腭裂動(dòng)物模型與多組學(xué)分析技術(shù)進(jìn)展2025非綜合征型腭裂是常見的先天性顱面部畸形之一，全球發(fā)病率約為千分之一。腭裂不僅影響患者的外貌，還可能引起一系列功能障礙，如喂養(yǎng)困難、言語障礙、聽力損失及心理和社會適應(yīng)問題。因此，腭裂的研究具有重要的臨床和社會意義。盡管近年來在遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和臨床治療方面取得了一定進(jìn)展，但其具體病因、發(fā)病機(jī)制及有效治療策略依然不完全明了。傳統(tǒng)的腭裂動(dòng)物模型，如小鼠、新西蘭兔、斑馬魚等已廣泛應(yīng)用于探索其分子機(jī)制和發(fā)育過程。在這些基礎(chǔ)上構(gòu)建腭裂模型的方法近些年取得了一定突破，出現(xiàn)了新的基因編輯技術(shù)的應(yīng)用。而隨著這些研究技術(shù)的進(jìn)步以及越來越多的新型技術(shù)被引入到腭裂的研究中，推動(dòng)了口腔醫(yī)師對這一復(fù)雜疾病機(jī)制的深入理解。現(xiàn)代化研究技術(shù)，特別是多組學(xué)技術(shù)、單細(xì)胞測序、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)等已成為顱面發(fā)育和疾病研究的強(qiáng)大工具，分別從RNA、蛋白、表觀遺傳等的不同分辨率和不同空間層次深入探索腭發(fā)育的分子機(jī)制。通過與動(dòng)物模型的結(jié)合，不僅可在細(xì)胞和分子層面上提供更精細(xì)的分析，還可揭示不同發(fā)育階段和不同組織間的復(fù)雜相互作用，為腭裂的早期診斷、治療和個(gè)性化干預(yù)提供了新視角。本綜述探討腭裂的動(dòng)物模型及其在現(xiàn)代化研究技術(shù)中的應(yīng)用進(jìn)展，重點(diǎn)討論如何通過多組學(xué)分析、單細(xì)胞技術(shù)和空間組學(xué)等前沿手段，為揭示腭裂發(fā)生機(jī)制提供新思路，并展望這些技術(shù)在未來研究中的潛力。一、人類腭發(fā)育的胚胎學(xué)基礎(chǔ)與腭裂發(fā)生機(jī)制transition,EMT)并遷移至發(fā)育中的顱面區(qū)域。神經(jīng)嵴細(xì)胞來源的外胚間充質(zhì)細(xì)胞與外胚層和中胚層細(xì)胞共同參與[1]。胚胎發(fā)育的第6周，上頜突的外側(cè)邊緣開始出現(xiàn)腭原基，這是腭發(fā)育的第一個(gè)跡象[2]。隨后，腭突在原發(fā)腭后方并沿發(fā)育中的舌的兩側(cè)垂直生長。在妊娠第8周，腭突在舌上方重新定向，首先在腭的前部區(qū)域發(fā)生提升，然后向后部延伸[3]。隨后，腭突朝中線生長并相互接觸，其頂端的內(nèi)側(cè)邊緣上皮(medialedgeepithelium,MEE)彼此黏附并融合，形成中線上皮縫(midlineepithelialseam,MES)[和融合首先在腭的前1/3區(qū)域開始，并在第9周向前后方向擴(kuò)展[3]。隨著腭的前部區(qū)域與原發(fā)腭融合完成，MES的退化進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了腭內(nèi)間充腔側(cè)的上皮細(xì)胞分化為分層的鱗狀非角化上皮成骨骼和肌肉。其中，腭的前2/3區(qū)域發(fā)生骨化，形成硬腭；后1/3區(qū)域發(fā)育成軟腭，但不發(fā)生骨化，這一過程的[6-7]。2.人類腭裂的發(fā)生機(jī)制：腭裂的發(fā)生機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜且多層次的過程，涉及遺傳因素和環(huán)境因素，二者共同括上皮細(xì)胞的程序性死亡(凋亡)、EMT、細(xì)胞遷移障礙、初級纖毛功能在腭突中線融合過程中，上皮細(xì)胞的正常凋亡和EMT是清除MES并實(shí)無法正常融合，從而引發(fā)腭裂[9,13]。神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移不足或腭突間充質(zhì)的發(fā)育障礙導(dǎo)致腭部組織的結(jié)構(gòu)異常，還而細(xì)胞外基質(zhì)的合成、降解或重塑障礙則可組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[17]。此外，基因與環(huán)境的相互作用(如遺傳易感性、毒素暴露及營養(yǎng)缺乏)也通過調(diào)控這些細(xì)胞行為過程，進(jìn)一步增加腭裂的發(fā)(1)小鼠：小鼠腭的發(fā)育過程與人類相似，但人類腭部發(fā)育持續(xù)數(shù)周，小鼠腭部發(fā)育在數(shù)天內(nèi)即可完成[19]。小鼠繼發(fā)腭的發(fā)育始于胚胎期第11.5天(E11.5)此時(shí)成對的腭突開始形成，并在E12.5~E13.5期間腭并在E14.5開始按前后(A-P)順序融合，最終在E16.5完成硬腭的融合[20-22]。而軟腭區(qū)域的發(fā)育則在胚胎期部肌在E16.5前融合),其他軟腭肌肉的發(fā)育會持續(xù)到出生后階段[23]。盡垂直生長、抬升及中線融合等關(guān)鍵步驟上表中約99%的基因與人類同源，許多小鼠品系攜帶自發(fā)性或基因工程誘導(dǎo)的突變，表現(xiàn)出腭裂表型，因此小鼠是揭示腭裂發(fā)病機(jī)制的卓越模式生物[24-27]。截至目前，已有超過600種表現(xiàn)腭裂表型的突變小鼠模型被報(bào)道。這些研究不僅為人類遺傳學(xué)研究提供了優(yōu)秀腭裂發(fā)育相關(guān)分子和細(xì)胞機(jī)制、關(guān)鍵信號通路以網(wǎng)絡(luò)的理解[28-34]。(2)新西蘭兔：Sivaraman等[35]將新西蘭兔腭發(fā)育為5個(gè)階段，即腭突形成(階段I)、腭突接近(階段Ⅱ)、硬腭部分閉合(階段Ⅲ)、硬腭完全閉合(階段IV)及軟腭完全閉合(階段V)。腭閉合過程從妊娠第17d早晨開始，此時(shí)約75%的胎兔腭處于腭突形成狀態(tài)(階段I);妊娠第19d早晨，所有胎兔的硬腭閉合階段(階段IV或V)已完成，約75%的胎兔軟腭閉合(階段V)已完成；最終在妊娠第腭裂研究過程中具有一定優(yōu)勢。首先，其較大的其次，新西蘭兔性情溫順，飼養(yǎng)成本低，繁殖周期較短(平均妊娠期為30d),每窩產(chǎn)仔數(shù)量多，人工飼養(yǎng)技術(shù)成熟，且離乳時(shí)間較短(30~40d)[37]。這些特點(diǎn)顯著提高了新西蘭兔模型的實(shí)驗(yàn)操作性和經(jīng)濟(jì)性。(3)d37,腭突的內(nèi)側(cè)邊緣在中線處接觸，兩側(cè)腭突的中線邊緣之間由MES護(hù)皮細(xì)胞在中線上皮縫的鼻腔和口腔兩端形這一時(shí)間節(jié)點(diǎn)的研究為腭裂模型的干預(yù)研究效地指導(dǎo)腭裂病理機(jī)制的探索和治療方法的研發(fā)。此外裂是一種有效的治療方法，可滿足受影響個(gè)體的即時(shí)需求，但術(shù)后并較常見，并可能因手術(shù)方式而有所不同[39]。由于人類患者需年滿18歲犬作為自然發(fā)生腭裂的動(dòng)物模型，在腭裂手術(shù)方案的研究和驗(yàn)證要價(jià)值。例如，純種獵兔犬的自發(fā)腭裂率為1.1%,而Brittany西班牙獵犬通過遺傳分離得到的先天性腭裂犬品系，其腭裂發(fā)生率高達(dá)26.9%的療效[42-43]。此外，犬在2年內(nèi)即可完成發(fā)育成熟，相較于人類的生長周期大幅縮短，從而顯著提高新型手術(shù)方法和聯(lián)合治療策略研究的效率[44-45]。(4)羊：山羊的腭突通常在妊娠第38d閉合[46]。羊胚胎體型較大，便于實(shí)施精細(xì)的宮內(nèi)操作及組織學(xué)觀察據(jù)[47]。同時(shí)，將該模型作為工具，為不同修復(fù)面生長的研究提供了科學(xué)支持[48]。(5)恒河猴：研究表明，恒河猴的腭發(fā)育過程與人類高度相似，腭突在妊娠40d時(shí)呈垂直排列，妊娠46d時(shí)升高并開始融合，妊娠65d時(shí)腭部完全閉合，并在妊娠74~85d階段保持完整形態(tài)[49]。作為靈長類動(dòng)物，相比于小型哺乳動(dòng)物(如鼠、兔類)和中型動(dòng)物(如犬、羊),恒河猴在上唇、腭部及鼻腭發(fā)育方面更接近人類，適用于腭裂病因、發(fā)生機(jī)制及手術(shù)修復(fù)策略驗(yàn)成本較高、妊娠周期較長，且倫理限制較大，大規(guī)模研究中的應(yīng)用。(6)雞：盡管雞胚胎的唇腭部形態(tài)和結(jié)構(gòu)與人類存在顯著差異，但其先天性生理性腭裂特性為研第8天，腭突的形態(tài)更加明顯，血管清晰可見，透過腭突可觀察到鼻腔的輪廓，同時(shí)上頜骨和顴骨出現(xiàn)軟骨結(jié)構(gòu)；第9天，兩側(cè)腭突進(jìn)一步靠攏，但中間仍保留一條與鼻腔相通的裂隙，此時(shí)腭突中10天，腭骨開始骨化，上頜骨和顴骨基本完成骨化過程；至第11~12天，腭骨的骨化完全形成，腭突逐漸變薄，裂隙更加在唇腭發(fā)育及腭裂發(fā)生中的作用[51]。因此，雞型，對哺乳動(dòng)物腭裂病因?qū)W研究起重要的補(bǔ)充作用。(7)斑馬魚：脊椎動(dòng)物面部發(fā)育由一個(gè)高度保守的遺傳網(wǎng)絡(luò)調(diào)例如，在哺乳動(dòng)物中，額鼻突與上頜突的融合顱神經(jīng)嵴發(fā)育而來，構(gòu)成口腔頂部及顱底，其形成過程來源于3個(gè)不同部和功能上與哺乳動(dòng)物的腭具有一定的相似性視化觀察，非常適合高分辨率成像[52,56]。此外，Stuart等[57]開發(fā)了其精細(xì)的形態(tài)特征。斑馬魚模型的其他優(yōu)勢interspacedshortpalindromicrepeat,CRISPR/Cas9)基因編輯技術(shù)，以及繁殖能力強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)成本低[58]。的關(guān)鍵貢獻(xiàn)在于其可實(shí)現(xiàn)胚胎發(fā)育過程的實(shí)時(shí)成像。約80%與人類疾病相的斑馬魚模型，涵蓋多種模擬人類疾病的表型，這些資源2.模型的構(gòu)建方法：(1)基因編輯法：基因編輯技術(shù)通過敲除、突變或過表達(dá)特定基因，模擬腭裂的遺傳背景，幫助研究關(guān)鍵基因在腭發(fā)于小鼠和斑馬魚模型中。目前，CRISPR/Cas9、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子鋅指核酸酶(zinc-fingernuclease,ZFN)等基因編輯工具廣泛應(yīng)用于已成為最常用的基因編輯技術(shù)[59]。小鼠作為研究型，尤其在20世紀(jì)80年代，小鼠胚胎干細(xì)胞和基因靶向技術(shù)的出現(xiàn)，使對小鼠基因組幾乎每個(gè)基因的直接靶向操生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展[60]。通過通路和分子機(jī)制。盡管單個(gè)或組合基因突變可早期死亡，但Cre/loxP系統(tǒng)等定點(diǎn)DNA重組技術(shù)使得研究者可在特定時(shí)間或發(fā)育階段系統(tǒng)性地分析特定細(xì)胞類型中基因的功能，為腭裂之一，其基因編輯技術(shù)經(jīng)歷了從轉(zhuǎn)基因(Tol2轉(zhuǎn)座子)到定點(diǎn)基因編輯 使精準(zhǔn)基因編輯成為可能，可在不引起DNA雙鏈斷裂的情況下實(shí)現(xiàn)特定并為人類疾病的研究和治療提供更精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)平臺。(2)化學(xué)藥物誘導(dǎo)法：化學(xué)藥物致畸(腭裂)動(dòng)物模型主要通過在母體懷孕期暴露于某些化素(地塞米松)、維甲酸、二噁英和毒藜堿等[79-82]。糖皮質(zhì)激素在胚胎其中地塞米松的致畸作用尤其顯著。大量研鼠受孕第8.5~15天，通過腹腔或皮下注射給予6~8mg/kg地塞米松[79,87]。Liu等[86]通過在孕13~16d每日早晨向孕兔后腿四頭肌肌內(nèi)注射1.0mg地塞米松成功建立了新西蘭兔先天性腭裂模型。在地塞米松誘導(dǎo)的腭裂模型中，地塞米松通過抑制腭突凋亡，最終導(dǎo)致腭裂的形成[79,83]。維甲酸是胚胎發(fā)育中的關(guān)鍵微量元要[88]。在E10.5時(shí)，雌性小鼠通過口服灌腔注射100mg/kg的維甲酸研究表明，多種信號通路、與核糖體相關(guān)的途Newell-Morris等[95]通過給予妊娠期的短尾猴口服梯度劑量的維甲酸，面部畸形。2,3,7,8-四氯二苯并對二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)作為二噁英中毒性最強(qiáng)的衍量更大，約為40mg/kg[87,96-101]。TCDD誘導(dǎo)畸形形成的腭突更小，腭上皮的形態(tài)異性，最終導(dǎo)致腭融合失敗[81]。性腭裂的山羊模型。在妊娠第31~42天，每天分兩次肌內(nèi)注射15mg,通過一系列機(jī)械作用機(jī)制導(dǎo)致腭裂的形成[46]。(3)手術(shù)造裂法：外科手術(shù)造裂的腭裂動(dòng)物模型因其較高的一致性和擬腭裂畸形。這種模型經(jīng)濟(jì)有效，廣泛應(yīng)用于修復(fù)策略等方面的研究。手術(shù)造裂法最常用的蘭兔中也有涉及。由于人類顱骨的血供相對較少，小的骨缺損難以自愈；而動(dòng)物的自愈能力較強(qiáng)，許多早期動(dòng)物模型中，骨創(chuàng)經(jīng)常發(fā)生自發(fā)愈合，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[103]。因此，Schmitz和Hollinger[1終生無法自愈，以提高實(shí)驗(yàn)的可靠性和有效性。(4)其他方法：缺氧已被證明是腭裂發(fā)生的重要誘因。在斑馬魚模型中，研究人員將受精后8h (CNCC遷移)之前的幼魚置于30%或50%的缺氧環(huán)境中，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組胚胎表現(xiàn)出缺氧條件下的表型異常，包括篩板1.轉(zhuǎn)錄組學(xué)：轉(zhuǎn)錄組測序(RNAsequencing,RNA-seq)是目前應(yīng)用成為揭示關(guān)鍵通路或核心基因的核心工具。Potter和Pott合激光捕獲微解剖和RNA-seq,對E14.5小鼠腭發(fā)育進(jìn)行了區(qū)域特異性 (包括腭部內(nèi)側(cè)與外側(cè)、口腔與鼻區(qū)域的前部和后部)表達(dá)分析，生成了衡與Wnt和Shh信號通路失調(diào)的關(guān)聯(lián)[92,94]。除此之外，RNA-seq在基因編輯小鼠中挖掘致病機(jī)制，尋找相關(guān)通路也起到關(guān)鍵作用。在TGFβ3敲除小鼠中，識別出特定基因(如Chrng、Foxc2、H19等)通過Smad依賴性途徑調(diào)節(jié)腭裂發(fā)生，而Foxf2突變小鼠中揭示了新的LEF1和SMAD3的下調(diào)可能通過抑制MEE的EMT過程，導(dǎo)致腭融合節(jié)PI3K信號和早期內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因，并增強(qiáng)PI3K-Akt信號，促進(jìn)顱神經(jīng)脊細(xì)胞的增殖與存活[110]。在轉(zhuǎn)錄因子層面，Dlx類似的，Rbfox2的缺失通過Rbfox2-TGF-β-Tak1信號軸干擾腭發(fā)育，也為潛在的治療策略提供了新的靶點(diǎn)。在prdm1a-/-突變斑馬魚模型中，也通過RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)prdm1a的喪失顯著降低了多種顱面發(fā)育關(guān)鍵基因(如emilin3a、dlx5a/dlx6a、hand2、sox9b等)的表達(dá)，提示中的重要作用[113]。2.蛋白組學(xué)：隨著液相色譜技術(shù)的不斷進(jìn)步，蛋白組學(xué)已成為解析腭裂發(fā)組學(xué)通過定量分析蛋白質(zhì)的表達(dá)、翻譯后修飾及相互作用網(wǎng)絡(luò)，可補(bǔ)充目前蛋白組學(xué)在腭裂方面的研究主要集中于化學(xué)藥物誘導(dǎo)腭裂小鼠模型，通過差異蛋白篩選挖掘潛在的調(diào)控因子。有研通路的變化，包括氧化磷酸化、糖酵解/糖新生和谷胱甘肽代謝及氨基酸可能與TCDD誘導(dǎo)的小鼠腭裂發(fā)生相關(guān)，并且小鼠胚胎腭組織中能量代謝、細(xì)胞遷移及凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)失調(diào)，程中發(fā)揮重要作用。另外，Yuan等[117]分別建立了由TCDD和維甲酸誘導(dǎo)的腭裂小鼠模型，使用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來研究腭裂形成的關(guān)鍵蛋白，通過對這兩種模型的交集分析，發(fā)現(xiàn)14-3-3σ和AnnexinA1等差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能是腭裂形成的分子機(jī)制之一。3.學(xué)的研究集中在DNA甲基化、組蛋白修飾以及非編碼RNA,這些調(diào)控機(jī)制在顱面發(fā)育過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。DNA甲基化和組蛋白修飾調(diào)控腭突的發(fā)育、融合和細(xì)胞行為。Ulschmid化是口腔面部形態(tài)發(fā)生和腭裂發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。2018年，兩項(xiàng)全基因組甲基化譜研究揭示了DNA甲基化在小鼠腭發(fā)育中的重要作用，特Smad3和Mid1等基因在維甲酸誘導(dǎo)的腭裂小鼠模型中發(fā)生了顯著的甲使用利用轉(zhuǎn)座酶研究染色質(zhì)可進(jìn)入性的高通量測序技術(shù)(assayfortransposaseaccessiblechromatinwithhigh-throughputsequencing,ATAC-seq),對人類腭表皮模型(包括斑馬魚表皮、小鼠胚胎腭上皮和人類口腔上皮細(xì)胞系)及相應(yīng)的間充質(zhì)細(xì)胞類型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)調(diào)控KRT18/KRT8表達(dá)的表皮增強(qiáng)子內(nèi)，突出其在腭裂中的潛在功能作用。在非編碼RNA相關(guān)的研究中，Ding等[120]通過RNA-seq結(jié)合功能分析探討了miRNA在小鼠面中部發(fā)育中的作用，發(fā)現(xiàn)在額鼻區(qū)域特異性表達(dá)的Mir23b和主要表達(dá)于頭部和軀干肌肉的Mir133b在面和長鏈非編碼RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)表達(dá)動(dòng)態(tài)，驗(yàn)證Efnb1)的表達(dá)模式，提供了腭生成中基因表達(dá)和調(diào)控的全景視圖，突出探討了環(huán)狀RNA(circularRNA,circRNA)和lncRNA作為內(nèi)源競爭RNA(competingendogenousRNAs,ceRNA)在腭裂中的作用，識別了circRNA_0954-miRNA-881-3p-PRKAR1a、ENSMUSTO0000159153-miR-137ENSMUSTO00000236086-miR-34b-3p-EphA10/TRPM2作為腭裂酸誘導(dǎo)小鼠腭裂模型發(fā)現(xiàn)Mett114通過m?A修飾在腭間充質(zhì)細(xì)胞增殖中中的關(guān)鍵作用也得到了確認(rèn)[94]。相似地，在TCDD誘導(dǎo)的腭裂小鼠模型中，識別了BMP信號通路相關(guān)靶向Smad1和Smad5的lncRNA,為研究TCDD誘導(dǎo)的腭裂機(jī)制提供了新的見解[124]。4.代謝組學(xué)：代謝過程中，代謝途徑的變化與基因表達(dá)的調(diào)控之間的關(guān)系。在腭裂研究中，代謝組學(xué)可幫助識別關(guān)鍵代謝物，為揭示腭裂的合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析，探討了維甲酸裂之間可能存在關(guān)聯(lián)。而Zhang等[127]在維甲酸誘導(dǎo)的腭裂中發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝明顯不同，維甲酸誘導(dǎo)的腭裂組中增加的不整合起來，可從不同維度解析腭裂發(fā)生的系Oberbeck等[129]通過聯(lián)合RNA-seq、ChIP-seq和ATAC-seq揭示了RIPK4和IRF6通過調(diào)控表皮分化過程中的關(guān)鍵基因表達(dá)，維持表皮完整綜合征。(1)單細(xì)胞測序：單細(xì)胞RNA-seq(single-cellRNA-seq,scRNA-seq)可以單細(xì)胞分辨率剖析整個(gè)轉(zhuǎn)錄組，從階段細(xì)胞亞群的分化路線；而單細(xì)胞ATAC-seq(single-cellATAC-seq,scATAC-seq)則可揭示細(xì)胞胞測序整合，可比較正常與突變或處理組之調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，明確病變細(xì)胞群的來源與作用機(jī)制。在腭發(fā)育scRNA-seq相的小鼠胚胎中揭示了E