ICS65.020.30B43DB12Determinationoftotalcoliforms,fecalcoliformsandEscheri天津市市場監(jiān)督管理委員會發(fā)布1DB12/T956—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所、軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：趙潤、李辰宇、王景峰、張克強(qiáng)、諶志強(qiáng)、杜連柱、梁雨。DB12/T956—20202奶牛場糞污中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了基于酶底物法測定規(guī)?；膛黾S污中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的技術(shù)要求及操作方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于規(guī)?；膛黾S污中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的同時測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682—2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27522—2011畜禽養(yǎng)殖污水采樣技術(shù)規(guī)范HJ1001—2018水質(zhì)總大腸菌群，糞大腸菌群和大腸埃希氏菌測定酶底物法3術(shù)語和定義HJ1001—2018界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件，為了方便使用，以下重復(fù)列出了HJ1001—2018中的某些術(shù)語和定義。3.1總大腸菌群和糞大腸菌群totalcoliformsandfecalcoliforms奶牛場糞污中常見的腸桿菌科細(xì)菌，恒溫（總大腸菌群：37℃;糞大腸菌群：44.5℃)培養(yǎng)后可分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黃色鄰硝基苯酚。3.2大腸埃希氏菌EscherichiaColi俗稱大腸桿菌，恒溫37℃培養(yǎng)后既能夠分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成鄰硝基苯酚，同時可以分解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）釋放4-甲基傘形酮，在365nm紫外光源照射下顯藍(lán)色。3.3最大可能數(shù)mostprobablenumber（MPN）一種基于泊松分布的間接計數(shù)方法。根據(jù)一定體積不同稀釋度樣品經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的目標(biāo)微生物陽性數(shù)，查表估算一定體積樣品中目標(biāo)微生物存在數(shù)量。4糞污樣品采集DB12/T956—202034.1采樣物品采樣容器應(yīng)使用一次性無菌容器，或經(jīng)121℃、20min高壓滅菌處理。其余采樣工具、文具、器具、防護(hù)用品按照GB/T27522—2011中第4.1款規(guī)定執(zhí)行。4.2采樣方法按照GB/T27522—2011中第4.4.2款的規(guī)定執(zhí)行。4.3樣品保存采樣后應(yīng)在低溫（4℃)條件下保存并在6h內(nèi)完成測定。5酶底物測定5.1方法原理在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h～24h，總大腸菌群和糞大腸菌群能夠產(chǎn)生β-半乳糖苷酶并分解培養(yǎng)底物中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成鄰硝基苯酚（ONP該物質(zhì)在白光或日光照射下顯黃色。大腸埃希氏菌可以分解4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）釋放4-甲基傘形酮，在365nm紫外光源照射下顯藍(lán)色。計數(shù)97孔板中陽性單元格出現(xiàn)數(shù)量，查MPN表，分別計算樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的濃度值。5.2試劑材料5.2.1分析時應(yīng)使用符合GB/T6682—2008中三級水規(guī)定要求的實驗用水，并經(jīng)121℃、20min高壓滅菌后使用。5.2.2培養(yǎng)基宜采用HJ1001—2018中第6.1款規(guī)定的MinimalMediumONPG-MUG培養(yǎng)基。每100mL預(yù)處理后的樣品應(yīng)使用培養(yǎng)基粉末2.7g±0.5g，培養(yǎng)基可采用市售商品化培養(yǎng)基制品，成分見表1。表1培養(yǎng)基成分表54N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸鈉鹽（HEPESN-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEDB12/T956—202045.2.397孔定量盤：具有48個標(biāo)準(zhǔn)孔格，1個大孔格和48個小孔格，經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌的市售商品化成品。5.2.4標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤。5.3儀器設(shè)備5.3.1恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差37℃±1℃、44.5℃±0.5℃。5.3.2小型熨斗：用于97孔定量盤（5.2.3）的封口。5.3.3移液管：一次性無菌塑料吸管，也可采用計量合格的可調(diào)式移液器。5.3.4實驗室常用儀器設(shè)備，121℃高壓滅菌20min后備用。5.3.5紫外燈：具有365nm中心波長的光源。5.3.6電子天平：量程大于200g，精度不小于0.1g。5.4樣品前處理使用電子天平（5.3.6）準(zhǔn)確稱量樣品2g（精確到0.1g）或使用移液管（5.3.3）吸取樣品2.0mL按4.2中方法采集的糞污樣品置于盛有198mL生理鹽水的無菌勻質(zhì)袋中，手持震蕩無菌均質(zhì)袋2min，靜置觀察樣品狀態(tài)，當(dāng)樣品中含有大顆粒固體樣品時使用手指碾壓粉碎并繼續(xù)震蕩直至樣品形成懸濁液，過0.25mm尼龍篩制成10-2稀釋液。用移液管（5.3.3）吸取上述稀釋液1mL加入到99mL無菌水中，依次稀釋分別得到10-4、10-6等濃度稀釋液。5.5接種定容制備100mL樣品或稀釋樣品于現(xiàn)場采樣袋或采樣瓶中，加入2.7g培養(yǎng)基（5.2.2）粉末，震蕩均勻并靜置5min，待培養(yǎng)基混勻溶解后，將樣品均勻倒入97孔定量盤（5.2.3）內(nèi)（保證每個孔內(nèi)充滿完全密封。未培養(yǎng)前觀察孔內(nèi)顏色，若出現(xiàn)類似或深于標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤（5.2.4）的顏色時，應(yīng)觀察樣品濁度，停止實驗并重新取樣過濾制備樣品。5.6培養(yǎng)測定總大腸菌群和大腸埃希氏菌時，將接種后的97孔定量盤樣品放入恒溫培養(yǎng)箱（5.3.1）中37℃±0.5℃下培養(yǎng)18h后進(jìn)行判讀，當(dāng)97孔定量盤中孔格顏色弱于標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤（5.2.4）時，應(yīng)進(jìn)一步延長培養(yǎng)時間至24h再進(jìn)行判讀。測定糞大腸菌群時，將接種后的97孔定量盤放入的恒溫培養(yǎng)箱（5.3.1）中44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)18h后進(jìn)行判讀，當(dāng)97孔定量盤中孔格顏色弱于標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤（5.2.4）時，應(yīng)進(jìn)一步延長培養(yǎng)時間至24h再進(jìn)行判讀。5.7結(jié)果分析5.7.1結(jié)果判讀與計數(shù)接種培養(yǎng)后的97孔定量盤在日光或白色光源照射下呈黃色即為總大腸菌群或糞大腸菌群陽性；在紫外燈（5.3.5）照射下呈藍(lán)色即為大腸埃希氏菌陽性。分別記錄97孔定量盤中大孔和小孔的陽性孔數(shù)量。5.7.2結(jié)果計算從97孔定量盤法MPN表（見附錄A）中查得每100mL樣品MPN值后，再根據(jù)樣品不同的稀釋度，按照公式（1）換算樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)或大腸埃希氏菌濃度（MPN/L）：DB12/T956—20205C=(MPN×1000)/f……………(1)C——樣品濃度，MPN/L；MPN值——查得每100mL樣品MPN值，MPN/100mL；1000——單位轉(zhuǎn)換因子（由MPN/mL轉(zhuǎn)換為MPN/L）；F——最大接種量，mL；測定結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，結(jié)果大于等于100時以科學(xué)計數(shù)法表示；若97孔均為陰性，報告目標(biāo)微生物未檢出。5.7.3檢出限本方法的檢出限為10MPN/