ICS65.020.30

B40/49

DB50

重慶市地方標(biāo)準(zhǔn)

DB50/T1044—2020

無(wú)菌（Germ-free,GF）豬微生物學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)

規(guī)范

TechnicalSpecificationforMicrobiologicalMonitoringofGerm-freePig

2020-10-10發(fā)布2020-12-30實(shí)施

重慶市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB50/T1044—2020

目次

前言...................................................................................................................................................................2

1范圍...................................................................................................................................................................3

2規(guī)范性引用文件...............................................................................................................................................3

3術(shù)語(yǔ)和定義.......................................................................................................................................................3

4妊娠母豬微生物學(xué)監(jiān)測(cè)...................................................................................................................................4

5無(wú)菌豬微生物學(xué)監(jiān)測(cè).......................................................................................................................................4

6飲水和日糧微生物學(xué)監(jiān)測(cè)...............................................................................................................................6

7隔離器和物品微生物學(xué)監(jiān)測(cè)...........................................................................................................................7

1

DB50/T1044—2020

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則編寫(xiě)。

本標(biāo)準(zhǔn)由重慶市畜牧科學(xué)院提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由重慶市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：重慶市畜牧科學(xué)院。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：葛良鵬、孫靜、梁浩、劉作華、丁玉春、吳夢(mèng)、黃勇。

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DB50/T1044—2020

無(wú)菌（Germ-free,GF）豬微生物學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了無(wú)菌豬生產(chǎn)及使用過(guò)程中的妊娠母豬、無(wú)菌豬、飲水和日糧、隔離器和物品等微生物

學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于無(wú)菌豬生產(chǎn)和使用時(shí)微生物學(xué)質(zhì)量控制。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB16551豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范

GB/T18090-2008豬繁殖與呼吸綜合診斷方法

GB/T18448.1-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體外寄生蟲(chóng)檢測(cè)方法

GB/T18448.2-2008實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲(chóng)檢測(cè)方法

GB/T18641偽狂犬病診斷技術(shù)

GB/T18935-2003口蹄疫診斷技術(shù)

GB/T21674-2008豬圓環(huán)病毒聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法

SN/T1559-2010非洲豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范

SN/T1919-2016豬細(xì)小病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范

NY/T544-2015豬流行性腹瀉診斷技術(shù)

NY/T548-2015豬傳染性胃腸炎診斷技術(shù)

NY/T678豬偽狂犬病免疫酶試驗(yàn)方法

NY/T679豬繁殖與呼吸綜合癥免疫酶試驗(yàn)方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)與定義適用于本文件。

3.1

無(wú)菌豬Germ-free(GF)pig

利用現(xiàn)有檢測(cè)手段，無(wú)可檢出一切活的微生物（包括細(xì)菌、病毒）和寄生蟲(chóng)，能保證豬源性細(xì)胞、

組織、器官研究的生物安全性和清晰的微生物背景的實(shí)驗(yàn)用豬，簡(jiǎn)稱無(wú)菌豬。

3.2

悉生豬Gnotobitoic(GN)pig

以無(wú)菌豬為對(duì)象，通過(guò)微生物移植技術(shù)構(gòu)建出只含有特定菌群，并始終在可屏蔽外界微生物條件下

生活的實(shí)驗(yàn)用豬，可分為單一菌株移植悉生豬和組合菌群移植悉生豬。

3

DB50/T1044—2020

3.3

隔離環(huán)境Isolationenvironment

與外界完全隔離，可阻斷任何外源微生物侵入的封閉空間。

3.4

屏障環(huán)境Barrierenvironment

屏障環(huán)境應(yīng)作為隔離環(huán)境的第一層保障，用于放置和使用無(wú)菌隔離器。

4妊娠母豬微生物學(xué)監(jiān)測(cè)

妊娠豬應(yīng)未注射豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗，外觀健康、無(wú)異常；應(yīng)排除經(jīng)胎盤(pán)垂直傳播的四種

疾病，包括豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病、豬細(xì)小病毒病。病原篩查方法參照GB/T16551、

GB/T18641、NY/T679和SN/T1919-2016執(zhí)行。

5無(wú)菌豬微生物學(xué)監(jiān)測(cè)

5.1采樣

5.1.1采樣管的準(zhǔn)備

宜采用螺帽蓋的采樣管，內(nèi)部自帶1支拭子。也可通過(guò)帶螺帽蓋的離心管和1支棉簽自制而成。采

樣管選擇在保質(zhì)期內(nèi)的、且包裝完好的無(wú)菌采樣管（宜經(jīng)過(guò)環(huán)氧乙烷滅菌處理），或提前高溫高壓滅菌

處理。采樣當(dāng)天，無(wú)菌采樣管放入屏障設(shè)施的傳遞窗內(nèi)，并紫外光照30min及以上。

5.1.2采樣管轉(zhuǎn)入隔離器

在保持無(wú)菌豬飼養(yǎng)隔離器傳遞通道內(nèi)部密封罩密封狀態(tài)下，取下傳遞通道外側(cè)密封罩，將無(wú)菌采樣

管放入傳遞通道，密封外側(cè)密封罩。采用1.5%-2%新制的過(guò)氧乙酸從傳遞通道外側(cè)密封罩上的消毒孔，

對(duì)傳遞通道內(nèi)部空間進(jìn)行噴霧消毒。噴霧時(shí)間不宜低于5min。密封消毒孔，并等待30min以上。通過(guò)

無(wú)菌豬飼養(yǎng)隔離器操作手套，從隔離器內(nèi)部取下傳遞通道內(nèi)側(cè)密封罩，將無(wú)菌采樣管移入隔離器內(nèi)，重

新罩上傳遞通道的內(nèi)側(cè)密封罩。

5.1.3采樣過(guò)程

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求用拭子采集樣本（如豬肛門(mén)拭子、鼻拭子或新鮮糞便），立即裝回采樣管，并蓋緊螺

帽蓋。

5.1.4采樣管轉(zhuǎn)出隔離器

取下傳遞通道內(nèi)部密封罩，將采樣管轉(zhuǎn)到隔離器的傳遞通道內(nèi)部，罩好內(nèi)部密封罩，再打開(kāi)隔離器

傳遞通道的外部密封罩，將采樣管取出，重新罩上外部密封罩。采用1.5%-2%新制的過(guò)氧乙酸從傳遞通

道外部密封罩上的消毒孔，對(duì)傳遞通道內(nèi)部空間進(jìn)行噴霧。噴霧時(shí)間宜不少于5min。

5.2細(xì)菌監(jiān)測(cè)

4

DB50/T1044—2020

5.2.1培養(yǎng)及觀察

將采集的樣本分別接種于血瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯和硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，分別在需氧和厭氧條

件下37℃培養(yǎng)48h及以上。無(wú)菌條件下，取培養(yǎng)后的樣本，涂片、固定、革蘭染色后顯微鏡下檢查菌

體及形態(tài)。每個(gè)隔離器，宜平行檢測(cè)重復(fù)3次。

5.2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

固體培養(yǎng)基上，應(yīng)無(wú)任何可見(jiàn)菌落；液體培養(yǎng)基內(nèi)，應(yīng)無(wú)渾濁、無(wú)沉淀，且鏡檢無(wú)細(xì)菌菌體。

5.2.3監(jiān)測(cè)頻率

宜每周檢測(cè)1次。

5.3真菌監(jiān)測(cè)

5.3.1培養(yǎng)及觀察

將采集的樣本接種于大豆酪蛋白固體培養(yǎng)基，分別在20℃、28℃和37℃下需氧培養(yǎng)48h及以上。

每個(gè)隔離器，宜平行檢測(cè)重復(fù)3次。

5.3.2判定標(biāo)準(zhǔn)

固體培養(yǎng)基上，應(yīng)無(wú)任何可見(jiàn)菌落，且鏡檢無(wú)真菌菌體。

5.3.3監(jiān)測(cè)頻率

宜每周檢測(cè)1次。

5.4無(wú)菌豬病毒監(jiān)測(cè)

5.4.1監(jiān)測(cè)指標(biāo)

應(yīng)對(duì)4種垂直傳播病毒進(jìn)行監(jiān)測(cè)，包括豬瘟病毒、細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合

征病毒。應(yīng)對(duì)5種豬常見(jiàn)病毒進(jìn)行監(jiān)測(cè)，包括口蹄疫病毒O、豬圓環(huán)-2型病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬

傳染性胃腸炎病毒、非洲豬瘟病毒。

5.4.2指標(biāo)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

無(wú)菌豬的9種病毒指標(biāo)及其檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表19種病毒指標(biāo)及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

病毒指標(biāo)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

豬瘟病毒GB/T16551-2008

豬繁殖與呼吸綜合征病毒按照GB/T18090-2008

豬細(xì)小病病毒SN/T1919-2016

5

DB50/T1044—2020

豬偽狂犬病病毒NY/T678-2003

豬圓環(huán)-2型病毒GB/T21674-2008

豬口蹄疫病毒OGB/T18935-2003

豬流行性腹瀉病毒NY/T544-2015

豬傳染性胃腸炎病毒NY/T548-2015

非洲豬瘟病毒SN/T1559-2010

5.4.3判定標(biāo)準(zhǔn)

上述9種病毒不應(yīng)檢出。

5.4.4監(jiān)測(cè)頻率

宜每月檢測(cè)1次。

5.5無(wú)菌豬寄生蟲(chóng)監(jiān)測(cè)

5.5.1監(jiān)測(cè)指標(biāo)

對(duì)豬弓形蟲(chóng)、豬血虱、豬疥螨3種豬寄生蟲(chóng)指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

5.5.2指標(biāo)檢測(cè)方法

豬弓形蟲(chóng)檢測(cè)按照GB/T18448.2-2001執(zhí)行，豬血虱、豬疥螨按照GB/T18448.1-2001執(zhí)行。

5.5.3判定標(biāo)準(zhǔn)

不應(yīng)檢出任何寄生蟲(chóng)。

5.5.4監(jiān)測(cè)頻率

宜每周檢測(cè)1次。

6飲水和日糧微生物學(xué)監(jiān)測(cè)

6.1飲水微生物學(xué)監(jiān)測(cè)

6.1.1采樣與培養(yǎng)

無(wú)菌條件下，取冷卻的滅菌純水1mL，接種到大豆酪蛋白固體培養(yǎng)基，分別在28℃和37℃需氧培

養(yǎng)24h。宜平行檢測(cè)重復(fù)3次。

6

DB50/T1044—2020

6.1.2判定標(biāo)準(zhǔn)

不應(yīng)檢出任何細(xì)菌。

6.2日糧微生物學(xué)監(jiān)測(cè)

6.2.1采樣與培養(yǎng)

按照日糧總量的5%進(jìn)行抽樣檢查。無(wú)菌條件下，每袋無(wú)菌豬日糧取25g，加入25mL滅菌水，充分

混勻，靜置10min。取上清液1mL，分別接種到大豆酪蛋白固體培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯和硫乙醇酸鹽培

養(yǎng)基，在分別在需氧和厭氧