(2025年)儀器分析高效液相色譜試題及答案一、單項選擇題（每題2分，共20分）1.高效液相色譜（HPLC）中，以下哪種檢測器無法用于梯度洗脫？A.紫外-可見檢測器（UV-VIS）B.熒光檢測器（FLD）C.示差折光檢測器（RID）D.蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）2.反相HPLC中，若流動相甲醇-水比例由30:70調(diào)整為50:50，目標(biāo)組分的保留時間會：A.延長B.縮短C.不變D.先延長后縮短3.衡量色譜柱柱效的關(guān)鍵參數(shù)是：A.分離度（R）B.理論塔板數(shù)（n）C.容量因子（k）D.拖尾因子（T）4.對于強(qiáng)極性、熱不穩(wěn)定的小分子化合物，最適宜的HPLC分離模式是：A.正相色譜B.反相色譜C.離子交換色譜D.尺寸排阻色譜5.以下哪種操作會導(dǎo)致HPLC色譜峰展寬？A.減小進(jìn)樣體積B.降低流動相流速C.使用粒徑更小的色譜填料D.縮短色譜柱長度6.某樣品在C18色譜柱上保留較弱，峰形尖銳但與相鄰峰未完全分離，優(yōu)先考慮的優(yōu)化措施是：A.提高流動相pHB.降低流動相有機(jī)相比例C.增加柱溫D.更換為C8色譜柱7.檢測氨基酸類化合物時，若樣品無紫外吸收，最合理的前處理方法是：A.酸化處理B.衍生化標(biāo)記（如丹磺酰氯）C.堿化處理D.固相萃取富集8.以下關(guān)于UHPLC（超高效液相色譜）的描述，錯誤的是：A.采用粒徑<2μm的色譜填料B.操作壓力顯著高于傳統(tǒng)HPLCC.分析時間通常短于傳統(tǒng)HPLCD.對流動相純度要求低于傳統(tǒng)HPLC9.流動相脫氣不充分時，最可能出現(xiàn)的問題是：A.基線漂移B.保留時間波動C.色譜柱壽命縮短D.檢測器信號噪聲增大10.采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析時，關(guān)鍵要求是：A.內(nèi)標(biāo)物與待測物保留時間一致B.標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液的色譜條件完全相同C.流動相pH嚴(yán)格控制在中性D.色譜柱溫度波動不超過5℃二、填空題（每空1分，共20分）1.高效液相色譜的基本分離原理是基于樣品中各組分在（）和（）之間的分配差異。2.反相色譜常用的固定相是（），流動相以（）為主，極性（）固定相。3.理論塔板數(shù)的計算公式為（），其中tR代表（），W1/2代表（）。4.分離度R的表達(dá)式為（），當(dāng)R≥（）時，可認(rèn)為兩峰完全分離。5.紫外檢測器的檢測限通常比示差折光檢測器（），但無法檢測（）的物質(zhì)。6.梯度洗脫是指在分離過程中逐漸改變流動相的（）或（），適用于（）樣品的分離。7.色譜峰拖尾的常見原因包括（）、（）或（）。8.流動相的pH值會影響（）色譜的保留行為，通常需控制在色譜柱填料的（）范圍內(nèi)（如C18柱一般為pH2-8）。三、簡答題（每題8分，共32分）1.簡述反相高效液相色譜（RP-HPLC）的分離機(jī)制，并說明流動相有機(jī)相比例、柱溫對保留時間的影響規(guī)律。2.比較紫外-可見檢測器（UV-VIS）與蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）的優(yōu)缺點，各舉1例適用的分析場景。3.某實驗室使用HPLC分析中藥提取物中的生物堿類成分時，出現(xiàn)色譜峰展寬、分離度下降的問題，可能的原因有哪些？提出3種優(yōu)化措施。4.簡述HPLC方法驗證中“系統(tǒng)適用性試驗”的主要內(nèi)容及意義。四、綜合題（共28分）題目1（14分）：某研究小組需建立HPLC方法測定人血漿中的某藥物（弱酸性，pKa=4.5，紫外吸收波長254nm），要求定量檢測限為0.1μg/mL。已知該藥物在C18柱上保留較強(qiáng)，血漿中存在蛋白質(zhì)及內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。（1）設(shè)計色譜條件：選擇色譜柱類型、流動相組成（需考慮pH調(diào)節(jié)）、檢測器及檢測波長。（2）提出樣品前處理的關(guān)鍵步驟（至少3步），并說明每一步的目的。（3）若初始實驗中色譜峰出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾（拖尾因子T=1.8），可能的原因是什么？給出2種解決方法。題目2（14分）：某實驗室使用C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）、流動相（甲醇-水=40:60，pH=3.0）、流速1.0mL/min、柱溫30℃，分離3種組分（A、B、C），得到色譜圖如下（假設(shè)圖中數(shù)據(jù)：t0=2.0min，tR(A)=5.0min，tR(B)=8.0min，tR(C)=12.0min；W(A)=0.8min，W(B)=1.0min，W(C)=1.2min）。（1）計算組分B的容量因子（k）、理論塔板數(shù)（n）及組分B與C的分離度（R）。（2）若希望縮短分析時間，同時保持組分B與C的分離度≥1.5，可采取哪些措施？（至少3種）答案一、單項選擇題1.C2.B3.B4.B5.B6.B7.B8.D9.D10.B二、填空題1.固定相；流動相2.C18（或十八烷基硅烷鍵合硅膠）；水；大于3.n=5.54×(tR/W1/2)2；保留時間；半高峰寬4.R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)；1.55.低（或更靈敏）；無紫外吸收（或末端吸收）6.組成；比例；復(fù)雜（或?qū)挶Ａ舴秶?.固定相活性位點未封閉；流動相pH不合適；柱超載（或進(jìn)樣量過大）8.離子型（或可解離）；耐受三、簡答題1.分離機(jī)制：反相色譜中，固定相為非極性（如C18），流動相為極性（如水-甲醇），樣品組分通過疏溶劑作用與固定相發(fā)生疏水相互作用。極性小的組分與固定相作用力強(qiáng)，保留時間長；極性大的組分保留時間短。流動相有機(jī)相比例：有機(jī)相比例升高（如甲醇比例增加），流動相極性降低，組分與固定相的疏水作用減弱，保留時間縮短；反之，有機(jī)相比例降低，保留時間延長。柱溫：柱溫升高，分子擴(kuò)散加劇，組分在固定相的保留減弱，保留時間縮短；同時，柱溫升高可能改善傳質(zhì)，提高柱效。2.UV-VIS檢測器優(yōu)點：靈敏度高（檢測限可達(dá)ng級）、線性范圍寬、響應(yīng)快、適用于梯度洗脫；缺點：僅能檢測有紫外吸收的物質(zhì)（需共軛結(jié)構(gòu)）。適用場景：檢測含苯環(huán)的藥物（如阿司匹林）。ELSD檢測器優(yōu)點：通用型檢測器，可檢測無紫外吸收的物質(zhì)（如糖類、脂質(zhì)）；缺點：靈敏度較低（檢測限通常為μg級）、響應(yīng)非線性、不適用于梯度洗脫（需揮發(fā)性流動相）。適用場景：檢測中藥中的多糖類成分。3.可能原因：①色譜柱老化（固定相流失或污染）；②流動相pH不合適（生物堿為堿性，未完全質(zhì)子化導(dǎo)致與硅膠表面硅羥基作用增強(qiáng)）；③流速過高或柱溫過低（傳質(zhì)阻力大）；④樣品前處理不充分（雜質(zhì)污染色譜柱）。優(yōu)化措施：①更換新色譜柱或再生色譜柱（用強(qiáng)溶劑沖洗）；②調(diào)節(jié)流動相pH至3-4（使生物堿充分質(zhì)子化，減少拖尾）；③降低流速（如0.8mL/min）或提高柱溫（如35℃）；④加強(qiáng)樣品前處理（如固相萃取去除大分子雜質(zhì)）。4.系統(tǒng)適用性試驗內(nèi)容：①理論塔板數(shù)（n）：評估柱效，需達(dá)到規(guī)定值；②分離度（R）：相鄰峰分離度≥1.5，確保分離完全；③拖尾因子（T）：峰對稱性，一般要求0.95≤T≤1.05；④重復(fù)性（RSD）：連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積或保留時間RSD≤2.0%。意義：驗證色譜系統(tǒng)是否符合分析要求，確保方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，避免因儀器或色譜條件波動導(dǎo)致結(jié)果偏差。四、綜合題題目1（1）色譜條件：-色譜柱：C18柱（或耐酸型C18，因藥物為弱酸性）；-流動相：水（含0.1%甲酸，調(diào)節(jié)pH至3.0，使藥物以分子形式存在，減少拖尾）-甲醇（比例根據(jù)保留調(diào)整，如初始30:70）；-檢測器：紫外檢測器，檢測波長254nm（與藥物吸收峰匹配）。（2）樣品前處理步驟：①蛋白沉淀：加入乙腈（或甲醇），沉淀血漿中的蛋白質(zhì)（避免堵塞色譜柱）；②離心：3000rpm離心10min，分離上清液（獲取含藥物的溶液）；③過濾：0.22μm微孔濾膜過濾（去除顆粒雜質(zhì)，保護(hù)色譜柱）；④稀釋（可選）：若藥物濃度過高，用流動相稀釋至線性范圍內(nèi)（避免柱超載）。（3）拖尾原因：①藥物為弱酸性，流動相pH未有效抑制解離（如pH>pKa，藥物部分解離，與硅膠表面硅羥基作用）；②色譜柱硅羥基未完全封端（殘留活性位點吸附藥物）；③進(jìn)樣量過大（柱超載）。解決方法：①調(diào)節(jié)流動相pH至2.5-3.0（低于pKa2個單位，使藥物充分質(zhì)子化）；②更換封端更完全的色譜柱（如極性封端C18柱）；③減少進(jìn)樣體積（如從20μL降至10μL）。題目2（1）計算：-組分B的容量因子k=(tR(B)-t0)/t0=(8.0-2.0)/2.0=3.0；-理論塔板數(shù)n(B)=5.54×(tR(B)/W(B))2=5.54×(8.0/1.0)2=5.54×64=354.56（約355）；-分離度R(B,C)=2(tR(C)-tR(B))/(W(B)+W(C))=2×(12.0-8.0)/(1.0+1.2)=8.0/2.