緒論課題背景知母有清熱除煩、清肺潤燥、滋陰降火等功效，能夠治療陰虛證REF_Ref7973\r\h[1]。現(xiàn)在有大量的人患有陰虛證，導(dǎo)致身體機(jī)能的衰退，含有知母的方劑很好的解決了這一困擾REF_Ref5532\r\h[2]。為了能更好地了解知母治療陰虛證的機(jī)制，本文從能量代謝角度進(jìn)行研究。知母治療陰虛證的認(rèn)識知母（AnemarrhenaasphodeloidesBge.）為百合科植物知母的干燥根莖。知母最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性味苦寒，無毒，質(zhì)地柔潤，具有清熱、瀉火、滋陰、潤燥等功效，屬中藥中的清熱泄火藥，常用于中藥復(fù)方中，臨床主要用于肺熱咳嗽、陰虛潮熱等的治療REF_Ref7973\r\h[1]。陰虛證是一種常見的臨床病癥，是指體內(nèi)陰液虧虛而無法制陽，以及滋補(bǔ)、津潤等作用衰退所引起的一系列病理變化的虛熱證候REF_Ref14029\r\h[3]。在中醫(yī)上陰虛證主要表現(xiàn)為食欲增加、體形消瘦、口干喜飲、易躁易怒，五心煩熱等特征REF_Ref14238\r\h[4]。經(jīng)過研究表明知母的解熱機(jī)制與能量代謝中Na+-K+-ATP酶有一定關(guān)系，從知母中提取的知母皂苷元是一種Na+-K+-ATP酶抑制劑，崔淑蘭等人對熱證大鼠的研究也表明知母解熱作用的發(fā)揮與能量代謝密切相關(guān)REF_Ref14708\r\h[5]REF_Ref14675\r\h[6]。因此本研究從能量代謝角度研究知母對陰虛證發(fā)揮的清熱作用。中醫(yī)陰虛證模型的認(rèn)識隨著現(xiàn)代的研究，陰虛證的造模方法分為兩大類，中醫(yī)理論陰虛證模型和西醫(yī)理論陰虛證模型。以中醫(yī)理論為指導(dǎo)的造模方法，如溫燥性中藥造模、形勞傷陰造模、利水傷陰造模等造模方法更符合陰虛證的臨床表現(xiàn)，但存在造模不穩(wěn)定的問題。以西醫(yī)理論為指導(dǎo)的造模方法如甲狀腺激素類造模、腎上腺皮質(zhì)激素類造模等造模方法所用時間短，造模穩(wěn)定，符合本實(shí)驗(yàn)要求，所以本實(shí)驗(yàn)用西醫(yī)理論指導(dǎo)下的甲狀腺素造模REF_Ref15005\r\h[7]?，F(xiàn)在的陰虛證模型也多采用甲狀腺素造模（甲亢模型），甲亢模型能夠使動物出現(xiàn)體重減輕、飲水增多、躁動不安、皮毛不光澤等現(xiàn)象REF_Ref15358\r\h[8]，與陰虛證的臨床表現(xiàn)相似。韓麗華，劉婷等人對小鼠的研究也充分證實(shí)了這一點(diǎn)REF_Ref15707\r\h[9]REF_Ref15710\r\h[10]。因此本實(shí)驗(yàn)以甲亢為模型進(jìn)行藥物對陰虛證的作用研究。能量代謝的研究進(jìn)展生物體的能量代謝是生物體內(nèi)物質(zhì)代謝的最基本形式，生物體內(nèi)物質(zhì)代謝過程中的能量釋放、轉(zhuǎn)移和利用稱為能量代謝REF_Ref15949\r\h[11]。在正常狀態(tài)下，能量轉(zhuǎn)換過程中ATP的產(chǎn)生、利用及產(chǎn)熱在調(diào)節(jié)機(jī)體寒熱方面起到了十分重要的作用。因此從生物體內(nèi)檢測Na+-K+-ATP酶活性來檢測生物體的能量代謝是目前研究的熱點(diǎn)之一REF_Ref16141\r\h[12]。甲狀腺的主要功能是合成甲狀腺激素，維持生物體代謝。甲狀腺分泌T3、T4等生物活性激素，同樣也是影響機(jī)體能量代謝、調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的重要因素REF_Ref16386\r\h[13]REF_Ref16396\r\h[14]。徐珊等人對熱證大鼠的研究充分證實(shí)了用T3、T4及Na+-K+-ATP酶來測定能量代謝的可行性REF_Ref16595\r\h[15]。本實(shí)驗(yàn)從能量代謝角度研究知母對陰虛證發(fā)揮的清熱作用。立題依據(jù)目前知母的研究多為復(fù)方研究，且成分復(fù)雜，無法準(zhǔn)確的探究出知母的確切作用機(jī)制。于是人們開始對知母進(jìn)行單獨(dú)研究。本論文從能量代謝方面研究，以小鼠體重及飲水量的變化作為體征指標(biāo)，確定小鼠甲亢模型的建立；以T3濃度，T4濃度，Na+-K+-ATP酶活性的變化來檢測能量代謝，研究知母對陰虛證小鼠能量代謝的影響，此實(shí)驗(yàn)為以后知母的研究和臨床使用提供了依據(jù)。PAGE18PAGE18藥物和材料實(shí)驗(yàn)動物動物昆明小鼠，雄性數(shù)量40只體重15-25g級別SPF級購買公司遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司合格證號SCXK(遼）2015-0001實(shí)驗(yàn)藥物知母（質(zhì)量符合中國藥典，2015年）190701廣東源森泰藥業(yè)有限公司甲狀腺素片（40mg/片）20140401上海長城藥業(yè)有限公司六味地黃丸（濃縮丸）140548.河南省宛西制藥股份有限公司主要試劑、化學(xué)品生理鹽水20180106石家莊四藥有限公司Na+-K+-ATP酶試劑盒20160505博士得生物技術(shù)有限公司三碘甲狀腺原氨酸（T3）試劑盒20091119上海潤裕生物科技有限公司甲狀腺素（T4）試劑盒20091119上海江萊生物科技有限公司6.7mg/ml戊巴比妥20190111中心醫(yī)院提供主要儀器和設(shè)備5毫升注射器20180628圣光醫(yī)用制品股份有限公司5ml真空采血管20160809山東省成武縣華博醫(yī)療器械有限責(zé)任公司1.5ml離心管20190311比克曼生物一次性靜脈采血針20170413山東省成武縣醫(yī)用制品廠500ml容量瓶PA-500江蘇華鷗玻璃有限公司可見分光光度計721G上海儀電分析儀器有限公司微型臺式離心機(jī)MC-12plus寧波市群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司電子天平CX-12000長協(xié)電子酶標(biāo)儀HBS-1101南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司微量移液器器及槍頭（0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、100-1000uL）WKYIII上海力辰邦西儀器科技有限公司水浴鍋HH-M4上海赫田科學(xué)儀器有限公司4℃實(shí)驗(yàn)冰柜FYL-YS-430L北京福意聯(lián)醫(yī)療設(shè)備有限公司-20℃低溫實(shí)驗(yàn)冰柜FYL-YS-128L北京福意聯(lián)醫(yī)療設(shè)備有限公司實(shí)驗(yàn)方法樣品制備知母水煎液：將知母藥材浸泡于10倍量的蒸餾水中1小時，然后煮沸1小時，用四層紗布過濾，取濾液；將藥物殘渣加入10倍量蒸餾水中，再煮沸1小時，用四層紗布過濾，取濾液。合并兩次濾液，于水浴中濃縮至濃度0.2g/ml。使用前將樣品保存在4℃冰柜中。甲狀腺懸濁液：取75片甲狀腺片，用蒸餾水洗去有色糖衣，置于研缽中研磨至粉末，將粉末移置燒杯中加入300ml蒸餾水進(jìn)行溶解，充分?jǐn)嚢?，全部溶解后，加蒸餾水定容于500ml容量瓶中，制成6mg/ml的懸濁液。使用前將樣品保存在4℃冰柜中。六味地黃丸混懸液：取400粒濃縮丸，置于研缽中研磨至粉末，將粉末移置燒杯中加入300ml蒸餾水進(jìn)行溶解，充分?jǐn)嚢?，待全部溶解后，加蒸餾水定容于500ml容量瓶中，制成0.3g/ml的懸濁液。使用前將樣品保存在4℃冰柜中。動物分組、給藥及處理表1動物處理方法Table1Animalhandlingmethods分組1~7天制造甲亢模型8~16天給藥治療備注給藥方式給藥名稱給養(yǎng)方式給藥名稱空白組灌胃生理鹽水灌胃生理鹽水1.適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，平均隨機(jī)分為四組。2.最后一次給藥（第16天）后給予禁食不禁水12小時，腹主動脈取血，進(jìn)行T3、T4、Na+-K+-ATP酶測定。模型組灌胃甲狀腺懸濁液灌胃生理鹽水對照組灌胃甲狀腺懸濁液灌胃六味地黃丸混懸液給藥組灌胃甲狀腺懸濁液灌胃知母水煎液動物飼養(yǎng)環(huán)境在本研究的整個過程中，將這些動物飼養(yǎng)在空調(diào)房（溫度22℃；相對濕度55%）中，并用標(biāo)準(zhǔn)飼料和水喂養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。符合《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》相關(guān)規(guī)定。小鼠給藥劑量計算根據(jù)體表面積，采用人鼠等效劑量比計算不同樣品的劑量。根據(jù)2015年版《中國藥典》規(guī)定，人服用知母的一日劑量為12g，而小鼠用知母的等效劑量為15.6g/kg，計算得小鼠的知母給藥量為78ml/kg。參考文獻(xiàn)及以往實(shí)驗(yàn)，可知小鼠的甲狀腺懸濁液等效劑量為30mg/kg，計算得小鼠的甲狀腺懸濁液給藥量為5ml/kg。根據(jù)六味地黃丸說明書，可知正常人一日劑量為9g，計算得小鼠的等效劑量為1.17g/kg，小鼠的六味地黃丸給藥量為3.9ml/kg。小鼠體征檢測體重：每天每只小鼠給藥前用電子天平稱量，單位（g），并記錄結(jié)果。飲水：每天每籠給予10ml水，24小時后測量每個鼠籠中剩余水量（G）ml，當(dāng)日每只小鼠的用水量為（10-G）ml。T3、T4、Na+-K+-ATP酶測定取小鼠分別腹腔注射6.7mg/ml的戊巴比妥0.01ml/g進(jìn)行麻醉。在麻醉下，暴露腹腔，然后從腹主動脈采集血液。將每只小鼠的血液分為3份，做好標(biāo)記。表2實(shí)驗(yàn)具體操作方法Table2Specificoperationmethodoftheexperiment測定方法樣品處理備注T3測定小鼠血液室溫靜置10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清液，按試劑盒說明書進(jìn)行T3測定。上清液均于-20℃保存，若保存過程中有沉淀形成，應(yīng)再次進(jìn)行離心。T4測定小鼠血液室溫靜置30分鐘后，離心5分鐘左右（800-1000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清液，按試劑盒說明書進(jìn)行T4測定。Na+-K+-ATP酶活性測定小鼠血液在4℃低溫離心20分鐘（2500轉(zhuǎn)/分）。取下層紅細(xì)胞置于3倍體積的預(yù)冷生理鹽水中，輕輕攪拌懸浮，離心，棄上清液，連續(xù)兩次，吸取洗滌后的紅細(xì)胞進(jìn)行充分溶血，30分鐘后按試劑盒說明書進(jìn)行Na+-K+-ATP酶活性測定。溶血后的紅細(xì)胞于4℃保存，若保存過程中有沉淀形成，應(yīng)再次進(jìn)行離心。數(shù)據(jù)分析表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理Table3experimentaldataprocessing取樣第1、4、7、10、13、16天實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS17.0數(shù)據(jù)處理均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示計量資料有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.05實(shí)驗(yàn)結(jié)果小鼠體征檢測結(jié)果小鼠體重結(jié)果如表4和REF_Ref5354127\h圖1所示，模型組與空白組相比，小鼠體重降低（P<0.05）；對照組、給藥組與模型組相比，小鼠體重均明顯增加（P<0.05）。表4知母水煎液對小鼠體重的影響（±S，g，n=10）Table4Effectofanemarrhenaasphodeloidesdecoctiononbodyweightofmice(±S，g，n=10)組別1d4d7d10d13d16d空白組20.25±0.9621.64±0.7322.83±0.8824.77±0.9025.13±1.1426.90±1.32模型組20.00±0.9221.45±0.9022.58±0.9422.91±1.12**23.47±1.22**23.24±1.55**對照組20.26±0.9121.48±0.9922.56±0.1724.30±0.70^24.48±1.54^25.40±1.28^給藥組20.10±0.9321.02±1.0722.64±0.9524.08±0.99^24.40±1.53^25.34±1.56^注：與空白組相比，**P<0.05；與模型組相比^P<0.05。圖1知母水煎液對小鼠體重的影響（±S，g，n=10）Figure1EffectofAnemarrhenaasphodeloidesDecoctiononbodyweightofmice（±S，g，n=10）注：與空白組相比，**P<0.05；與模型組相比^P<0.05。小鼠飲水量結(jié)果如表5和圖2所示，模型組與空白組相比，小鼠飲水量增加（P<0.05）；對照組、給藥組與模型組相比，小鼠飲水量均明顯降低（P<0.05）。表5知母水煎液對小鼠飲水量的影響（±S，ml/d，n=10）Table5EffectofAnemarrhenaDecoctiononwaterconsumptionofmice（±S，ml/d，n=10）組別1d4d7d10d13d16d空白組3.80±0.423.54±0.363.61±0.643.57±0.653.69±0.433.54±0.98模型組4.10±1.153.72±0.444.28±0.574.69±0.92**4.73±0.96**5.53±0.91**對照組4.12±0.813.51±0.474.23±0.554.00±0.37^3.87±0.46^3.69±0.44^給藥組4.14±1.023.69±0.384.17±0.394.20±0.79^4.15±0.62^3.80±0.52^注：與空白組相比，**P<0.05；與模型組相比^P<0.05。圖2知母水煎液對小鼠飲水量的影響Figure2EffectofAnemarrhenaDecoctiononwaterconsumptionofmice（±S，ml/d，n=10）注：與空白組相比，**P<0.05；與模型組相比^P<0.05。T3，T4，Na+-K+-ATP酶檢測結(jié)果T3濃度結(jié)果見REF_Ref5095059\h表6和REF_Ref5354164\h圖3所示，模型組與空白組相比，小鼠T3濃度增加（P<0.05）；對照組、給藥組與模型組相比，小鼠T3濃度重明顯降低（P<0.05）。表6知母水煎液對T3的影響（±S，nmol/l，n=10）Table6EffectofAnemarrhenaDecoctiononT3（±S，nmol/l，n=10）組別T3濃度空白組0.64±0.10模型組0.76±0.08**對照組0.67±0.05^給藥組0.69±0.10^注：與空白組相比，**P<0.05；與模型組相比，^P<0.05。圖3知母水煎液對T3的影響（±S，nmol/l，n=10）Table3EffectofAnemarrhenaDecoctiononT4（±S，nmol/l，n=10）注：A：空白組；B：模型組；C：對照組；D：給藥組；與空白組相比，**P<0.05；與模型組相比，^P<0.05。T4濃度結(jié)果見REF_Ref5095059\h表7和REF_Ref5354164\h圖4所示，模型組與空白組相比，小鼠T4濃度增加（P<0.05）；對照組、給藥組與模型組相比，小鼠T4濃度重明顯降低（P<0.05）。表7知母水煎液對T4的影響（±S，nmol/l，n=10）Table7EffectofAnemarrhenaDecoctiononT4（±S，nmol/l，n=10）組別T4濃度空白組40.80±5.64模型組45.56±4.52**對照組40.76±5.27^給藥組41.37±4.96^注：與空白組相比，**P<0.05；與模型組相比，^P<0.05。圖4知母水煎液對T4的影響（±S，nmol/l，n=10）Table4EffectofAnemarrhenaDecoctiononT4（±S，nmol/l，n=10）注：A：空白組；B：知母組；C：對照組；D：給藥組；與空白組相比，**P<0.05；與模型組相比，^P<0.05。Na+-K+-ATP酶活性結(jié)果見REF_Ref5095059\h表8和REF_Ref5354164\h圖5所示，模型組與空白組相比，小鼠Na+-K+-ATP酶活性增加（P<0.05），對照組、給藥組與模型組相比，小鼠Na+-K+-ATP酶活性降低（P<0.05）。表8知母水煎液對Na+-K+-ATP酶的影響（±S，μmolPi/gprot/hour，n=10）Table8EffectofAnemarrhenaasphodeloidesDecoctiononNa+-K+-ATPase（±S，μmolPi/gprot/hour，n=10）組別Na+-K+-ATP酶活性空白組1042±165模型組2283±236**對照組1631±173^給藥組1698±235^注：與空白組相比，**P<0.05；與模型組相比，^P<0.05。圖5知母水煎液對Na+-K+-ATP酶的影響（±S，μmolPi/gprot/hour，n=10）Table5EffectofAnemarrhenaasphodeloidesDecoctiononNa+-K+-ATPase（±S，μmolPi/gprot/hour，n=10）注：A：空白組；B：模型組；C：對照組；D：給藥組；與空白組相比，**P<0.05；與模型組相比，^P<0.05。小結(jié)小鼠體征檢測結(jié)果表明，模型組與空白組相比，小鼠的體重降低，飲水量增加（P<0.05）；對照組、給藥組與模型組相比，小鼠體重增加，飲水量顯著降低（P<0.05）。小鼠體T3，T4，Na+-K+-ATP酶測量結(jié)果表明，模型組與空白組相比，小鼠T3濃度、T4濃度、Na+-K+-ATP酶活性增高（P<0.05），對照組、給藥組與模型組相比，小鼠T3濃度、T4濃度、Na+-K+-ATP酶活性顯著降低（P<0.05）。PAGE18PAGE18討論在中醫(yī)學(xué)中，基于藥理作用研究藥物性質(zhì)的特點(diǎn)和規(guī)律，是探索中醫(yī)藥屬性理論的典型途徑REF_Ref18000\r\h[16]REF_Ref18359\r\h[17]。本研究采用T3、T4、Na+-K+-ATP酶測定來探討知母對機(jī)體能量代謝的影響。研究結(jié)果表明，通過灌胃服甲狀腺素的方法進(jìn)行甲亢造模，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組體重比空白組低，飲水量比正常組高，具有陰虛證的表現(xiàn)皮毛光澤度差、躁動不安、體重減輕、飲水量增多等特點(diǎn)，說明陰虛證小鼠動物模型造模成功。該甲亢造模方法是以西醫(yī)理論為基礎(chǔ)的造模方法，此造模方法是通過化學(xué)、生物、機(jī)械等現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段進(jìn)行干預(yù)，使實(shí)驗(yàn)動物致病，從而形成近似中醫(yī)陰虛證的病理傷害，使造模成功。以西醫(yī)理論為指導(dǎo)的造模方法具有操作過程易掌握、成功率高、效果明顯、數(shù)據(jù)客觀、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最為廣泛的一種造模方法。但中醫(yī)證候與西醫(yī)臨床診斷存在一定的差異，動物模型采用西醫(yī)理論建模方法，理論上脫離中醫(yī)理論，不符合臨床實(shí)際，且條件不容易控制，容易造成不必要的麻煩，此外，藥物造模與人類自身的狀態(tài)也存在差異。因此甲亢動物造模方法對于中醫(yī)證候方面的實(shí)驗(yàn)研究只能進(jìn)行單一的模仿，具有一定的局限性。因此如何根據(jù)臨床實(shí)際進(jìn)行動物造模，是今后研究的重要方向。研究結(jié)果表明，知母水煎液能降低陰虛證小鼠的T3濃度、T4濃度、Na+-K+-ATP酶活性。說明知母水煎液能降低陰虛證小鼠能量代謝，并且知母能通過降低能量代謝來發(fā)揮清熱作用。知母的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，含有多種同分異構(gòu)體，很難確定藥物的作用機(jī)制，因此，對于知母清熱作用的探索在今后還有很長一段路。本實(shí)驗(yàn)采用的是T3，T4，Na+-K+-ATP酶檢測方法，此方法靈敏，特異，簡便易行，用量少。但是要求實(shí)驗(yàn)過程精確，而且會存在交叉反應(yīng)，樣品處理不迅速等因素，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。而且還有其它的檢測能量代謝的方法，本實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)不夠豐富，這些都是現(xiàn)在存在的問題，因此尋找更好的實(shí)驗(yàn)方法也是我們今后研究的方向。本研究為知母治療陰虛證的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。結(jié)論綜上所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組T3濃度，T4濃度，Na+-K+-ATP酶活性比空白組高；對照組、給藥組T3濃度、T4濃度、Na+-K+-ATP酶活性比模型組低，說明知母水煎液能降低陰虛證小鼠的T3濃度、T4濃度、Na+-K+-ATP酶活性。所以知母水煎液能夠降低陰虛證小鼠的能量代謝，且知母能通過降低能量代謝來發(fā)揮清熱作用。參考文獻(xiàn)許靜.知母的效用與臨床應(yīng)用分析[J].上海中醫(yī)藥雜志,2014,48(1):67.翁敏芬.一種治療肝腎陰虛證型狐惑病的中藥:CN201610538619.7[P].2016-10-26.趙春草,吳飛,張繼全,等.知母的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國新藥與臨床雜志,2015,34(12):898-902.DOI:10.14109/ki.xyylc.2015.12.002.賀玉偉,柴程芝,寇俊萍,戚進(jìn),余伯陽.甲狀腺素誘導(dǎo)小鼠模型表觀指征變化與陰虛火旺證的相關(guān)性研究[J].實(shí)驗(yàn)動物科學(xué),2013,30(02):1-6+10.楊麗蓉.知母的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)(中醫(yī)中藥分冊),2002(04):207-210.崔淑蘭.大鼠虛熱證模型的建立、評價及知母對虛熱證大鼠影響的研究[D].山東中醫(yī)藥大學(xué),2012.姜麗芳,賀偉平,李少華,廖品東.陰虛證動物模型的造模方法與思路評述[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2009,33(01):15-18.賀玉偉,柴程芝,寇俊萍,戚進(jìn),余伯陽.甲狀腺素誘導(dǎo)小鼠模型表觀指征變化與陰虛火旺證的相關(guān)性研究[J].實(shí)驗(yàn)動物科學(xué),2013,30(02):1-6+10.韓麗華,王振濤,申洪超,陳舒茵,黎瑞汝,梁生旺,張會超.律復(fù)康膠囊對甲狀腺素誘導(dǎo)陰虛證小鼠模型的作用[J].中醫(yī)研究,2010,23(02):23-25.劉婷.因?qū)幤瑢谞钕偎卣T導(dǎo)的甲亢陰虛型動物的藥效學(xué)研究[D].南方醫(yī)科大學(xué),2009.崔淑蘭,趙儉,王永剛,王世軍.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