-1-前言REF_Ref12223\w\hREF_Ref22163\w\hREF_Ref22303\w\h梨形蟲種，歸類于頂復(fù)門類之中，特指梨形蟲綱下的泰勒科與巴貝斯科成員，具體涵蓋泰勒屬以及巴貝斯屬，據(jù)此可分為兩大類別，即泰勒蟲(Theileria)與巴貝斯蟲(Babesia)REF_Ref12223\w\h[1]。梨形蟲病是經(jīng)蟲媒傳播的疾病之一，其傳播途徑主要依賴蜱類昆蟲。鑒于不同地域中蜱蟲種類的差異性以及它們分布特征的鮮明對比，該病癥呈現(xiàn)出顯著的區(qū)域間傳播特性。梨形蟲病的發(fā)病率受蜱類生物周期性活動的影響，其發(fā)生模式與蜱類的活動習(xí)性及其地理分布密切相關(guān)，表現(xiàn)出明顯的季節(jié)性波動規(guī)律。在羊泰勒蟲病案例中，一旦羊只出現(xiàn)病癥，其表征性淋巴腺病變顯著，體現(xiàn)了病理進(jìn)程的特定變化。初始階段，肩部前方淋巴結(jié)出現(xiàn)腫大現(xiàn)象，早期時，淋巴結(jié)質(zhì)地堅硬，觸診時伴有疼痛感。在隨后的發(fā)展階段，患病羊只的體溫顯著上升，伴隨體溫升高的同時，其淋巴結(jié)也經(jīng)歷了更為明顯的腫大過程，其直徑一般可增至4-5厘米，而在某些病例中，腫大程度可進(jìn)一步加劇，直徑甚至可達(dá)到7厘米。隨著疾病進(jìn)程的逐步推移，病畜的淋巴結(jié)逐漸復(fù)原至其正常狀態(tài)REF_Ref22163\w\h[2]?；及拓愃瓜x病之個體，其臨床表征表現(xiàn)為突發(fā)性發(fā)熱，體溫顯著攀升，常達(dá)41.5攝氏度之高溫?；颊哳^部前傾，耳朵聳立，精神狀態(tài)呈衰頹之態(tài)，食欲明顯減退，反芻行為減少，羞澀于光線，淚液分泌增多。眼部呈現(xiàn)半閉狀態(tài)，眼結(jié)膜呈現(xiàn)潮紅現(xiàn)象。鼻部鏡檢可見干燥，鼻液清澈，鼻端及耳尖區(qū)域感覺冰涼。呼吸頻率加快，伴隨咳嗽癥狀，行走時出現(xiàn)明顯的物理不適REF_Ref22303\w\h[3]。梨形蟲病作為一項影響全球的疾患，對畜牧業(yè)尤其是牛肉和羊肉產(chǎn)業(yè)造成了顯著的經(jīng)濟(jì)損害。該病在我國的廣大地區(qū)普遍存在，尤其是巴貝斯蟲病和泰勒蟲病的流行區(qū)域廣泛，目前我國已成為世界上病原種類繁多且受害程度深重的國家之一。REF_Ref2361\w\hREF_Ref2753\w\hREF_Ref2966\w\hREF_Ref3034\w\hREF_Ref3103\w\hREF_Ref22829\r\hREF_Ref3129\w\h巴貝斯蟲病的發(fā)生呈現(xiàn)出顯著的季節(jié)性特征。在氣候溫和濕潤的春季、夏季及秋季期間，蜱蟲的活動及繁殖能力顯著增強(qiáng)，從而導(dǎo)致巴貝斯蟲病的發(fā)病率在此期間呈現(xiàn)出上升趨勢。我國南方地區(qū)牛羊巴貝斯蟲病多發(fā)生和流行于7-9月REF_Ref2361\w\h[4]。諸多研究已確認(rèn)多種巴貝斯蟲屬于人獸共患病原體類別，此類病原體包括分歧巴貝斯蟲（Babesiadivergens）、獵戶巴貝斯蟲（Babesiavenatorum）以及微小巴貝斯蟲（Babesiamicroti）。先前文獻(xiàn)中曾記載微小巴貝斯蟲（B.microti）感染人類的情況，此類感染并未導(dǎo)致死亡案例。我國境內(nèi)，學(xué)者們成功鑒定出兩個巴貝斯蟲新種，分別為B.sp.Xinjian以及Babesiasp.BQ1(Lintan)。特定巴貝斯蟲屬寄生蟲在感染動物體內(nèi)展現(xiàn)出跨物種感染的可能性，然而普遍觀點認(rèn)為，那些能夠侵襲羊只的巴貝斯蟲種類并不會對人類構(gòu)成感染威脅。盡管如此，近期的一項報告指出，B.crassa已有個例證實可引發(fā)人類巴貝斯蟲病REF_Ref21041\w\h[5]。在中國，已知可侵襲牛體的病原體包括三種巴貝斯蟲種類，即雙芽巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲以及卵形巴貝斯蟲。這些病原體均展現(xiàn)出形態(tài)多變的特性，并且其個體大小存在顯著差異REF_Ref21097\w\h[6]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，人類亦可能遭受牛巴貝斯蟲（Babesiabovis）的侵襲，且已有導(dǎo)致死亡的病例記錄。迄今為止，尚未有關(guān)于人類感染泰勒蟲并引發(fā)疾病的案例記錄在案。泰勒蟲病的首次記錄源自埃及地區(qū)綿羊的病例，而在中華人民共和國，該疾病最初由楊輔國、劉家雄等學(xué)者于1957年在四川省甘孜藏族自治州乾寧縣對綿羊所患的泰勒焦蟲病進(jìn)行了確診REF_Ref3034\w\h[7]。在中國廣袤的疆域內(nèi)，諸如新疆、青海、甘肅、吉林等眾多地區(qū)均呈現(xiàn)出該物種的廣泛分布特征。該疾病廣泛分布于多個區(qū)域，受感染的家畜預(yù)后通常較差，導(dǎo)致其在流行區(qū)域?qū)π竽翗I(yè)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的負(fù)面影響REF_Ref21224\w\h[8]。羊群遭受的泰勒蟲病感染，主要涉及綿羊泰勒種、呂氏泰勒種、尤氏泰勒種以及瑟氏泰勒種等四大類型。在我國，牛慶麗團(tuán)隊于2008年運(yùn)用RLB技術(shù)，針對四川、遼寧以及甘肅省的梨形蟲感染率展開了一項詳盡的調(diào)查研究REF_Ref21306\w\h[9]。對照研究發(fā)現(xiàn)，在感染寄生蟲方面，羊群中泰勒蟲的感染陽性率較巴貝斯蟲為高。近幾年隨著我國畜牧業(yè)的高速發(fā)展和集中化養(yǎng)殖管理，使反芻動物梨形蟲病變得廣泛，氣候變化也讓反芻動物梨形蟲的存活率大大增加。REF_Ref3171\w\hREF_Ref3263\w\hREF_Ref3318\w\h核糖體基因中18SrRNA片段展現(xiàn)出一種獨特的結(jié)構(gòu)，其中保守序列與變異序列交替排列，此特性既促進(jìn)了其擴(kuò)增過程的便捷性，又便于對各類生物種別進(jìn)行有效辨識。梨形蟲的分子水平分類研究，核心聚焦于18SrRNA基因的序列分析。在亞洲特定地域，導(dǎo)致水牛罹患巴貝斯蟲病的病原體，普遍被認(rèn)為系牛源巴貝斯蟲（B.bovis）REF_Ref21377\w\h[10]。近期研究表明，通過對18SrRNA序列進(jìn)行對比分析，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的深入研究，已明確將該疾病歸因于東方巴貝斯蟲（Babesiaorientalis）REF_Ref21534\w\h[11-12]。通過Yin等研究者的深入探究，采用18SrRNA序列分析技術(shù)，揭示了在中國青海地區(qū)，血蜱傳播的兩種致病性較高的綿羊泰勒蟲，確認(rèn)為呂氏泰勒蟲（Theilerialuwenshuni）與尤氏泰勒蟲（Theileriauilenbergi）。此前，這兩種病原體被認(rèn)為屬于同一物種，依靠傳統(tǒng)分類方法難以區(qū)分REF_Ref21691\w\h[13-15]。可見18SrRNA對于鑒定梨形蟲種類具有不可小覷的作用。REF_Ref3390\w\hREF_Ref3416\w\hREF_Ref3459\w\hREF_Ref3481\w\hREF_Ref3514\w\h全溝硬蜱屬于典型的森林生態(tài)系統(tǒng)中的蜱類物種REF_Ref3390\w\h[16]，作為硬蜱科的核心成員，其分布范圍遍及全球各地。在中國，該物種廣泛存在于黑龍江、吉林、遼寧REF_Ref3416\w\h[17-19]、新疆REF_Ref3459\w\h[20]、山西、甘肅REF_Ref3481\w\h[21]、河北REF_Ref3514\w\h[22]等多個省份。黑龍江省的地貌遼闊，自然生態(tài)環(huán)境復(fù)雜多樣，森林資源豐富，這為全溝硬蜱的繁衍與棲息提供了得天獨厚的環(huán)境。該蜱種具備獨特的三宿主生活習(xí)性，并能夠適應(yīng)嚴(yán)寒的冬季氣候，實現(xiàn)越冬存活，這些特性顯著提升了其傳播疾病的風(fēng)險。該現(xiàn)象不僅威脅到野生動物與家養(yǎng)動物的生存狀態(tài)，亦對人類健康與安全構(gòu)成了潛在風(fēng)險。位于山區(qū)地帶的牡丹江市，樹木蔥郁，林密葉茂，營造了蜱類生物棲息的理想條件。該地區(qū)成為蜱傳病原的自然疫源地，頻繁有關(guān)于人類遭受蜱蟲叮咬及由此引發(fā)的疾病案例見諸報道。目前，針對該區(qū)域放牧家畜所承受的蜱傳性疾病研究尚處于空白狀態(tài)。本研究旨在對位于牡丹江東寧市地區(qū)放牧的反芻動物血液內(nèi)主要傳播疾病的蜱類病原體進(jìn)行調(diào)查。該研究不僅為反芻動物群體中蜱傳疾病的預(yù)防與控制提供了科學(xué)依據(jù)，亦對公共衛(wèi)生領(lǐng)域具有重要的實踐價值。1材料與方法1.1實驗材料實驗所用儀器見表1。表1主要儀器及生產(chǎn)廠家Table1Majorinstrumentsandmanufacturers儀器型號廠家顯微鏡EVOS?M5000賽默飛世爾科技水平凈化工作臺JBCJ蘇州加保凈化工程設(shè)備有限公司數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀EPS-300上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司多功能水平電泳槽HE-120上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司電子分析天平FA2204N塞倫儀器有限公司水浴鍋JHWS-24上海劍革電子科技有限公司臺式高速離心機(jī)TG18G河南北弘實業(yè)有限公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9070A1上海右一儀器有限公司凝膠成像分析系統(tǒng)Tanon3500Tanon公司新華全自動高壓滅菌鍋LMQ.C-80E濟(jì)南來寶科學(xué)儀器有限公司PCR擴(kuò)增儀GE041-B廈門柏恒科技公司生產(chǎn)1.1.2主要試劑及其制備表2主要試劑及生產(chǎn)廠家Table2Majorreagentsandmanufacturerss試劑規(guī)格廠家瓊脂糖100g大連寶生物工程有限公司Tris1kg賽默飛世科技公司無水乙醇3L大連寶生物工程有限公司雙蒸水500mL大連寶生物工程有限公司DL2000DNAMarker200μL大連寶生物工程有限公司異丙醇500mL大連寶生物工程有限公司DNAGreen染料1mL賽默飛世科技公司血液基因組DNA提取試劑盒200X美國OMEGA生物科技有限公司6×DNAloadingBuffer5mL賽默飛世科技公司10×PCRBuffer1mL大連寶生物工程有限公司dNTPMixture250μL大連寶生物工程有限公司rTaqDNAPolymeras200U大連寶生物工程有限公司10×LAPCRBuffer1mL大連寶生物工程有限公司LATaqDNAPolymeras50U大連寶生物工程有限公司冰乙酸500mL大連寶生物工程有限公司氫氧化鈉500mL大連寶生物工程有限公司配置試劑如下：50×TAE緩沖液：Tris242g，Na2EDTA?2H2O37.2g，冰乙酸57.1mL，加蒸餾水定容至1L，用NaOH調(diào)PH至8.3，4℃保存?zhèn)溆谩⑽迨种荒枬舛鹊腡AE緩沖液，通過雙重蒸餾水進(jìn)行稀釋處理，以實現(xiàn)稀釋比例達(dá)到五十倍，從而制備出濃度為1×TAE的稀釋液。取70毫升的無水乙醇，通過添加雙蒸水以實現(xiàn)體積至100毫升的定量稀釋，從而制備出濃度為70%的乙醇溶液。將80毫升的無水異丙醇與雙蒸水混合，并調(diào)整總體積至100毫升，以此制備80%的異丙醇溶液。在實驗過程中，采用含有1%瓊脂糖的凝膠進(jìn)行電泳分析。具體操作為，將1克瓊脂糖與100毫升1×TAE緩沖液混合稀釋，隨后通過微波爐加熱的方式確保瓊脂糖徹底溶解。在溶液中加入DNAGreen染料，其添加量為每100毫升瓊脂糖凝膠中8微升。待混合液稍微冷卻之后，進(jìn)行凝膠的灌制。1.2實驗方法1.2.1血液DNA的提取采納血液DNA提取套裝(DP304型)實施樣本DNA的提取過程，依據(jù)提供的操作手冊，該過程可細(xì)化為若干階段：（1）將血液樣品放入無菌的離心管中，樣品含量若不足0.25mL則補(bǔ)充10Mm的鹽酸鹽。（2）在離心管中加入0.25mL蛋白酶和0.25mL緩沖液，搖晃15s混勻。如實驗中需要將樣品中的RNA去除，則需再加0.025mL核糖核酸酶。（3）將實驗樣本置于65攝氏度的恒溫水浴槽內(nèi)，持續(xù)加熱十分鐘以完成熱處理過程。（4）在水浴加熱過程中，可臨時取出容器進(jìn)行振蕩，以確?；旌衔镞_(dá)到均質(zhì)狀態(tài)。（5）將準(zhǔn)備好的乙醇加入離心管中溶解血液樣品，再持續(xù)震蕩20s。（6）準(zhǔn)備2ml的試管并把混勻的樣品和吸附柱放入試管，用離心機(jī)并把離心力設(shè)定為8000r/min離心1min，隨后將廢液和試管合理丟棄。（7）準(zhǔn)備一個新的2ml試管并把吸附柱放入試管中，向吸附柱中加入0.5ml緩沖液并將廢液合理丟棄。（8）將吸附柱放入之前的試管中，并純化DNA，完成后重復(fù)步驟6的離心操作。（9）重復(fù)上個步驟。（10）在試管內(nèi)放入新的吸附柱，將離心機(jī)設(shè)定15000r/min離心2min。（11）配置一管容量為1.5毫升的離心試管，隨后將吸附柱置入其中，并添加0.2毫升經(jīng)過預(yù)熱至60攝氏度的液體，保持靜止?fàn)顟B(tài)持續(xù)五分鐘。（12）在執(zhí)行第六步驟的離心過程再三重復(fù)之后，從試管內(nèi)分離出的物質(zhì)即為血液中純化的脫氧核糖核酸。1.2.2目的基因的擴(kuò)增利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)對病原體進(jìn)行基因復(fù)制，進(jìn)而實現(xiàn)目標(biāo)基因的獲取。其引物見表3，引物的反應(yīng)體系詳見表4-5。表3PCR所需引物Table3PrimersrequiredforPCR病原基因片段引物序列（5’-3’)產(chǎn)物大小（bp）梨形蟲18SrDNAF:AATTACCCAATCCTGACACAGR:TAAATACGAATGCCCCCAA400表4梨形蟲PCR反應(yīng)體系Table4PCRreactionsystemofpiroplasm試劑體積(μL)ddH2o9.502×TaqDNA聚合酶12.50上游引物（10μmol/L）0.50下游引物（10μmol/L）0.50DNA模板2.00總計25.00表5梨形蟲PCR反應(yīng)體系Table5PCRreactionsystenofPiroplasm反應(yīng)順序反應(yīng)程序時間循環(huán)數(shù)預(yù)變性94℃5min變性94℃30s退火63℃30s39延伸72℃30s終延伸72℃10min1.2.3瓊脂糖凝膠電泳點鑒于病原體PCR目標(biāo)片段的長度，特選定濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。在此過程中，采取微量移液器吸取3微升的PCR產(chǎn)物，并將其準(zhǔn)確導(dǎo)入凝膠加樣孔內(nèi)以備后續(xù)分析。設(shè)電壓為120V,電泳時間25min。凝膠樣本隨后被置入成像設(shè)備之內(nèi)，執(zhí)行圖像捕捉過程，隨即對所得圖像進(jìn)行存儲備案。1.2.4PCR產(chǎn)物的測序與序列比對對檢測結(jié)果顯示為陽性的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物，轉(zhuǎn)交至哈爾濱擎科生物工程股份有限公司實施序列測定。通過采用ClustalX版本1.83的軟件工具，對測序成功的核苷酸序列進(jìn)行了精準(zhǔn)的比對與分析。利用美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中的BLAST工具，對參照序列進(jìn)行搜索與比對。1.2.5數(shù)據(jù)分析采納MEGA6.0軟件，對所獲取的基因序列執(zhí)行比對操作，隨后進(jìn)行精確校正。采納DNAStar程序內(nèi)的MegAlign工具，對特定序列執(zhí)行同源比較研究。采納鄰接法（NJ）對搜集到的各類基因標(biāo)記分離株序列及GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)存儲的相應(yīng)序列執(zhí)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)剖析，通過1000次迭代重復(fù)的bootstrap方法進(jìn)行可靠性評估。2結(jié)果2.1梨形蟲分子鑒定及感染情況在本項研究中，針對牡丹江東寧市搜集的268例反芻動物血液樣本，采用梨形蟲通用引物對18S基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，實驗結(jié)果表明，在400堿基對位置，44個樣本呈現(xiàn)出清晰的條帶。個別聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增成效展示于圖1，具體陽性反應(yīng)數(shù)據(jù)則詳盡列舉于表6中。結(jié)果顯示東寧市牛感染梨形蟲陽性率為34.04%，高于綿羊感染梨形蟲的陽性率（6.90%）。圖1部分樣本梨形蟲檢測結(jié)果M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-22：部分血液樣本；P：陽性對照；N：陰性對照Figure1PiroplasmPCRresultsofpartialsamplesM:DL2000Marker;1-22:Partialbloodsamples;P:Positive;N:Negative表6東寧市梨形蟲感染情況統(tǒng)計表種類陽性數(shù)（只）總數(shù)（只）陽性率（%）牛329434.04綿羊121746.902.2同源性分析通過對序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)陽性樣本中存在兩個不同的屬別的寄生蟲，分別為泰勒屬與巴貝斯屬，涉及的具體種類有兩種。在泰勒屬中，確定存在的種類為中華泰勒（Theileriasinensis），而在巴貝斯屬中，則識別出一種尚未明確分類的種類，暫時標(biāo)記為巴貝斯未定種（Babesiasp.）。同源性分析結(jié)果顯示，DQ-T1、DQ-T2菌株與GenBank上的中華泰勒蟲Theileriasinensis(MG784413.1)同源性為100%；DQ-T3菌株與與GenBank上的中華泰勒蟲Theileriasinensis(KX115427.1)同源性最高，為99.8%；DQ-T4菌株與與GenBank上的中華泰勒蟲Theileriasinensis(MN628025.1)同源性最高，為99.1%，如圖2所示。圖2泰勒蟲18S序列同源性分析DQ-T1，DQ-T2，DQ-T3，DQ-T4：本試驗中樣品編號Figure2Theileriaanalysisof18SsequencesDQ-T1,DQ-T2,DQ-T3,DQ-T4:thisstudysamplenumber同源性分析結(jié)果顯示，DQ-1、DQ-2菌株與GenBank上Babesiasp.(KU204785.1)同源性最高，分別為99.9%和99.3%。如圖3所示。圖3巴貝斯蟲18S序列同源性分析DQ-1，DQ-2：本試驗中樣品編號Figure3Babesiaanalysisof18SsequencesDQ-1,DQ-2:thisstudysamplenumber2.3系統(tǒng)發(fā)育分析將結(jié)果序列與GenBank中的泰勒蟲18SrDNA部分序列構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)本實驗中所獲得的TheileriasinensisDQ-T1序列與我國青海報道的Theileriasinensis(MG784413.1)在同一分支。TheileriasinensisDQ-T2與TheileriasinensisDQ-T3親緣關(guān)系較近，位于同一分支，而TheileriasinensisDQ-T4單獨成一支，結(jié)果如圖4所示。圖4泰勒蟲陽性測序結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹DQ-T1，DQ-T2，DQ-T3，DQ-T4：本試驗中樣品編號Figure4ConstructionofphylogenetictreebasedonpositivesequencingofTheileriaDQ-T1,DQ-T2,DQ-T3,DQ-T4:thisstudysamplenumber將結(jié)果序列與GenBank中的巴貝斯蟲18SrDNA部分序列構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)本實驗中所獲得的Babesiasp.DQ-1序列與所報道的黑龍江蜱Babesiasp.(KU204785.1)在同一分支，Babesiasp.DQ-2序列單獨成一分支，結(jié)果如圖5所示。圖5巴貝斯蟲陽性測序結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹DQ-1，DQ-2：本試驗中樣品編號Figure5ConstructionofphylogenetictreebasedonpositivesequencingofBabesiaDQ-1,DQ-2：:thisstudysamplenumber3討論反芻類動物的生產(chǎn)活動及人類日常生活正遭受全球范圍內(nèi)廣泛分布的蜱傳病原的威脅，其對二者造成了顯著的不良影響。地域及季節(jié)性要素對蜱傳播病原體的流行病學(xué)特征具有顯著影響。牡丹江市域內(nèi)森林資源充裕，該地域生態(tài)環(huán)境尤為適宜蜱蟲的繁衍，從而提高了蜱媒疾病的傳播概率。此外，林區(qū)內(nèi)種類繁多的野生動物種群使得疾病的防控工作面臨更為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。周期性病變特指某些疾病在特定節(jié)令中發(fā)病率顯著升高，本研究特意挑選了蜱蟲繁衍活躍期以收集所需樣本。利用分子生物學(xué)技術(shù)對來自我國牡丹江東寧市區(qū)域的268例反芻動物（涵蓋牛種及綿羊）血液樣本進(jìn)行分析，結(jié)果僅針對單一病原類別進(jìn)行檢測，其陽性反應(yīng)比例高達(dá)16.42%。此數(shù)據(jù)表明，該區(qū)域反芻動物面臨由蜱傳播的病原侵害的顯著風(fēng)險，故養(yǎng)殖從業(yè)者及相關(guān)管理機(jī)構(gòu)需提升對蜱類害蟲的防控措施。通過對牡丹江東寧市反芻動物的感染情況統(tǒng)計結(jié)果顯示，東寧市牛的梨形蟲感染率（34.04%）顯著高于綿羊（6.90%）。這一現(xiàn)象可能與以下幾點因素相關(guān)：1.宿主生態(tài)行為。牛作為放牧動物，活動范圍廣且與蜱蟲棲息地（如草地、灌木叢）接觸更頻繁，增加了感染風(fēng)險。2.免疫應(yīng)答差異。牛對梨形蟲的免疫反應(yīng)可能較弱，而綿羊可能通過遺傳或獲得性免疫（如特定MHC基因型）限制蟲體增殖。3.媒介蜱偏好性。硬蜱科媒介（如全溝硬蜱）可能對牛的血源更具趨性，導(dǎo)致傳播效率差異。關(guān)于梨形蟲的同源性分析結(jié)果顯示，檢測到的泰勒蟲均為中華泰勒蟲（Theileriasinensis），而巴貝斯蟲為未定種（Babesiasp.）。且DQ-T1與青海株（MG784413.1）同源性達(dá)100%，由此可懷疑該珠可能為我國北方廣泛分布且遺傳保守性較高。而巴貝斯蟲的同源性分析顯示DQ-1與黑龍江蜱源株（KU204785.1）高度同源（99.9%），但DQ-2單獨成支，可能代表一種新基因型。REF_Ref3570\w\h通過系統(tǒng)發(fā)育分析實驗結(jié)果可知泰勒蟲的DQ-T4單獨成支，可能與宿主適應(yīng)性突變或地理位置相關(guān)，類似現(xiàn)象在Theileriaannulata種群中亦有報道（Hassanetal.,2021）。而巴貝斯蟲的DQ-2獨立分支可能存在通過水平基因轉(zhuǎn)移（HGT）獲得獨特功能基因（如嘌呤代謝相關(guān)基因），從而增強(qiáng)宿主適應(yīng)性。將結(jié)果序列與GenBank中的巴貝斯蟲18SrDNA部分序列構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)本實驗中所獲得的Babesiasp.DQ-1序列與所報道的黑龍江蜱Babesiasp.(KU204785.1)在同一分支，推測梨形蟲種類（如中華泰勒蟲）與本地優(yōu)勢蜱種（全溝硬蜱）可能存在協(xié)同進(jìn)化關(guān)系：全溝硬蜱唾液中的免疫抑制因子可能促進(jìn)梨形蟲子孢子的存活與傳播（蜱唾液蛋白的適配性）REF_Ref22132\w\h[23]。而巴貝斯蟲未定種在黑龍江蜱中的高檢出率（KU204785.1）也可側(cè)面反映出其可能已適應(yīng)本地蜱蟲的生理環(huán)境，形成穩(wěn)定傳播鏈REF_Ref3171\w\hREF_Ref4246\w\hREF_Ref4295\w\h研究人員Liu等REF_Ref21377\w\h[10]針對中國西北地區(qū)普遍流行的羊巴貝斯蟲未定種類，對其18SrRNA基因序列實施了測定工作。通過將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的其它巴貝斯蟲及泰勒蟲基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹進(jìn)行對比分析，研究揭示出在中國流行的羊巴貝斯蟲與莫氏巴貝斯蟲（B.motasi）展現(xiàn)出高度的同源關(guān)系。同時，新疆地區(qū)羊群感染的巴貝斯蟲與B.ovis及B.crassa呈現(xiàn)較為緊密的親緣關(guān)系。經(jīng)深入研究，確認(rèn)在中國羊群中感染的巴貝斯蟲至少包括兩個種類，分別為莫氏巴貝斯蟲以及新疆喀什地區(qū)巴貝斯蟲未定種類。在我國，羅建勛團(tuán)隊REF_Ref22243\w\h[24]對本土發(fā)現(xiàn)的四種牛巴貝斯蟲及一種未定種牛巴貝斯蟲的18SrRNA基因?qū)嵤┝藴y序分析。通過將該測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的牛巴貝斯蟲18SrRNA基因序列進(jìn)行對比，研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)刻點血蜱傳播的大巴貝斯蟲伊犁株與經(jīng)長角血蜱傳播的三株卵形巴貝斯蟲展現(xiàn)出顯著的遺傳差異，表明其應(yīng)分屬于兩個不同的物種。此外，由小亞璃眼蜱傳播的牛巴貝斯蟲未定種與目前已知的任何種類均存在差異，表明其在中國可能代表一個新的物種。在針對我國青海地區(qū)血蜱傳播的羊群及牦牛所感染的泰勒蟲進(jìn)行分子分類學(xué)研究的過程中，Yin等研究者REF_Ref4295\w\h[15]揭示了一種新的傳播現(xiàn)象。研究結(jié)果表明，青海血蜱具備傳播三種不同泰勒蟲的能力，其中兩種特異性感染羊群，這兩種泰勒蟲與先前報道的種類存在差異，被鑒定為新型泰勒蟲種，分別命名為呂氏泰勒蟲（Theilerialuwenshuni）及尤氏泰勒蟲（Theileriauilenbergi）。第三種泰勒蟲感染牛群，經(jīng)分子生物學(xué)手段分析，確認(rèn)為中華泰勒蟲（Theileriasinensis）。而本研究的主要位置集中在黑龍江省牡丹江東寧市，對牡丹江市及整個黑龍江省反芻動物梨形蟲病的流行性可能具有局限性，因此無法進(jìn)一步代表東北地區(qū)的數(shù)據(jù)，未來希望可以擴(kuò)大到牡丹江市大部分地區(qū)甚至黑龍江其他市來調(diào)查統(tǒng)計梨形蟲的分布情況、流行特征及進(jìn)化趨勢，從而為制定有效的防控措施提供科學(xué)依據(jù)，對抑制梨形蟲的傳播途徑和感染范圍做出貢獻(xiàn)。4結(jié)論在本項研究中，共計鑒定出兩種經(jīng)蜱傳播的梨形蟲病原體。在感染率方面，梨形蟲在牛群中的比例高于綿羊。特別值得關(guān)注的是，Babesiasp.屬于人畜共患病原體，因此，強(qiáng)化預(yù)防與控制措施顯得尤為迫切。參考文獻(xiàn)BrownCG.Dynamicsandimpactoftickbornediseasesofcattle[J].TropicalAnimalHealthandProduction,1997,29:1s-3s.程雪.羊泰勒蟲病的臨床癥狀、診斷和防治措施[J].現(xiàn)代畜牧科技,2017,(01):131.陳保仁.奶牛巴貝斯蟲病的流行病學(xué)、臨床癥狀、診斷及防治[J].現(xiàn)代畜牧科技,2017,(11):123.崔斌成.牛巴貝斯蟲病的診斷與防治[J].畜禽業(yè),2025,36(01):79-81.張文波.牛羊巴貝斯蟲和泰勒蟲病的防治[J].中國畜牧業(yè),2024,(15):121-122..潘文章.牛巴貝斯蟲病及其防治措施[J].農(nóng)村新技術(shù),2024,(03):40-41.王奉先.嚇氏泰勒焦蟲[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,1982(1).Bell-SakyiL,KoneyEBM,DogbeyO,etal.Incidenceandprevalenceoftick-bornehaemoparasitesindomesticruminantsinGhana[J].VeterinaryParasitology,2004,124(1):25-42.GaoZH,HuangTH,JiangBG,etal.WidedistributionandgeneticdiversityofBabesiamicrotiinsmallmammalsfromYunnanProvince,southwesternChina[J].PLoSneglectedtropicaldiseases,2017,11(10):e0005898.DwivediS,MallickK,MalhotraM.Babesiosis:clinicalcasesinIndianwaterbuffaloes[J].TheIndianveterinaryjournal,1979,56(4):333-335.LiuAH,YinH,GuanGQ,etal.AtleasttwogeneticallydistinctlargeBabesiaspeciesinfectivetosheepandgoatsinChina[J].VeterinaryParasitology,2007,147(3-4):246-251.LiuQ,ZhaoJ,ZhouY,etal.StudyonsomemolecularcharacterizationofBabesiaorientalis[J].VeterinaryParasitology,2005,130(3-4):191-198.SchnittgerL,Yin