A完

全-一樣。②少數(shù)性狀與母羊B（卵母細胞細胞質供體）相同，因細胞質中的基因來自母羊

B,受質基因控制的性狀與母羊B相同。③性狀與母羊C（代孕母體）無關，因母羊C沒

有為新個體提供遺傳物質。

1.小克隆T像誰？克隆動物的細胞質中遺傳物質來自于卵母細胞并非供體細胞；

生物性狀的表達還受環(huán)境因素的影響。

2.核移梢技術與試管嬰兒一樣么？無性生殖，有性生殖

3.該過程用到的技術手段?動物細胞培養(yǎng)、核移植、早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植等

4.細胞核移植技術是克隆動物的關鍵技術

干細胞：具有自我更新和增殖、分化能力的細胞

干細胞的分類：根據(jù)干細胞所處的發(fā)育階段，可以把干細胞分成胚胎干細胞和成

體干細胞。

1.胚胎干細胞：高等動物受精卵發(fā)育成囊胚時的內細胞團，能在體外進行培養(yǎng)和

傳代，并在一定條件下保持分化的全能性，幾乎可以分化出所有的細胞類型。

.①胚胎干細胞的功能特點：能在體外進行培養(yǎng)和傳代，并在一定條件下保持分化

的全能性；能夠分化出所有的細胞類型。

②胚胎干細胞主要來源:囊胚的內細胞團或是胎兒的原始生殖細胞。

內細胞團原始生殖細胞

胚胎卜細胞胚胎F細胞

前沿視窗：胚胎前細胞具有分化全能性,但其來源有限且涉及復雜的倫理問題；

而各種成體干細胞（除造血干細胞外）的采集往往在技術上非常困難，且不具備分化

成所有細胞類型的能力。

2.成體干細胞：分布在成體組織中尚未分化的、具有自我更新潛能的干細胞，在

組織或系統(tǒng)的修復和再生中起著關鍵作用。按照分化潛能的大小，可以將成體干細胞

分成兩種類型。

①多能干細胞：具有分化出多種細胞組織的能力，但不具備發(fā)育成完整個體的能

力，如骨髓多能造血干細胞，可以分化出多種不同的血細胞。

②單能干細胞：只能分化成一種類型或密切相關的兩種類型的細胞，如上皮組織

基底層的干細胞分化成肌肉中的成肌細胞等。

3.誘導性多能干細胞（iPS細胞）：鑒于體細胞和干細胞擁有相同的遺傳信息，

目前可以通過多種以通過多種技術手段將體細胞誘導形成的具有與胚胎干細胞類似分

裂和分化能力的干細胞。

抗性培養(yǎng)基僅允許

1病母感染細胞生長

外胚層細胞i普系中胚層細胞潛系內胚層細胞譜系

補充：治療性克隆

生殖性克?。涸诓溉閯游锏目寺∵^程中，克隆后代的進一步發(fā)育還需要將早期胚

胎移植入一個代孕母體的子宮內，我們將這種類型的克隆稱為生殖性克隆。

治療性克?。耗康牟皇钱a(chǎn)生一個活體生物，而是產(chǎn)生胚胎干細胞，并將其在合適

的條件下（如某些生長刺激型蛋臼質存在）分化成各種特化細胞乃至形成組織或器官。

如果人們能找到正確的條件，便能培養(yǎng)胚胎干細胞用于修復受損或病變器官，如

用來置換因脊髓損傷或心肌梗死所損壞的細胞。

應用：1）治療血液系統(tǒng)疾?。?）我國已經(jīng)掌握了臍血干細胞分離、純化、冷凍

保存和復蘇的全套技術，并在上海建立了我國第一個臍血庫；3）將胰島干細胞經(jīng)體外

誘導分化成產(chǎn)胰島素的胰島B細胞并移植給糖尿病小鼠，接受移植的小鼠血糖濃度控

制良好，這為干細胞治療糖尿病奠定了基礎；4）在一定的藥物誘導下，皮膚干細胞能

使燒傷處的皮膚原位再生。

三、利用胚胎工程快速繁育優(yōu)良動物品種

1.動物胚胎的形成經(jīng)歷受精及早期發(fā)育

胚胎工程：對動物早期胚胎或配子進行顯微操作和處理以獲得目標個體的技術。

（1）操作對象：生殖細胞、受精卵以及早期胚胎細胞。

（2）胚胎的早期發(fā)育過程：雖然高等動物的種類繁多，但是胚胎的早期發(fā)育有著

相似的過程，分成受精、卵裂、桑棋環(huán)、囊胚、原腸肝與器官形成等階段。

發(fā)育階段發(fā)育特點

受精由于卵黃的分布不對稱，精子與卵結合之后形成的受精卵可以

分為動物極（發(fā)育為外胚層）和植物極（發(fā)育為中胚層和內胚層）。

802"、'（8細胞的時候不是上下均等分裂的，上面的得到的細胞質比較少，

下面得到的細胞質比較多，上面就是動物極，下面大的就是植物極）

Aa

小??

卵裂期在卵裂階段，受精卵先分裂成兩個細胞（不均質分裂，兩個細

胞的胚胎，2細胞胚），之后細胞通常會逐次倍增，但胚胎的總體

積大致不變。

桑根胚受精卵分裂成16~32個細胞的階段，稱為桑根胚。（全能細胞，

致密的細胞團）

囊胚在這個階段，動物極細胞的分裂頻率會超越靠近植物極且含有

較多卵黃的細胞群，形成中空的球狀胚，稱為囊胚。（內細胞團發(fā)

育成胎兒的各種組織，滋養(yǎng)層細胞（貼著透明帶的一圈細胞）將來

原腸胚隨后形成的原腸胚具有外胚層、中胚層與內胚層,這三種胚層

在之后會分化出各種組織和器官，逐漸發(fā)育成胚胎。

2.胚胎工程快速繁育優(yōu)良動物品種

1.胚胎工程技術：體外受精、胚胎移植、胚胎分割移植等

體外受精：哺乳動物的精子和卵在人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術。

受精：精子與卵子結合形成合子（受精卵）的過程

場所：自然條件下，哺乳動物受精在受精卵內完成的。

體外受精包括：卵的采集及成熟培養(yǎng)（（只能采集減二中的卯母細胞）在輸卵管

內進一步成熟，到MII（減二）期，才具備與精子受精的能力（后續(xù)經(jīng)過精子的刺激才

能進行后續(xù)的減數(shù)分裂，才能形成成熟的卵細胞，意味著沒有