疫苗菌毒種培育工工藝作業(yè)技術(shù)規(guī)程文件名稱：疫苗菌毒種培育工工藝作業(yè)技術(shù)規(guī)程編制部門：綜合辦公室編制時間：2025年類別：兩級管理標準編號：審核人：版本記錄：第一版批準人：一、總則

本規(guī)程適用于疫苗菌毒種培育工藝作業(yè)過程中的技術(shù)規(guī)范，包括菌毒種的篩選、保存、繁殖、純化等環(huán)節(jié)。規(guī)程要求參與人員具備相應的專業(yè)知識，嚴格遵守操作規(guī)程，確保菌毒種的純度和穩(wěn)定性，為疫苗生產(chǎn)提供合格的菌毒種原料。同時，操作過程中應注重環(huán)境保護和生物安全。

二、技術(shù)準備

1.技術(shù)條件：

-操作人員應經(jīng)過專業(yè)培訓，具備菌毒種培育的相關(guān)知識和技能。

-工作環(huán)境應滿足無菌操作要求，包括溫度、濕度、潔凈度等。

-實驗室應配備必要的生物安全柜、超凈工作臺、顯微鏡、離心機、培養(yǎng)箱等設備。

-使用的水質(zhì)應符合GB5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》。

2.設備校驗：

-生物安全柜、超凈工作臺等無菌操作設備應定期進行無菌檢測，確保其性能符合操作要求。

-培養(yǎng)箱、離心機等關(guān)鍵設備應進行性能校驗，確保其溫度、轉(zhuǎn)速等參數(shù)準確可靠。

-水浴鍋、電子天平等輔助設備應定期進行校準，確保其測量精度。

3.材料準備：

-菌種來源：選用經(jīng)過鑒定和驗證的菌種，確保其純度和活力。

-培養(yǎng)基：按照GB/T604.1-2002《微生物培養(yǎng)基通用試驗方法》制備培養(yǎng)基，并確保其無菌性。

-抗生素：選用對目標菌種有效的抗生素，并按照規(guī)定濃度添加。

-其他試劑：根據(jù)實驗需求準備必要的試劑，如指示劑、緩沖液等。

4.參數(shù)設置：

-培養(yǎng)溫度：根據(jù)菌種特性，設定適宜的培養(yǎng)溫度，通常在25-37℃之間。

-培養(yǎng)時間：根據(jù)菌種生長曲線，確定適宜的培養(yǎng)時間，一般為24-48小時。

-液體培養(yǎng)基的pH值：根據(jù)菌種需求，調(diào)整培養(yǎng)基的pH值，通常在6.5-7.5之間。

-培養(yǎng)基濃度：根據(jù)實驗目的，調(diào)整培養(yǎng)基的濃度，確保菌種能夠正常生長。

5.實驗室安全管理：

-操作人員應穿戴合適的防護服、手套、口罩等個人防護用品。

-實驗室內(nèi)禁止吸煙、飲食和化妝，防止交叉污染。

-嚴格按照生物安全操作規(guī)程進行操作，防止菌種逃逸和感染。

-定期對實驗室進行消毒處理，確保實驗環(huán)境的安全。

6.文檔記錄：

-操作人員應詳細記錄實驗過程，包括菌種名稱、培養(yǎng)基成分、操作步驟、觀察結(jié)果等。

-實驗記錄應清晰、完整，便于后續(xù)分析和追溯。

三、技術(shù)操作程序

1.菌種復蘇與純化

-將保存的菌種從凍存管中取出，置于37℃水浴中復溫30分鐘。

-使用無菌接種環(huán)取適量菌種，接種于適宜的培養(yǎng)基平板上。

-將平板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時，觀察菌落生長情況。

-挑選單菌落進行純化，重復接種直至獲得純菌。

2.菌種擴大培養(yǎng)

-將純化后的菌種接種于液體培養(yǎng)基中，置于搖床或培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

-根據(jù)菌種生長曲線，調(diào)整培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速，確保菌種正常生長。

-觀察菌液濁度，當濁度達到預設標準時，終止培養(yǎng)。

3.菌種純度檢測

-從擴大培養(yǎng)的菌液中取適量樣品，進行涂布平板法檢測。

-將涂布后的平板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時，觀察菌落形態(tài)。

-對菌落進行分類，確認菌種純度。

4.菌種保存

-將純化后的菌種接種于凍存培養(yǎng)基中，置于-80℃冰箱中保存。

-定期對凍存菌種進行復蘇和純化，確保菌種活力。

5.操作順序與注意事項

-操作前，確保實驗室內(nèi)環(huán)境符合無菌要求。

-按照無菌操作規(guī)程進行操作，避免交叉污染。

-操作過程中，嚴格遵循無菌技術(shù)，如使用無菌器械、消毒雙手等。

-操作順序：復蘇→純化→擴大培養(yǎng)→純度檢測→保存。

6.技術(shù)方法

-使用無菌操作技術(shù)進行菌種接種、培養(yǎng)和保存。

-根據(jù)菌種特性，選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。

-利用顯微鏡觀察菌落形態(tài)，判斷菌種純度。

7.故障處理

-若菌種生長緩慢或停止生長，檢查培養(yǎng)基、溫度、pH值等條件，排除故障。

-若出現(xiàn)污染，立即停止操作，對污染源進行消毒處理，并對設備進行清洗和消毒。

-若菌種活力下降，重新復蘇純化，確保菌種活力。

-若出現(xiàn)意外情況，立即向相關(guān)人員報告，并采取相應措施處理。

四、設備技術(shù)狀態(tài)

1.技術(shù)參數(shù)標準

-生物安全柜：確保無菌操作區(qū)風速符合ISO14644-1標準，風速均勻分布，無死角。

-超凈工作臺：風速應符合ISO14644-1標準，工作區(qū)風速應穩(wěn)定在0.45m/s，無渦流。

-培養(yǎng)箱：溫度控制精度應在±0.5℃，濕度控制精度應在±5%。

-離心機：轉(zhuǎn)速精度應在±1%，運行平穩(wěn)，無異常振動。

-顯微鏡：放大倍數(shù)應準確，調(diào)焦系統(tǒng)應靈敏，圖像清晰。

-水浴鍋：溫度控制精度應在±0.5℃，溫度穩(wěn)定，無泄漏。

-電子天平：稱量精度應符合GB/T8170標準，讀數(shù)穩(wěn)定，操作簡便。

2.異常狀態(tài)識別

-生物安全柜：風速不穩(wěn)定、氣流方向異常、報警燈亮等。

-超凈工作臺：風速異常、工作區(qū)污染、報警燈亮等。

-培養(yǎng)箱：溫度波動大、濕度異常、設備故障等。

-離心機：轉(zhuǎn)速不穩(wěn)定、震動過大、報警燈亮等。

-顯微鏡：放大倍數(shù)不準確、調(diào)焦困難、圖像模糊等。

-水浴鍋：溫度不穩(wěn)定、泄漏、操作面板故障等。

-電子天平：讀數(shù)不準確、故障代碼顯示等。

3.狀態(tài)檢測方法

-定期進行設備性能測試，如生物安全柜的風速測試、超凈工作臺的風速和壓力測試等。

-使用校準儀器對設備進行校準，如溫度計、壓力計等。

-通過目視檢查和聽覺檢查來識別設備是否有明顯的物理損傷或異常聲音。

-運行過程中，記錄設備的工作參數(shù)，如溫度、濕度、轉(zhuǎn)速等，并與標準值進行對比。

-對設備進行定期維護和保養(yǎng)，如更換空氣過濾器、清潔設備表面等。

4.維護與保養(yǎng)

-設備應按照制造商的維護指南進行定期保養(yǎng)。

-操作人員應接受專業(yè)培訓，了解設備的維護保養(yǎng)知識。

-設備的維護保養(yǎng)記錄應詳細記錄，包括保養(yǎng)日期、保養(yǎng)內(nèi)容、保養(yǎng)人員等信息。

-發(fā)現(xiàn)設備異常時，應立即停止使用，并通知維修人員進行檢查和維修。

5.狀態(tài)報告

-定期對設備的技術(shù)狀態(tài)進行評估，并形成狀態(tài)報告。

-狀態(tài)報告應包括設備名稱、型號、檢測日期、檢測結(jié)果、維護保養(yǎng)情況等。

-狀態(tài)報告應提交給相關(guān)部門，以便進行設備管理和決策。

五、技術(shù)測試與校準

1.測試方法

-生物安全柜測試：使用風速儀測量無菌操作區(qū)的風速，確保其符合ISO14644-1標準。

-超凈工作臺測試：使用風速計和壓力計，檢查風速和壓力是否穩(wěn)定，工作區(qū)風速是否符合要求。

-培養(yǎng)箱測試：使用溫度計和濕度計，檢測培養(yǎng)箱的溫度和濕度控制是否符合設定標準。

-離心機測試：使用轉(zhuǎn)速計和振動計，驗證離心機的轉(zhuǎn)速和運行時的振動是否在規(guī)定范圍內(nèi)。

-顯微鏡測試：通過目測和圖像質(zhì)量檢查，確保顯微鏡的放大倍數(shù)和調(diào)焦性能符合要求。

-水浴鍋測試：使用溫度計，檢查水浴鍋的溫度控制是否準確。

-電子天平測試：使用標準砝碼，校準電子天平的稱量精度。

2.校準標準

-生物安全柜、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、離心機等設備的校準應符合ISO17025標準。

-顯微鏡的校準應符合制造商的技術(shù)規(guī)范。

-水浴鍋的校準應符合GB/T8170標準。

-電子天平的校準應符合GB/T8170標準。

3.結(jié)果處理

-測試和校準的結(jié)果應詳細記錄，包括測試日期、測試人員、測試設備和測試方法。

-對于不符合標準的設備，應立即停止使用，并采取措施進行維修或更換。

-對于測試和校準中發(fā)現(xiàn)的任何異常，應分析原因，并制定相應的糾正和預防措施。

-結(jié)果記錄應保存至少五年，以便于未來的審計和追溯。

-定期對測試和校準結(jié)果進行審查，確保設備始終處于良好的技術(shù)狀態(tài)。

4.校準周期

-生物安全柜、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、離心機等設備的校準周期應根據(jù)制造商的推薦和使用頻率來確定，通常為6個月至1年。

-顯微鏡、水浴鍋和電子天平的校準周期也應根據(jù)制造商的推薦和使用頻率來確定，通常為1年。

5.校準機構(gòu)

-選擇具有資質(zhì)的校準機構(gòu)進行設備的校準，確保校準結(jié)果的準確性和可靠性。

-校準機構(gòu)的資質(zhì)應經(jīng)過認證，并符合國家相關(guān)法規(guī)和標準。

六、技術(shù)操作姿勢

1.操作姿態(tài)

-站立時，雙腳與肩同寬，保持身體平衡。

-腰部挺直，避免長時間低頭或彎腰，以減少腰背負擔。

-臂部自然下垂，肘部微曲，避免過度伸展。

-頭部保持正直，視線水平，避免頸部過度前傾或后仰。

-操作時，手腕放松，避免長時間重復性動作導致的腕部疲勞。

2.移動范圍

-操作臺周圍留有足夠的空間，便于操作者移動和取用物品。

-移動時，使用正確的步伐，避免突然轉(zhuǎn)身或跳躍，以防跌倒或扭傷。

-避免長時間站立或坐姿，適時調(diào)整位置，減少疲勞。

3.休息安排

-每工作45-60分鐘后，應至少休息5-10分鐘，進行身體放松和眼部休息。

-休息時，可進行輕微的伸展運動，如頸部、肩部、腰部和下肢的伸展。

-休息區(qū)域應舒適，避免在嘈雜或通風不良的環(huán)境中休息。

4.環(huán)境調(diào)節(jié)

-工作環(huán)境應保持適宜的溫度和濕度，避免過熱或過冷。

-確保良好的照明，避免眼睛疲勞。

5.安全防護

-操作過程中，穿戴適當?shù)膫€人防護裝備，如防護服、手套、眼鏡等。

-使用安全工具和設備，如防滑鞋、防靜電手環(huán)等。

-遵守實驗室的安全規(guī)定，避免接觸有害物質(zhì)和生物危害。

6.姿勢調(diào)整

-定期檢查和調(diào)整操作姿勢，確保身體舒適，避免長時間保持同一姿勢導致的肌肉緊張。

-對于需要長時間操作的設備，如顯微鏡、電腦等，應調(diào)整高度和距離，以適應操作者的身體條件。

7.培訓與監(jiān)督

-新員工應接受專業(yè)培訓，學習正確的操作姿勢和安全規(guī)范。

-定期對操作者進行姿勢和操作的監(jiān)督，確保規(guī)范執(zhí)行。

七、技術(shù)注意事項

1.技術(shù)要點

-確保所有操作均遵循無菌技術(shù)原則，避免污染。

-在進行菌毒種操作前，應仔細閱讀相關(guān)文獻和操作手冊，了解菌種特性和安全注意事項。

-操作過程中，應保持實驗室環(huán)境的清潔和整潔，定期進行消毒。

-使用設備前，應確保其處于正常工作狀態(tài)，并按照操作規(guī)程進行操作。

-對于特殊試劑和化學品，應嚴格按照說明書進行使用，注意個人防護。

2.避免的錯誤

-避免在操作過程中隨意離開實驗臺，防止操作中斷或污染。

-避免在操作過程中交談或分心，確保操作準確無誤。

-避免使用未經(jīng)消毒的物品接觸菌種或培養(yǎng)基。

-避免在操作過程中直接接觸菌種或培養(yǎng)基，應使用無菌器械。

-避免在實驗室內(nèi)進食、飲水或吸煙，以防交叉污染。

3.必須遵守的紀律

-嚴格遵守實驗室安全規(guī)程，如穿戴防護服、手套、口罩等。

-未經(jīng)允許，不得將實驗室內(nèi)物品帶出實驗室。

-不得隨意更改實驗設備或操作流程。

-實驗室內(nèi)禁止使用手機等電子設備，以免干擾實驗操作。

-實驗室內(nèi)禁止進行與實驗無關(guān)的活動，如大聲喧嘩、打鬧等。

-實驗結(jié)束后，應清理實驗臺，確保所有用品歸位，并做好記錄。

4.數(shù)據(jù)記錄與報告

-操作過程中，應詳細記錄實驗數(shù)據(jù)，包括時間、溫度、壓力、觀察結(jié)果等。

-實驗數(shù)據(jù)應真實、準確，不得篡改或偽造。

-實驗報告應完整、規(guī)范，包括實驗目的、方法、結(jié)果和討論。

5.應急處理

-了解并熟悉實驗室內(nèi)的應急設備和使用方法，如滅火器、急救箱等。

-發(fā)生意外情況時，應立即停止操作，并按照應急預案進行處理。

-確保所有人員了解緊急疏散路線和集合點。

6.持續(xù)學習與改進

-操作人員應不斷學習新技術(shù)、新方法，提高自身技能水平。

-定期對實驗流程和操作規(guī)范進行審查，發(fā)現(xiàn)不足及時改進。

八、作業(yè)收尾處理

1.數(shù)據(jù)記錄

-完成操作后，應立即對實驗數(shù)據(jù)進行整理和記錄，確保數(shù)據(jù)的準確性和完整性。

-數(shù)據(jù)記錄應包括實驗目的、方法、結(jié)果、觀察現(xiàn)象以及任何異常情況。

-數(shù)據(jù)記錄應使用規(guī)范化的格式，便于查閱和分析。

2.設備狀態(tài)確認

-使用完畢后，應檢查所有設備是否處于正常工作狀態(tài)，如有異常，應立即報告并采取措施。

-清潔并整理實驗設備，確保下次使用時設備能夠正常運行。

-對設備進行必要的維護和保養(yǎng)，如更換耗材、校準儀器等。

3.資料整理

-將實驗記錄、數(shù)據(jù)報告、操作手冊等相關(guān)資料整理歸檔，確保資料的安全和便于檢索。

-實驗記錄和報告應按照實驗室規(guī)定的時間段進行歸檔，并確保歸檔資料的安全保密。

4.實驗室清潔

-清理實驗臺，移除所有實驗用品，確保工作區(qū)域干凈整潔。

-清潔實驗設備，去除殘留物和污染物，使用適當?shù)那鍧崉┖拖緞?/p>

-檢查實驗室廢物處理是否符合規(guī)定，確保有害廢物得到正確處理。

5.安全檢查

-確認所有實驗操作都已安全結(jié)束，所有實驗用品都已妥善存放。

-關(guān)閉所有不必要的電源和水源，確保實驗室安全。

6.環(huán)境檢查

-確認實驗室環(huán)境符合安全標準，無安全隱患，如通風良好、溫度適宜等。

九、技術(shù)故障處理

1.故障診斷

-當設備或系統(tǒng)出現(xiàn)故障時，操作人員應立即停止操作，并記錄故障現(xiàn)象。

-根據(jù)故障現(xiàn)象，結(jié)合設備操作手冊和故障代碼，初步判斷故障原因。

-如無法自行診斷，應立即通知設備維護人員或技術(shù)支持人員。

2.排除程序

-維護人員或技術(shù)支持人員到達現(xiàn)場后，應詳細詢問故障現(xiàn)象，并再次確認故障。

-根據(jù)