ICS65.020.01

CCSB21

DB63

青海地方標準

DB63/T2288—2024

青稞品種鑒定技術規(guī)程SNP分子標記法

2024-6-19發(fā)布2024-7-25實施

青海省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB63/T2288—2024

前言

本文件按照GB/T1.1─2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。

本文件由青海省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。

本文件起草單位：中國科學院西北高原生物研究所、青海省農(nóng)作物種子站、海南州農(nóng)牧業(yè)綜合服務

中心、青海省鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展指導中心。

本文件主要起草人：王寒冬、沈裕虎、王蕾、徐金青、邊海燕、韓文婷、李春橋、薛明珍、王煥強、

李俊仁、包天忠、趙璨、王健斌、陳同睿、尤恩、鄧超。

本文件由青海省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳監(jiān)督實施。

I

DB63/T2288—2024

青稞品種鑒定技術規(guī)程SNP分子標記法

1范圍

本文件規(guī)定了青稞（HordeumvalgareL.var.nudumHook.f.）品種鑒定SNP分子標記方法的術語和

定義、縮略語、儀器設備及試劑、溶液配制、KASP引物信息、引物選擇、操作程序、數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計、

結果應用等技術要求。

本文件適用于青稞品種及種質資源的鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣

GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程發(fā)芽試驗

GB/T3543.5農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程真實性和品種純度鑒定

GB4404.1糧食作物種子第1部分：禾谷類

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T19495.3轉基因產(chǎn)品檢測核酸提取純化方法

GB/T30988多酚類植物基因組DNA提取純化及測試方法

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

推薦引物

用本文件進行品種及種質資源鑒定時選用的一套SNP引物。

3.2

參照品種

具有所用SNP位點上不同等位變異的品種。

3.3

送檢樣品

送到種子檢驗機構檢驗的樣品。

1

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3.4

試驗樣品

在實驗室中從送檢樣品中分離出來的部分樣品，供檢驗項目使用。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAcid）

KASP：競爭性等位基因特異性PCR（KompetitiveAlleleSpecificPCR）

PCR：聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction）

SNP：單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism）

5儀器設備及試劑

儀器設備及試劑見附錄A，所用試劑均為分析純。本文件所使用的超純水應符合GB/T6682的要求。

6溶液配制

見附錄B。

7KASP引物信息

分為Ⅰ、Ⅱ兩組。見附錄C

8KASP引物選擇

首先選擇附錄C中Ⅰ組引物進行擴增。當樣品間檢測出的差異位點數(shù)小于2時，選用附錄C中Ⅰ、Ⅱ

組所有引物進行擴增。

9操作程序

9.1樣品準備

按照GB/T3543.5的規(guī)定，送檢樣品質量應符合GB4404.1糧食作物種子第1部分：禾谷類中對大

麥種子純度的要求。試驗樣品的分樣應符合GB/T3543.2的規(guī)定。按照GB/T3543.4的規(guī)定進行發(fā)芽，供

發(fā)芽的籽粒數(shù)須大于等于50粒。植株長至三葉一心時，按單株采取葉片進行樣品制備。

9.2DNA樣品制備

按照GB/T19495.3的方法或采用商用的植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA的提取。每個送檢品種制

備的DNA樣品數(shù)量須大于等于50個單株；單提、單檢。試驗樣品DNA純度、濃度測試應符合GB/T30988

的規(guī)定。

9.3實時熒光定量PCR儀SNP分型

2

DB63/T2288—2024

SNP分型操作流程如下：

a)將2μLDNA樣品編號后分別加到96孔PCR板上對應編號的反應孔中，每塊PCR板均須加2

個陰性對照（即用2μL超純水替代DNA樣品，其余所加試劑完全一致）。每塊PCR板只檢測

一個送檢品種。

b)依試驗樣品量，按照表1配制KASP基因分型混合液。配制前所有試劑均應渦旋振蕩，補足損

失的體積。

表1KASP基因分型混合液

試劑體積（μL）

2×KASPMastermix5

Primer_Allele[FAM](10μmol/L)0.5

Primer_Allele[HEX](10μmol/L)0.5

Primer_Common(10μmol/L)1

超純水1

總體積8

c)使用微量移液器將9.3SNP分型操作流程2）中的KASP基因分型混合液分別加入到9.3SNP

分型操作流程1）已加入DNA樣品的PCR板上的反應孔中，每孔加8μL。

d)用熒光透視的膜將PCR板密封，然后轉速3000rpm，離心時間30sec。

e)KASP反應在實時熒光定量PCR儀上進行，程序設置見表2。

表2實時熒光定量PCR反應程序

步驟說明溫度時間循環(huán)數(shù)

1預變性94℃15min1

變性94℃20sec

210

復性/延伸61~55℃60sec（每循環(huán)降低0.6℃）

變性94℃20sec

326

復性/延伸55℃60sec

f)PCR反應結束后，在該儀器上進行熒光數(shù)據(jù)的讀取，讀取時程序設置為：溫度30℃，時間60sec，

循環(huán)數(shù)1。

g)當數(shù)據(jù)對應的熒光信號較低，分群較散時，可以增加循環(huán)后進行熒光讀取，同時保證陰性對照

沒有被擴增。程序設置如下：94℃變性20sec，57℃復性/延伸60sec，此步驟進行3個循環(huán)。

再按照9.3SNP分型操作流程6）進行熒光數(shù)據(jù)的讀取。

10數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計

樣品每個SNP位點的等位變異采用熒光定量PCR儀檢出的熒光信號表示。通過讀取熒光信號確定試驗

樣品在該位點的等位變異并進行記錄和統(tǒng)計。

11結果應用

當送檢品種樣品間差異位點數(shù)大于等于2，則判定為“不同品種”；當送檢品種樣品間差異位點數(shù)

等于1，判定為“近似品種”；當送檢品種樣品間差異位點數(shù)等于0，判定為“極近似品種或相同品種”。

3

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另外，可將試驗結果直接與附錄D參照品種SNP堿基類型進行比對，當與參照品種一致時，可以鑒定

為某一品種。

4

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AA

附錄A

（規(guī)范性）

主要儀器設備及試劑

A.1主要儀器設備

實時熒光定量PCR儀、電子恒溫不銹鋼水浴鍋、電子天平（精度0.01g、0.0001g各一臺）、磁力

攪拌機、高速臺式離心機、高通量組織研磨儀、微量分光光度計、高壓滅菌鍋、酸度計、微量移液器、

冰箱。

A.2主要試劑

乙二胺四乙酸二納、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、十六烷基三甲基溴化銨、β-

巰基乙醇、Tris-飽和酚、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、2×KASPMastermix、KBDAssaymix、超純水。

5

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BB

附錄B

（規(guī)范性）

溶液配制

B.1DNA提取試劑

B.1.10.5mol/L乙二胺四乙酸二納鹽（EDTA）（pH8.0）溶液

稱取9.305g的EDTA-Na2·2H2O，加40mL超純水，充分溶解，用0.8g~1.1gNaOH固體調節(jié)pH至8.0，

定容至50ml。在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min，室溫保存。

B.1.21mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸（Tris-HCl）（pH8.0）溶液

稱取6.06g的Tris，加40ml的超純水，充分溶解。用1.8mL~2.2mL的濃HCl（36%~38%）調節(jié)pH

至8.0，定容至50ml。滅菌溫度和時間同B.1.1，室溫保存。

B.1.3DNA提取液

依次加入十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）8g、氯化鈉32.7g、10mLTris-HCl溶液（pH8.0）

（見B.1.2）和4mLEDTA溶液（pH8.0）（見B.1.1），再加入超純水，充分溶解后，用超純水定容至

400mL。滅菌溫度和時間同B.1.1，4℃保存。

B.1.410倍DNA溶解液

取10mL1mol/LTris-HCl溶液（pH8.0）（見B.1.2）和2mL0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）

（見B.1.1），加入超純水，混合均勻，定容至100ml。分裝后滅菌，滅菌溫度和時間同B.1.1，室溫保

存。

6

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CC

附錄C

（規(guī)范性）

推薦KASP引物

推薦KASP引物見表C.1

表C.1推薦KASP引物

標記引物組別染色體等位變異KASP引物序列（5′–3′）

Primer_Allele[FAM]:CTGAGTTTGTGGAAGGAGCTATTTTT

1H_1Ⅰ1HA/TPrimer_Allele[HEX]:CTGAGTTTGTGGAAGGAGCTATTTTA

Primer_Common:TCAGTAAGAGTGAAATGACCTGCAACAAA

Primer_Allele[FAM]:TGTTGCTCCTTCTGCTGCCC

2H_1Ⅰ2HC/APrimer_Allele[HEX]:GTTGTTGCTCCTTCTGCTGCCA

Primer_Common:CCACACAAACCTCACTGCTAGTAGTA

Primer_Allele[FAM]:CGCAACACCTGGATTCGGTCG

3H_1Ⅰ3HG/APrimer_Allele[HEX]:CGCAACACCTGGATTCGGTCA

Primer_Common:CGCTGGCAGCTCCAGGGCAA

Primer_Allele[FAM]:GCGTCAGGTTGAGGAGATTCTG

4H_1Ⅰ4HG/TPrimer_Allele[HEX]:GGCGTCAGGTTGAGGAGATTCTT

Primer_Common:AAGGTTGCCAAGCTCAAAAAGGAGAAATT

Primer_Allele[FAM]:CGTCAGCACTGACTGTCCC

5H_1Ⅰ5HG/APrimer_Allele[HEX]:CTCGTCAGCACTGACTGTCCT

Primer_Common:CTTGCCTGCATCCATTCATTCAAATACAA

Primer_Allele[FAM]:CCAATTCGCCTGATTAAACCAACC

6H_1Ⅰ6HG/APrimer_Allele[HEX]:CTCCAATTCGCCTGATTAAACCAACT

Primer_Common:ACAGATCTGGCGGACAGTTATGGAA

Primer_Allele[FAM]:AGAAATATTCCAGCCGGCCGAG

7H_1Ⅰ7HG/APrimer_Allele[HEX]:AGAAATATTCCAGCCGGCCGAA

Primer_Common:CGGTACTACCGCCAGAGTTCAAAAT

Primer_Allele[FAM]:GCGACGCAGCACGACCGA

1H_2Ⅱ1HA/GPrimer_Allele[HEX]:GCGACGCAGCACGACCGG

Primer_Common:CTGATTCGACGCAGCGCTGGAA

Primer_Allele[FAM]:GACAAGGCCAGCGGTGCAGT

2H_2Ⅱ2HA/GPrimer_Allele[HEX]:ACAAGGCCAGCGGTGCAGC

Primer_Common:TCGTGCACGCCAAGACCTCCAA

Primer_Allele[FAM]:CCTCCGGTGGCCGGCG

3H_2Ⅱ3HG/APrimer_Allele[HEX]:GCCTCCGGTGGCCGGCA

Primer_Common:GGCCGGATCCAGGCTCCCTT

7

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表C.1推薦KASP引物（續(xù)）

標記引物組別染色體等位變異KASP引物序列（5′–3′）

Primer_Allele[FAM]:CCACCTCCTTCTCCAGCCGT

4H_2Ⅱ4HT/CPrimer_Allele[HEX]:CACCTCCTTCTCCAGCCGC

Primer_Common:GGCGGGCCCAAGATGGGCTT

Primer_Allele[FAM]:ATTGGACTAATGGAGGAGTCACTTC

6H_2Ⅱ6HC/APrimer_Allele[HEX]:AATTGGACTAATGGAGGAGTCACTTA

Primer_Common:TCCAAACTGTTTTGGGGAAATTACTCCTT

Primer_Allele[FAM]:GGCGGCACCGACGCCG

7H_2Ⅱ7HG/APrimer_Allele[HEX]:CTGGCGGCACCGACGCCA

Primer_Common:GCTAAGCCCCGCCGGCCAT

Primer_Allele[FAM]:GCCACCCAACCGTAGCAGC

1H_3Ⅱ1HC/TPrimer_Allele[HEX]:CGCCACCCAACCGTAGCAGT

Primer_Common:GGTGCCCTAGGGTTTCCCCTTA

Primer_Allele[FAM]:GGTGGTCTGATCCTCAAAGGC

2H_3Ⅱ2HG/TPrimer_Allele[HEX]:GGGTGGTCTGATCCTCAAAGGA

Primer_Common:CCTTCCGTCACAGCCATGAAGTTTA

Primer_Allele[FAM]:CATGCCTTGCATAATTTACAAGTTATGC

3H_3Ⅱ3HC/TPrimer_Allele[HEX]:ACATGCCTTGCATAATTTACAAGTTATGT

Primer_Common:CTCCGAACCAAACACTCTAATCATAACTT

Primer_Allele[FAM]:GTAGCGCCACTTGCGTGCTC

4H_3Ⅱ4HC/APrimer_Allele[HEX]:AGTAGCGCCACTTGCGTGCTA

Primer_Common:CTTCCTCCTCCCACACCCGTAT

Primer_Allele[FAM]:GCACTAAACATCGCACTCGGG

6H_3Ⅱ6HG/APrimer_Allele[HEX]:GTGCACTAAACATCGCACTCGGA

Primer_Common:TTAGGCGATTCGTGATCGCAGCTAA

Primer_Allele[FAM]:GCCTCAGCCTCCGCCTCA

7H_3Ⅱ7HT/GPrimer_Allele[HEX]:GCCTCAGCCTCCGCCTCC

Primer_Common:CGGAGGCTGAGGCGGAGCAT

Primer_Allele[FAM]:CAAATCTATGTTTGCCGTGTACATTGT

1H_4Ⅱ1HT/CPrimer_Allele[HEX]:AAATCTATGTTTGCCGTGTACATTGC

Primer_Common:GCTCCTATCACCACAACTGCAAGTA

Primer_Allele[FAM]:GCGTTTCGCCAGCGCACAG

2H_4Ⅱ2HC/GPrimer_Allele[HEX]:GCGTTTCGCCAGCGCACAC

Primer_Common:ATCGACCAATAGATTTGGGGAAACGTTTA

Primer_Allele[FAM]:GCGCACCGGTGCGTGCTT

2H_5Ⅱ2HT/CPrimer_Allele[HEX]:GCGCACCGGTGCGTGCTC

Primer_Common:CCGAAGAGCTCGGCGTCGAA

Primer_Allele[FAM]:CAATACCTACCAATGGTATATAGCAAG

3H_4Ⅱ3HC/TPrimer_Allele[HEX]:AACAATACCTACCAATGGTATATAGCAAA

Primer_Common:GACCTGAAAGCAGTACTAACGATATCTTA

8

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表C.1推薦KASP引物（續(xù)）

標記引物組別染色體等位變異KASP引物序列（5′–3′）

Primer_Allele[FAM]:CGCTCCGCCATCATCGGC

4H_4Ⅱ4HG/APrimer_Allele[HEX]:GCGCTCCGCCATCATCGGT

Primer_Common:CAGGAAGGCGCACCGACACTTA

Primer_Allele[FAM]:GGCATTGGCAGCTTCAACACGA

6H_4Ⅱ6HT/CPrimer_Allele[HEX]:GCATTGGCAGCTTCAACACGG

Primer_Common:TGCTGTCCAGTTTTCAGCTCCTGTT

Primer_Allele[FAM]:AGGTAACAACAATGAAGCGAACGAC

6H_5Ⅱ6HC/TPrimer_Allele[HEX]:AAGGTAACAACAATGAAGCGAACGAT

Primer_Common:CGTCCTCCGCCTCATCGTCAT

Primer_Allele[FAM]:TCTTGATGGCGTCGTCCA

6H_6Ⅱ6HA/GPrimer_Allele[HEX]:GCTTCTTGATGGCGTCGTCCG

Primer_Common:GAAGAAGCGGCCCAAGCAGCTA

Primer_Allele[FAM]:GTACCGTCATCCTTGCGGTTGT

7H_4Ⅱ7HT/APrimer_Allele[HEX]:GTACCGTCATCCTTGCGGTTGA

Primer_Common:GAAAGTCTTCGCAAAAAGTCCGACGAA

注1：[]中為標記熒光

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DD

附錄D

（資料性）

參照品種SNP堿基類型

參照品種推薦引物變異位點SNP堿基類型見表D.1

表D.1參照品種推薦引物變異位點SNP堿基類型

品種名稱1H_11H_21H_31H_42H_12H_22H_32H_42H_53H_13H_23H_33H_44H_1

福8-4TRCTMAKCTGGTTG

莫多吉1號ARCYCAKGTGGTTK

門農(nóng)1號ARCYCAKGTGGTTK

東青1號TRCYCAKGTGRTCG

同德系選8號ARCYCAKCTGGTTK

互青2號ARCTCAKGTGRTTG

北青1號TRCYCAKSYGGTTG

北青4號TRCYMAKCCGRTTG

北青5號TRCYMAKSTGGTTK

北青6號TRYYCAKCCGGTTG

北青7號TRCYCAKGTGGTCG

北青8號ARCYMAKGTGGTTK

昆侖1號TRCYCAKCCGGYCG

昆侖2號TRCTMAGCCGGCCG

昆侖3號TRCYCAKCCGRCCG

昆侖8號TRCTCAKCCGGTCK

昆侖10號TRCTCAKCCGGTCG

昆侖12號TACTMAKCTGGTTG

昆侖164TRCYMAKCCGRTTG

昆侖13號TRCTCAKCTGGTTG

巴青1號ARCYMAKCTGRYTG

昆侖14TACTCAGCTGRCTG

昆侖15TACTCAKCTGGTTG

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表D.1參照品種推薦引物變異位點SNP堿基類型（續(xù)）

品種名稱4H_24H_34H_45H_16H_16H_26H_36H_46H_56H_67H_17H_27H_37H_4

福8-4CARGGAGCYGGGKT

莫多吉1號CAGGRARCYGRRGT

門農(nóng)1號CAGGRAGCYGRGTT

東青1號CAGGGAGCCGGGGT

同德系選8號CAGGGARCYG