原生質(zhì)體融合

一原生質(zhì)體融合二原生質(zhì)體融合的特點(diǎn)三原生質(zhì)體融合的過程四原生質(zhì)體融合的應(yīng)用一原生質(zhì)體融合定義：原生質(zhì)體融合就是將兩個親株的細(xì)胞壁分別通過酶解作用加以剝除，使其在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包被著的球狀原生質(zhì)體。然后將兩個親株的原生質(zhì)體在高滲條件下混合，由聚乙二醇助融，使它們相互凝集，通過細(xì)胞質(zhì)融合接著發(fā)生兩次基因組之間的接觸、交換、遺傳重組，在再生細(xì)胞中獲得重組體。一原生質(zhì)體融合原理：兩個具有不同基因型的細(xì)胞，采用適宜的水解酶剝離細(xì)胞壁后，在融合劑作用下，兩原生質(zhì)體接觸，融合成為異核體，經(jīng)過繁殖復(fù)制進(jìn)一步核融合，形成雜合二倍體，再經(jīng)過染色體交換產(chǎn)生重組體，達(dá)到基因重組的目的，最后對重組體進(jìn)行生產(chǎn)性能，生理生化和遺傳特性分析。二原生質(zhì)體融合的特點(diǎn)1雜交頻率較高由于原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁的障礙，而且在原生質(zhì)體融合時加入融合促進(jìn)劑PEG，所以微生物原生質(zhì)體間的雜交頻率都明顯高于常規(guī)雜交方法。2受接合型或致育性的限制較小由于兩親株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利不同種屬間微生物的雜交。另外，出于原生質(zhì)體融合是和致育性沒有關(guān)系的細(xì)胞雜交，所以其受接合型或致育性的限制就比較小。

3重組體種類較多由于原生質(zhì)體融合后，兩個親株的整套基因組之間發(fā)生相互接觸．有機(jī)會發(fā)生多次交換，可以產(chǎn)生各種各樣的基因組合而得到多種類型的重組體4遺傳物質(zhì)的傳遞更為完整由于原生質(zhì)體融合是兩個親株的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行類似合二為一的過程，因此，遺傳物質(zhì)的交換更為完整。原核微生物中可以得到將兩個或更多個完整的基因組攜帶到—起。

5可以獲得性狀優(yōu)良的重組體可以與其他的育種方法相結(jié)合，將從其他方法獲得的優(yōu)良性狀，通過原生質(zhì)體融合再組合到一個單菌株中。6可以提高育種（篩選）效率采用溫度、藥物或紫外線照射等處理鈍化一方親株的原生質(zhì)體，然后再與另一親株的原生質(zhì)體融合，因此就可以在篩選過程中除去一方親株，從而提高篩選效率。7有可能采用產(chǎn)量性狀較高的茵株作為融合親株由于遺傳標(biāo)記如營養(yǎng)缺陷型往往影響工業(yè)微生物的某些生物合成能力，而進(jìn)行一般基因重組時又必須采用較多的遺傳標(biāo)記，因此，勢必使出發(fā)菌株的生產(chǎn)性能下降而影響雜交子代的生產(chǎn)水平。但由于原生質(zhì)體融合頻率較高．所以采用較少標(biāo)記或不帶標(biāo)記的菌株進(jìn)行融合．這對改良生產(chǎn)菌株性能來說非常有效。8有助于建立工業(yè)微生物的轉(zhuǎn)化體系三原生質(zhì)體融合的過程親株甲乙原生質(zhì)體融合體酶解融合再生再生篩選優(yōu)化

遺傳標(biāo)記親株篩選

原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體再生及再生頻率計(jì)算

原生質(zhì)體的融合

異核體檢出重組體檢出和鑒定重組體的形態(tài)，生理生化和遺傳分析

1標(biāo)記菌株的篩選用于原生質(zhì)體融合的親本需要攜帶遺傳標(biāo)記，以便于重組體的檢出。常用營養(yǎng)缺陷型和抗性作為標(biāo)記，也可以采用熱致死，孢子顏色，菌落形態(tài)作為標(biāo)記。實(shí)際時究竟采用哪種遺傳標(biāo)記，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。如果原生質(zhì)體融合的目的是為了進(jìn)行遺傳分析，那么應(yīng)該采用帶有隱性基因的營養(yǎng)缺陷性或抗性菌株；如果從育種角度進(jìn)行原生質(zhì)體融合，由于大多數(shù)營養(yǎng)缺陷性菌株都會影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，所以在選擇營養(yǎng)缺陷性標(biāo)記時，應(yīng)盡量避免采用對正常代謝有影響的缺陷性菌株

2原生質(zhì)體的制備獲得有活力、去壁較為完全的原生質(zhì)體是原生質(zhì)體融合育種技術(shù)的先決條件。在細(xì)菌和放線菌中，制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；制備葡萄球菌的原生質(zhì)體，則需用溶葡萄球菌素處理；制備酵母菌的原生質(zhì)體時，一般可用蝸牛酶；制備絲狀真菌的原生質(zhì)體時，可用蝸牛酶，在絲狀真菌的原生質(zhì)體制備中很少單獨(dú)使用一種酶，而是采用兩種或三種酶混合處理。另外，影響原生質(zhì)體制備的因素有許多，主要是

菌體的性質(zhì)，酶的性質(zhì)以及反應(yīng)環(huán)境(1)菌體的前處理為了使酶的作用效果更好一些，可對菌體作一些前處理，主要是在培養(yǎng)基中加入一些物質(zhì)，加入這些物質(zhì)的目的，就是使菌體的細(xì)胞壁對酶的敏感性增加。例如：青霉素能干擾甘氨酸交聯(lián)橋與四肽側(cè)鏈上的D—丙氨酸之間的聯(lián)結(jié)，使細(xì)菌不能合成完整的具有空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的細(xì)壁，結(jié)果使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，便于溶菌酶處理。(2)菌體的培養(yǎng)時間微生物能否較好地形成原生質(zhì)體與微生物的生理狀態(tài)有一定的關(guān)系。為了使菌體細(xì)胞易于原生質(zhì)體比，一般選擇對數(shù)生長期的菌體。這時的細(xì)胞正在生長，代謝旺盛，細(xì)胞壁對酶解作用最為敏感。由其得到的原生質(zhì)體，形成率高，再生率也很高。(1)酶濃度對于不同種屬的微生物來說．不僅對酶的種類要求不同，就是酶的濃度也有差異。一般地說，酶濃度增加，原生質(zhì)體的形成率也增加，超過一定范圍．則原生質(zhì)體形成率的提高不明顯。酶濃度過低，則不利于原生質(zhì)體的形成；酶濃度過高，則導(dǎo)致原生質(zhì)體再生率的降低。因此，有人建議以使原生質(zhì)體形成率和再生率之積達(dá)到最大時的酶濃度作為最佳酶濃度。

(2)酶解溫度據(jù)報(bào)道酶解溫度對原生質(zhì)體再生的影響很大。因此，在選擇最佳酶解溫度時．除了要考慮酶的最適溫度外，還要用原生質(zhì)體再生率加以校正(3)酶解時間酶解時間過短，原生質(zhì)體形成不完全，結(jié)果會影響原生質(zhì)體間的融合；酶解時間過長，原生質(zhì)體脫壁太完全，原生質(zhì)體的質(zhì)膜也易受到損傷，從而影響原生質(zhì)體的再生，最終也不利于原生質(zhì)體融合。因此，為了使融合實(shí)驗(yàn)得以成功，必須要選擇合適的酶解時間才行。(1)滲透壓穩(wěn)定劑等滲透壓在原生質(zhì)體制備中，不僅起到保護(hù)原生質(zhì)體免于膨脹作用，還有助于酶和底物的結(jié)合。滲透壓穩(wěn)定劑多采用Kcl、NaCl等無機(jī)物和甘露醇、山梨醉、蔗糖、丁二酸鈉等有機(jī)物。菌株不同，最佳穩(wěn)定劑也有差異，在細(xì)菌中多用蔗糖，丁二酸鈉、NaCl等；在酵母菌中多用山梨醉、甘露醇等；在霉菌中多用Kcl和NaCl等。穩(wěn)定劑的使用濃度一般均在o．3一o．8mol/L之間。除此以外，破壁時的pH值、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方式、離子強(qiáng)度和種類等對原生質(zhì)體的形成也有一定的影響。3原生質(zhì)體的再生酶解去壁后得到的原生質(zhì)體應(yīng)具有再生能力，即能重建細(xì)胞壁，恢復(fù)細(xì)胞完整形態(tài)并能生長、分裂，這是原生質(zhì)體融合育種的必要條件。僅有細(xì)胞質(zhì)膜的原生質(zhì)體對滲透壓很敏感、很容易破裂，致使原生質(zhì)外流而使細(xì)胞死亡。所以，再生培養(yǎng)基必須與原生質(zhì)體內(nèi)的滲透壓相等。這就要在再生培養(yǎng)基中加入具有一定滲透壓的基質(zhì)，即滲透壓穩(wěn)定劑原生質(zhì)體的再生是一個非常復(fù)雜的過程．一些學(xué)者研究認(rèn)為，若原生質(zhì)體的細(xì)胞壁剝?nèi)サ貌惶珡氐祝瑒t有助于細(xì)胞壁的再生，殘留的細(xì)胞壁尤如結(jié)晶時的“晶種”一樣。大量實(shí)驗(yàn)也證明，破壁太徹底往往會引起原牛質(zhì)體再生率的大大降低．在進(jìn)行融合實(shí)驗(yàn)前，—般先要對原生質(zhì)體再生率進(jìn)行測定，否則就很難確定不能融合或融合頻率低是由于雙親原生質(zhì)休本來就沒有活性或再生率很低，還是由于融合條件不適合所致。因此，測定原生質(zhì)體形成率和再生率不僅可作為檢查、改善原生質(zhì)體形成和再生條件的指標(biāo)，而且也是分析融合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，改善融合條件的一個重要指標(biāo)。原生質(zhì)體再生率的計(jì)算公式：原生質(zhì)體再生率＝（再生平板菌數(shù)-低滲剩余菌數(shù)）/（破壁前菌數(shù)-低滲剩余菌數(shù)）一般地說，原生質(zhì)體的再生率常常只有百分之幾到百分之幾十，各的甚至可達(dá)100％。如果原生質(zhì)體不能恢復(fù)成原來菌的正常狀態(tài)，那么微生物的原生質(zhì)體在遺傳操縱工作方面的應(yīng)用將是不可能的。4原生質(zhì)體的融合僅僅將原生質(zhì)體等量地混合在一起．融合頻率仍然很低，只有加入表面活性劑聚乙二醇(PEG)，融合頻率才會提高，常用的PEG是相對分子量為4000和6000的兩種。在原生質(zhì)體融合過程中，除了要加入PEG外，還要加入鈣鎂等陽離子，它們對融合也有促進(jìn)作用。在有鈣離子存在的條件下融合時pH值為堿性能刺激產(chǎn)生最大的融合頻率，這是因?yàn)镻H能夠改變體系的電性狀態(tài)，從而影響原生質(zhì)體的融合。由于PEG既是融合劑又是滲透壓穩(wěn)定劑，濃度低于20％會使原生質(zhì)體破裂而失去穩(wěn)定性，濃度過高又會引起原生質(zhì)體收縮而降低融合頻率，因此，融合時PEG的最終濃度常采用30%一40％。由干PEG一加入，原生質(zhì)體間的粘著即？強(qiáng)烈地發(fā)生，融合就能較長時間有效地進(jìn)行，所以PEG的處理時間不得太長。此外，PEG在高濃度下有毒，因此也要求融合時間不宜過長。。有人指出，先用紫外線照時原生質(zhì)體，再進(jìn)行融合可以大大增加融合頻率另外，利用物理因子也可以促進(jìn)細(xì)胞融合，主要是電融合技術(shù)。電融合是以空間定向，時間同步的可控方式來實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體的融合，從而改變了化學(xué)融合(指用PEG融合)的隨機(jī)過程。同時．其融合頻率高，操作簡便、快速，對細(xì)胞損傷較小，并可以在顯微鏡下進(jìn)行。5．融合子的選擇原生質(zhì)體融合后，重組子即融合子的選擇方法是使原生質(zhì)體融合技術(shù)得以應(yīng)用的關(guān)鍵。按照schaeffer的觀點(diǎn)，有兩個遺傳標(biāo)記互補(bǔ)就可以確定其為融合子。因此，就可以通過那些選擇性遺傳標(biāo)記，在選擇培養(yǎng)基上挑出融合子。但是，由于原生質(zhì)體融合后會產(chǎn)生兩種情況，一種是真正的融合，即產(chǎn)生雜合二倍體或單倍重組體；另一種是暫時的融合，形成異核體。兩者均可以在選擇培養(yǎng)基上生長，一般前者較穩(wěn)定．而后一種則是不穩(wěn)定的，會分離成親本類型，有的甚至可以以異核狀態(tài)移接幾代。因此．要獲得真正融合子，必須在融合原生質(zhì)體再生后，進(jìn)行幾代自然分離、選擇，才能加以確定。常用的融合子篩選方法有兩種：直接法,間接法和鈍化選擇法

(1)直接法原生質(zhì)體融合后直接分離到MM或SM上，即可直接檢出融合細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)是只需一步就可得到重組體，而大多數(shù)重組體是穩(wěn)定的，缺點(diǎn)是難以檢出那些表型延遲而基因已重組的融合體。

(2)間接法把融合產(chǎn)物分離到CM上，使原生質(zhì)體再生，融合和非融合的原生質(zhì)體都能生長，再分離到SM上。其優(yōu)點(diǎn)是能促使細(xì)胞更好地再生，表型延遲重組體容易檢出。缺點(diǎn)是需要兩步才能檢出重組體，需要相當(dāng)大的人力和物力，而且得到的重組體不大穩(wěn)定。直接法和間接法都要用營養(yǎng)缺陷性標(biāo)記，所得重組體不一定能提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。

(3)鈍化選擇法鈍化選擇法是指滅活原生質(zhì)體和具活性原生質(zhì)體融合，把親株中的一方（野生型）原生質(zhì)體在50°C熱處理2-3小時，使融合前原生質(zhì)體代謝途徑中的某些酶鈍化不能再生，再與另一方（雙缺陷性）原生質(zhì)體融合，并分離到mm上，滅活除用加熱方法外，還可以用紫外或藥物處理。6實(shí)用性菌株的篩選微生物原生質(zhì)融合是一種新的基因重組技術(shù)，它具有定向育種的含義。但是，融合后所產(chǎn)生的融合子類型仍然是各種各樣的。性能不同，產(chǎn)量不同的情況仍然存在，因此必要的人工篩選仍然很重要，主要是遺傳穩(wěn)定性等的實(shí)驗(yàn)。四原生質(zhì)體融合