生物制藥AKTAavant自動化操作指南一、儀器概述AKTAavant是Cytiva（原GE）研發(fā)的全自動蛋白純化系統(tǒng)，在生物制藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用于抗體、重組蛋白、疫苗等生物分子的分離純化。系統(tǒng)集成泵、多參數(shù)檢測器（UV/Vis、電導(dǎo)、pH）、層析柱位、自動收集器等模塊，通過Unicorn軟件實現(xiàn)方法編輯、過程監(jiān)控與數(shù)據(jù)管理，支持親和、離子交換、凝膠過濾等多種層析技術(shù)，可顯著提升純化效率與重復(fù)性。二、操作前準(zhǔn)備（一）環(huán)境與儀器核查1.環(huán)境條件：實驗環(huán)境溫度宜控制在20-25℃，濕度≤60%，操作間潔凈度需達(dá)ISO8級（或Class100,000）以上，避免粉塵、微生物污染。2.儀器狀態(tài)：電源穩(wěn)定，模塊（泵、檢測器、收集器）物理連接牢固，無松動或損壞；管路系統(tǒng)安裝正確：進(jìn)液管浸入緩沖液瓶，出液管連接收集容器，層析柱按“進(jìn)液端-出液端”方向安裝（參考柱說明書），管路內(nèi)無氣泡（可通過“Prime”功能排除）；軟件啟動：打開Unicorn軟件，確認(rèn)儀器與軟件通訊正常（狀態(tài)欄顯示“Ready”）。（二）試劑與耗材準(zhǔn)備1.緩沖液：根據(jù)純化方法配制平衡液、上樣液、洗脫液（如親和純化的BindingBuffer、ElutionBuffer），經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，pH、濃度誤差≤±0.05、±1%；2.層析柱：選擇適配的層析柱（如HiTrap系列、HiScreen系列），使用前檢查柱效（參考說明書的柱效測試方法），確認(rèn)無泄漏、柱床平整；3.耗材：準(zhǔn)備無菌離心管/收集瓶（容量匹配收集體積）、樣品過濾膜（0.22/0.45μm）、一次性手套、護(hù)目鏡等防護(hù)用品。三、基本操作流程（一）方法編輯與參數(shù)設(shè)置1.新建方法：在Unicorn軟件中點擊“Method”→“New”，輸入方法名稱（含版本號），選擇層析柱型號（軟件自動加載柱參數(shù)）；2.步驟設(shè)置：平衡階段：設(shè)置流速（如1.0mL/min）、緩沖液（平衡液），運行時間/體積（建議3-5個柱體積），監(jiān)控UV（280nm）、電導(dǎo)、pH信號至基線穩(wěn)定；上樣階段：調(diào)整流速（如0.5mL/min），選擇“Load”步驟，設(shè)置樣品體積（≤柱體積的5%，視載量調(diào)整），樣品經(jīng)0.22μm過濾后通過上樣環(huán)或直接進(jìn)樣；洗脫階段：設(shè)置洗脫方式（梯度/階躍），梯度洗脫需定義起始/終止?jié)舛龋ㄈ?-100%ElutionBuffer）、梯度時間（如20min），流速可提升至2.0mL/min以縮短時間；再生/清洗：設(shè)置高濃度洗脫液（如1MNaCl）或再生液（如0.1MNaOH）沖洗柱子，去除殘留雜質(zhì)，恢復(fù)柱性能。（二）上樣與純化過程監(jiān)控1.樣品上樣：上樣前確認(rèn)柱子已平衡（UV基線穩(wěn)定），點擊“Start”運行方法，上樣過程中觀察UV信號（樣品上樣時UV值通常升高），若出現(xiàn)異常峰（如雜峰、基線漂移），需暫停檢查樣品純度或管路氣密性；2.洗脫監(jiān)控：洗脫階段密切關(guān)注UV峰形（目標(biāo)峰應(yīng)對稱、無拖尾），電導(dǎo)曲線應(yīng)與洗脫梯度匹配（如離子交換純化中電導(dǎo)隨鹽濃度升高而上升），pH曲線需穩(wěn)定（波動≤±0.1）；3.手動干預(yù)：若出現(xiàn)壓力超限（如＞0.5MPa）、液體泄漏等情況，可通過“Pause”暫停方法，排除故障后點擊“Resume”繼續(xù)。（三）收集與數(shù)據(jù)分析1.收集設(shè)置：在方法中設(shè)置收集條件，可選擇“峰收集”（UV閾值觸發(fā)，如≥50mAU開始，≤30mAU停止）或“時間收集”（按固定時間/體積分段收集），收集管需提前標(biāo)記并編號；2.樣品分析：收集后對樣品進(jìn)行濃度測定（如Bradford法、UV280nm）、純度分析（SDS、SEC-HPLC），記錄峰面積、保留時間等參數(shù)，用于計算回收率、純度；3.數(shù)據(jù)導(dǎo)出：在Unicorn軟件中點擊“Report”→“Export”，選擇數(shù)據(jù)格式（如CSV、PDF），保存至合規(guī)的電子記錄系統(tǒng)（需包含審計追蹤信息）。四、維護(hù)與故障排查（一）日常維護(hù)1.管路清潔：每次實驗后用純水沖洗管路（流速2mL/min，運行5個柱體積），去除殘留緩沖液；每周用20%乙醇沖洗管路（避光保存），防止微生物滋生；2.柱子維護(hù)：使用后用再生液（如親和柱用1MNaCl，離子交換柱用0.1MNaOH）沖洗，再用純水過渡，密封柱兩端后4℃保存；長期不用時，按說明書進(jìn)行“封存處理”（如加20%乙醇）；3.模塊保養(yǎng)：每月檢查泵密封件（無漏液、異響），清潔檢測器流通池（用純水沖洗，避免刮擦），校準(zhǔn)UV燈（使用標(biāo)準(zhǔn)濾光片或參比溶液）。（二）常見故障處理1.壓力異常：壓力過高：檢查管路是否打折、柱子是否堵塞（可反沖柱子，流速0.5mL/min）、流速是否設(shè)置過高（降低流速至推薦范圍）；壓力過低：檢查進(jìn)液管是否進(jìn)氣（重新浸入緩沖液，執(zhí)行“Prime”）、泵密封件是否損壞（聯(lián)系售后更換）。2.檢測信號異常：UV信號波動：檢查流通池是否有氣泡（執(zhí)行“Prime”排氣）、燈能量是否不足（更換UV燈）、樣品是否渾濁（重新過濾樣品）；電導(dǎo)/pH漂移：檢查電極是否污染（用純水沖洗，必要時校準(zhǔn)）、緩沖液是否變質(zhì)（重新配制）。3.液體泄漏：檢查管路接頭是否松動（重新擰緊）、柱子密封圈是否老化（更換密封圈）、泵頭是否漏液（清潔泵頭，更換密封墊）。五、注意事項1.安全操作：接觸生物樣品時佩戴無菌手套、護(hù)目鏡，避免直接接觸酸堿試劑；實驗結(jié)束后按醫(yī)療廢物處理廢液、耗材；2.數(shù)據(jù)完整性：所有操作需記錄（含方法參數(shù)、操作時間、樣品信息），電子數(shù)據(jù)需定期備份（至少雙份，異地存儲），審計追蹤功能需開啟（符合GMP附錄11要求）；3.合規(guī)性要求：操作需符合《藥