ICS70.080CCSB44代替DB43/T958.1—2014第1部分：遺傳質(zhì)量控制ExperimentalminipigPart1:Geneticqualitycontrol DB43/T958.1—2023I前言 Ⅲ Ⅴ 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14遺傳分類及命名 2 26近交系實驗用小型豬的遺傳質(zhì)量監(jiān)測 37封閉群實驗用小型豬的遺傳質(zhì)量監(jiān)測 48基因修飾小型豬的遺傳質(zhì)量監(jiān)測 6DB43/T958.1—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB43/T958《實驗用小型豬》的第1部分。DB43/T958已發(fā)布了以下部分：——第1部分：遺傳質(zhì)量控制；——第2部分：微生物、寄生蟲學(xué)等級與監(jiān)測；——第3部分：配合飼料；——第4部分：病理學(xué)診斷規(guī)范；——第5部分：環(huán)境與設(shè)施。本文件替代DB43/T958.1—2014《實驗用小型豬第1部分：遺傳質(zhì)量控制》，與DB43/T958.1—2014相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動外，主要技術(shù)變化如下：a）增加了“引言”一章；b）更改了術(shù)語“近交系”定義（見3.2，2014版的3.2c）更改了術(shù)語“遠交群”和“封閉群”定義（見3.3、3.4，2014版的3.3d）增加了術(shù)語“基因修飾小型豬”和定義（見3.5e）更改了“表1近交系實驗用小型豬遺傳檢測抽樣要求”、“表4封閉群實驗用小型豬遺傳檢測抽樣要求”中“抽樣數(shù)量”（見6.2、7.2，2014版的6.2、7.2）；f）增加了近交系微衛(wèi)星檢測內(nèi)容（見表3）；g）更改了封閉群微衛(wèi)星檢測內(nèi)容（見表5，2014版的表4h）增加了“基因修飾小型豬的遺傳質(zhì)量監(jiān)測”（見8）。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由湖南省科學(xué)技術(shù)廳提出并歸口。本文件起草單位：中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南賽諾生物科技股份有限公司。本文件主要起草人：王維、胡鵬志、馬小倩、李桑、徐暢、王佳、石興勇。本文件及其所替代文件的歷次版本發(fā)布情況為：——2014年首次發(fā)布為DB43/T958.1—2014；——本次為第一次修訂。DB43/T958.1—2023V引言實驗用小型豬標(biāo)準化能更好的促進器官移植、人工智能醫(yī)療器械等生物醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域和相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，為湖南省生物醫(yī)藥領(lǐng)域科學(xué)研究、產(chǎn)品效驗、鑒定測試等活動開展提供質(zhì)量保證，有利于湖南省政府部門行政審批和監(jiān)管工作的實施。為了保證實驗用小型豬研發(fā)、生產(chǎn)和應(yīng)用的穩(wěn)定、高效進行，對實驗用小型豬進行標(biāo)準化管理已成為首要任務(wù)。在這方面，湖南省已建立了實驗用小型豬基礎(chǔ)性地方標(biāo)準體系。在該體系中，DB43/T958《實驗用小型豬》是指導(dǎo)湖南省實驗用小型豬培育的基礎(chǔ)性和通用性的標(biāo)準。DB43/T958旨在確立普遍適用于標(biāo)準化實驗用小型豬遺傳質(zhì)量控制、微生物檢測、飼料、病理學(xué)檢測、環(huán)境設(shè)施的準則，擬由五個部分構(gòu)成。——第1部分：遺傳質(zhì)量控制。目的在于維持實驗用小型豬的遺傳質(zhì)量穩(wěn)定性。——第2部分：微生物、寄生蟲學(xué)等級與監(jiān)測。目的在于保證實驗用小型豬的生物安全性?！?部分：配合飼料。目的在于保障實驗用小型豬飼料的安全和營養(yǎng)。——第4部分：病理學(xué)診斷規(guī)范。目的在于標(biāo)準化實驗用小型豬病理學(xué)檢測內(nèi)容和方法?！?部分：環(huán)境與設(shè)施。目的在于標(biāo)準化不同等級實驗用小型豬環(huán)境條件控制和設(shè)施建設(shè)。遺傳質(zhì)量控制標(biāo)準化是為了建立穩(wěn)定且高質(zhì)量的實驗用小型豬種群。為了做好這項工作，湖南省在2014年發(fā)布了有關(guān)實驗用小型豬遺傳質(zhì)量控制規(guī)定的地方標(biāo)準。DB43/T958.1發(fā)布實施已九年，這期間實驗用小型豬遺傳質(zhì)量控制受到越來越廣泛的重視，與遺傳質(zhì)量控制有關(guān)的理論研究和實踐都發(fā)生了變化。首先，我國實驗動物遺傳質(zhì)量控制檢測內(nèi)容和方法的研究不斷深入，逐步建立和明晰不同物種遺傳質(zhì)量控制標(biāo)準體系，充實和完善了實驗用小型豬的相關(guān)部分。其次，隨著DB43/T958.1的廣泛應(yīng)用以及遺傳質(zhì)量控制檢測實踐的逐漸深入，新的需求與建議不斷產(chǎn)生。鑒于此，確有必要修訂完善DB43/T958.1，以不斷適應(yīng)國內(nèi)外相關(guān)遺傳質(zhì)量控制檢測的新變化以及實驗用小型豬發(fā)展的新需求，確保高質(zhì)量實驗用小型豬的穩(wěn)定發(fā)展。對實驗用小型豬遺傳質(zhì)量控制進行標(biāo)準化，首先需要明確其遺傳分類；其次是檢測標(biāo)準。本次對DB43/T958.1的修訂，重點考慮了近交系和封閉群的區(qū)分、基因修飾豬以及檢測方法，明確了近交系、封閉群和基因修飾豬的定義，并進一步清晰的規(guī)定近交系和封閉群微衛(wèi)星檢測方法，提高了各項檢測的抽樣標(biāo)準。通過更加嚴謹?shù)臋z測方法和抽樣數(shù)量，讓實驗用小型豬遺傳質(zhì)量控制更加穩(wěn)定，從而提高實驗用小型豬的質(zhì)量和應(yīng)用效率，更好地促進實驗用小型豬的發(fā)展、研究和應(yīng)用。DB43/T958.1—20231實驗用小型豬第1部分：遺傳質(zhì)量控制本文件規(guī)定了實驗用小型豬的遺傳分類、繁殖方法、近交系及封閉群的遺傳質(zhì)量標(biāo)準。本文件適用于實驗用小型豬的遺傳質(zhì)量控制。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB14923實驗動物遺傳質(zhì)量控制NY/T1673畜禽微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性檢測技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1實驗用小型豬experimentalminipig經(jīng)人工飼養(yǎng)與培育，對其攜帶的病原微生物、寄生蟲進行控制，遺傳背景明確或者來源清楚，12月齡體重宜不超過50kg，用于科學(xué)研究（非臨床應(yīng)用研究）、教學(xué)、生產(chǎn)、質(zhì)量控制鑒定以及其他科學(xué)實驗的小型豬。3.2近交系inbredstrain一個動物群體中，任何個體基因組中98.6％以上的座位為純合的品系。注：經(jīng)典近交系經(jīng)至少連續(xù)20代的全同胞兄妹交配培育而成代數(shù)的一對共同祖先。經(jīng)連續(xù)20代以上親子交配與全同胞兄妹交配有等同效果。近交系的近交系數(shù)3.3遠交群outbredstock為了維持群體的最大雜合度、以非近親交配方式進行繁殖生產(chǎn)的實驗動物種群。3.4封閉群closedcolony不引進外部動物、在群體內(nèi)隨機選擇動物進行繁殖，以維持有限雜合度的實驗動物種群。3.5基因修飾小型豬geneticmodifiedminipig2DB43/T958.1—2023用基因修飾等技術(shù)手段對特定基因改造所獲得的小型豬。4遺傳分類及命名4.1遺傳分類根據(jù)遺傳特點的不同，實驗用小型豬分為近交系和封閉群。4.2命名4.2.1近交系命名近交系一般以大寫英文字母命名，亦可以用大寫英文字母加阿拉伯?dāng)?shù)字命名，符號應(yīng)盡量簡短。如XENO等。4.2.2近交代數(shù)近交系的近交代數(shù)用大寫英文字母F表示。例如當(dāng)一個近交系的近交代數(shù)為30代時，寫成（F30）。4.2.3其它近交系亞系、支系、重組近交系、同源突變近交系以及同源導(dǎo)入近交系的定義和命名按照GB14923執(zhí)行。4.2.4遠交群和封閉群命名遠交群和封閉群的命名按照GB14923執(zhí)行。4.2.5基因修飾小型豬命名基因修飾小型豬屬于特殊近交系，其命名按照GB14923執(zhí)行。5繁殖5.1近交系的繁殖5.1.1原則選擇近交系實驗用小型豬繁殖方法的原則是保持近交系小型豬的同基因性及基因純合性。5.1.2引種作為繁殖用種豬的近交系實驗用小型豬，應(yīng)來自于近交系的基礎(chǔ)群或血緣擴大群，遺傳背景明確，有完整的資料（包括品系名稱、近交代數(shù)、遺傳基因特點及主要生物學(xué)特征等）。5.1.3方法stock）。當(dāng)近交系實驗用小型豬生產(chǎn)供應(yīng)數(shù)量不是很大時，一般不設(shè)血緣擴大群，僅設(shè)基礎(chǔ)群和生產(chǎn)群?；A(chǔ)群、血緣擴大群和生產(chǎn)群的具體繁殖方式按照GB14923執(zhí)行。5.2遠交群和封閉群小型豬的繁殖DB43/T958.1—202335.2.1原則選擇封閉群實驗用小型豬繁殖方法的原則是盡量保持封閉群小型豬的基因異質(zhì)性及多態(tài)性，避免近交系數(shù)增速過快。5.2.2引種5.2.2.1作為繁殖用種子的封閉群實驗用小型豬應(yīng)遺傳背景明確或來源清楚，有完整的資料（包括種群名稱、來源、遺傳基因特點及主要生物學(xué)特性等）。5.2.2.2根據(jù)繁殖方式，在保證每代近交系數(shù)增量不大于1％的前提下，決定最小引種規(guī)模。如采用循環(huán)交配方式，引種數(shù)量不得少于13對無血緣關(guān)系（三代以內(nèi)無共同祖先）的公母豬；若采用隨機交配方式，引種數(shù)量不得少于25對無血緣關(guān)系的公母豬。5.2.3方法封閉群應(yīng)保持封閉群實驗用小型豬的遺傳基因的穩(wěn)定，并盡量避免近親交配。具體繁殖方法按照6近交系實驗用小型豬的遺傳質(zhì)量監(jiān)測6.1檢測方法采用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測方法。具體方法按照NY/T1673執(zhí)行，各微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的染色體位置、等位基因數(shù)、等位基因片段范圍、引物序列、熒光標(biāo)記、PCR反應(yīng)的Tm值、鎂離子濃度等見表3。6.2抽樣對基礎(chǔ)群，凡在子代留有種豬的雙親動物都應(yīng)進行檢測。對生產(chǎn)群，按表1要求從每個近交系中隨機抽取非同窩成年豬。表1近交系實驗用小型豬遺傳檢測抽樣要求生產(chǎn)群中種母豬數(shù)量（N）抽樣數(shù)量>100頭6.3結(jié)果判定近交系實驗用小型豬遺傳檢測結(jié)果的判定按表2執(zhí)行。表2近交系實驗用小型豬遺傳檢測結(jié)果判定標(biāo)準6.4判定結(jié)論所有樣品檢測位點的等位基因都符合品系的特征，沒有新的等位基因出現(xiàn)為合格實驗用小型豬近交DB43/T958.1—20234系，否則判為不合格。6.5檢測頻率近交系實驗用小型豬生產(chǎn)群每年至少進行一次遺傳質(zhì)量檢測。表3各微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記所在的染色體位置、等位基因數(shù)、等位基因片段范圍、熒光標(biāo)記、兩側(cè)引物序列（左側(cè)：F，右側(cè)：R）、退火溫度和鎂離子濃度座位名稱染色體等位基等位基因1CGA1250-320FAMF-ATAGACATTATGTAAGTTGCTGATR-GAACTTTCACATCCCTAAGGTCGT2736455SW240292-114TAMRAF-AGAAATTAGTGCCTCAAATTGGR-AAACCATTAAGTCCCTAGCAAA67SW7238TAMRAF-ATCAGAACAGTGCGCCGTR-GTTTGAAAATGGGGTGTTTCC8S00904244-251TAMRAF-CCAAGACTGCCTTGTAGGTGAATAR-GCTATCAAGTATTGTACCATTAGG9S0218XTAMRAF-AAGATCATTTAGTCAAGGTCACAGR-TCTGATAGGGAACATAGGATAAATSW24896-121FAMF-CTTTGGGTGGAGTGTGTGCR-ATCCAAATGCTGCAAGCG7封閉群實驗用小型豬的遺傳質(zhì)量監(jiān)測7.1檢測方法采用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測方法。具體方法按照NY/T1673執(zhí)行，各微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的染色體位置、等位基因數(shù)、等位基因片段范圍、引物序列、熒光標(biāo)記、PCR反應(yīng)的Tm值、鎂離子濃度等見表5。7.2抽樣按表4要求從每個封閉群中隨機抽取非同窩成年豬。表4封閉群實驗用小型豬遺傳檢測抽樣要求群體數(shù)量抽樣數(shù)量DB43/T958.1—202357.3結(jié)果判定群體內(nèi)遺傳變異采用平均雜合度指標(biāo)或群體平衡狀態(tài)方法進行評價。當(dāng)平均雜合度在0.5-0.7時，且期望雜合度與觀測雜合度經(jīng)卡方檢驗無明顯差異時，群體為合格的封閉群實驗用小型豬群體?；蛴萌后w是否達到平衡狀態(tài)來判定，如果沒有達到平衡狀態(tài)，說明群體的基因頻率或基因型頻率發(fā)生變化，該封閉群實驗用小型豬群體判為不合格。具體方法按照NY/T1673執(zhí)行，各微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的染色體位置、等位基因數(shù)、引物序列及熒光標(biāo)記，PCR反應(yīng)的Tm值、鎂離子濃度7.4檢測頻率封閉群實驗用小型豬生產(chǎn)群每兩年至少進行一次遺傳質(zhì)量檢測。表5各微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記所在的染色體位置、等位基因數(shù)、等位基因片段范圍、熒光標(biāo)記、兩側(cè)引物序列（左側(cè)：F，右側(cè)：R）、退火溫度和鎂離子濃度染色體等位基等位基因1SW9741F-GGTGAAGTTTTTGCTTTGAACCR-GAAAGAAATCCAAATCCAAACC2S0091296-174F-TCTACTCCAGGAGATAAGCCAGATR-CAGTGACTCCATCACAGTTATGA3SW240292-114F-AGAAATTAGTGCCTCAAATTGGR-AAACCATTAAGTCCCTAGCAAA4SW10663F-GCAGGATGAACCACCCTGR-CTCTTGAGGCAACCTGCTG5SW10894F-TTTTCCCCTTCACTCACCCR-GATCAAAGTCCCTTACTCCGG65F-TCCTTCCCTCCTGGTAACTAR-GCACTTCCTGATTCTGGGTA7SW10576F-TCCCCTGTTGTACAGATTGATGR-TCCAATTCCAAGTTCCACTAGC8SW63279F-TGGGTTGAAAGATTTCCCAAR-GGAGTCAGTACTTTGGCA98F-CCAATCCTATTCACGAAAAAGCR-CAACCCACTTGCTCCCACC8F-AGGGTGGCTAAAAAAGAAAAGGR-ATCAAATCCTTACCTCTGCAGCSW9119F-CTCAGTTCTTTGGGACTGAACCR-CATCTGTGGAAAAAAAAGCCSW5119AAGCAGGAATCCCTGCATCCCCAGCCACCAGTCTGACSWr158F-TCCAATTCAACTCCTGGCTCR-GAATGTGCACATACCACATGCSW951F-TTTCACAACTCTGGCACCAGR-GATCGTGCCCAAATGGACSW2713F-TTCCATGGCTTTCTTCR-CATTCATTCCCAGTGAAACTTGDB43/T958.1—20236表5各微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)