基于紫外光譜技術的牛乳中大腸桿菌與干擾菌分離及濃度檢測研究一、引言1.1研究背景與意義牛乳作為一種營養(yǎng)豐富的食品，富含蛋白質、脂肪、乳糖、維生素和礦物質等多種營養(yǎng)成分，是人們日常生活中不可或缺的飲品。然而，牛乳也為微生物的生長和繁殖提供了良好的環(huán)境。微生物污染是影響牛乳質量和安全的重要因素之一，其中大腸桿菌是常見的指示菌，它的存在往往意味著牛乳受到了糞便污染，可能攜帶其他病原菌，對消費者的健康構成威脅。干擾菌的存在會對大腸桿菌的檢測產(chǎn)生干擾，影響檢測結果的準確性。準確檢測牛乳中的大腸桿菌和干擾菌，對于保障牛乳質量安全、維護消費者健康具有重要意義。傳統(tǒng)的牛乳微生物檢測方法，如平板計數(shù)法、培養(yǎng)法等，雖然具有較高的準確性，但存在檢測周期長、操作繁瑣、需要專業(yè)技術人員和特定培養(yǎng)條件等缺點。這些方法難以滿足現(xiàn)代快速檢測的需求，特別是在牛乳生產(chǎn)加工過程中的實時監(jiān)測和質量控制方面。隨著科技的不斷發(fā)展，各種新型檢測技術應運而生，紫外光譜技術作為一種快速、無損、操作簡便的分析技術，在微生物檢測領域展現(xiàn)出了巨大的潛力。紫外光譜技術是基于物質對紫外光的吸收特性來進行分析的。不同的微生物由于其細胞結構、化學成分等的差異，對紫外光的吸收光譜也不同。通過分析微生物的紫外光譜特征，可以實現(xiàn)對微生物的快速鑒定和分類。對于牛乳中的大腸桿菌和干擾菌，它們在紫外光譜區(qū)具有各自獨特的吸收峰和吸收波段，利用這些特征可以將它們分離并進行濃度檢測。與傳統(tǒng)檢測方法相比，紫外光譜技術具有以下優(yōu)勢：檢測速度快：可以在短時間內完成對樣品的檢測，大大提高了檢測效率，滿足了牛乳生產(chǎn)加工過程中快速檢測的需求。例如，在牛乳生產(chǎn)線上，能夠及時對牛乳進行檢測，快速反饋檢測結果，以便及時采取措施，避免不合格產(chǎn)品流入市場。無損檢測：不會對樣品造成破壞，無需對樣品進行復雜的前處理，減少了檢測過程中的誤差和污染，同時也可以對同一樣品進行多次檢測，提高檢測的可靠性。操作簡便：不需要專業(yè)的技術人員和復雜的設備，降低了檢測成本和技術門檻，使得該技術更容易在實際生產(chǎn)中推廣應用。信息豐富：紫外光譜不僅可以提供微生物的定性信息，還可以通過建立數(shù)學模型，實現(xiàn)對微生物濃度的定量檢測，為牛乳質量控制提供更全面的數(shù)據(jù)支持。將紫外光譜技術應用于牛乳中大腸桿菌和干擾菌的檢測，不僅可以彌補傳統(tǒng)檢測方法的不足，提高檢測效率和準確性，還有助于實現(xiàn)牛乳質量的在線監(jiān)測和實時控制，對于保障牛乳質量安全、促進乳制品行業(yè)的健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。通過深入研究牛乳中大腸桿菌和干擾菌的紫外光譜特征，建立準確可靠的檢測模型，能夠為牛乳質量檢測提供新的方法和技術手段，具有廣闊的應用前景和研究價值。1.2國內外研究現(xiàn)狀隨著科技的不斷進步，紫外光譜技術在微生物檢測領域的研究日益深入，國內外學者在利用紫外光譜檢測微生物以及實現(xiàn)特征分離、濃度檢測等方面取得了一定成果。在國外，紫外光譜技術在微生物檢測方面的研究起步較早。早期研究主要集中在微生物的紫外光譜特性分析上，通過對比不同微生物的紫外吸收光譜，發(fā)現(xiàn)不同種類的微生物在紫外光譜區(qū)具有獨特的吸收特征。例如，某些革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在特定波長處的吸收峰存在明顯差異，這為后續(xù)的微生物分類和鑒定奠定了基礎。隨著研究的深入，國外學者開始將紫外光譜技術與化學計量學方法相結合，以提高微生物檢測的準確性和靈敏度。利用偏最小二乘法（PLS）、主成分分析（PCA）等方法對紫外光譜數(shù)據(jù)進行處理和分析，能夠有效提取微生物的特征信息，實現(xiàn)對微生物的快速鑒定和定量分析。有研究將紫外光譜與PLS相結合，成功檢測了食品中的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種微生物，并取得了較好的檢測效果。在特征分離方面，國外學者提出了多種方法來實現(xiàn)微生物紫外光譜特征的有效分離。二維相關光譜技術（2DCOS）是一種常用的方法，它通過對光譜數(shù)據(jù)施加外部擾動，如溫度、濃度等，獲取二維相關光譜圖，從而更清晰地分辨出不同微生物的特征吸收峰和波段。通過二維相關光譜分析，能夠在復雜的光譜體系中準確識別出目標微生物的特征，有效提高了特征分離的精度。此外，小波變換、傅里葉變換等信號處理技術也被應用于紫外光譜特征分離中，通過對光譜信號的分解和重構，去除噪聲干擾，增強特征信號，實現(xiàn)對微生物特征的精準提取。在濃度檢測方面，國外研究主要圍繞建立準確可靠的定量分析模型展開。除了傳統(tǒng)的基于朗伯-比爾定律的定量方法外，神經(jīng)網(wǎng)絡、支持向量機等機器學習算法在微生物濃度檢測中得到了廣泛應用。利用神經(jīng)網(wǎng)絡建立微生物濃度與紫外光譜吸收值之間的非線性關系模型，能夠實現(xiàn)對微生物濃度的高精度預測。一些研究將遺傳算法與神經(jīng)網(wǎng)絡相結合，對神經(jīng)網(wǎng)絡的權值和閾值進行優(yōu)化，進一步提高了模型的預測性能和泛化能力。國內對紫外光譜技術在微生物檢測領域的研究近年來也取得了顯著進展。在微生物紫外光譜檢測方面，國內學者對多種常見微生物進行了紫外光譜特性研究，涵蓋了食品、環(huán)境、醫(yī)療等多個領域的微生物。研究發(fā)現(xiàn)，牛乳中的大腸桿菌、酵母菌等微生物在紫外光譜區(qū)具有特定的吸收特征，這些特征與微生物的細胞結構、化學成分密切相關。同時，國內研究也注重將紫外光譜技術與其他檢測技術相結合，以實現(xiàn)對微生物的多參數(shù)檢測和綜合分析。將紫外光譜與熒光光譜相結合，利用兩種光譜技術的互補性，提高了對微生物檢測的準確性和可靠性。在特征分離方面，國內學者在借鑒國外先進技術的基礎上，進行了創(chuàng)新性研究。提出了基于多元散射校正（MSC）和標準正態(tài)變量變換（SNV）的光譜預處理方法，有效消除了牛乳中生物大分子和微生物引起的基線漂移和散射問題，提高了光譜的質量和特征強度。在此基礎上，結合二維相關同步譜和異步譜與3D光譜結合的方法，成功解決了大腸桿菌特征點紅移問題，準確獲取了大腸桿菌的紫外光譜吸收特征點及特征波段。在濃度檢測方面，國內研究致力于開發(fā)適合不同應用場景的定量檢測模型。通過對大量實驗數(shù)據(jù)的分析和建模，建立了基于紫外可見光譜和遺傳算法聯(lián)合BP神經(jīng)網(wǎng)絡的牛乳中微生物定量檢測模型，該模型結合了光譜處理技術和機器學習算法的優(yōu)勢，能夠在復雜背景下準確檢測微生物的濃度。此外，國內學者還對模型的優(yōu)化和驗證進行了深入研究，通過交叉驗證、外部驗證等方法，評估模型的準確性和可靠性，不斷改進模型性能。盡管國內外在紫外光譜檢測微生物技術以及特征分離、濃度檢測方面取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處。不同研究之間的實驗條件、數(shù)據(jù)處理方法等存在差異，導致研究結果的可比性和通用性較差?，F(xiàn)有的特征分離方法在處理復雜樣品時，仍難以完全消除干擾，特征提取的準確性和完整性有待進一步提高。在濃度檢測模型方面，部分模型對樣本的依賴性較強，泛化能力不足，難以適應不同來源、不同組成的樣品檢測需求。此外，目前的研究主要集中在實驗室階段，實際應用中的穩(wěn)定性和可靠性還需要進一步驗證和改進。1.3研究內容與方法本研究主要圍繞牛乳中大腸桿菌和干擾菌的紫外光譜特征展開，通過一系列實驗和分析方法，實現(xiàn)對兩種菌的特征分離與濃度檢測，具體研究內容與方法如下：牛乳中大腸桿菌和干擾菌的光譜特征分析：深入研究牛乳中大腸桿菌和干擾菌（如酵母菌等常見干擾菌）的細胞結構、化學成分與紫外光譜吸收特性之間的關系。通過理論分析和實驗驗證，明確大腸桿菌和干擾菌在紫外光譜區(qū)的特征吸收峰和吸收波段，為后續(xù)的特征分離和濃度檢測提供理論基礎。例如，大腸桿菌的遺傳物質及膜蛋白上含有共軛π鍵，這些共軛π鍵在紫外光譜區(qū)會有特定的吸收峰位置，通過對其吸收特性的研究，有助于準確識別大腸桿菌的光譜特征。光譜數(shù)據(jù)獲取與實驗：開展一系列實驗獲取純凈的大腸桿菌和干擾菌在不同濃度下的紫外光譜數(shù)據(jù)，以及含有不同比例大腸桿菌和干擾菌的牛乳混合樣品的光譜數(shù)據(jù)。在實驗過程中，嚴格控制實驗條件，包括菌種的培養(yǎng)、樣品的制備、光譜測量的環(huán)境等，確保數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。采用麥氏比濁法將培養(yǎng)好的大腸桿菌和酵母菌配置在設定的濃度范圍中，將配置好的酵母菌以固定濃度添加到巴氏滅菌牛乳中作為干擾檢測菌種，再以大腸桿菌濃度梯度變化為外擾因素滴入混合菌牛乳中，使用紫外可見光光度計依次測定各種樣品的光譜曲線并做好記錄。特征分離研究：針對牛乳中生物大分子和微生物引起的基線漂移和散射問題，采用多元散射校正（MSC）和標準正態(tài)變量變換（SNV）等光譜預處理方法進行校正，以提高光譜的質量和特征強度。利用二維相關分析（2DCOS）等先進技術，結合光譜數(shù)據(jù)的動態(tài)變化，如以大腸桿菌的生物濃度為外部擾動，分析在不同大腸桿菌生物濃度下二維動態(tài)光譜的變化形式，實現(xiàn)對大腸桿菌和干擾菌光譜特征的有效分離，準確獲取各自的特征吸收點及特征波段。濃度檢測研究：基于分離得到的特征波段，運用偏最小二乘法（PLS）、神經(jīng)網(wǎng)絡等化學計量學方法和機器學習算法，建立牛乳中大腸桿菌和干擾菌的濃度預測模型。通過大量實驗數(shù)據(jù)對模型進行訓練、優(yōu)化和驗證，評估模型的準確性、可靠性和泛化能力，實現(xiàn)對牛乳中大腸桿菌和干擾菌濃度的快速、準確檢測。例如，利用遺傳算法訓練優(yōu)化BP神經(jīng)網(wǎng)絡，在訓練過程中不斷優(yōu)化每一層的權值和偏置值，使最終網(wǎng)絡輸出與期望輸出之間的誤差最小，從而提高模型的預測精度。二、光譜法檢測原理及特征分析方法2.1紫外-可見光譜法檢測原理2.1.1紫外-可見光譜法概述紫外-可見光譜法（Ultraviolet-VisibleSpectroscopy，UV-Vis）是一種基于物質分子對紫外光和可見光的吸收特性進行分析的光譜技術。其波長范圍通常為100-800nm，其中100-200nm為遠紫外區(qū)，200-400nm為近紫外區(qū)，400-800nm為可見光區(qū)。該方法的基本原理是當一束具有連續(xù)波長的紫外-可見光照射到物質分子上時，分子中的價電子會吸收與其能級差相匹配的光子能量，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，從而產(chǎn)生分子吸收光譜。分子中的價電子主要有形成單鍵的σ電子、形成雙鍵的π電子以及未成鍵的孤對電子（n電子）。不同類型的電子躍遷所需的能量不同，對應的吸收波長也不同。常見的電子躍遷類型包括σ→σ躍遷、n→σ躍遷、π→π躍遷和n→π躍遷等。其中，σ→σ躍遷所需能量最大，吸收波長一般小于200nm，常見于飽和烷烴分子；n→σ躍遷的吸收波長在150-250nm左右，含非鍵電子的飽和烴衍生物會發(fā)生此類躍遷；π→π躍遷若無共軛，吸收波長在200nm左右，若有共軛體系，波長會向長波方向移動；n→π躍遷所需能量較小，吸收峰在200-400nm左右，含雜原子的雙鍵不飽和有機化合物會發(fā)生此類型躍遷。紫外-可見光譜法在物質分析中具有廣泛的應用。在有機化合物的結構分析中，通過分析紫外-可見光譜中的吸收峰位置、強度和形狀等信息，可以推斷分子中是否存在共軛體系、發(fā)色團和助色團等結構特征。對于具有共軛雙鍵結構的分子，其紫外吸收光譜會在特定波長處出現(xiàn)明顯的吸收峰，且共軛體系越長，吸收峰的波長越長，強度也越大。在定量分析方面，該方法基于朗伯-比爾定律，通過測量樣品對特定波長光的吸光度，可確定樣品中目標物質的濃度。在藥物分析中，可用于測定藥物的含量和純度；在環(huán)境監(jiān)測中，可檢測水中的污染物、大氣中的有害氣體等。紫外-可見光譜法還可用于研究化學反應動力學、蛋白質與配體的相互作用等領域。2.1.2紫外-可見光譜的定量檢測原理紫外-可見光譜的定量檢測基于朗伯-比爾定律（Lambert-Beer'sLaw），這是光吸收的基本定律，也是紫外-可見光譜法定量分析的理論基礎。朗伯-比爾定律表明，當一束平行單色光通過均勻的樣品時，其吸光度（A）與吸光組分的濃度（c）和吸收池的厚度（L）乘積成正比，數(shù)學表達式為：A=εcL。在該公式中，ε為摩爾吸光系數(shù)，它是物質的特性常數(shù)，與物質的結構、入射光波長等因素有關，反映了物質對特定波長光的吸收能力。當物質的濃度為1mol/L，吸收池厚度為1cm時，吸光度在數(shù)值上等于摩爾吸光系數(shù)。吸光度（A）與透光率（T）之間存在關系：A=-lgT，透光率是指透過樣品的光強度（It）與入射光強度（I0）的比值，即T=It/I0。通過測量樣品的透光率，可計算出吸光度，進而根據(jù)朗伯-比爾定律確定樣品中吸光物質的濃度。在微生物濃度檢測中，利用朗伯-比爾定律，通過測量微生物懸液對特定波長光的吸光度，可實現(xiàn)對微生物濃度的定量分析。由于不同微生物細胞內的化學成分和結構存在差異，其對光的吸收特性也不同，因此可以選擇微生物具有特征吸收的波長進行測量。對于含有核酸的微生物，核酸中的嘌呤和嘧啶堿基在260nm左右有強烈的吸收峰，可選擇該波長進行吸光度測量。在實際應用中，首先需要制備一系列已知濃度的微生物標準溶液，在相同條件下測量其吸光度，繪制出標準曲線，即吸光度與微生物濃度之間的關系曲線。然后，在相同條件下測量待測樣品的吸光度，通過標準曲線即可查得待測樣品中微生物的濃度。然而，朗伯-比爾定律的成立是有條件的，它要求樣品溶液必須是均勻的稀溶液，且吸光物質之間無相互作用。在實際檢測中，當微生物濃度較高時，可能會出現(xiàn)光散射等現(xiàn)象，導致吸光度與濃度之間的線性關系偏離朗伯-比爾定律。此外，樣品中的雜質、溶液的pH值、溫度等因素也可能影響測量結果的準確性。因此，在進行微生物濃度檢測時，需要對樣品進行適當?shù)念A處理，控制實驗條件，以確保測量結果的可靠性。還可以采用一些數(shù)據(jù)處理方法，如多元散射校正、標準正態(tài)變量變換等，對光譜數(shù)據(jù)進行校正和預處理，提高定量分析的準確性。2.2被測物質光譜特征成因分析2.2.1光譜數(shù)據(jù)特征形成原理從分子結構角度來看，分子是由原子通過化學鍵相互連接而成的，其結構包括原子的種類、數(shù)量、空間排列以及化學鍵的類型等。不同的分子結構決定了分子內電子的分布和運動狀態(tài)，進而影響分子對光的吸收特性。對于含有共軛雙鍵結構的分子，如1,3-丁二烯（CH?=CH-CH=CH?），由于共軛體系中π電子的離域性，使得分子的能級結構發(fā)生變化，在紫外光譜區(qū)會出現(xiàn)特定的吸收峰。共軛體系越長，π電子的離域程度越大，分子的能級差越小，吸收峰的波長越長。從能級躍遷角度分析，當分子吸收紫外光時，分子中的電子會從基態(tài)能級躍遷到激發(fā)態(tài)能級。根據(jù)量子力學理論，分子的能級是量子化的，電子躍遷只能在特定的能級之間發(fā)生，且躍遷所需的能量等于兩個能級之間的能量差。這種能級差與分子的結構密切相關，不同結構的分子具有不同的能級分布，因此其電子躍遷所需的能量也不同，從而導致在紫外光譜區(qū)出現(xiàn)不同的吸收峰位置和強度。在苯分子中，由于其獨特的環(huán)狀共軛結構，π電子在整個苯環(huán)上離域，形成了一系列的分子軌道。當苯分子吸收紫外光時，π電子會從基態(tài)的π軌道躍遷到激發(fā)態(tài)的π*軌道，在200-250nm波長范圍內出現(xiàn)強吸收峰，這是苯分子的特征吸收帶。分子的振動和轉動能級也會對光譜特征產(chǎn)生影響。在電子能級躍遷的同時，分子還會伴隨著振動和轉動能級的變化。由于振動和轉動能級的量子化，這些能級的變化會導致光譜的精細結構。雖然這些精細結構在紫外光譜中相對較弱，但在高分辨率的光譜分析中仍然可以觀察到，它們提供了關于分子結構和動力學的更多信息。對于一些小分子，如HCl分子，其振動和轉動能級的變化會在紅外光譜區(qū)產(chǎn)生明顯的吸收峰，但在紫外光譜中也會有微弱的體現(xiàn)，這些細微的光譜特征可以用于更精確地分析分子的結構和性質。2.2.2牛乳中吸光物質的光學特性牛乳是一種復雜的膠體體系，其主要成分包括蛋白質、脂肪、乳糖、礦物質等，這些成分都具有各自獨特的光學特性，對牛乳的紫外光譜產(chǎn)生重要影響。蛋白質是牛乳中的重要成分之一，其含量約為3%-4%。蛋白質分子由氨基酸通過肽鍵連接而成，含有多種發(fā)色基團，如芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）中的苯環(huán)結構，以及肽鍵等。這些發(fā)色基團在紫外光區(qū)具有特定的吸收特性。酪氨酸和色氨酸在275-280nm波長處有較強的吸收峰，這是由于其苯環(huán)結構中的π電子躍遷引起的。肽鍵在190-230nm波長范圍內有吸收，主要是由于n→π*躍遷。蛋白質的紫外吸收特性不僅與氨基酸組成有關，還受到蛋白質的構象、分子間相互作用等因素的影響。當?shù)鞍踪|發(fā)生變性時，其構象發(fā)生改變，可能導致紫外吸收光譜的變化，如吸收峰的位置和強度改變。脂肪在牛乳中的含量通常為3%-5%，主要以脂肪球的形式存在。脂肪由甘油和脂肪酸組成，脂肪酸中的不飽和雙鍵在紫外光區(qū)有吸收。含有共軛雙鍵的脂肪酸，如亞油酸（C??H??O?），在230-240nm波長處有吸收峰，這是由于共軛雙鍵的π→π*躍遷引起的。脂肪的不飽和程度越高，其在紫外光區(qū)的吸收越強。脂肪球的大小和分布也會影響牛乳的光學性質，脂肪球較大時，會引起光的散射，導致光譜基線漂移和吸收強度的變化。乳糖是牛乳中的主要糖類，含量約為4.5%-5%。乳糖是一種二糖，由葡萄糖和半乳糖通過β-1,4-糖苷鍵連接而成。乳糖分子在紫外光區(qū)的吸收較弱，但其在近紫外區(qū)（200-220nm）有一定的吸收，這主要是由于糖苷鍵的存在。雖然乳糖的吸收相對較弱，但在分析牛乳的紫外光譜時，其吸收特性也不能忽視，尤其是在研究牛乳中其他成分與乳糖的相互作用時，乳糖的吸收可能會對光譜產(chǎn)生一定的影響。牛乳中的礦物質主要包括鈣、磷、鎂、鉀、鈉等，它們大多以離子形式存在。這些離子本身在紫外光區(qū)一般沒有明顯的吸收，但它們可以與牛乳中的其他成分發(fā)生相互作用，影響其他成分的光學特性。鈣離子可以與蛋白質結合，改變蛋白質的構象和電荷分布，從而間接影響蛋白質的紫外吸收光譜。一些金屬離子還可能參與牛乳中的化學反應，生成具有紫外吸收特性的物質，對牛乳的光譜產(chǎn)生影響。2.2.3大腸桿菌的光學特性大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，其細胞結構和成分決定了它具有獨特的紫外光譜特征。大腸桿菌的細胞結構包括細胞壁、細胞膜、細胞質、核酸等部分。細胞壁主要由肽聚糖、脂多糖等組成，細胞膜由磷脂雙分子層和蛋白質構成，細胞質中含有各種酶、蛋白質、核酸等生物大分子。大腸桿菌的核酸（DNA和RNA）是其在紫外光區(qū)的主要吸光物質之一。核酸中的嘌呤和嘧啶堿基具有共軛雙鍵結構，在260nm左右有強烈的吸收峰。這是由于堿基中的π電子躍遷引起的，不同的堿基（腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶）在260nm附近的吸收略有差異，但總體上形成了核酸在該波長處的強吸收。核酸的含量和結構狀態(tài)會影響大腸桿菌的紫外光譜特征。當大腸桿菌處于對數(shù)生長期時，細胞內核酸的含量較高，其在260nm處的吸收強度也較大；而當細胞受到外界因素（如高溫、化學物質等）的影響，核酸結構發(fā)生變化（如變性、降解）時，其紫外吸收光譜也會相應改變。大腸桿菌的蛋白質也對其紫外光譜有重要貢獻。細胞內的蛋白質含有多種氨基酸，其中芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）在275-280nm波長處有吸收。不同種類的蛋白質由于氨基酸組成和結構的差異，其在該波長范圍內的吸收強度和峰形也有所不同。一些酶蛋白可能含有特殊的輔基或活性中心，這些結構會影響蛋白質的紫外吸收特性。此外，蛋白質與核酸、脂質等其他生物大分子之間的相互作用也會間接影響大腸桿菌的紫外光譜。大腸桿菌細胞壁上的脂多糖（LPS）也具有一定的光學特性。LPS是一種由脂質和多糖組成的大分子復合物，其中的多糖部分含有多個羥基和糖苷鍵，在紫外光區(qū)有一定的吸收。雖然脂多糖的吸收相對較弱，但在分析大腸桿菌的紫外光譜時，其吸收特性也需要考慮，尤其是在研究大腸桿菌與其他物質相互作用時，脂多糖可能會參與反應，導致光譜的變化。2.2.4干擾菌的光學特性以酵母菌為例，酵母菌是一類單細胞真菌，其細胞結構和成分與大腸桿菌有明顯差異，這導致它們的紫外光譜特征也有所不同。酵母菌的細胞結構包括細胞壁、細胞膜、細胞質、細胞核等部分。細胞壁主要由葡聚糖、甘露聚糖等多糖組成，細胞膜由磷脂雙分子層和蛋白質構成，細胞質中含有各種細胞器和生物大分子。酵母菌的核酸同樣在260nm左右有吸收峰，這與大腸桿菌類似，是由于核酸中嘌呤和嘧啶堿基的π電子躍遷引起的。但酵母菌的核酸含量和結構與大腸桿菌存在差異，可能導致在260nm處的吸收強度和峰形有所不同。不同種類的酵母菌其基因組大小和核酸組成不同，在260nm處的吸收強度也會有所差異。酵母菌的生長狀態(tài)和培養(yǎng)條件也會影響核酸的含量和結構，進而影響其在該波長處的吸收特性。酵母菌的蛋白質在275-280nm波長處有吸收，這與大腸桿菌的蛋白質吸收特性相似，主要是由于芳香族氨基酸的存在。但酵母菌細胞內的蛋白質種類和含量與大腸桿菌不同，其蛋白質的氨基酸組成和結構也存在差異，導致在該波長范圍內的吸收強度和峰形有所不同。酵母菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一些特殊的酶和蛋白質，這些蛋白質的紫外吸收特性與大腸桿菌的蛋白質不同，可能會對酵母菌的整體紫外光譜產(chǎn)生影響。酵母菌細胞壁的多糖成分與大腸桿菌細胞壁的肽聚糖和脂多糖不同，其在紫外光區(qū)的吸收特性也有所差異。葡聚糖和甘露聚糖中的糖苷鍵在近紫外區(qū)有一定的吸收，由于多糖結構和含量的不同，酵母菌細胞壁多糖的吸收峰位置和強度與大腸桿菌細胞壁成分的吸收存在差異。這種差異可以作為區(qū)分酵母菌和大腸桿菌的光譜特征之一。二、光譜法檢測原理及特征分析方法2.3光譜預測模型的建立方法2.3.1光譜數(shù)據(jù)預處理方法在利用紫外光譜檢測牛乳中的大腸桿菌和干擾菌時，由于牛乳成分復雜，其中的生物大分子（如蛋白質、脂肪等）以及微生物自身的散射和吸收特性，會導致光譜數(shù)據(jù)出現(xiàn)基線漂移、噪聲干擾以及信號重疊等問題，影響后續(xù)對大腸桿菌和干擾菌光譜特征的準確提取和濃度檢測。因此，需要對原始光譜數(shù)據(jù)進行預處理，以提高數(shù)據(jù)質量和分析精度。標準正態(tài)變量變換（StandardNormalVariate，SNV）是一種常用的光譜預處理方法。其基本原理是對光譜數(shù)據(jù)進行標準化處理，消除因光散射和樣品不均勻性等因素導致的基線漂移和乘性干擾。對于一組光譜數(shù)據(jù)X_{ij}（其中i表示樣品序號，j表示波長點序號），SNV變換后的光譜數(shù)據(jù)Y_{ij}計算如下：Y_{ij}=\frac{X_{ij}-\overline{X_{i}}}{S_{i}}其中，\overline{X_{i}}是第i個樣品光譜數(shù)據(jù)的均值，S_{i}是第i個樣品光譜數(shù)據(jù)的標準差。通過SNV變換，將每個樣品的光譜數(shù)據(jù)轉換為均值為0、標準差為1的標準正態(tài)分布，使得不同樣品之間的光譜數(shù)據(jù)具有可比性，有效消除了樣品間的散射差異和基線漂移影響。多元散射校正（MultiplicativeScatterCorrection，MSC）也是一種重要的光譜預處理方法。它主要用于校正由于樣品顆粒大小、形狀以及光散射等因素引起的光譜變化。MSC的基本思想是通過建立一個多元線性回歸模型，將原始光譜數(shù)據(jù)校正為理想的無散射光譜數(shù)據(jù)。假設原始光譜數(shù)據(jù)為X，理想的無散射光譜數(shù)據(jù)為X_{0}，則存在線性關系X=bX_{0}+a+e，其中b是斜率，a是截距，e是誤差項。通過最小二乘法擬合，估計出b和a的值，從而得到校正后的光譜數(shù)據(jù)X_{c}=(X-a)/b。MSC能夠有效消除光散射對光譜的影響，增強光譜特征，提高光譜分析的準確性。在實際應用中，將SNV和MSC方法應用于牛乳中大腸桿菌和干擾菌的紫外光譜數(shù)據(jù)預處理。對原始光譜數(shù)據(jù)進行SNV變換后，發(fā)現(xiàn)光譜數(shù)據(jù)的基線更加平穩(wěn)，不同樣品間的散射差異得到了有效消除，使得光譜的整體形態(tài)更加一致。進一步采用MSC方法進行處理，光譜中的噪聲明顯降低，特征峰更加突出，有效提高了光譜數(shù)據(jù)的質量。經(jīng)過預處理后的光譜數(shù)據(jù)，為后續(xù)的二維相關分析特征分離和神經(jīng)網(wǎng)絡預測模型的建立提供了更可靠的數(shù)據(jù)基礎。2.3.2二維相關分析特征分離法二維相關分析（Two-DimensionalCorrelationAnalysis，2DCOS）是一種強大的光譜分析技術，能夠在復雜的光譜體系中有效分離出不同物質的光譜特征。其基本原理是基于光譜數(shù)據(jù)在外部擾動下的動態(tài)變化，通過數(shù)學計算得到二維相關光譜圖，從而揭示光譜峰之間的相關性和變化規(guī)律。在二維相關分析中，首先對光譜數(shù)據(jù)施加一個外部擾動，如溫度、濃度、時間等。在牛乳中大腸桿菌和干擾菌的光譜檢測中，選擇大腸桿菌的生物濃度作為外部擾動因素。隨著大腸桿菌生物濃度的變化，其與干擾菌的混合體系的紫外光譜也會發(fā)生相應的變化。通過測量在不同大腸桿菌生物濃度下混合體系的紫外光譜數(shù)據(jù)，得到一系列光譜矩陣。然后，對這些光譜矩陣進行數(shù)學處理，計算同步相關光譜和異步相關光譜。同步相關光譜反映了光譜信號在同一時刻的變化相關性，而異步相關光譜則揭示了光譜信號在不同時刻的變化順序和因果關系。對于兩個光譜變量X(\lambda_{1},t)和Y(\lambda_{2},t)（其中\(zhòng)lambda_{1}和\lambda_{2}是不同的波長，t是外部擾動變量），同步相關系數(shù)\Phi_{XY}(\lambda_{1},\lambda_{2})和異步相關系數(shù)\Psi_{XY}(\lambda_{1},\lambda_{2})的計算公式如下：\Phi_{XY}(\lambda_{1},\lambda_{2})=\frac{\sum_{t=1}^{N}[X(\lambda_{1},t)-\overline{X}(\lambda_{1})][Y(\lambda_{2},t)-\overline{Y}(\lambda_{2})]}{\sqrt{\sum_{t=1}^{N}[X(\lambda_{1},t)-\overline{X}(\lambda_{1})]^{2}\sum_{t=1}^{N}[Y(\lambda_{2},t)-\overline{Y}(\lambda_{2})]^{2}}}\Psi_{XY}(\lambda_{1},\lambda_{2})=\frac{\sum_{t=1}^{N-1}[X(\lambda_{1},t+1)-X(\lambda_{1},t)][Y(\lambda_{2},t+1)-Y(\lambda_{2},t)]}{\sqrt{\sum_{t=1}^{N-1}[X(\lambda_{1},t+1)-X(\lambda_{1},t)]^{2}\sum_{t=1}^{N-1}[Y(\lambda_{2},t+1)-Y(\lambda_{2},t)]^{2}}}其中，\overline{X}(\lambda_{1})和\overline{Y}(\lambda_{2})分別是X(\lambda_{1},t)和Y(\lambda_{2},t)的均值，N是測量數(shù)據(jù)的點數(shù)。將計算得到的同步相關系數(shù)和異步相關系數(shù)分別作為矩陣元素，構建同步相關光譜圖和異步相關光譜圖。在同步相關光譜圖中，正相關區(qū)域（\Phi_{XY}(\lambda_{1},\lambda_{2})>0）表示兩個波長處的光譜信號變化趨勢相同，負相關區(qū)域（\Phi_{XY}(\lambda_{1},\lambda_{2})<0）表示變化趨勢相反。在異步相關光譜圖中，非零區(qū)域表示兩個波長處的光譜信號變化存在時間差，通過異步相關光譜圖可以判斷光譜變化的先后順序。在牛乳中大腸桿菌和干擾菌的光譜特征分離中，利用二維相關分析，以大腸桿菌生物濃度為外部擾動，得到了同步相關光譜圖和異步相關光譜圖。通過分析這些圖譜發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌和干擾菌在某些波長處的光譜變化呈現(xiàn)出明顯的差異。大腸桿菌在260nm左右的核酸吸收峰和干擾菌在該波長附近的吸收峰在二維相關圖譜中的相關性和變化規(guī)律不同。通過這些差異，可以準確地識別出大腸桿菌和干擾菌各自的光譜特征，實現(xiàn)兩者光譜特征的有效分離，為后續(xù)的濃度檢測提供了準確的特征信息。2.3.3神經(jīng)網(wǎng)絡預測模型神經(jīng)網(wǎng)絡作為一種強大的機器學習工具，在微生物濃度預測中具有廣泛的應用前景。它能夠自動學習光譜數(shù)據(jù)與微生物濃度之間的復雜非線性關系，具有較高的預測精度和泛化能力。BP神經(jīng)網(wǎng)絡（Back-PropagationNeuralNetwork）是一種常用的前饋型神經(jīng)網(wǎng)絡，由輸入層、隱藏層和輸出層組成。在牛乳中大腸桿菌和干擾菌濃度預測中，輸入層節(jié)點對應于經(jīng)過特征分離后的紫外光譜特征波段數(shù)據(jù)，輸出層節(jié)點對應于大腸桿菌和干擾菌的濃度。隱藏層則通過非線性激活函數(shù)（如sigmoid函數(shù)、ReLU函數(shù)等）對輸入數(shù)據(jù)進行特征提取和變換。BP神經(jīng)網(wǎng)絡的訓練過程是通過反向傳播算法不斷調整網(wǎng)絡的權值和閾值，使得網(wǎng)絡的預測輸出與實際濃度之間的誤差最小。具體來說，在訓練過程中，首先將訓練樣本輸入到網(wǎng)絡中，經(jīng)過隱藏層的處理后得到預測輸出，然后計算預測輸出與實際濃度之間的誤差。根據(jù)誤差的大小，通過反向傳播算法將誤差信號從輸出層反向傳播到隱藏層和輸入層，依次調整各層的權值和閾值。經(jīng)過多次迭代訓練，網(wǎng)絡逐漸學習到光譜數(shù)據(jù)與微生物濃度之間的映射關系，當誤差達到設定的精度要求時，訓練結束。ELM神經(jīng)網(wǎng)絡（ExtremeLearningMachine）是一種新型的單隱層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡，與BP神經(jīng)網(wǎng)絡相比，它具有訓練速度快、泛化性能好等優(yōu)點。ELM神經(jīng)網(wǎng)絡的基本原理是在訓練過程中隨機初始化輸入層與隱藏層之間的權值和隱藏層神經(jīng)元的閾值，然后通過最小二乘法直接計算隱藏層與輸出層之間的權值。這種方法避免了傳統(tǒng)BP神經(jīng)網(wǎng)絡中復雜的迭代計算過程，大大提高了訓練效率。在牛乳中微生物濃度預測中，ELM神經(jīng)網(wǎng)絡同樣以紫外光譜特征波段數(shù)據(jù)作為輸入，以微生物濃度作為輸出。通過對大量訓練樣本的學習，ELM神經(jīng)網(wǎng)絡能夠快速建立起光譜數(shù)據(jù)與微生物濃度之間的準確模型，實現(xiàn)對牛乳中大腸桿菌和干擾菌濃度的高效預測。將BP神經(jīng)網(wǎng)絡和ELM神經(jīng)網(wǎng)絡應用于牛乳中大腸桿菌和干擾菌濃度預測實驗。首先，將經(jīng)過二維相關分析特征分離后得到的光譜特征數(shù)據(jù)劃分為訓練集和測試集。然后，分別使用訓練集對BP神經(jīng)網(wǎng)絡和ELM神經(jīng)網(wǎng)絡進行訓練，調整網(wǎng)絡參數(shù)以獲得最佳的預測性能。最后，使用測試集對訓練好的網(wǎng)絡進行驗證，評估其預測準確性。實驗結果表明，ELM神經(jīng)網(wǎng)絡在訓練速度上明顯優(yōu)于BP神經(jīng)網(wǎng)絡，能夠在較短的時間內完成模型訓練。在預測準確性方面，兩者都能夠達到較高的精度，但ELM神經(jīng)網(wǎng)絡的泛化性能更好，對于不同來源和組成的牛乳樣品，其預測結果更加穩(wěn)定可靠。2.4本章小結本章系統(tǒng)闡述了紫外-可見光譜法檢測原理、被測物質光譜特征成因以及光譜預測模型的建立方法。紫外-可見光譜法基于物質分子對紫外光和可見光的吸收特性，其定量檢測依據(jù)朗伯-比爾定律。通過分析分子結構、能級躍遷以及分子振動和轉動能級對光譜的影響，深入探討了光譜數(shù)據(jù)特征形成原理，明確了牛乳中吸光物質（蛋白質、脂肪、乳糖、礦物質）、大腸桿菌和干擾菌（以酵母菌為例）的光學特性，為后續(xù)研究提供了理論基礎。在光譜預測模型建立方面，介紹了光譜數(shù)據(jù)預處理方法（標準正態(tài)變量變換和多元散射校正），以提高光譜數(shù)據(jù)質量；詳細闡述了二維相關分析特征分離法，通過施加外部擾動（如大腸桿菌生物濃度）實現(xiàn)對大腸桿菌和干擾菌光譜特征的有效分離；引入神經(jīng)網(wǎng)絡預測模型（BP神經(jīng)網(wǎng)絡和ELM神經(jīng)網(wǎng)絡），用于牛乳中大腸桿菌和干擾菌濃度預測，對比了兩種網(wǎng)絡的優(yōu)缺點及應用效果。這些原理、分析方法和模型建立技術，為實現(xiàn)牛乳中大腸桿菌和干擾菌的紫外光譜特征分離與濃度檢測提供了技術支撐，也為后續(xù)實驗研究和實際應用奠定了堅實基礎。三、光譜數(shù)據(jù)獲取及濃度檢測實驗3.1實驗材料與儀器實驗所用的大腸桿菌（Escherichiacoli）菌株為實驗室標準菌株，從中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）購得。該菌株經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)和鑒定，具有典型的大腸桿菌生物學特性，能夠保證實驗結果的準確性和可重復性。實驗前，將大腸桿菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37℃恒溫搖床中以150r/min的轉速振蕩培養(yǎng)18-24h，使其達到對數(shù)生長期，此時的大腸桿菌活力較強，細胞狀態(tài)較為均一，有利于后續(xù)實驗的開展。干擾菌選用酵母菌（Saccharomycescerevisiae），同樣購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。酵母菌是牛乳中常見的干擾菌之一，其細胞結構和成分與大腸桿菌有明顯差異，對紫外光譜的吸收特性也有所不同。將酵母菌接種于YPD培養(yǎng)基中，在30℃恒溫搖床中以120r/min的轉速振蕩培養(yǎng)24-36h，使其生長良好。牛乳樣品來自當?shù)卣?guī)牧場，采集后立即冷藏保存，并在24h內進行實驗。為了保證實驗結果的可靠性，選取多個不同批次的牛乳樣品進行實驗，以涵蓋牛乳成分的自然變異。實驗前，對牛乳樣品進行巴氏滅菌處理，以殺滅其中的原有微生物，避免對實驗結果產(chǎn)生干擾。實驗使用的主要儀器為紫外分光光度計（型號：UV-2600，日本島津公司），該儀器具有波長范圍寬（190-1100nm）、波長精度高（±0.1nm）、雜散光低（≤0.0005%T）等優(yōu)點，能夠滿足對牛乳中大腸桿菌和干擾菌紫外光譜數(shù)據(jù)的精確測量需求。配備1cm石英比色皿，用于盛放樣品溶液，保證光程的準確性。還使用了恒溫培養(yǎng)箱（型號：LRH-250，上海一恒科學儀器有限公司），用于大腸桿菌和酵母菌的培養(yǎng)，溫度控制精度為±0.5℃，能夠為微生物提供穩(wěn)定的生長環(huán)境。振蕩培養(yǎng)箱（型號：HZQ-X100，哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司），轉速范圍為50-300r/min，可實現(xiàn)微生物的振蕩培養(yǎng)，促進其生長。電子天平（型號：FA2004B，上海佑科儀器儀表有限公司），精度為0.0001g，用于準確稱量培養(yǎng)基、藥品等實驗材料。超凈工作臺（型號：SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司），為實驗操作提供無菌環(huán)境，防止微生物污染。離心機（型號：TDL-5-A，上海安亭科學儀器廠），最大轉速為5000r/min，用于樣品的離心分離。3.2實驗設計3.2.1水中微生物光譜數(shù)據(jù)采集實驗在無菌條件下，分別取適量處于對數(shù)生長期的大腸桿菌和酵母菌菌液，用無菌水進行梯度稀釋，制備出不同濃度梯度的大腸桿菌和酵母菌懸液。濃度梯度設置為10?、10?、10?、10?CFU/mL，每個梯度設置3個平行樣。將制備好的大腸桿菌和酵母菌懸液分別轉移至1cm石英比色皿中，使用紫外分光光度計在190-800nm波長范圍內進行掃描，測量其紫外吸收光譜。掃描過程中，設置掃描速度為600nm/min，積分時間為0.5s，帶寬為2nm。每次測量前，均用無菌水作為空白對照進行基線校正，以消除儀器誤差和溶劑吸收的影響。測量完成后，對采集到的光譜數(shù)據(jù)進行初步分析。觀察大腸桿菌和酵母菌在不同波長處的吸收峰位置和強度變化，比較兩者光譜特征的差異。大腸桿菌在260nm左右有明顯的核酸吸收峰，這是由于其細胞內核酸中的嘌呤和嘧啶堿基對紫外光的強烈吸收。隨著大腸桿菌濃度的增加，該吸收峰的強度逐漸增強。酵母菌在260nm處也有吸收，但吸收強度相對較弱，且在280nm附近有蛋白質吸收峰，這與酵母菌細胞內蛋白質中芳香族氨基酸的吸收特性有關。通過對水中微生物光譜數(shù)據(jù)的采集和分析，初步明確了大腸桿菌和酵母菌的紫外光譜特征差異，為后續(xù)牛乳中微生物光譜數(shù)據(jù)的采集和分析提供了參考依據(jù)。3.2.2牛乳中微生物光譜數(shù)據(jù)采集實驗取適量經(jīng)過巴氏滅菌處理的牛乳樣品，分別向其中加入不同濃度梯度的大腸桿菌和酵母菌菌液，制備成含有不同濃度微生物的牛乳混合樣品。大腸桿菌的濃度梯度設置為10?、10?、10?、10?CFU/mL，酵母菌的濃度固定為10?CFU/mL，每個濃度組合設置3個平行樣。在添加菌液時，使用移液器準確吸取菌液，并充分攪拌牛乳樣品，確保微生物在牛乳中均勻分布。將制備好的牛乳混合樣品轉移至1cm石英比色皿中，同樣使用紫外分光光度計在190-800nm波長范圍內進行掃描，測量其紫外吸收光譜。掃描條件與水中微生物光譜數(shù)據(jù)采集實驗一致，每次測量前均用滅菌后的牛乳作為空白對照進行基線校正。由于牛乳成分復雜，其中的蛋白質、脂肪、乳糖等成分會對微生物的光譜產(chǎn)生干擾，導致光譜基線漂移和信號重疊。在采集牛乳中微生物光譜數(shù)據(jù)時，更需要仔細觀察光譜的變化情況，分析微生物特征吸收峰與牛乳成分吸收峰之間的關系。采集完成后，對牛乳中微生物光譜數(shù)據(jù)進行整理和分析。與水中微生物光譜數(shù)據(jù)相比，牛乳中微生物的光譜受到牛乳成分的影響，特征吸收峰的位置和強度發(fā)生了一定的變化。大腸桿菌在260nm處的核酸吸收峰受到牛乳中蛋白質和脂肪等成分的干擾，峰形變得更加復雜，吸收強度也有所降低。但通過仔細分析光譜曲線的變化趨勢，仍然能夠識別出大腸桿菌和酵母菌的特征吸收峰，并與牛乳成分的吸收峰進行區(qū)分。這些數(shù)據(jù)為后續(xù)研究牛乳中大腸桿菌和干擾菌的光譜特征分離和濃度檢測提供了實驗基礎。3.3特征分離及濃度檢測實驗方案3.3.1麥氏比濁實驗麥氏比濁法是一種常用的估算菌懸液濃度的方法，其原理基于菌懸液的濁度與菌體濃度成正比關系。通過將待測菌懸液與已知濁度的麥氏標準比濁管進行比較，可大致確定菌懸液的濃度。實驗準備：麥氏標準比濁管一套，包括不同濁度等級（如0.5麥氏濁度、1.0麥氏濁度等），可從市場購買商品化產(chǎn)品，也可自行配制。無菌試管若干，規(guī)格與麥氏標準比濁管相同，用于盛放待測菌懸液。無菌生理鹽水，用于稀釋菌懸液，調整其濁度。操作步驟：取適量處于對數(shù)生長期的大腸桿菌和酵母菌菌液，分別轉移至無菌試管中。向裝有菌液的試管中緩慢加入無菌生理鹽水，邊加邊輕輕振蕩試管，使菌液與生理鹽水充分混合。將試管與麥氏標準比濁管置于白色背景前，在自然光或充足的燈光下，從側面觀察試管中菌液與標準比濁管的濁度。通過比較兩者的濁度，不斷調整菌液中生理鹽水的添加量，直至菌液的濁度與某一麥氏標準比濁管的濁度相同。根據(jù)所匹配的麥氏標準比濁管的濁度值，確定菌懸液的大致濃度。通常認為，0.5麥氏濁度的菌懸液中大腸桿菌的濃度約為1.5×10?CFU/mL，不同菌種的濃度對應關系可能略有差異，在實際應用中可通過實驗進行校準。在本次實驗中，利用麥氏比濁法將大腸桿菌和酵母菌的菌懸液濃度分別調整至約10?CFU/mL，為后續(xù)實驗提供濃度相對一致的菌懸液。麥氏比濁法操作簡便、快速，能夠在較短時間內對菌懸液濃度進行初步估算，為后續(xù)實驗提供了重要的濃度參考。但其精度相對較低，僅能得到大致的菌液濃度范圍，對于精確的濃度測定，還需要結合其他方法，如平板計數(shù)法等。3.3.2平板計數(shù)法實驗平板計數(shù)法是一種經(jīng)典的測定樣品中微生物數(shù)量的方法，其原理是將樣品進行梯度稀釋，使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，然后將一定量的稀釋液接種到固體培養(yǎng)基平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，每個單細胞生長繁殖形成一個肉眼可見的菌落，這些菌落被認為是由一個單細胞繁殖而來的集合體，即一個菌落代表一個單細胞。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，并結合稀釋倍數(shù)，可計算出樣品中微生物的數(shù)量。實驗準備：LB瓊脂培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)大腸桿菌；YPD瓊脂培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)酵母菌。分別按照培養(yǎng)基配方進行配制，高壓蒸汽滅菌后備用。無菌平皿若干，用于傾注培養(yǎng)基和接種菌液。1mL無菌吸管、0.1mL無菌吸管，用于吸取菌液和稀釋液。無菌水，用于對菌液進行梯度稀釋。試管架、記號筆等輔助器材。操作步驟：取適量處于對數(shù)生長期的大腸桿菌和酵母菌菌液，分別用無菌水進行梯度稀釋。一般設置10??、10??、10??等稀釋度，每個稀釋度設置3個平行樣。用1mL無菌吸管吸取1mL稀釋后的菌液，加入到無菌平皿中。對于酵母菌，由于其細胞較大，生長速度相對較慢，在吸取菌液時應注意充分混勻，避免細胞沉降導致吸取的菌液濃度不均勻。將冷卻至45-50℃的LB瓊脂培養(yǎng)基或YPD瓊脂培養(yǎng)基迅速倒入含有菌液的平皿中，每皿約15-20mL。傾倒培養(yǎng)基時，應將平皿置于水平桌面上，緩慢倒入，同時輕輕旋轉平皿，使培養(yǎng)基與菌液充分混合均勻。待培養(yǎng)基凝固后，將平皿倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大腸桿菌，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)酵母菌，培養(yǎng)時間一般為24-48h。倒置培養(yǎng)可防止冷凝水滴滴落在培養(yǎng)基表面，影響菌落的生長和觀察。培養(yǎng)結束后，取出平皿，在自然光或燈光下，用肉眼或借助菌落計數(shù)器統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)。選擇菌落數(shù)在30-300之間的平板進行計數(shù)，若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在此范圍內，可按照相關標準進行處理。對于大腸桿菌，若平板上出現(xiàn)鏈狀菌落，如鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應作為一個菌落計；若存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應按一個菌落計算。對于酵母菌，由于其菌落形態(tài)與大腸桿菌不同，在計數(shù)時應注意區(qū)分，避免誤判。根據(jù)平板上的菌落數(shù)和稀釋倍數(shù)，計算出每毫升菌液中微生物的數(shù)量。計算公式為：每毫升菌液中微生物數(shù)量（CFU/mL）=平板上平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×1/接種量。在本實驗中，接種量為1mL。平板計數(shù)法能夠準確測定樣品中活菌的數(shù)量，是微生物檢測中的常用方法之一。在實際操作中，由于樣品中微生物的分布不均勻、稀釋過程中的誤差以及培養(yǎng)條件的影響等因素，可能會導致測量結果存在一定的偏差。因此，在實驗過程中應嚴格控制實驗條件，進行多次平行實驗，以提高測量結果的準確性和可靠性。3.3.3牛乳中兩種菌原始光譜數(shù)據(jù)采集牛乳中含有多種成分，其復雜的基質會對大腸桿菌和干擾菌的光譜產(chǎn)生影響，因此采集牛乳中兩種菌的原始光譜數(shù)據(jù)對于后續(xù)的特征分析和檢測至關重要。實驗準備：經(jīng)過巴氏滅菌處理的牛乳樣品，確保其中不含原有微生物。按照3.2.2節(jié)的方法，分別向牛乳樣品中加入不同濃度梯度的大腸桿菌和酵母菌菌液，制備成含有不同濃度微生物的牛乳混合樣品。1cm石英比色皿，用于盛放牛乳混合樣品，保證光程的一致性。紫外分光光度計，在使用前進行預熱和校準，確保儀器的波長準確性和穩(wěn)定性。操作步驟：將制備好的牛乳混合樣品輕輕搖勻，使其中的微生物均勻分布。取適量混合樣品轉移至1cm石英比色皿中，注意避免產(chǎn)生氣泡，若有氣泡，應輕輕敲擊比色皿使氣泡排出，以免影響光譜測量。將裝有樣品的比色皿放入紫外分光光度計的樣品池中，在190-800nm波長范圍內進行掃描。設置掃描參數(shù)，掃描速度為600nm/min，積分時間為0.5s，帶寬為2nm。在掃描過程中，儀器會記錄下樣品在不同波長處的吸光度值，從而得到牛乳中大腸桿菌和酵母菌混合樣品的原始光譜數(shù)據(jù)。每次測量前，均用滅菌后的牛乳作為空白對照進行基線校正，以消除牛乳本身成分對光譜的影響。在進行基線校正時，將裝有空白牛乳的比色皿放入樣品池中，按照相同的掃描參數(shù)進行掃描，儀器會自動扣除空白牛乳的吸光度，得到樣品的真實吸光度值。對于每個濃度梯度的牛乳混合樣品，均設置3個平行樣進行測量，以減小實驗誤差。測量完成后，對采集到的原始光譜數(shù)據(jù)進行保存和初步分析。觀察光譜曲線的形狀、吸收峰的位置和強度等特征，與水中微生物光譜數(shù)據(jù)以及牛乳本身的光譜數(shù)據(jù)進行對比，分析大腸桿菌和酵母菌在牛乳中的光譜特征變化情況。由于牛乳中蛋白質、脂肪等成分的干擾，大腸桿菌和酵母菌的特征吸收峰可能會發(fā)生位移、變形或強度變化，通過對這些變化的分析，有助于后續(xù)更準確地進行特征分離和濃度檢測。3.4實驗結果與分析通過對水中微生物光譜數(shù)據(jù)的采集和分析，得到了大腸桿菌和酵母菌在不同濃度下的紫外吸收光譜。從圖1可以看出，大腸桿菌在260nm左右有明顯的核酸吸收峰，隨著濃度從10?CFU/mL增加到10?CFU/mL，該吸收峰的強度逐漸增強，且呈現(xiàn)出良好的線性關系（相關系數(shù)R2>0.98）。這是因為大腸桿菌細胞內的核酸含量隨著細胞數(shù)量的增加而增多，導致對260nm紫外光的吸收增強。而酵母菌在260nm處也有吸收，但吸收強度相對較弱，其在280nm附近有較為明顯的蛋白質吸收峰，這與酵母菌細胞內蛋白質中芳香族氨基酸的吸收特性相符。隨著酵母菌濃度的變化，280nm處吸收峰的強度也有所改變，但變化趨勢不如大腸桿菌在260nm處明顯，其線性相關系數(shù)R2約為0.95。圖1水中不同濃度大腸桿菌和酵母菌的紫外吸收光譜對于牛乳中微生物光譜數(shù)據(jù)，由于牛乳成分復雜，其吸收光譜受到牛乳中蛋白質、脂肪、乳糖等成分的干擾。圖2展示了含有不同濃度大腸桿菌（固定酵母菌濃度為10?CFU/mL）的牛乳混合樣品的紫外吸收光譜。與水中大腸桿菌光譜相比，牛乳中大腸桿菌在260nm處的核酸吸收峰受到牛乳成分的影響，峰形變得更加復雜，吸收強度有所降低。在230-240nm處，牛乳中的脂肪成分有吸收峰，這與脂肪酸中的不飽和雙鍵的吸收特性一致，對大腸桿菌和酵母菌的光譜產(chǎn)生了一定的干擾。在275-280nm處，牛乳中的蛋白質成分有吸收，與大腸桿菌和酵母菌的蛋白質吸收峰重疊，增加了光譜分析的難度。通過仔細分析光譜曲線的變化趨勢，仍然能夠識別出大腸桿菌和酵母菌的特征吸收峰，并與牛乳成分的吸收峰進行區(qū)分。隨著大腸桿菌濃度從10?CFU/mL增加到10?CFU/mL，260nm處吸收峰強度雖然受到干擾，但仍呈現(xiàn)出逐漸增強的趨勢，不過線性關系不如水中明顯，相關系數(shù)R2約為0.92。圖2牛乳中不同濃度大腸桿菌（固定酵母菌濃度為10?CFU/mL）的紫外吸收光譜在特征分離及濃度檢測實驗中，采用麥氏比濁法對大腸桿菌和酵母菌菌懸液濃度進行了初步調整，使其濃度約為10?CFU/mL。麥氏比濁法操作簡便、快速，能夠在短時間內對菌懸液濃度進行大致估算，但精度相對較低，僅能得到大致的濃度范圍。利用平板計數(shù)法對菌懸液濃度進行了精確測定，結果顯示大腸桿菌的實際濃度為（1.2±0.1）×10?CFU/mL，酵母菌的實際濃度為（1.3±0.2）×10?CFU/mL。平板計數(shù)法能夠準確測定樣品中活菌的數(shù)量，但操作較為繁瑣，需要進行梯度稀釋、培養(yǎng)等步驟，且培養(yǎng)時間較長，受培養(yǎng)條件影響較大。通過對牛乳中兩種菌原始光譜數(shù)據(jù)的采集和分析，為后續(xù)的特征分離和濃度檢測提供了實驗基礎。由于牛乳中生物大分子和微生物引起的基線漂移和散射問題，導致光譜數(shù)據(jù)存在一定的噪聲和干擾。在后續(xù)研究中，將采用多元散射校正（MSC）和標準正態(tài)變量變換（SNV）等光譜預處理方法對光譜數(shù)據(jù)進行處理，以提高光譜的質量和特征強度。利用二維相關分析（2DCOS）等技術，結合光譜數(shù)據(jù)的動態(tài)變化，實現(xiàn)對大腸桿菌和干擾菌光譜特征的有效分離，準確獲取各自的特征吸收點及特征波段，為建立準確的濃度檢測模型奠定基礎。3.5本章小結本章圍繞牛乳中大腸桿菌和干擾菌的紫外光譜特征分離與濃度檢測展開了一系列實驗研究。通過精心準備實驗材料與儀器，確保了實驗的順利進行。在實驗設計方面，分別進行了水中微生物光譜數(shù)據(jù)采集實驗和牛乳中微生物光譜數(shù)據(jù)采集實驗，初步明確了大腸桿菌和酵母菌在不同環(huán)境下的紫外光譜特征差異，為后續(xù)研究提供了重要的基礎數(shù)據(jù)。在特征分離及濃度檢測實驗方案中，采用了麥氏比濁實驗和平板計數(shù)法實驗對菌懸液濃度進行測定，前者操作簡便但精度較低，后者雖操作繁瑣但能準確測定活菌數(shù)量，兩者相互補充，為實驗提供了可靠的濃度參考。通過牛乳中兩種菌原始光譜數(shù)據(jù)采集，獲取了受牛乳復雜成分干擾下的微生物光譜數(shù)據(jù)，為后續(xù)的光譜預處理和特征分離提供了原始依據(jù)。實驗結果表明，大腸桿菌在260nm左右的核酸吸收峰和酵母菌在280nm附近的蛋白質吸收峰在不同環(huán)境下呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。在牛乳中，微生物光譜受到牛乳成分的干擾，特征吸收峰的形狀、位置和強度均發(fā)生了改變。盡管如此，通過對光譜數(shù)據(jù)的仔細分析，仍能識別出兩種菌的特征吸收峰。然而，實驗過程中也發(fā)現(xiàn)了一些問題。牛乳中生物大分子和微生物引起的基線漂移和散射問題較為嚴重，導致光譜數(shù)據(jù)存在噪聲和干擾，影響了特征分離和濃度檢測的準確性。不同批次牛乳樣品的成分差異可能對實驗結果產(chǎn)生一定影響，如何消除這些差異帶來的干擾還需要進一步研究。在后續(xù)研究中，針對這些問題，將重點優(yōu)化光譜預處理方法，進一步提高光譜數(shù)據(jù)的質量，如嘗試不同的預處理算法組合，或者開發(fā)新的預處理技術，以更有效地消除基線漂移和散射等干擾。對不同批次牛乳樣品進行更深入的分析，建立相應的校正模型，以降低樣品差異對實驗結果的影響。通過不斷改進實驗方法和數(shù)據(jù)分析手段，提高牛乳中大腸桿菌和干擾菌紫外光譜特征分離與濃度檢測的準確性和可靠性。四、光譜特征分離及濃度檢測研究4.1數(shù)據(jù)預處理原始光譜數(shù)據(jù)在采集過程中，受到牛乳復雜成分、儀器噪聲以及環(huán)境因素等影響，往往存在基線漂移、散射干擾、噪聲等問題，這些問題會降低光譜數(shù)據(jù)的質量，影響后續(xù)對大腸桿菌和干擾菌光譜特征的準確提取和分析。因此，對原始光譜數(shù)據(jù)進行預處理至關重要。多元散射校正（MSC）是一種用于消除光散射影響的有效方法。在牛乳體系中，微生物和牛乳中的脂肪球、蛋白質顆粒等會引起光的散射，導致光譜基線漂移和信號失真。MSC通過建立一個多元線性回歸模型，將原始光譜數(shù)據(jù)校正為理想的無散射光譜數(shù)據(jù)。假設原始光譜數(shù)據(jù)為X，理想的無散射光譜數(shù)據(jù)為X_{0}，則存在線性關系X=bX_{0}+a+e，其中b是斜率，a是截距，e是誤差項。通過最小二乘法擬合，估計出b和a的值，從而得到校正后的光譜數(shù)據(jù)X_{c}=(X-a)/b。經(jīng)過MSC處理后，光譜中的散射干擾得到有效抑制，基線更加平穩(wěn)，有助于后續(xù)對微生物特征吸收峰的準確識別。標準正態(tài)變量變換（SNV）主要用于消除因樣品不均勻性和光程變化等因素導致的乘性干擾。對于一組光譜數(shù)據(jù)X_{ij}（其中i表示樣品序號，j表示波長點序號），SNV變換后的光譜數(shù)據(jù)Y_{ij}計算如下：Y_{ij}=\frac{X_{ij}-\overline{X_{i}}}{S_{i}}其中，\overline{X_{i}}是第i個樣品光譜數(shù)據(jù)的均值，S_{i}是第i個樣品光譜數(shù)據(jù)的標準差。通過SNV變換，將每個樣品的光譜數(shù)據(jù)轉換為均值為0、標準差為1的標準正態(tài)分布，使得不同樣品之間的光譜數(shù)據(jù)具有可比性，進一步提高了光譜數(shù)據(jù)的質量。在對牛乳中大腸桿菌和干擾菌的原始光譜數(shù)據(jù)進行預處理時，首先應用MSC方法消除光散射影響，然后再進行SNV變換消除乘性干擾。從圖3可以看出，原始光譜數(shù)據(jù)（圖中藍色曲線）存在明顯的基線漂移和噪聲干擾，在200-300nm波長范圍內，基線波動較大，影響了微生物特征吸收峰的識別。經(jīng)過MSC處理后（圖中綠色曲線），光譜基線得到了一定程度的校正，基線漂移現(xiàn)象有所改善，但仍存在一些細微的噪聲。當進一步進行SNV變換后（圖中紅色曲線），光譜數(shù)據(jù)的噪聲明顯降低，基線更加平穩(wěn)，微生物的特征吸收峰更加突出。在260nm左右大腸桿菌的核酸吸收峰和280nm附近酵母菌的蛋白質吸收峰，經(jīng)過預處理后變得更加明顯，峰形更加尖銳，這為后續(xù)的二維相關分析特征分離和濃度檢測提供了更可靠的數(shù)據(jù)基礎。圖3光譜數(shù)據(jù)預處理前后對比圖（藍色為原始光譜，綠色為MSC處理后光譜，紅色為MSC和SNV處理后光譜）除了上述兩種方法，還可以結合其他預處理技術進一步提高光譜數(shù)據(jù)質量。采用Savitzky-Golay濾波對光譜數(shù)據(jù)進行平滑處理，去除高頻噪聲，使光譜曲線更加平滑，有助于突出微生物的特征吸收峰。在實際應用中，需要根據(jù)光譜數(shù)據(jù)的特點和實驗需求，選擇合適的預處理方法組合，以達到最佳的預處理效果。4.2二維相關特征分離經(jīng)過數(shù)據(jù)預處理后，為了進一步實現(xiàn)牛乳中大腸桿菌和干擾菌光譜特征的有效分離，采用二維相關分析（2DCOS）技術。二維相關分析能夠利用外部擾動下光譜數(shù)據(jù)的動態(tài)變化，揭示光譜峰之間的相關性和變化規(guī)律，從而在復雜的牛乳光譜體系中準確識別出大腸桿菌和干擾菌各自的特征。在本實驗中，選擇大腸桿菌的生物濃度作為外部擾動因素。隨著大腸桿菌生物濃度的變化，牛乳中大腸桿菌和干擾菌混合體系的紫外光譜也會相應改變。通過測量在不同大腸桿菌生物濃度下混合體系的紫外光譜數(shù)據(jù)，獲得一系列光譜矩陣。對這些光譜矩陣進行數(shù)學處理，計算同步相關光譜和異步相關光譜。同步相關光譜反映了光譜信號在同一時刻的變化相關性，而異步相關光譜則揭示了光譜信號在不同時刻的變化順序和因果關系。對于兩個光譜變量X(\lambda_{1},t)和Y(\lambda_{2},t)（其中\(zhòng)lambda_{1}和\lambda_{2}是不同的波長，t是外部擾動變量，即大腸桿菌生物濃度），同步相關系數(shù)\Phi_{XY}(\lambda_{1},\lambda_{2})和異步相關系數(shù)\Psi_{XY}(\lambda_{1},\lambda_{2})的計算公式如下：\Phi_{XY}(\lambda_{1},\lambda_{2})=\frac{\sum_{t=1}^{N}[X(\lambda_{1},t)-\overline{X}(\lambda_{1})][Y(\lambda_{2},t)-\overline{Y}(\lambda_{2})]}{\sqrt{\sum_{t=1}^{N}[X(\lambda_{1},t)-\overline{X}(\lambda_{1})]^{2}\sum_{t=1}^{N}[Y(\lambda_{2},t)-\overline{Y}(\lambda_{2})]^{2}}}\Psi_{XY}(\lambda_{1},\lambda_{2})=\frac{\sum_{t=1}^{N-1}[X(\lambda_{1},t+1)-X(\lambda_{1},t)][Y(\lambda_{2},t+1)-Y(\lambda_{2},t)]}{\sqrt{\sum_{t=1}^{N-1}[X(\lambda_{1},t+1)-X(\lambda_{1},t)]^{2}\sum_{t=1}^{N-1}[Y(\lambda_{2},t+1)-Y(\lambda_{2},t)]^{2}}}其中，\overline{X}(\lambda_{1})和\overline{Y}(\lambda_{2})分別是X(\lambda_{1},t)和Y(\lambda_{2},t)的均值，N是測量數(shù)據(jù)的點數(shù)。將計算得到的同步相關系數(shù)和異步相關系數(shù)分別作為矩陣元素，構建同步相關光譜圖和異步相關光譜圖。在同步相關光譜圖中，正相關區(qū)域（\Phi_{XY}(\lambda_{1},\lambda_{2})>0）表示兩個波長處的光譜信號變化趨勢相同，負相關區(qū)域（\Phi_{XY}(\lambda_{1},\lambda_{2})<0）表示變化趨勢相反。在異步相關光譜圖中，非零區(qū)域表示兩個波長處的光譜信號變化存在時間差，通過異步相關光譜圖可以判斷光譜變化的先后順序。圖4展示了以大腸桿菌生物濃度為外部擾動得到的二維相關同步光譜圖。從圖中可以看出，在260nm左右，存在明顯的自相關峰，這與大腸桿菌的核酸吸收峰位置相對應。隨著大腸桿菌生物濃度的增加，該波長處的吸收強度同步增強，表明在260nm處的光譜信號與大腸桿菌的濃度變化密切相關。在280nm附近，也存在一些相關峰，但強度相對較弱，這與酵母菌的蛋白質吸收峰位置相關。通過分析同步相關光譜圖中相關峰的位置和強度，可以初步識別出大腸桿菌和酵母菌的特征吸收峰。圖4二維相關同步光譜圖圖5為二維相關異步光譜圖。從圖中可以觀察到，在某些波長區(qū)域，異步相關系數(shù)不為零，表明這些波長處的光譜信號變化存在時間差。在260nm和280nm之間，異步相關光譜圖顯示出一定的變化特征。通過分析異步相關光譜圖，可以進一步確定大腸桿菌和酵母菌光譜變化的先后順序，從而更準確地分離出它們的光譜特征。例如，在大腸桿菌生物濃度增加的過程中，260nm處的光譜信號變化先于280nm處的某些信號變化，這與大腸桿菌和酵母菌在牛乳中的生理特性和濃度變化對光譜的影響有關。圖5二維相關異步光譜圖綜合同步相關光譜圖和異步相關光譜圖的分析結果，確定了大腸桿菌的特征吸收波段為255-265nm，在這個波段內，大腸桿菌的核酸吸收峰表現(xiàn)出明顯的濃度相關性和獨特的光譜變化特征。對于酵母菌，其特征吸收波段為275-285nm，該波段內的蛋白質吸收峰與酵母菌的濃度和光譜變化密切相關。通過二維相關分析，成功實現(xiàn)了牛乳中大腸桿菌和干擾菌光譜特征的有效分離，準確獲取了各自的特征吸收點及特征波段。這些特征信息為后續(xù)建立準確的濃度檢測模型提供了關鍵的數(shù)據(jù)支持。4.3預測模型的建立與驗證4.3.1模型建立在成功實現(xiàn)牛乳中大腸桿菌和干擾菌光譜特征分離后，基于分離得到的特征波段數(shù)據(jù)，選用合適的神經(jīng)網(wǎng)絡算法建立濃度預測模型。神經(jīng)網(wǎng)絡具有強大的非線性映射能力，能夠自動學習光譜數(shù)據(jù)與微生物濃度之間復雜的關系，為準確預測提供可能。BP神經(jīng)網(wǎng)絡作為一種經(jīng)典的神經(jīng)網(wǎng)絡模型，在本研究中被首先考慮用于建立濃度預測模型。BP神經(jīng)網(wǎng)絡由輸入層、隱藏層和輸出層組成，各層之間通過權值和閾值相互連接。在本實驗中，輸入層節(jié)點對應于經(jīng)過二維相關分析特征分離后得到的大腸桿菌和酵母菌的特征波段數(shù)據(jù)，這些特征波段數(shù)據(jù)包含了與微生物濃度密切相關的光譜信息。輸出層節(jié)點則對應于大腸桿菌和酵母菌的濃度。隱藏層的作用是對輸入數(shù)據(jù)進行特征提取和變換，通過非線性激活函數(shù)（如sigmoid函數(shù)）將輸入數(shù)據(jù)映射到一個新的特征空間，從而更好地捕捉數(shù)據(jù)中的非線性關系。BP神經(jīng)網(wǎng)絡的訓練過程采用反向傳播算法。在訓練開始時，隨機初始化網(wǎng)絡的權值和閾值。將訓練樣本的特征波段數(shù)據(jù)輸入到網(wǎng)絡中，經(jīng)過隱藏層的處理后得到預測輸出。計算預測輸出與實際濃度之間的誤差，根據(jù)誤差的大小，通過反向傳播算法將誤差信號從輸出層反向傳播到隱藏層和輸入層，依次調整各層的權值和閾值。在反向傳播過程中，使用梯度下降法來更新權值和閾值，使得誤差逐漸減小。經(jīng)過多次迭代訓練，網(wǎng)絡逐漸學習到光譜數(shù)據(jù)與微生物濃度之間的映射關系，當誤差達到設定的精度要求時，訓練結束。ELM神經(jīng)網(wǎng)絡作為一種新型的單隱層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡，也被應用于本研究中的濃度預測模型建立。與BP神經(jīng)網(wǎng)絡不同，ELM神經(jīng)網(wǎng)絡在訓練過程中隨機初始化輸入層與隱藏層之間的權值和隱藏層神經(jīng)元的閾值，然后通過最小二乘法直接計算隱藏層與輸出層之間的權值。這種方法避免了傳統(tǒng)BP神經(jīng)網(wǎng)絡中復雜的迭代計算過程，大大提高了訓練速度。在本實驗中，ELM神經(jīng)網(wǎng)絡同樣以大腸桿菌和酵母菌的特征波段數(shù)據(jù)作為輸入，以微生物濃度作為輸出。通過對大量訓練樣本的學習，ELM神經(jīng)網(wǎng)絡能夠快速建立起光譜數(shù)據(jù)與微生物濃度之間的準確模型。4.3.2模型驗證為了評估建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡和ELM神經(jīng)網(wǎng)絡濃度預測模型的準確性和可靠性，利用實驗獲得的測試集數(shù)據(jù)對模型進行驗證。將測試集的特征波段數(shù)據(jù)輸入到訓練好的模型中，得到預測的大腸桿菌和酵母菌濃度。通過計算預測濃度與實際濃度之間的誤差指標，如均方根誤差（RMSE）、平均絕對誤差（MAE）和決定系數(shù)（R2）等，來評估模型的性能。均方根誤差（RMSE）能夠反映預測值與實際值之間的平均誤差程度，其值越小，說明模型的預測精度越高。計算公式為：RMSE=\sqrt{\frac{1}{n}\sum_{i=1}^{n}(y_{i}-\hat{y}_{i})^{2}}其中，n是測試樣本的數(shù)量，y_{i}是第i個樣本的實際濃度，\hat{y}_{i}是第i個樣本的預測濃度。平均絕對誤差（MAE）表示預測值與實際值之間絕對誤差的平均值，它可以直觀地反映預測值與實際值的偏離程度。計算公式為：MAE=\frac{1}{n}\sum_{i=1}^{n}|y_{i}-\hat{y}_{i}|決定系數(shù)（R2）用于衡量模型對數(shù)據(jù)的擬合優(yōu)度，其值越接近1，說明模型對數(shù)據(jù)的擬合效果越好，預測能力越強。計算公式為：R^{2}=1-\frac{\sum_{i=1}^{n}(y_{i}-\hat{y}_{i})^{2}}{\sum_{i=1}^{n}(y_{i}-\overline{y})^{2}}其中，\overline{y}是實際濃度的平均值。對BP神經(jīng)網(wǎng)絡和ELM神經(jīng)網(wǎng)絡的預測結果進行計算，得到如表1所示的誤差指標數(shù)據(jù)。模型RMSE（CFU/mL）MAE（CFU/mL）R2BP神經(jīng)網(wǎng)絡3.2×10?2.5×10?0.90ELM神經(jīng)網(wǎng)絡2.1×10?1.6×10?0.95從表1中可以看出，ELM神經(jīng)網(wǎng)絡的RMSE和MAE值均小于BP神經(jīng)網(wǎng)絡，表明ELM神經(jīng)網(wǎng)絡的預測精度更高，預測值與實際值之間的誤差更小。ELM神經(jīng)網(wǎng)絡的R2值為0.95，更接近1，說明其對數(shù)據(jù)的擬合效果更好，能夠更準確地預測牛乳中大腸桿菌和酵母菌的濃度。除了上述誤差指標評估外，還通過繪制預測值與實際值的散點圖來直觀地展示模型的預測效果。從圖6中可以看出，ELM神經(jīng)網(wǎng)絡的預測值與實際值更加接近，數(shù)據(jù)點更緊密地分布在對角線附近，而BP神經(jīng)網(wǎng)絡的預測值與實際值存在一定的偏差，部分數(shù)據(jù)點偏離對角線較遠。這進一步驗證了ELM神經(jīng)網(wǎng)絡在牛乳中大腸桿菌和干擾菌濃度預測方面具有更好的性能。圖6BP神經(jīng)網(wǎng)絡和ELM神經(jīng)網(wǎng)絡預測值與實際值散點圖（藍色為BP神經(jīng)網(wǎng)絡，紅色為ELM神經(jīng)網(wǎng)絡）在實際應用中，還對不同來源和組成的牛乳樣品進行了模型驗證。選取了多個不同牧場、不同季節(jié)采集的牛乳樣品，按照相同的實驗方法制備含有大腸桿菌和酵母菌的混合樣品，并進行光譜數(shù)據(jù)采集和濃度檢測。結果表明，ELM神經(jīng)網(wǎng)絡模型在不同牛乳樣品中的預測表現(xiàn)較為穩(wěn)定，能夠準確地預測微生物濃度，而BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型在一些樣品中的預測誤差相對較大。這說明ELM神經(jīng)網(wǎng)絡模型具有更好的泛化能力，能夠適應不同牛乳樣品的檢測需求。4.4本章小結本章圍繞牛乳中大腸桿菌和干擾菌的紫外光譜特征分離與濃度檢測展開了深入研究。在數(shù)據(jù)預處理環(huán)節(jié)，運用多元散射校正（MSC）和標準正態(tài)變量變換（SNV）方法，有效消除了原始光譜數(shù)據(jù)中的基線漂移、散射干擾和噪聲問題，顯著提高了光譜數(shù)據(jù)質量，為后續(xù)分析奠定了良好基礎。采用二維相關分析（2DCOS）技術，以大腸桿菌生物濃度為外部擾動，成功實現(xiàn)了牛乳中大腸桿菌和干擾菌光譜特征的有效分離。通過分析同步相關光譜圖和異步相關光譜圖，準確確定了大腸桿菌的特征吸收波段為255-265nm，酵母菌（干擾菌代表）的特征吸收波段為275-285nm，為濃度檢測提供了關鍵的特征信息?；诜蛛x得到的特征波段數(shù)據(jù)，建立了BP神經(jīng)網(wǎng)絡和ELM神經(jīng)網(wǎng)絡濃度預測模型，并利用測試集數(shù)據(jù)對模型進行驗證。結果表明，ELM神經(jīng)網(wǎng)絡在預測精度和泛化能力方面表現(xiàn)更優(yōu)，其均方根誤差（RMSE）為2.1×10?CFU/mL，平均絕對誤差（MAE）為1.6×10?CFU/mL，決定系數(shù)（R2）達到0.95，能夠更準確地預測牛乳中大腸桿菌和酵母菌的濃度。然而，研究過程中也發(fā)現(xiàn)一些不足之處。在數(shù)據(jù)預處理階段，雖然MSC和SNV方法能有效改善光譜質量，但對于某些復雜牛乳樣品，仍可能存在部分干擾無法完全消除的情況，需要進一步探索更有效的預處理方法或方法組合。在二維相關分析中，外部擾動因素的選擇可能對特征分離效果產(chǎn)生一定影響，如何選擇更合適的擾動因素以及優(yōu)化分析算法，以提高特征分離的準確性和穩(wěn)定性，有待進一步研究。未來的研究可以朝著開發(fā)更先進的數(shù)據(jù)預處理技術、探索更多有效的特征分離方法以及優(yōu)化神經(jīng)網(wǎng)絡模型結構和參數(shù)等方向展開，以不斷提高牛乳中大腸桿菌和干擾菌紫外光譜特征分離與濃度檢測的準確性和可靠性，推動該技術在實際生產(chǎn)中的廣泛應用。五、結論與展望5.1研究總結本研究圍繞牛乳中大腸桿菌和干擾菌的紫外光譜特征分離與濃度檢測展開，取得了一系列重要成果。通過深入分析紫外-可見光譜法檢測原理，明確了光譜數(shù)據(jù)特征形成的原理以及牛乳中吸光物質、大腸桿菌和干擾菌的光學特性