真菌纖維素酶調(diào)控機制的研究進展ADVANCESINTHEREGULATOYMECHANISMOFFUNGALCELLULASE目錄摘要………………………1關(guān)鍵詞……………………10前言……………………21真菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)…………………22真菌纖維素酶基因調(diào)控機制…………33表觀遺傳修飾對調(diào)控機制的影響……………………33.1DNA甲基化對纖維素酶基因表達的影響………….43.2蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶對纖維素酶的影響…………........53.3組蛋白修飾對纖維素酶基因表達的影響…………63.4RNA干擾對纖維素酶基因表達的影響…………....63.4.1siRNA……………..63.4.2非編碼長鏈RNA………………….74展望…………………….8參考文獻………………....9致謝………………………13真菌纖維素酶調(diào)控機制的研究進展摘要：纖維素是世界上非常豐富的可再生生物質(zhì)類資源，此類資源每年都有大量被浪費，沒有得到較好的利用，且如秸稈之類被焚毀的同時也造成了一定的環(huán)境污染，故此提高對于此類資源的合理安置利用在當前環(huán)保問題日益受到重視，新能源開發(fā)迫在眉睫的情況下有十分重要的意義。真菌因具有所產(chǎn)纖維素酶酶系廣，活性高，且能被分泌到胞外等特點，被廣泛的應(yīng)用在工業(yè)上纖維素酶的生產(chǎn)。關(guān)于真菌纖維素酶的調(diào)控機制目前還不是十分清楚，本文綜述了關(guān)于真菌纖維素酶調(diào)控相關(guān)的表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、RNA干擾組蛋白修飾、染色質(zhì)改型等，以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相關(guān)信息，以期對未來進行的培育具有更高纖維素酶活性的真菌提供一些參考價值。關(guān)鍵詞：真菌纖維素酶AdvancesintheregulatorymechanismoffungalcellulaseAbstract:Celluloseisveryrichintheworldofrenewablebiomassresources,everyyeartherearealargenumberofsuchresourceswasted,didn'tgetagooduseof,andsuchasstrawburnedatthesametimealsocausedcertainenvironmentalpollution,andthereforeimproveforsuchresourcesreasonableplaceforuseinthecurrentenvironmentalprotectionisbecomingmoreandmoreattention,theimmediatesituationanddevelopmentofnewenergyhastheveryvitalsignificance.Fungihavebeenwidelyusedintheproductionofcellulaseduetotheirwiderangeofenzymes,highactivityandabilitytobesecretedoutsidethecell.Onfungalcellulaseregulationmechanismisstillnotveryclear,thispaperreviewstheonfungalcellulaseregulationrelatedepigeneticmodificationincludingDNAmethylation,histonemodificationandchromatinmodificationsofRNAinterference,andtranscriptionalregulatoryfactorsrelatedinformation,inordertothefutureofcultivatingfungiwithhighercelluloseenzymeactivitytoprovidesomereferencevalue.Keywords:0前言纖維素是目前世界上儲存含量最為豐富的可再生資源，每年全球有超過1500億噸的有機物在光合作用下生成，其中包含著大量纖維素類物質(zhì)[1]。然而當前對于纖維素此類生物質(zhì)資源的利用率仍然不高，每年都會有大量的秸稈等纖維素類資源被焚毀或廢棄，這些對資源的浪費行為同時對環(huán)境造成了不小的污染，故對于纖維素類生物質(zhì)資源的合理利用在新能源開發(fā)和環(huán)境保護方面有重要意義。纖維素酶是一類糖苷水解酶，是一組能降解纖維素酶系的總稱，這些酶組成的酶系進行協(xié)同作用將纖維素降解為纖維二糖和寡糖，最終降解為葡萄糖。纖維素酶由內(nèi)切β-葡聚糖苷酶(EG)、外切β-葡聚糖苷酶（CBH)和β-葡萄糖苷酶（BG）3類酶組成[2]。纖維素酶應(yīng)用十分廣泛，在食品、飼料、釀酒、加工等領(lǐng)域起著十分重要的作用。在自然界中纖維素酶的來源非常廣泛，大量的微生物如細菌、真菌、放線菌等都能產(chǎn)生纖維素酶，且不同菌種產(chǎn)生的構(gòu)成這種纖維素酶系的酶有細微的區(qū)別[3]。但工業(yè)生產(chǎn)中常用真菌做為纖維素生產(chǎn)酶，目前里氏木霉做為常用的纖維素酶生產(chǎn)菌活躍在各個工廠、實驗室等。其他可大量分泌纖維素酶的真菌包括有里氏木霉(Trichoderma

reesei)、

草酸青霉(Penicillium

oxalicum)、黑曲霉(Aspergillusniger)、粗糙脈孢菌(Neurospora

crassa)等[4]，有研究表明真菌產(chǎn)生的纖維素酶降解纖維素的能力在微生物中比較出色，且真菌所生產(chǎn)出的纖維素酶具有酶系較廣、活性較高、分泌到胞外等特點[5]。通過對真菌產(chǎn)生纖維素酶的調(diào)控機制進行研究以控制工業(yè)上纖維素酶的生產(chǎn)，這對獲得更高性能的生產(chǎn)纖維素酶的菌株有重要意義。本文通過對近年一些影響真菌所產(chǎn)纖維素酶活性的方法，以及部分調(diào)控機制進行綜述，表述了一些調(diào)控機制在纖維素酶產(chǎn)生過程中的重要作用。1真菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)從當下大部分纖維素酶相關(guān)的已知研究可知，真菌纖維素酶的結(jié)構(gòu)構(gòu)成一般包括三個結(jié)構(gòu)區(qū)域，其中有兩個結(jié)構(gòu)域分別負責(zé)催化和結(jié)合功能以及一個連接肽(Linker)，且這個連接肽是被高度糖基化的，負責(zé)催化功能的結(jié)構(gòu)域稱為催化結(jié)構(gòu)域（CD）,而另一個負責(zé)結(jié)合功能的結(jié)構(gòu)域稱為結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD）。外切葡糖苷酶的CD可在整個纖維素鏈的晶體區(qū)域持續(xù)單向產(chǎn)生纖維二糖。研究表明，外切葡糖苷酶的CBD吸收纖維素，在CBD中纖維素等此類聚合物被分解成長短不一不一的短纖維，這是由于纖維素這類聚合物之間的氫鍵被破壞了。雖然另外有些真菌纖維素酶其結(jié)構(gòu)構(gòu)成并不存在CBD此類結(jié)構(gòu)，但這些真菌纖維素酶水解纖維素的能力并沒有受到太大的影響。Linker負責(zé)將CBD和CD這兩種結(jié)構(gòu)域連接到一起，使其發(fā)揮作用的同時將CBD與CD以合適的距離將其間隔開來，使得這兩種結(jié)構(gòu)域在發(fā)揮其催化、結(jié)合等功能時能夠較為長久的維持這兩種結(jié)構(gòu)域的活性[6]。2真菌纖維素酶基因控制機制眾所周知，真菌纖維素酶合成的相關(guān)調(diào)控基因非常之多，且這些調(diào)節(jié)控制纖維素酶合成的基因基本上都有控制其自身代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，然而在有些情況下，可能這些調(diào)節(jié)控制纖維素酶合成的基因會受到相同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的控制。目前，在纖維素酶的相關(guān)基因識別方面，里氏木霉中被鑒定出的與纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有不少，如CRE1、XYR1、ACE1與ACE2等[7]。ACE1、ACE2這兩種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它們特殊的作用于一類具有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域，且有三個這樣區(qū)域的纖維素酶，其中ACE1負責(zé)正向調(diào)控，ACE2負責(zé)負向調(diào)控。CRE1是比較常見的阻遏碳代謝的調(diào)控因子，當有外源環(huán)境具有葡萄糖這一類簡單單糖時，CRE1會對纖維素酶的代謝起阻遏作用。XYR1是一種纖維素酶和半纖維素酶基因所必需的激活因子，其激活的與纖維素酶合成相關(guān)的基因有cbh1、cbh2、egl1、bgl1、xyn1以及xyn2等[8]。至今，從部分現(xiàn)有研究中以發(fā)現(xiàn),在里氏木霉中,纖維二糖酶是由經(jīng)cbh1這一基因控制合成維素酶，內(nèi)切β-葡聚糖苷酶則是egl1這一基因控制合成的纖維素酶。一項研究表明，紅褐肉座菌的蛋白復(fù)合物Hap2/3/5同樣對cbh2基因的表達有調(diào)控作用，但沒有詳細說明具體作用[9]。”纖維素及其衍生物(纖維二糖和槐糖)、乳糖和單糖山梨糖這一類物質(zhì)是真菌纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄的主要誘導(dǎo)物，且這種誘導(dǎo)效應(yīng)會被碳代謝阻遏這一機理所影響。研究表明，XYR1、ACE2和ACE1是乳糖調(diào)節(jié)控制的基因表達。XYR1這一轉(zhuǎn)錄因子同時會被D-半乳糖的誘導(dǎo)所影響，但這種調(diào)控不會影響到乳糖的代謝[7]。3表觀遺傳修飾對調(diào)控機制的影響從目前的研究情況看來，纖維素酶的調(diào)控機制目前已經(jīng)有些部分進行了較為深入的研究。真菌纖維素酶的表觀遺傳修飾的方法主要有:DNA甲基化、RNA干擾、染色體重塑、組蛋白修飾等，這些系統(tǒng)相互作用，形成特定基因表達功能所需的特殊染色質(zhì)來調(diào)節(jié)控制基因的表達[10]。DNA甲基化是當下關(guān)于真菌纖維素酶表觀遺傳修飾所有研究中的一種典型代表，這種典型的表觀遺傳修飾方法通常是會對基因的表達進行一定程度上的抑制[11]。組蛋白修飾包括組蛋白的甲基化、乙?；⒘姿峄?、糖基化等。目前纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)的組蛋白修飾相關(guān)研究有相當之多，但其中研究最為深入的還是組蛋白乙酰化這一方向。組蛋白去乙酰化酶和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶這兩種酶在組蛋白乙?；胶饩S持中有十分巨大的作用。RNA干擾這一表觀遺傳修飾方法目前較為熱門，主要包括siRNA和長鏈非編碼RNA對纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄合成纖維素酶的調(diào)節(jié)控制作用[6]。3.1DNA甲基化對真菌纖維素酶的調(diào)控作用有關(guān)研究得出的結(jié)論認為，少數(shù)一些真菌，僅粗糙脈孢菌（Neurosporacrassa）、多頭絨泡菌（Physarumpolycephalum）、黃曲霉（Aspergillusflavus）、布拉克須霉（Phycomycesblakesleeanus）等真菌胞嘧啶最容易受到DNA甲基化的影響[12]。真菌纖維素酶基因其DNA甲基化的位點存在很大程度上的相似，這種相似性主要是體現(xiàn)于和植物此類基因甲基化的位點進行比較所得出的結(jié)論，這些位點大部分集中于轉(zhuǎn)座子和其他重復(fù)序列上，從而進一步的控制和抑制基因表達。最近一段時間以來，真菌纖維素酶DNA甲基化的相關(guān)研究在方法上有了一些突破，其中現(xiàn)有一種非常重要的手段，這就是化學(xué)試劑修飾。周嬌嬌等在含0.1mmol/L5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-Aza-2?-deoxycytidine,5?-Aza）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)里氏木霉T.reeseiQM9414，他們發(fā)現(xiàn)該菌株相比于出發(fā)菌株，它的DNA甲基化酶的表達量水平有一個非常明顯的下降，在這種情況下該菌株的DNA甲基化程度也有所下降，且這種下降不是某些個體上的差異，而是來自所有基因，與此同時cbh1、egl1和xyr1這三個控制纖維素酶合成的基因的表達水平有一個較為顯著的增長。經(jīng)酶活測定發(fā)現(xiàn)羧甲基纖維素鈉酶活性（carboxymethylcellulose-Naenzymaticactivities，CMCA）以及濾紙酶活性（filterpaperenzymaticactivities，F(xiàn)PA）明顯增加[13]。類似的情況下，刺激灰霉病酶（Humicolagriseavar.thermoidea，Hgvt）受到5?-Aza的作用后，其木聚糖酶的活性在96小時后有較為顯著的提高。在含葡萄糖（Glu）培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)5?-Aza使Hgvt細胞生物水解酶和XYN-2木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)錄積累增加，而在小麥麩皮（WB）上培養(yǎng)時，檢測到5’-Aza增強了轉(zhuǎn)錄因子CreA基因的表達[14]。上述研究表明，ACE1、ACE2、CRE1和XYR1等纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達，可能會在一定程度上受到來自于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5?-Aza的作用，使其轉(zhuǎn)錄功能受到不同程度的影響，進而使得纖維素酶基因的表達在轉(zhuǎn)錄階段受到控制，同樣的，這種影響也會在一定程度上體現(xiàn)在木聚糖酶基因的表達上。由此可見在當下的研究之中，部分方法對于纖維素酶活性的影響已經(jīng)有了非常顯著的效果，這對于將來更進一步關(guān)于纖維素酶表觀遺傳修飾的研究提供了更多的基礎(chǔ)技術(shù)支持以及內(nèi)容上的參考。3.2蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶真菌纖維素酶的調(diào)控作用LaeA是本世紀初于絲狀真菌中被發(fā)現(xiàn)的一種全局性調(diào)控因子，這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是一種蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。在構(gòu)巢曲霉中，VELVET蛋白復(fù)合體的作用十分重要，這種復(fù)合物主要由LaeA、VeA、Ve1B三種調(diào)控因子組成，并且LaeA參與了異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾[15]。在草酸青霉中，LaeA作為一種全局調(diào)控因子作用十分重要，其中糖苷水解酶基因的表達就受其控制，clrB、xlnR和creA等轉(zhuǎn)錄因子具有不可或缺的重要作用，這些轉(zhuǎn)錄因子與糖苷水解酶基因相關(guān)，而這些轉(zhuǎn)錄因子表達也受LaeA的調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，如果能夠?qū)⒁吧蚅aeA菌株的基因拷貝用一種方法進行插入，這個插入是基于突變型LaeA菌株基因組上進行的。那么就會獲得一個顯而易見的結(jié)果，突變型菌株在纖維素酶合成以及菌株自體生長的缺陷就會被修復(fù)。然而，在這種情況下β-木糖苷酶基因xyl3A被激活表達了，這種激活是野生型LaeA基因插入引起的基因突變所造成的一種副作用，在這種作用下胞外木糖苷酶活性有了一個極大的提高，這個活性增強達到了驚人的5倍，這說明LaeA對細胞外木糖苷酶的形成具有負調(diào)控作用[16]。有研究表明與LaeA同源蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶LAE1是里氏木霉性發(fā)育的調(diào)控因子，LAE1在里氏木霉中同樣有十分重要的作用，如纖維素酶和多糖水解酶的這兩種和菌株生長關(guān)系十分密切的水解酶的表達就都受到LAE1這一蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)。在乳糖誘導(dǎo)條件下，敲除LAE1基因的瑞克毛霉分離株的纖維素酶活性明顯低于親本株。當以木聚糖為碳源時，LAE1基因突變株中同樣會有一個明顯可見的顯著現(xiàn)象，那就是在此類突變株中其木聚糖酶的活性會有所變化，而且這種變化是向一種顯著性負向的負向進行，故而可以得知這種基因突變使得菌株的木聚糖酶活性降低。有研究發(fā)現(xiàn)LAE1在調(diào)節(jié)糖苷水解酶基因的表達時，LAE1也能夠控制纖維素酶轉(zhuǎn)錄激活因子XYR1基因的表達，然而LAE1功能不僅于此，在上述調(diào)節(jié)控制功能的同時，碳水化合物酶(CAZymes)基因家族的表達也會受到LAE1的調(diào)控，這已經(jīng)足夠體現(xiàn)LAE1作為一種蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶在纖維素酶等糖苷水解酶合成中所發(fā)揮的重要作用，但CAZymes編碼區(qū)H3K4、H3K9這兩個基因結(jié)構(gòu)區(qū)域并不會被LAE1直接甲基化[17]。雖然纖維素酶的合成存在多種誘導(dǎo)作用，但是LAE1相關(guān)性的纖維素酶基因的表達卻不受這些誘導(dǎo)作用的影響，這表明LAE1在里氏木霉纖維素酶合成的過程中有著不可或缺的作用，因為這些纖維素酶的合成過程中都會受到來自于LAE1的調(diào)控。目前的研究狀況是，雖然LAE1作為一種蛋白及轉(zhuǎn)移酶在真菌纖維素酶合成中有如此重要的作用，然而遺憾的是LAE1的甲基化靶點任然沒有在任何生物中得以鑒定。VeA作為LAE1的直系，這種關(guān)系在某種程度上是同源的，這種同源關(guān)系的體現(xiàn)來自于LAE1與LaeA的同源關(guān)系的構(gòu)成，VeA以及LaeA這兩個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在都是構(gòu)成VELVET蛋白復(fù)合體的同時，也都具備有對纖維素酶合成相關(guān)基因的調(diào)控[18]。在黃曲霉中，淀粉酶和蛋白酶的活性受到一種蛋白活性轉(zhuǎn)移酶的影響，其作用與LAE1在里氏木霉中如出一轍，VeA也是如此作用于黃曲霉中。VEL1突變株在培養(yǎng)基上進行纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)，當這種培養(yǎng)基的碳源選擇乳糖為碳源時，XYR1作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其結(jié)構(gòu)會遭到全局性的破壞，這就使得其正向調(diào)控的纖維素酶、木聚糖酶的表達會受一定的抑制，這說明VEL1能夠在某種程度上對纖維素酶的合成形成調(diào)控作用，也開始說是具有同其他調(diào)控因子如LEA1等，在纖維素酶合成過程中具有無可取代的作用。通過上述說明，可以清醒的認識到LaeA雖然是較近時間內(nèi)發(fā)現(xiàn)的全局性調(diào)控因子，但是LaeA在真菌纖維素酶合成過程中的重要作用顯而易見，且其在不同菌種中的同源轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子都是該菌株在合成纖維素酶過程中不可或缺的重要條件。可以預(yù)見在將來對于真菌纖維素酶合成調(diào)控機制的繼續(xù)研究，以及在工業(yè)上對高活性的纖維素酶和其相關(guān)的次生代謝產(chǎn)物進行生產(chǎn)的工藝研究上，LaeA此類全局性調(diào)控因子的作用都是不可忽視的重要參考項。3.3組蛋白修飾對真菌纖維素酶的調(diào)控作用組蛋白修飾是近年來對于真菌纖維素酶調(diào)控機制的熱門研究方向，尤以甲基化、乙?；揎椷@兩方面的研究為最,就目前的研究狀況來看組蛋白修飾中甲基化的穩(wěn)定程度相比較于其他修飾方法更穩(wěn)定，因此更適合作為表觀遺傳修飾進行信息傳遞，而乙酰化由于動態(tài)度較高，其常常用于和其他修飾方法相結(jié)合已獲得更加多樣性的調(diào)控功能。組蛋白乙?；傅木幋a基因gcn5是HAT家族的成員之一，最初在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)。Xin等對gcn5同源基因在里氏木霉TrGcn5突變研究發(fā)現(xiàn),如果對重組菌株進行一定的誘導(dǎo)作用，那么菌株CBD合成酶的活性會顯著降低，從而導(dǎo)致纖維素酶的結(jié)構(gòu)上的缺失,進而使得菌株纖維素酶活性降低，這種情況會在以半乳糖為碳源進行誘導(dǎo)時發(fā)生,而另一方面以羧甲基纖維素(CMC)或結(jié)晶纖維素為碳源誘導(dǎo)纖維素酶的情況卻與前者不同，在這種對纖維素進行簡單修飾病以此類纖維素碳源時，重組菌株在這種改變下的環(huán)境中其纖維素酶的表達沒有明顯異常,為了探究這情況產(chǎn)生的原因，實時熒光定量PCR(RT-qPCR)測量可以提供相當?shù)募夹g(shù)幫助，通過一系列嚴謹操作之后，結(jié)果證明cbh1基因的基因轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)一些問題,通過對結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，cbh1基因可能并沒有被激活，與此相對應(yīng)的是，另外兩種糖苷酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄則不受影響。這已經(jīng)足夠說明TrGcn5在纖維素酶合成過程中是如何發(fā)揮其調(diào)控作用以對菌株根據(jù)外部環(huán)境的刺激及時調(diào)整菌體自體分泌的水解酶體系，TrGcn5把染色質(zhì)進行重構(gòu)，這種組蛋白修飾正是前文中所提到的組蛋白乙酰化，且被重構(gòu)的部分是纖維素酶基因啟動子中特定的組蛋白尾部，由于這種組蛋白修飾行為可以使TrGcn5調(diào)控纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄激活[19]。在水稻惡苗病菌(Fusariumfujikuroi)中，蛋白復(fù)合體VELVET同樣十分重要，其作為一種結(jié)構(gòu)型蛋白復(fù)合體，主要由Vel1、Vel2和LAE1組成，在該菌株中為其構(gòu)成組分提供結(jié)構(gòu)支持。LAE1作為LaeA的直接同源基因，主要參與調(diào)控次生代謝基因簇，但也影響編碼轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)因子、組蛋白修飾因子、轉(zhuǎn)運蛋白等多種功能蛋白的基因表達。Lae1突變體中組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶HAT1的過表達導(dǎo)致部分生物合成的恢復(fù)，這表明在水稻惡病質(zhì)中，HAT1可能與Lae1參與相同的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[20]。周嬌嬌等敲除兩個了里氏木霉中的基因,這種基因敲除技術(shù)自上世紀80年代發(fā)展起來以后廣泛的活躍在各種生命科學(xué)技術(shù)的前沿工作中，而該試驗敲除的兩個基因負責(zé)編碼組蛋白H3賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(histoneH3lysinemethyltransferase,HKMT)以及組蛋白去乙?；?histonedeacetylase,HDAC)，這也就意味著如果纖維素酶活性上升，則表明敲除的兩個基因?qū)w維素酶的表達具有明顯的調(diào)控作用，結(jié)果也是顯而易見的，當用熒光定量PCR檢測cbh1egl1xyr1基因表達的水平時，可以發(fā)現(xiàn)這幾個基因的表達水平會有一個顯著變化,同時纖維素酶的表達顯著性的被激活[21]。最終結(jié)果表明，HKMT和HDAC這倆個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子都在纖維素酶合成過程中有重要作用，且這種作用是顯而易見的，如果兩個轉(zhuǎn)錄因子同時被激活，里氏木霉纖維素酶活性會有一個顯著的降低。BaVanVu等發(fā)現(xiàn)纖維素酶基因表達存在雙向調(diào)控機制。這種雙向調(diào)控機制在真菌對于環(huán)境變化的過程調(diào)整自體糖苷類水解酶的表達有重要意義，在以2%CMC為碳源誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)中纖維素酶編碼基因MoCel7C(MGG_14954)的轉(zhuǎn)錄水平較出發(fā)菌株提高了1000多倍，這種提高是顯著性的，從一定程度上反映了CMC對該菌株纖維素酶合成誘導(dǎo)的優(yōu)異性，同時非誘導(dǎo)條件下MoSET1基因突變體中MoCel7C的表達水平也有所提高。當該種菌株的環(huán)境下只有葡萄糖和纖維二糖等低碳糖時，其CMC誘導(dǎo)的MoCel7C啟動子的活化會受到嚴重的抑制，另一方面，MoCel7C基因位H3K4能否正常甲基化也與CMC激活該基因有關(guān)。此外，在米曲霉(M.oryzae)中，組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶MoSET1基因與其在稻瘟病菌的作用十分相似，都是通過對MoCel7C基因的影響，從而對纖維素酶合成過程進行調(diào)控，MoSET1基因會直接或間接地激活或抑制MoCel7C基因，這種調(diào)控作用體現(xiàn)了表觀遺傳修飾在纖維素酶基因表達過程中的重要作用。當在不同物理狀態(tài)的條件下對米曲霉進行培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，米曲霉在兩種狀態(tài)的培養(yǎng)基中其MoCel7C基因的表達會產(chǎn)生明顯的差異，當在不溶性結(jié)晶纖維素瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)米曲霉時，其MeCel7C啟動子會活化發(fā)生正常作用，但在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，米曲霉的MeCel7C啟動子卻未激活，說明米曲霉的MeCel7C啟動子有必要通過誘導(dǎo)真菌菌絲體激活，這種效應(yīng)得益于纖維素酶基因表達的雙向調(diào)控機制，一定程度上增強了真菌在惡劣環(huán)境的生存能力[22]。3.4RAN干擾對真菌纖維素酶的調(diào)控作用3.4.1siRNARNA干擾(RNAinterference,RNAi)即基因在轉(zhuǎn)錄后由于其高度保守性的特性使得其沉默的一種自然現(xiàn)象，這種現(xiàn)象是由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）誘發(fā)的、這會使得同源mRNA在基因組中發(fā)生高效特異性降解，形成siRNA，從而影響基因的正常表達，具有高效性、特異性、位置效應(yīng)、競爭效應(yīng)、可傳播性等特點。當前環(huán)境下RNA干擾技術(shù)，已經(jīng)被廣泛的使用在探索基因功能以及治療領(lǐng)域。此外，RNAi技術(shù)可以降低真菌纖維素酶相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的基因表達，并且由于其特點不會對真菌生長產(chǎn)生嚴重的一系列副反應(yīng)反應(yīng)或者導(dǎo)致其死亡，在此基礎(chǔ)上RNAi技術(shù)對于真菌纖維素酶調(diào)控機制的研究上可以發(fā)揮十分巨大的作用[23]。目前，RNAi技術(shù)在各大生物技術(shù)領(lǐng)域都發(fā)揮著十分重要的作用，同樣的對于真菌纖維素酶調(diào)控機制的研究上，RNAi干擾技術(shù)的應(yīng)用正在日益增多。而在這其中，大多研究人員偏好采用長鏈RNAi和誘導(dǎo)干擾載體這兩項技術(shù)。薛海曌通過對pUC19骨架質(zhì)粒進行了RNAi干擾載體的技術(shù)重構(gòu)，在草酸青霉中對淀粉酶基因amyI5A進行了干擾，其結(jié)果表明該基因mRNA的表達量受到了嚴重抑制，從而使得amyI5A基因表達受到了來自于這種構(gòu)造載體的嚴重干擾，這種載體被命名為pHX-RNAi[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶高產(chǎn)突變體康氏木霉（T.koningiiYC01,GenBank:JQ291608）中cre1基因的表達在受到RNAi技術(shù)的干擾后，木聚糖酶和纖維素酶相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子XYR1的表達顯著增加，這正是由于cre1基因的表達受到了RNAi干擾下的明顯抑制作用[25]。在表達組成型siRNA載體的干擾下，cre1基因的表達下降了50%左右,在第6天時,cbh1,egl1和xyr1等受cre1基因調(diào)控的纖維素酶合成相關(guān)基因的表達量有一個兩倍的增長，這個增長是基于同出發(fā)菌株進行的比較,這可以看出碳代謝阻遏因cre1在受到RNAi干擾后其活性受到了明顯的抑制,這也表明部分纖維素酶基因表達的基因抑制在表達組成型siRNA載體的干擾下被解除了[26]。使用載體p-Ppdc’’-Tcbh1干擾cre4基因會引起cre1在轉(zhuǎn)錄水平上的下降，這個下降大概體現(xiàn)在50％,這說明CRE4對cre1產(chǎn)生正調(diào)控作用，而CRE4對阻遏物ACE1、CRE2、CRE3的調(diào)控作用并不明顯，這可能是由于其代謝通路相關(guān)性不足，同時激活因子XYR1也對cre4的調(diào)控作用反應(yīng)微弱。另一方面,真菌纖維素酶基因cbh1和egl1在干擾重組菌中的表達量均有所增加，這個表達量的增長是建立在通過與出發(fā)菌株進行比較的基礎(chǔ)上，雖然增長只有兩倍,但這個表達量的增長也已經(jīng)足夠說明，部分阻遏物對纖維素酶基因表達的抑制干擾是可以通過一定手段進行緩解的，對CRE4基因的表達進行RNA干擾就是一個很好的例子[27]。王蓉等利用RNAi技術(shù)下調(diào)cre1基因在里氏木霉中的表達，在這種干擾下里氏木霉纖維素酶活性有一種非常明顯的變化，這種變化體現(xiàn)在兩個方面，那就是其外切纖維素酶和內(nèi)切纖維素酶的酶活均顯著升高的同時，受到干擾效應(yīng)的里氏木霉其β-葡萄糖苷酶的活性也顯著降低，這表明RNAi干擾作用下對纖維素酶活性的影響是雙向的，這就需要去尋找一個合適的提高纖維素酶活性的最佳干擾條件。且在里氏木霉中，主要是由bgl1基因負責(zé)調(diào)控β-葡萄糖苷酶的活性，這就表了另一個可能的事實，bgl1的表達可能直接或間接受cre1基因的影響，這進一步的表明了cre1在纖維素酶合成中的重要作用[28]。RNA干擾的作用顯然不止于此，其豐富的作用表現(xiàn)在可以干擾轉(zhuǎn)錄因子的同時，RNA干擾還可以影響重要的轉(zhuǎn)錄相關(guān)酶基因的表達，這些作用對于真菌纖維素酶調(diào)控機制的研究具有重要意義。周嬌嬌等在干擾里氏木霉gcn5后發(fā)現(xiàn)，干擾轉(zhuǎn)化菌株的組蛋白乙酰化修飾被顯著抑制，導(dǎo)致纖維素酶調(diào)控基因表達顯著降低，進一步造成纖維素酶活性降低[20]。幾乎所有現(xiàn)有的數(shù)據(jù)都表明組蛋白修飾中的乙?；揎椩谡婢w維素酶的調(diào)控中有不可或缺的重要作用。在此條件下，通過上述說明，可以認識到siRNA干擾載體在對真菌纖維素酶相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子進行干擾時，這種技術(shù)操作對菌株較小傷害的同時，又能夠改變菌株相關(guān)纖維素酶的產(chǎn)量，且這種改變有益于工業(yè)上對于菌株改造的需求，能夠大幅增加單位產(chǎn)量以提高效益。3.4.2長鏈非編碼RNA長鏈非編碼RNA（LncRNA）在21世紀生物技術(shù)領(lǐng)域是當期最為火熱的方向之一，當下關(guān)于這種轉(zhuǎn)錄長度超過200nt的RNA分子在真菌相關(guān)方面的研究同樣異?；馃幔@種RNA分子在真菌中最早被發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母中，在Dicer酶的控制作用下，LncRNA可以與特異性的mRNA分子結(jié)合形成siRNA分子[29]。2018年，Petra等人首先在絲狀真菌里氏木霉QM9414中發(fā)現(xiàn)了一種被3'聚腺苷化LncRNA，即HAX1。HAX1只存在于里氏木霉中，HAX1突變體在以一些菌株為代表的表達中會使得纖維素酶的分泌量降低，就如在QM9414這一菌株中，不過當HAX1過表達后，QM9414的纖維素酶的分泌量恢復(fù)正常，這一變化說明QM9414菌株型的纖維素酶表達受HAX1的調(diào)節(jié)控制。在QM6a中，HAX1其表達會對纖維素酶的活性造成較為顯著的影響，當HAX1這一RNA分子缺陷或不表達時，QM6a的表型并不會受到影響，然而在QM6a表達HAX1后，QM6a菌株的纖維素酶活性有明顯變化，這個變化對于QM6a菌株在缺少簡單碳源的環(huán)境下，使其可以迅速大量的獲得分解纖維素以得到碳源維持自身代謝以及繁殖等生物功能。不同菌株QM6a、QM9414和Rut-c30的進化程度不同，這個結(jié)論顯而易見，這就可能會使得其生理功能結(jié)構(gòu)構(gòu)成上有一些細微的差別，這有可能是這三種菌株型HAX1長度不同的原因之一[30]。4展望近年來,日益廣泛的系統(tǒng)生物學(xué)的方法(基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)代謝工具)揭示植物真菌誘導(dǎo)信號應(yīng)該感對纖維素和纖維素酶的巨大推進作用,根據(jù)纖維素酶的轉(zhuǎn)錄和調(diào)整者的研究的進展,但纖維素酶誘導(dǎo)機制、信號傳遞途徑等過程的分子基礎(chǔ)也不明的分剩下公告。同時，基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組和蛋白質(zhì)組等的大量數(shù)據(jù)提供了更詳細的關(guān)聯(lián)。纖維素酶誘導(dǎo)控制的生物化學(xué)路徑和控制信息。這種整合不僅有助于進一步揭示纖維素酶產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)，還為科研人員提供更多改造的靶點和通道，促進纖維素酶的高效生產(chǎn)，推動生物質(zhì)的有效分解。最新的人工轉(zhuǎn)錄因子證明了植物真菌產(chǎn)纖維素酶可以人工控制轉(zhuǎn)錄基因技術(shù)的應(yīng)用,可以調(diào)整整個纖維素酶的定向設(shè)計方式,有助于更深刻理解各種環(huán)境信號傳遞通道纖維素酶誘導(dǎo)的調(diào)整過程中的作用。另外，利用人工鋅指紋蛋白發(fā)現(xiàn)了新的纖維素酶基因表達控制位點，深刻認識了絲狀真菌纖維素酶基因表達控制的機制，并以此為基礎(chǔ)實現(xiàn)了纖維素酶表達控制的方向控制。未來的結(jié)合可以植物菌內(nèi)源的調(diào)整元件和人工調(diào)整元件比,設(shè)計了纖維素酶效率控制系統(tǒng)是提高纖維素酶合成和分泌的效率,結(jié)合發(fā)酵控制技術(shù),提高纖維素酶的產(chǎn)量,降低生產(chǎn)成本,促進纖維素酶是木質(zhì)纖維素原料應(yīng)用生物的東西。參考文獻 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