ICS07.080

CCSA40

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CAB

辣椒素合成酶活力的測定

Determinationoftheactivityof

capsaicinsynthase

（征求意見稿）

20XX-XX-XX發(fā)布20XX-XX-XX實(shí)施

中國產(chǎn)學(xué)研合作促進(jìn)會發(fā)布

T/CAB

目次

前言....................................................................III

1范圍.....................................................................1

2規(guī)范性引用文件...........................................................1

3術(shù)語和定義...............................................................1

4原理.....................................................................1

5試劑.....................................................................1

6儀器設(shè)備.................................................................2

7試樣制備和試驗(yàn)步驟.......................................................2

7.1試樣酶液的制備.......................................................2

7.2辣椒素合成酶活力的測定...............................................2

7.3辣椒素含量的測定.....................................................2

8試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理.............................................................3

9精密度...................................................................3

II

T/CAB

辣椒素合成酶活力的測定

1范圍

本文件描述了測定辣椒素合成酶活力的方法。

本文件適用于生化試劑及科研試驗(yàn)中辣椒素合成酶活力的測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T21266辣椒及辣椒制品中辣椒素類物質(zhì)測定及辣度表示方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

辣椒素合成酶活力單位capsaicinsynthaseactivityunit

在37℃、pH6.8的條件下，每小時(shí)生成1μmol辣椒素所需的酶量為一個(gè)酶活力單位，單

位為U。

4原理

辣椒素合成酶催化香蘭素胺和8-甲基-6-壬烯酰CoA反應(yīng)生成辣椒素，通過高效液相色

譜測定辣椒素的生成量，來計(jì)算酶活力。

5試劑

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級水。

5.1香蘭素胺：CAS號7149-10-2，純度≥98%。

5.2乙酰CoA：CAS號102029-73-2，純度≥93%。

5.3ATP：CAS號987-65-5，純度≥98%。

1

T/CAB

5.48-甲基-6-壬烯酸：CAS號59320-77-3，分析純。

5.5磷酸鉀緩沖液：500mmol/L，pH6.8。

5.6鹽酸溶液：500mmol/L。

5.7氯仿：色譜純。

5.8甲醇：色譜純。

5.9辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥95%。

5.10反應(yīng)底物溶液：含0.5M磷酸鉀緩沖液，pH6.8，1μMMgCl2，1μMATP，5μM香

蘭素胺，5μM8-甲基-6-壬烯酸和5μM乙酰CoA。

使用分析天平準(zhǔn)確稱取0.095mgMgCl2、0.551mgATP、0.948mg香蘭素胺、0.851mg

8-甲基-6-壬烯酸和4.378mg乙酰CoA溶解在950mL的磷酸鉀緩沖液（5.5）中，轉(zhuǎn)移至1L

容量瓶定容，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

6儀器設(shè)備

6.1分析天平：感量為0.001mg。

6.2pH計(jì)：精度為0.01。

6.3恒溫水浴鍋：溫度精度為1℃。

6.4高效液相色譜儀（HPLC）：配備紫外檢測器。

6.5移液器：1000μL。

7試樣制備和試驗(yàn)步驟

7.1試樣酶液的制備

使用移液器移取適量辣椒素合成酶液體樣品溶于水中進(jìn)行稀釋，使待測酶液活力控制在

15U/mL以下。

7.2辣椒素合成酶活力的測定

將適量酶液加入1mL反應(yīng)底物溶液中開始反應(yīng)，反應(yīng)混合物在37℃±1℃溫育2小時(shí)后，

用0.5MHCl終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物用氯仿萃取濃縮后溶于100μL甲醇，以HPLC測定辣椒素的

含量。

7.3辣椒素含量的測定

按照GB/T21266中的方法測定辣椒素的含量。

2

T/CAB

8試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

試樣中辣椒素合成酶活力按式（1）計(jì)算：

1000×?×?×?

?=1····················································(1)

?×?×?2

式中：

X——辣椒素合成酶活力，單位為酶活力單位每毫升（U/mL）；

C——HPLC測定的辣椒素含量，單位為微克每毫升（μg/mL）；

V1——HPLC測定中用于溶解辣椒素的甲醇的體積，單位為毫升（mL）；

V2——酶活力測定中加入酶液的體積，單位為微升（μL）；

M——辣椒素的分子量（取值為305.4）；

t——反應(yīng)時(shí)間，單位為小時(shí)；

D——稀釋倍數(shù)。

以三次平行測定結(jié)果的算數(shù)平均值作為最終的酶活力測定值，計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)

字。

9精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不超過算數(shù)平均值的10%。

__________________________

3

《辣椒素合成酶活力的測定》中國產(chǎn)學(xué)研合作促進(jìn)

會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)編制說明

一、工作簡況

（一）任務(wù)來源

辣椒素是辣椒中特有的一種生物堿類植物次生代謝產(chǎn)物，在食品、

保健、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和軍事等領(lǐng)域都具有重要應(yīng)用前景。辣椒素合成酶

（capsaicinsynthase，CS）催化辣椒素合成過程最后一步反應(yīng)，即8-

甲基-6-壬烯基CoA與香蘭素胺合成辣椒素，被認(rèn)為是辣椒素合成調(diào)控

的關(guān)鍵酶。研究辣椒素合成酶活力與辣椒素含量的關(guān)系，可為豐富不

同辣椒類型的辣椒素合成酶的基因資源和通過基因工程方法調(diào)控辣

椒素含量打下基礎(chǔ)。

對于辣椒素合成酶活力的測定，由于缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，使得在進(jìn)

行生化實(shí)驗(yàn)中難以確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重復(fù)性、科學(xué)性和準(zhǔn)確性。因此建

立辣椒素合成酶活力檢測方法標(biāo)準(zhǔn)十分重要。研制辣椒素合成酶活力

的測定標(biāo)準(zhǔn)將為辣椒素合成酶的生產(chǎn)、流通及監(jiān)管提供依據(jù)，促進(jìn)我

國辣椒素合成酶相關(guān)的食品、保健、醫(yī)藥等工業(yè)的健康發(fā)展，具有非

常重要的現(xiàn)實(shí)意義。根據(jù)行業(yè)的現(xiàn)實(shí)需求，中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院于2024

年3月提出《辣椒素合成酶活力的測定》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃，并牽頭承擔(dān)

標(biāo)準(zhǔn)起草任務(wù)。

2024年5月，經(jīng)中國產(chǎn)學(xué)研合作促進(jìn)會組織專家通過批準(zhǔn)立項(xiàng)，

立項(xiàng)名稱為《辣椒素合成酶活力的測定》。

（二）標(biāo)準(zhǔn)的起草單位及起草人

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：

（三）主要工作過程

1.預(yù)階段

2024年3月至2024年5月標(biāo)準(zhǔn)起草單位組織相關(guān)技術(shù)人員對《辣椒

素合成酶活力的測定》標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目進(jìn)行了預(yù)研，對辣椒素合成酶的活力

測定條件進(jìn)行了摸索，初步確立了辣椒素合成酶活力的測定方法。標(biāo)

準(zhǔn)起草組向中國產(chǎn)學(xué)研合作促進(jìn)會提交了標(biāo)準(zhǔn)建議書與標(biāo)準(zhǔn)草案，進(jìn)

行申報(bào)立項(xiàng)。

2.立項(xiàng)階段

2024年5月，中國產(chǎn)學(xué)研合作促進(jìn)會正式通過本團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)。

3.起草階段

針對該標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目，正式成立了標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組，明確了任務(wù)要

求，安排了工作進(jìn)度，根據(jù)單位參與的人員的專業(yè)、技能、人數(shù)將任

務(wù)合理分配。依據(jù)GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)

化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》對標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)一步完善的同時(shí)，開展技術(shù)

指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證工作。

在此期間，通過線上和線下會議結(jié)合的形式開展了3次工作會議。

會議就標(biāo)準(zhǔn)制定的相關(guān)問題進(jìn)行了協(xié)商與研究，并對標(biāo)準(zhǔn)的框架及內(nèi)

容進(jìn)行了認(rèn)真研究和討論。由此形成了最終的《辣椒素合成酶活力的

測定》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿和編制說明。

二、確定標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容

（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則

堅(jiān)持嚴(yán)要求、適宜性與可操作性相結(jié)合的原則。嚴(yán)要求即標(biāo)準(zhǔn)的

編制嚴(yán)格遵循GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文

件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》及相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行；適宜性既要充分考慮

到本行業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀與特點(diǎn)，又要有一個(gè)適宜的范圍與程度,從而提

高標(biāo)準(zhǔn)貫徹實(shí)施的可操作性。

（二）本標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容

1.主體內(nèi)容

本標(biāo)準(zhǔn)的主體內(nèi)容包括：范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、

原理、試劑、儀器設(shè)備、試樣制備和試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理以及精

密度。

2.范圍

本文件描述了測定辣椒素合成酶活力的方法。本文件適用于生化

試劑及科研試驗(yàn)中辣椒素合成酶活力的測定。

3.規(guī)范性引用文件

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。

GB/T21266辣椒及辣椒制品中辣椒素類物質(zhì)測定及辣度表示

方法

4.術(shù)語和定義

對辣椒素合成酶活力單位進(jìn)行了定義，是在37℃、pH6.8的條件

下，每小時(shí)生成1μmol辣椒素所需的酶量為一個(gè)酶活力單位，其單位

為U。

5.原理

辣椒素合成酶催化香蘭素胺和8-甲基-6-壬烯酰CoA反應(yīng)生成辣

椒素，通過高效液相色譜測定辣椒素的生成量，來計(jì)算酶活力。

6.試劑

本標(biāo)準(zhǔn)給出了辣椒素合成酶的測定方法中所使用的試劑的清單，

包括香蘭素胺、乙酰CoA、ATP、8-甲基-6-壬烯酸、磷酸鉀緩沖液、

鹽酸溶液、氯仿、甲醇、辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品，以及辣椒素合成酶的反應(yīng)底

物溶液。描述了試劑的主要特性，并給出了溶液的制備方法。

由于酶活會受到反應(yīng)底物濃度、pH以及溫度的影響，在測定不同

反應(yīng)底物濃度，不同pH以及不同溫度的辣椒素合成酶活力的基礎(chǔ)上，

合理確定了辣椒素合成酶活力測定的底物溶液的相關(guān)參數(shù)。辣椒素合

成酶的反應(yīng)底物溶液含0.5M磷酸鉀緩沖液，pH6.8，1μMMgCl2，1

μMATP，5μM香蘭素胺，5μM8-甲基-6-壬烯酸和5μM乙酰CoA。

7.儀器設(shè)備

本標(biāo)準(zhǔn)給出了辣椒素合成酶活力的測定方法中所使用的儀器設(shè)

備的清單，并描述了主要特性。儀器設(shè)備包括分析天平、pH計(jì)、恒溫

水浴鍋、高效液相色譜儀以及移液器。

8.試樣制備和試驗(yàn)步驟

使用移液器移取適量辣椒素合成酶液體樣品溶于水中進(jìn)行稀釋，

使待測酶液活力控制在15U/mL以下。

酶活的測定步驟為：將適量酶液加入1mL反應(yīng)底物中開始反應(yīng)，

反應(yīng)混合物在37℃±1℃溫育2小時(shí)后，用0.5MHCl終止反應(yīng)。反

應(yīng)產(chǎn)物用氯仿萃取濃縮后溶于100μL甲醇，以HPLC測定辣椒素的含

量。辣椒素含量的測定是按照GB/T21266中的方法進(jìn)行測定。

9.試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

試樣中辣椒素合成酶活力按式（1）計(jì)算：

1000×?×?×?

?=1························(1)

?×?×?2

式中：

X——辣椒素合成酶活力，單位為酶活力單位每毫升（U/mL）；

C——HPLC測定的辣椒素含量，單位為微克每毫升（μg/mL）；

V1——HPLC測定中用于溶解辣椒素的甲醇的體積，單位為毫升

（mL）；

V2——酶活力測定中加入酶液的體積，單位為微升（μL）；

M——辣椒素的分子量（取值為305.4）；

t——反應(yīng)時(shí)間，單位為小時(shí)；

D——稀釋倍數(shù)；

以三次平行測定結(jié)果的算數(shù)平均值作為最終的酶活力測定值，計(jì)

算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

10.精密度

取同一樣品，相同條件下連續(xù)測定3次，結(jié)果如表1所示。辣椒素

合成酶活力的RSD為8.64%，說明重復(fù)性好?；谝陨现貜?fù)性結(jié)果，

在標(biāo)準(zhǔn)文本中規(guī)定了精密度為：在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定

結(jié)果的絕對差值不得超過算數(shù)平均值10%。

表1重復(fù)性條件下的酶活測定數(shù)據(jù)

酶酶活1酶活2酶活3平均酶活RSD

（U/mg）（U/mg）（U/mg）（U/mg）

辣椒素合成酶0.180.190.160.188.64%

（三）本標(biāo)準(zhǔn)制定參考的主要依據(jù)

本標(biāo)準(zhǔn)制定過程中參考了以下相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：GB/T33