導(dǎo)論1.1胚胎干細(xì)胞系的建立胚胎干細(xì)胞（Embryonicstemcell，ESC）是囊胚時(shí)期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞（Innercellmass,ICM）在體外適當(dāng)條件培養(yǎng)而獲得的多能干細(xì)胞，具有無限自我更新和分化成體內(nèi)各種細(xì)胞類型的潛能。1981年，Evans和Kaufman等人首次通過體外培養(yǎng)技術(shù)，從小鼠囊胚中獲得可以在體外長期培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞系（mouseESC,mESC）REF_Ref20492\r\h[1]。1998年，Thomason等首次從人類胚胎中獲得人胚胎干細(xì)胞系（humanESC,hESC）REF_Ref14437\r\h[2]。2006年，Yamanaka等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Oct4（Octamer-bindingtranscriptionfactor4）、Sox2（SexdeterminingregionY-box2）、Nanog和Klf4（Kruppel-likefactor4）能夠?qū)⒊审w細(xì)胞重編程為類似胚胎干細(xì)胞的狀態(tài)，即誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Inducedpluripotentstemcell，iPSC），iPSC具有ESC的特性，包括自我更新能力、多能性和分化能力REF_Ref27471\r\h[3]。iPSC的發(fā)現(xiàn)解決了ESC來源的倫理限制問題，具有十分廣泛的應(yīng)用前景。ESC所具有的特性使其不僅在組織修復(fù)與再生醫(yī)學(xué)等方面具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，并且為研究發(fā)育過程與細(xì)胞命運(yùn)決定、人類疾病建模與疾病發(fā)生機(jī)制等方面提供了強(qiáng)大的工具REF_Ref2303\r\h[4]。1.2胚胎干細(xì)胞的多能性調(diào)控ESC的多能性使其具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，了解ESC多能性的維持及調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要。ESC的多能性由轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)維持，并受到特定信號通路的影響REF_Ref26224\r\h[5]。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，多能性狀態(tài)的維持依賴于多能性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Pluripotencygeneregulatorynetwork，PGRN）。Oct4是維持多能性必需的轉(zhuǎn)錄因子。胚胎發(fā)育過程中，Oct4在受精卵到桑葚胚階段的細(xì)胞中均有表達(dá)，隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)程，Oct4在所有分化成熟的組織中均不表達(dá)，僅在仍具有多能性的細(xì)胞中維持表達(dá)REF_Ref30192\r\h[6]。Oct4的不同表達(dá)水平影響ESC的分化，Oct4表達(dá)水平高于正常水平的2倍時(shí)，ESC向中內(nèi)胚層分化；Oct4表達(dá)水平低于正常水平的1/2時(shí)，ESC向滋養(yǎng)外胚層分化REF_Ref31929\r\h[7]。Sox2也是維持多能性的重要轉(zhuǎn)錄因子，Sox2的表達(dá)始于胚胎的ICM，隨著胚胎的發(fā)育，廣泛分布于上胚層、神經(jīng)組織和胚外外胚層。Sox2可與Oct4協(xié)同調(diào)控Nanog、Fgf4（Fibroblastgrowthfactor4）、Fbx15（F-Boxprotein15）及其自身等多能性調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)REF_Ref4115\r\h[8]。Nanog在胚胎發(fā)育的早期階段至關(guān)重要，Nanog在ICM中表達(dá)較高，調(diào)控ICM向上胚層的發(fā)育過程，且在已經(jīng)分化的細(xì)胞中不表達(dá)REF_Ref8752\r\h[9]。Nanog基因敲除后的mESC喪失多能性并向原內(nèi)胚層方向分化。過表達(dá)Nanog的ESC在不存在白血病抑制因子（Leukemiainhibitoryfactor,LIF）的條件下仍可保持正常形態(tài)。Oct4、Sox2、Nanog協(xié)同促進(jìn)維持多能性相關(guān)基因的表達(dá)，抑制分化譜系特異性基因的表達(dá)，共同維持ESC的多能性。除核心轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Nanog之外，研究發(fā)現(xiàn)存在其他轉(zhuǎn)錄因子如Klf4，Tbx3（T-boxtranscriptionfactor3）和Esrrb（Estrogen-relatedreceptorbeta）等共同維持ESC的多能性REF_Ref12717\r\h[10]。圖1.1胚胎干細(xì)胞多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子REF_Ref29399\r\h[11]Fig.1.1ESCpluripotency-relatedtranscriptionfactors信號通路在ESC多能性的維持方面也發(fā)揮著重要作用。LIF是維持體外培養(yǎng)mESC多能性的重要因子，在缺乏LIF的條件下，ESC會迅速向內(nèi)胚層方向分化。研究發(fā)現(xiàn)，LIF會通過激活Jak/Stat3REF_Ref26580\r\h[12]、PI3K/AktREF_Ref18181\r\h[13]和Shp2/MAPK信號通路REF_Ref18201\r\h[14]參與調(diào)控下游多能性相關(guān)基因的表達(dá)。LIF結(jié)合細(xì)胞膜上LIF受體（Leukemiainhibitoryfactorreceptor，LIFR）與gp130（Glycoprotein130）形成的異源二聚體復(fù)合物，通過轉(zhuǎn)磷酸激活Jak（Januskinase），激活的Jak磷酸化gp130特定的酪氨酸殘基使其創(chuàng)建一個對接位點(diǎn)，進(jìn)而磷酸化被招募來的Stat3（Signaltransducerandactivatoroftranscription3），磷酸化的Stat3二聚化并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)REF_Ref17453\r\h[15]。Stat3可與Nanog、Oct4協(xié)同調(diào)控c-Myc（Cellular-myelocytomatosisviraloncogene）、Klf4、Esrrb等多能性相關(guān)基因的表達(dá)。除Stat3外，Jak還可以激活被招募的PI3K（Phosphoinositide3-kinase），進(jìn)而激活蛋白激酶B（ProteinkinaseB,PKB，又稱Akt）REF_Ref24494\r\h[16]，Akt轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，通過其下游蛋白Gsk3b（Glycogensynthasekinase3beta）促進(jìn)Nanog與c-Myc的表達(dá)，進(jìn)而參與ESC多能性的調(diào)控REF_Ref24523\r\h[17]。LIF還可以通過Jak磷酸化Shp2（Srchomology2-containingproteintyrosinephosphatase2），Shp2通過結(jié)合Grb2（Growth

factorreceptor-boundprotein

2）-Sos（Sonofsevenless）復(fù)合物激活MAPK信號通路，調(diào)節(jié)ESC的自我更新與分化REF_Ref27753\r\h[18]。Erk/MAPK信號通路主要由絲裂原活化蛋白激酶激酶（Mitogen-activatedproteinkinase/Extracellularsignal-regulatedkinase，MAPK）和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellularsignal-regulatedkinase，Erk）組成，參與調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、分化和存活等多種生物學(xué)過程。Erk/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)通路的作用機(jī)制為：細(xì)胞因子等刺激因子通過結(jié)合酪氨酸激酶受體（Receptortyrosinekinase，RTK）、G蛋白偶聯(lián)受體（Gprotein-coupledreceptors，GPCR）或細(xì)胞外基質(zhì)受體等細(xì)胞膜上的受體進(jìn)而通過磷酸化激活下游的Ras蛋白，激活的Ras蛋白進(jìn)一步使MAPK磷酸化激活，激活的MAPK進(jìn)一步磷酸化并激活Erk，激活的Erk進(jìn)入細(xì)胞核，與下游轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控下游基因的表達(dá)REF_Ref9976\r\h[19]。Erk/MAPK信號通路通過磷酸化多能性因子參與ESC多能性的維持REF_Ref2981\r\h[20]，研究發(fā)現(xiàn)，在mESC中，加入MAPK抑制劑可促進(jìn)ESC的自我更新和多能性REF_Ref31206\r\h[21]。敲除Erk的mESC中多能性關(guān)鍵因子Nanog、Oct4、Sox2的表達(dá)水平顯著下調(diào)，不利于多能性的維持REF_Ref28589\r\h[22]。然而，Erk調(diào)控ESC多能性的分子機(jī)制尚不完全清楚，這也是本研究的研究目的。圖1.2ESC多能性相關(guān)信號通路REF_Ref29980\r\h[23]Fig.1.2SignalingpathwaysrelatedtothemaintenanceofESCpluripotency1.3Hnrnpf簡介為了探索Erk/MAPK信號通路調(diào)節(jié)mESC多能性和自我更新能力的分子機(jī)制，實(shí)驗(yàn)室前期通過免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,co-IP）結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定了與Erk2相互作用的蛋白，對Erk敲除的細(xì)胞系進(jìn)行定量磷酸化蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析鑒定了磷酸化下調(diào)的蛋白，結(jié)合這兩方面的數(shù)據(jù)找到多個Erk下游潛在的磷酸化底物，其中包括核內(nèi)不均一性核糖核蛋白F（HeterogeneousnuclearribonucleoproteinF，Hnrnpf）。圖1.3co-IP結(jié)合定量磷酸化蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析篩選Erk下游磷酸化底物的過程Fig.1.3Co-IPbindingquantitativephosphorylationproteomicmassspectrometryscreeningofphosphorylatedsubstratesdownstreamofErkco-IP結(jié)合質(zhì)譜分析過程。B.定量磷酸化蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析過程核內(nèi)不均一性核糖核蛋白（Heterogeneousnuclearribonucleoprotein，hnRNP）是一類重要的RNA結(jié)合蛋白（RNA-bindingproteins，RBP），主要位于細(xì)胞核中，通過識別靶基因轉(zhuǎn)錄本中開放閱讀框或非翻譯區(qū)的特定核苷酸序列與靶基因結(jié)合，影響結(jié)合的mRNA的選擇性剪接、轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)定位，改變其功能，從而參與干細(xì)胞的自我更新和分化REF_Ref26691\r\h[24]。Hnrnpf是hnRNP家族的成員，可以通過與前體mRNA和成熟mRNA上的特定序列結(jié)合，參與其加工、運(yùn)輸和穩(wěn)定性調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，敲除Hnrnpf的小鼠胚胎會發(fā)生胚胎致死REF_Ref334\r\h[25]，這表明Hnrnpf在胚胎發(fā)育中起著重要作用。在ESC中的研究發(fā)現(xiàn)，Hnrnpf可以通過調(diào)控Tcf3的剪接來調(diào)節(jié)hESC多能性REF_Ref24018\r\h[26]。hnRNPs的磷酸化可以調(diào)節(jié)其與mRNA的結(jié)合親和性、交互作用以及細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)間的轉(zhuǎn)運(yùn)等過程。目前研究發(fā)現(xiàn)，Erk/MAPK信號通路可以激活hnRNPA0REF_Ref30840\r\h[27]、hnRNPKREF_Ref30314\r\h[28]、hnRNPLL等hnRNPs磷酸化，但是關(guān)于Erk是否可以磷酸化Hnrnpf并不清楚。1.4研究內(nèi)容及意義ESC因其具有無限自我更新能力和多能性，在發(fā)育生物學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、組織修復(fù)等方面有巨大的應(yīng)用前景。因此，研究ESC多能性維持的分子機(jī)制具有重要的研究價(jià)值。本研究目的為驗(yàn)證激酶Erk對Hnrnpf的磷酸化作用，為實(shí)驗(yàn)室前期的數(shù)據(jù)提供實(shí)驗(yàn)支持，并為進(jìn)一步探究Erk通過Hnrnpf調(diào)節(jié)mESC多能性和自我更新能力的具體分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。研究Erk對Hnrnpf的磷酸化作用，有助于探索Erk/MAPK信號通路通過Hnrnpf調(diào)控ESC多能性的潛在信號通路，完善多能性維持的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

正文2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)儀器表2.1主要實(shí)驗(yàn)儀器及來源Table2.1Mainexperimentalinstrumentsandtheirsources儀器名稱來源移液器2μL/20μL/200μL/1000μLGilson電動移液器JENCONS純水儀Millipore渦旋儀VortexPCR儀博日核酸電泳儀北京六一凝膠成像系統(tǒng)Bio-Rad臺式離心機(jī)Eppendorf超凈工作臺Esco恒溫水浴鍋Hualida金屬浴GL-150BNanoDrop-2000Thermo制冰機(jī)Manitowoc電子天平Sartorius分析天平SartoriuspH計(jì)Sartorius高壓蒸汽滅菌鍋HIRAYAMA冰箱4/-20/-80℃海爾/ThermoFisher恒溫培養(yǎng)箱天津電爐臺式溫控?fù)u床Zhiheng分光光度計(jì)Eppendorf低溫離心機(jī)Thermo立式高速冷凍離心機(jī)Beckman超聲破碎儀Misonix微波爐西門子水平旋轉(zhuǎn)儀SCILOGEX蛋白電泳儀Tanon轉(zhuǎn)膜裝置Tanon封膜機(jī)青葉WesternBlotting曝光儀Tanon電熱鼓風(fēng)干燥箱上海博迅液氮罐東亞2.1.2實(shí)驗(yàn)耗材表2.2主要實(shí)驗(yàn)耗材及來源Table2.2Mainexperimentalconsumablesandtheirsources耗材名稱來源普通吸頭10μL/200μL/1000μLAxygen1.5mL/2mLEP管AxygenPCR管Axygen15mL/50mL離心管Nest10mL/50mL移液管NestPVDF膜Millipore密封膜AxygenStarSpinFastCellRNAKitGenStarEasyPure?

PCRPurificationKitTransGeneEasyPure?QuickGelExtractionKitTransGeneEasyPure?

PCRPurificationKitTransGene0.45μm濾膜Millipore0.45μm過濾針頭Millipore2.1.3實(shí)驗(yàn)試劑及配制方法表2.3實(shí)驗(yàn)所用主要試劑及來源Table2.3Mainreagentsusedintheexperimentandtheirsources試劑名稱來源胰蛋白胨OXOID酵母提取物OXOID氯化鈉（NaCl）Sigma瓊脂粉Solarbio三羥甲基氨基甲烷（Tris）Solarbio甘氨酸（Glycine）Solarbio十二烷基磺酸鈉（SDS）BBI過硫酸銨（APS）Sigma四甲基乙二胺（TEMED）Sigma甘油生工鹽酸（HCl）化學(xué)試劑公司磷酸氫二鈉（Na2HPO4）Sigma氯化鉀（KCl）Sigma磷酸二氫鈉（KH2PO4）Sigma蛋白酶抑制劑（PI）Roche苯甲基磺酰氯（PMSF）RocheTween-20Sigma2-巰基乙醇Sigma胰蛋白酶Gibco5×SDSSampleBufferGenStarStarRuler彩色預(yù)染蛋白Marker（10-250kDa）GenstarStarScriptIII一管化去基因組反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液GenstarStarMarkerD8000Genstar高保真（HF）限制性內(nèi)切酶NEB

rCutSmart緩沖液NEBT4DNA連接酶全式金FastPfuDNA聚合酶全式金牛血清白蛋白（BSA）SigmaAnti-ThiophosphateesterAbcamLB培養(yǎng)液表2.4LB培養(yǎng)液（1L）Table2.4Luria-Bertaniliquidmedium(1L)試劑名稱用量胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10gddH2O定容至1L121℃、100kPa高溫高壓滅菌20min，保存于4℃冰箱。LB固體培養(yǎng)基表2.5LB固體培養(yǎng)基（1L）Table2.5Luria-Bertanisolidmedium(1L)試劑名稱用量胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g瓊脂粉15gddH2O定容至1L121℃、100kPa高溫高壓滅菌20min，冷卻至45℃左右倒入培養(yǎng)皿，凝固后保存于4℃冰箱。裂解液表2.6裂解液Table2.6LysisBuffer成分用量1MTris-HCl（pH8.0）100μL14.3M2-巰基乙醇3.3μLLysozyme（10mg/mL）100μLPMSF10μLddH2O4.8mL50×TAEBuffer表2.750×TAEBuffer（1L）Table2.750×TAEBuffer(1L)試劑名稱用量Tris242gNa2EDTA37.2g醋酸調(diào)節(jié)pH至8.5ddH2O定容至1L5×Tris-GlycineBuffer表2.85×Tris-GlycineBuffer（1L）Table2.85×Tris-GlycineBuffer(1L)試劑名稱用量Tris15.1gGlycine94gSDS5gddH2O定容至1LTris-HCl緩沖液表2.9Tris-HCl緩沖液（1L）Table2.9Tris-HClBuffer(1L)試劑名稱1MTris-HCl緩沖液（pH8.0）1.5MTris-HCl緩沖液（pH8.8）Tris121.1g181.7g濃HCl調(diào)節(jié)pH至8.0調(diào)節(jié)pH至8.8ddH2O定容至1L定容至1L先加入約800mLddH2O，隨后加入濃HCl調(diào)節(jié)pH值，再加ddH2O定容至1L。10×TBS緩沖液表2.1010×TBS緩沖液（500mL）Table2.1010×TBSBuffer(500mL)試劑名稱用量3MNaCl250mL1MTris-HCl（pH8.0）100mLddH2O150mL10×磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferedSaline,PBS）表2.1110×PBS（1L）Table2.1110×PBS(1L)試劑名稱用量NaCl80gNa2HPO411.5gKCl2gKH2PO42gddH2O定容至1L5%脫脂牛奶封閉液表2.125%脫脂牛奶封閉液Table2.12Nonfat-DriedMilkBlockingBuffer（5%）試劑名稱用量脫脂奶粉5g1×TBSBuffer100mLTween-20200μL0考馬斯亮藍(lán)染色液表2.13考馬斯亮藍(lán)染色液（1L）Table2.13CoomassieBlueStainingSolution成分用量考馬斯亮藍(lán)R-2501g異丙醇250mL冰醋酸100mLddH2O650mL1考馬斯亮藍(lán)染色脫色液表2.14考馬斯亮藍(lán)染色脫色液（1L）Table2.14CoomassieBlueStainingDestainingSolution成分用量乙醇50mL乙酸100mLddH2O850mL2Kinasebuffer（KB）表2.1510×KBTable2.1510×KB試劑名稱用量1MHEPES（pH7.5）10mL5MKOAc25mL0.5MNaOAc5mL200mMMgOAc25mL100mMEGTA5mL1MMgCl210mLddH2O20mL表2.162×KBTable2.162×KB試劑名稱用量10×KBbuffer30μL3mg/mLdigitonin3μL30mMGTP30μL1mMATP30μL1mMATP-γ-s30μL152mg/mLPI3μL100mMPMSF3μL2.1.4菌株表2.17實(shí)驗(yàn)菌株名稱、來源及用途Table2.17Experimentalstrainname,sourceandpurpose名稱來源用途E.coilBL21(DE3)TransGene蛋白表達(dá)E.coilTrans1-T1TransGene質(zhì)粒擴(kuò)增2.1.5質(zhì)粒及引物本實(shí)驗(yàn)使用的載體為原核表達(dá)載體pGEX-6P-1，通過將目的基因序列插入載體構(gòu)建相應(yīng)原核表達(dá)質(zhì)粒。表2.18引物序列表Table2.18Primersequencelist引物名稱引物序列Hnrnpf-FCGGGATCCATGATGCTGGGCCCTGAGGGAGGTHnrnpf-RATTTGCGGCCGCCTAATCATATCCGCCCATGCTGTTCTG2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1分子克隆獲得目的基因片段（1）RNA提取收集細(xì)胞。使用StarSpinFastCellRNAKit提取RNA。使用Nanodrop2000測定濃度后，保存于-80℃冰箱。（2）反轉(zhuǎn)錄按照表2.19配制反應(yīng)體系，以20μL體系為例。表2.19反轉(zhuǎn)錄體系Table2.19Reversetranscriptionsystem成分用量RNA模板1μgStarScriptIIIAll-in-oneRTMix1μL5×StarScriptIIIAll-in-oneRTBuffer4μLNuclease-freeWater補(bǔ)齊至20μL依據(jù)表2.20設(shè)置反應(yīng)時(shí)間與溫度。表2.20反應(yīng)條件Table2.20Reversetranscriptionreactionconditions溫度時(shí)間37℃2min50℃15min85℃2min反應(yīng)得到的cDNA保存于-20℃冰箱。（3）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）擴(kuò)增目的片段PCR反應(yīng)體系依據(jù)表2.21將各成分加入PCR管內(nèi)，以50μL體系為例。表2.21PCR反應(yīng)體系（50μL）Table2.21PCRreactionsystem(50μL)成分用量模板10-30ng10μM正向引物1μL10μM反向引物1μL5×TransStart?FastPfuBuffer10μL2.5mMdNTP4μLTransStart?FastPfuDNAPolymerase1μLddH2O補(bǔ)齊至50μLPCR反應(yīng)程序依據(jù)表2.22設(shè)置PCR反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR。表2.22PCR反應(yīng)程序Table2.22PCRreactionprogram循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間1cycle95℃10min30~35cycles95℃30sTm-5℃30s72℃4kb/min1cycle72℃10min退火溫度根據(jù)引物Tm值決定；延伸時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增片段長度，依據(jù)TransStart?FastPfuDNA聚合酶的擴(kuò)增效率4kb/min決定。（4）瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠的配制以1%的瓊脂糖凝膠為例：稱取0.6g瓊脂糖溶于60mL1×TAE溶液，加熱至瓊脂糖完全溶解，稍微冷卻后加入6μL核酸染料，搖勻后倒入制膠板中。電泳將完全凝固的瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移至加滿1×TAE溶液的電泳槽中，加入樣品，90V、最大電流恒壓電泳30min。凝膠成像觀察與PCR產(chǎn)物回收使用凝膠成像系統(tǒng)對電泳完成的凝膠進(jìn)行觀察，若條帶單一，則通過EasyPure?

PCRPurificationKit進(jìn)行回收；若有多條條帶，則切取目的條帶，通過EasyPure?QuickGelExtractionKit進(jìn)行回收?；厥蘸笫褂肗anodrop2000測定產(chǎn)物濃度。目的基因片段與載體酶切（1）酶切按照表2.23體系加入各組分，于37℃酶切1h。表2.23酶切體系（50μL）Table2.23Digestion?System(50μL)成分含量DNA1μg10×rCutSmart5μL限制性核酸內(nèi)切酶12μL限制性核酸內(nèi)切酶22μLddH2O補(bǔ)齊至50μL（2）瓊脂糖凝膠電泳將載體的酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶驗(yàn)證是否切開。（3）純化酶切后的目的片段使用EasyPure?

PCRPurificationKit進(jìn)行純化，酶切后的載體使用EasyPure?QuickGelExtractionKit進(jìn)行純化。純化后使用Nanodrop2000測定濃度。連接本實(shí)驗(yàn)使用T4DNA連接酶，按照表2.24體系加入各組分，16℃過夜連接。表2.24連接體系Table2.24Ligationsystem成分用量載體與目的基因片段摩爾比1：310×T4DNALigaseBuffer1μLT4DNALigase1μLddH2O補(bǔ)齊至10μL轉(zhuǎn)化（1）從-80℃冰箱中取出分裝好的50μLTrans1-T1感受態(tài)，于冰上解凍后，加入5μL連接產(chǎn)物，冰浴30min。同時(shí)打開水浴鍋并設(shè)置溫度為42℃。（2）水浴熱激1min，隨后迅速冰浴3min。（3）加入500μL無抗LB培養(yǎng)液，37℃搖床培養(yǎng)1h。（4）4000rpm離心3min。（5）保留100μL上清液重懸菌體沉淀，涂布于對應(yīng)抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃恒溫倒置培養(yǎng)過夜。質(zhì)粒提取、鑒定與保存（1）質(zhì)粒提取挑取轉(zhuǎn)化陽性的單克隆至3mL對應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃條件下過夜培養(yǎng)，隨后使用EasyPure?PlasmidMiniPrepKit提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒使用Nanodrop2000測濃度后，于-20℃條件下保存。（2）質(zhì)粒鑒定酶切驗(yàn)證對提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，按照表2.25加入體系后，37℃酶切30?min。表2.25酶切體系（10μL）Table2.25Digestive?System(10μL)成分含量質(zhì)粒0.1μg10×rCutSmart1μL限制性核酸內(nèi)切酶10.2μL限制性核酸內(nèi)切酶20.2μLddH2O補(bǔ)齊至10μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后觀察條帶。若出現(xiàn)與插入片段和載體大小相同的條帶，則初步認(rèn)為質(zhì)粒構(gòu)建成功。測序取8-10μL提取的質(zhì)粒加入至PCR管中，與10μL通用引物一起送至公司測序，測序結(jié)果與插入片段進(jìn)行比對成功即為質(zhì)粒構(gòu)建成功。（3）保存將測序成功的質(zhì)粒進(jìn)行快轉(zhuǎn)，挑取單克隆37℃過夜培養(yǎng)，第二天吸取500μL菌液與500μL70%甘油混勻后保存于-80℃冰箱。2.2.2目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)小規(guī)模蛋白誘導(dǎo)表達(dá)（1）蛋白誘導(dǎo)表達(dá)挑取單克隆或吸取200μL菌液至6mL對應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃條件下過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接240μL菌液至6mL抗性的LB培養(yǎng)液中，共3管，37℃搖床培養(yǎng)，每隔兩小時(shí)吸取1mL菌液加入比色皿，使用紫外分光光度計(jì)檢測OD值。培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8。一管作為對照組，37℃搖床培養(yǎng)8h取樣1mL菌液作為對照；其余兩管中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）（終濃度為500μM），分別置于16℃與37℃搖床培養(yǎng)，于誘導(dǎo)4h、8h和過夜三個時(shí)間點(diǎn)取樣1mL菌液，所得樣品12000g離心1min，棄上清，沉淀保存于-80℃冰箱。（2）純化樣品向上一步所得沉淀中加入100μL裂解液，冰上放置30min。在液氮中反復(fù)凍融3次（于冰上融化）。4℃，12000g離心30min。取上清40μL，加入10μL5×SDSLoadingBuffer，100℃煮5min；吸取沉淀于新1.5mLEP管中，加入40μL10%SDS，100℃煮10min，再加入10μL5×SDSLoadingBuffer，100℃煮5min。樣品保存于-80℃冰箱中。（3）SDS電泳制膠仔細(xì)清洗蛋白膠板、背板和制膠梳子，用蒸餾水潤洗后晾干備用；組裝膠架，加入蒸餾水檢漏，一段時(shí)間后液面不下降即為不漏，倒出蒸餾水；按照表2.26配制分離膠，以1.5mm玻璃片、10%分離膠為例。表2.2610%分離膠的配方Table2.26Formulationofseparatinggel(10%)成分用量ddH2O2.85mL1.5MTris-HCl（pH8.8）1.95mL30%Acryl/BisSolution（29:1）2.55mL10%SDS75μL10%APS75μLTEMED3μL混勻之后，使用1000μL移液槍或電動移液器將其加入膠板間隙中，水封后靜置30min凝膠。待分離膠凝固后，將上層水倒出。按照表2.27配制濃縮膠，以1.5mm玻璃片、5%濃縮膠為例。表2.275%濃縮膠的配方Table2.27Formulationofstackinggel(5%)成分用量ddH2O2.1mL1.0MTris-HCl（pH6.8）375μL30%Acryl/BisSolution（29:1）495mL10%SDS30μL10%APS30μLTEMED3μL混勻后加入膠板間隙中，插入制膠梳子，室溫靜置30min凝膠。電泳將配制好的蛋白膠組裝好放入電泳槽內(nèi)，向電泳槽內(nèi)加入1×RunningBuffer，拔出制膠梳子，加入樣品。表2.281×RunningBuffer的配方Table2.28Formulationof1×RunningBuffer成分用量5×Tris-GlycineBuffer200mLddH2O800mL90V恒壓，最大電流電泳100min。（4）考馬斯亮藍(lán)染色加入考馬斯亮藍(lán)染色液至沒過凝膠，染色2h。加入考馬斯亮藍(lán)染色脫色液至沒過凝膠，脫色液變藍(lán)后更換，直至凝膠條帶清晰。（5）確定誘導(dǎo)表達(dá)條件根據(jù)考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果，選擇誘導(dǎo)表達(dá)蛋白量多且雜蛋白較少的條件作為最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。擴(kuò)大培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)挑取單克隆或甘油菌于5mL對應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng)活化菌種。將菌液按照1%的接種量接種到1L的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8。加入IPTG使其終濃度為500μM，按照蛋白小表的最佳條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。2.2.3GST標(biāo)簽蛋白上清分離純化（1）破菌將所有菌液轉(zhuǎn)移至1L離心杯中，4000rpm離心20min，棄上清。加入30mL1×PBS緩沖液（pH8.0）重懸菌體沉淀，4000rpm離心20min，棄上清。加入30mL1×PBS緩沖液（pH8.0）重懸菌體，再加入PMSF使其終濃度為1mM。使用均質(zhì)機(jī)破碎菌體。4℃、18000rpm離心40min，收集上清。（2）預(yù)清洗beads吸取100μLGlutathioneSepharose4B至1.5mLEP管，加入1mL預(yù)冷的1×PBS緩沖液，使用垂直混合儀于4℃混勻5min，4℃、5000g離心5min，棄上清。重復(fù)清洗3次。（3）孵育beads將預(yù)清洗的beads加入樣品上清中，使用垂直混合儀于4℃過夜混勻。（4）清洗beads4℃、4000rpm離心15min，棄上清；加入10mL預(yù)冷的1×PBS緩沖液重懸beads，4℃、4000rpm離心10min，棄上清。重復(fù)清洗3次。（5）洗脫蛋白將清洗完成的beads轉(zhuǎn)移至1.5mLEP管，加入1mLElutionBuffer（500mMTris-HCl,10mMGSH,pH8.0），4℃孵育1h，4℃、4000rpm離心5min，收集上清。（6）保存蛋白通過SDS電泳分析目的蛋白的純化情況。選擇純化效果最佳的樣品，加入終濃度為20%的甘油，保存于-80℃。2.2.4體外激酶反應(yīng)（1）按照表2.29中的體系加入樣品，30℃水浴反應(yīng)30min。加樣前可對蛋白純化樣品通過蛋白膠考染進(jìn)行定量，加樣時(shí)保證加入目的蛋白量相同。表2.29體外激酶反應(yīng)體系Table2.29Invitrokinasereactionsystem組成型活化激酶目的蛋白2×KBddH2O體系10.5μg15μL補(bǔ)齊至30μL體系23μg15μL補(bǔ)齊至30μL體系30.5μg3μg15μL補(bǔ)齊至30μL（2）加入1.5μL對硝基甲磺酸芐酯（p-Nitrobenzylmesylate，PNBM）使其終濃度為50mM，室溫避光反應(yīng)30min。（3）WesternblotSDS電泳：向完成反應(yīng)的蛋白樣品中加入5×SDSLoadingBuffer，100℃加熱5min。按照中SDS電泳步驟進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜將PVDF膜在甲醇中浸泡激活1min。組裝三明治轉(zhuǎn)膜裝置，從黑色面板到白色面板的放置順序依次為海綿、3層濾紙、蛋白膠、PVDF膜、3層濾紙、海綿。將轉(zhuǎn)膜裝置放入加滿轉(zhuǎn)膜buffer的轉(zhuǎn)膜槽中，加入冰盒，將轉(zhuǎn)膜槽用冰覆蓋后，90V恒壓轉(zhuǎn)膜100min。表2.30轉(zhuǎn)膜緩沖液Table2.30Transfer

Buffer成分用量5×Tris-GlycineBuffer100mL甲醇200mLddH2O700mL封閉將PVDF膜正面放置于塑料盒內(nèi)，加入適量5%脫脂牛奶，于水平旋轉(zhuǎn)儀60-80rpm室溫孵育2h?？贵w孵育一抗孵育：使用5%脫脂牛奶將一抗稀釋至合適比例，將PVDF膜使用塑封膜包裹，加入適量稀釋好的一抗后，使用封膜機(jī)進(jìn)行封口。放置于垂直混合儀4℃孵育過夜。二抗孵育：孵育完成的膜轉(zhuǎn)移至塑料盒中，加入適量的1×TBS至沒過膜，于水平旋轉(zhuǎn)儀60-80rpm室溫洗膜5min后棄1×TBS，重復(fù)三次。隨后加入1mL由5%脫脂牛奶稀釋至合適比例的二抗，用封膜機(jī)封口后，置于水平旋轉(zhuǎn)儀室溫孵育2h。發(fā)光與曝光發(fā)光加入適量的1×TBS至沒過膜，于水平旋轉(zhuǎn)儀60-80rpm室溫洗膜5min后棄1×TBS，重復(fù)6次；按照1:1的比例將化學(xué)發(fā)光液A液與B液混合于1.5mLEP管，吸取適量化學(xué)發(fā)光液加至膜的正面。曝光使用全自動化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行成像，根據(jù)條帶亮度調(diào)整曝光時(shí)間。2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2.3.1底物蛋白Hnrnpf的質(zhì)粒構(gòu)建提取小鼠ESC細(xì)胞的RNA反轉(zhuǎn)為cDNA作為PCR模板，依據(jù)保護(hù)堿基-酶切位點(diǎn)-互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物，使用TransStart?FastPfuDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因Hnrnpf的編碼序列。使用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ/NotⅠ對目的基因片段與原核表達(dá)載體pGEX-6P-1進(jìn)行雙酶切，使用T4DNA連接酶連接目的基因片段與載體構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)，使用含有氨芐青霉素的平板進(jìn)行篩選，挑取單克隆后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示pGEX-6P-1-Hnrnpf被酶切為兩個條帶，其中分子量較大片段為載體骨架，1000bp上方的條帶為目的基因，符合其理論值1245bp。將質(zhì)粒送至生物公司進(jìn)行DNA測序，顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖2.1重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2.1Identificationofrecombinantplasmidsbydoubledigestion1：pGEX-6P-1-Hnrnpf2.3.2底物蛋白Hnrnpf的蛋白純化將構(gòu)建成功的pGEX-6P-1-Hnrnpf質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coilBL21(DE3)后進(jìn)行蛋白的小規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)，通過蛋白小表的結(jié)果確定誘導(dǎo)表達(dá)的最適條件，隨后進(jìn)行大規(guī)模的誘導(dǎo)表達(dá)并對蛋白進(jìn)行純化。Hnrnpf帶有GST標(biāo)簽，其實(shí)際大小約為71kDa。Hnrnpf蛋白小表的結(jié)果如圖2.2A所示，70kDa上方存在蛋白富集，與目的蛋白大小理論值71kDa一致。結(jié)果顯示，目的蛋白在上清與沉淀中均存在富集，且在沉淀中表達(dá)量更高，但沉淀中雜蛋白占比較高，不利于目的蛋白的純化，且于沉淀中純化蛋白更易導(dǎo)致蛋白失活。在16℃誘導(dǎo)24h的條件下，目的蛋白的表達(dá)量更高且雜蛋白表達(dá)量較少，所以我們最終選擇于16℃過夜培養(yǎng)，并在上清中純化蛋白。大規(guī)模培養(yǎng)轉(zhuǎn)入pGEX-6P-1-Hnrnpf質(zhì)粒的E.coilBL21(DE3)，加入終濃度為500mM的IPTG于16℃、220rpm誘導(dǎo)24h，在上清中利用GST標(biāo)簽對蛋白進(jìn)行純化。將純化后的蛋白與不同質(zhì)量的牛血清白蛋白（BSA）一起進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)果顯示，70kDa上方存在目的蛋白富集，40-50kDa存在雜蛋白，純化獲得較為純凈的目的蛋白。雜蛋白可以被GST-beads吸附，綜合Westernblot結(jié)果，我們認(rèn)為該雜蛋白為目的蛋白的降解片段，不影響后續(xù)體外激酶反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。比較目的蛋白條帶與不同質(zhì)量BSA條帶的亮度（圖2.2B），根據(jù)上樣量為3ul，我們認(rèn)為純化的目的蛋白濃度約為100ng/μL。圖2.2Hnrnpf蛋白純化Fig.2.2HnrnpfproteinpurificationA：Hnrnpf蛋白小規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)。B：Hnrnpf蛋白純化。1-6：100ng,300ng,400ng,500ng,700ng,1000ngBSA，7：純化后的Hnrnpf蛋白2.3.3驗(yàn)證Erk能夠磷酸化Hnrnpf為了驗(yàn)證定量磷酸化蛋白質(zhì)譜分析的結(jié)果，我們從E.coliBL21(DE3)中純化出帶有GST標(biāo)簽的Hnrnpf蛋白，并使用實(shí)驗(yàn)室前期純化的激酶caErk2與純化的Hnrnpf蛋白于同一緩沖體系中進(jìn)行體外激酶反應(yīng)。體外激酶反應(yīng)的原理是，ATP-γ-S中的第三個磷酸基團(tuán)的氧被硫替代，在激酶反應(yīng)中，ATP-γ-S可替代ATP將其磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至底物蛋白的氨基酸殘基上，從而使底物蛋白帶有巰基。在此基礎(chǔ)上，加入PNBM進(jìn)行烷基化反應(yīng)可形成被ThioP抗體識別的硫代磷酸酯表位表位，通過Westernblot可以檢測磷酸化信號。體外激酶反應(yīng)的結(jié)果顯示，與只加入Hnrnpf未加入caErk2的體系相比，加入了Hnrnpf與caErk2的體系可以檢測到磷酸化水平顯著增加，這表明Hnrnpf是Erk的下游磷酸化底物。圖2.3Erk2在體外磷酸化HnrnpfFig.2.3Erk2phosphorylatesHnrnpfinvitro

結(jié)論與展望3.1結(jié)論本研究成功構(gòu)建pGEX-6P-1-Hnrnpf表達(dá)質(zhì)粒，并通過誘導(dǎo)表達(dá)成功純化了Hnrnpf蛋白，隨后對純化的Hnrnpf與實(shí)驗(yàn)室前期純化的激酶caErk2進(jìn)行體外激酶反應(yīng)，驗(yàn)證激酶Erk對下游蛋白Hnrnpf的磷酸化作用。研究發(fā)現(xiàn)Hnrnpf是Erk的下游磷酸化底物。3.2展望在ESC的自我更新與多能性維持過程中，Erk/MAPK信號通路發(fā)揮著重要作用，但關(guān)于Erk維持多能性的具體機(jī)制尚未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，Hnrnpf是Erk的下游磷酸化底物，為實(shí)驗(yàn)室之前的開創(chuàng)性研究成果提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐，并為探索Erk磷酸化Hnrnpf維持ESC多能性的具體機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。在未來的工作中，我們將進(jìn)一步識別和驗(yàn)證Hnrnpf的磷酸化位點(diǎn)、研究磷酸化對Hnrnpf結(jié)構(gòu)和功能的影響以及探究其在ESC自我更新和多能性維持中的作用。通過這些研究，我們期望能夠?yàn)榻沂綞SC多能性維持的分子機(jī)制提供新的思路，并為再生醫(yī)學(xué)和組織工程等領(lǐng)域的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)，我們也期待這些研究成果能夠?yàn)榕R床治療相關(guān)疾病提供新的策略和方法。

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