ICS67.050CCSX0437Detectionofβ-lactoglobulingeneknockoutcowandβ-lactoglobulinincow'smilkIDB37/T4415—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實(shí)施。本文件由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東奧克斯畜牧種業(yè)有限公司、蒙天乳業(yè)有限公司、山東省畜牧總站。本文件主要起草人：黃金明、戴蘊(yùn)平、魏曉超、丁芳榮、王秀革、鞠志花、姜強(qiáng)、胡智勝、張亞冉、高亞平、劉文浩、王金鵬、楊春紅、李彥芹、宋明智、高運(yùn)東、侯明海。DB37/T4415—20211β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鑒定及牛奶中β-乳球蛋白的檢測(cè)技術(shù)本文件確立了β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛的定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）鑒定方法，以及牛奶中β-乳球蛋白（BLG）的定性免疫印跡（Western-Blot）和定量酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)方法。本文件適用于β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛以及牛奶中β-乳球蛋白的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)GB/T27642—2011牛個(gè)體及親子鑒定微衛(wèi)星DNA法NY/T1663—2008乳與乳制品中β-乳球蛋白的測(cè)定聚丙烯酰胺凝膠電泳法NY/T1672—2008綿羊多胎主效基因FecB分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T2695—2015牛遺傳缺陷基因檢測(cè)技術(shù)規(guī)程SN/T2497.16—2010進(jìn)出口危險(xiǎn)化學(xué)品安全試驗(yàn)方法第16部分：Western-Blot實(shí)驗(yàn)農(nóng)業(yè)部2031號(hào)公告-14-2013轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)普通牛(Bostaurus)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性PCR方法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1牛β-乳球蛋白基因Bostaurusβ-lactoglobulinBLGBLG基因（NCBIReferencesequence:NC_037338.1簡(jiǎn)稱PAEP，來(lái)源于普通牛（Bostaurus編碼β-乳球蛋白的基因。注：基因全長(zhǎng)4900bp，由7個(gè)外顯子和3.2β-乳球蛋白基因敲除奶牛β-lactoglobulinknockoutcow利用基因編輯技術(shù)敲除β-乳球蛋白基因的奶牛。4聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法-基因定性檢測(cè)4.1原理通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增出包含牛BLG基因全長(zhǎng)的DNA片段，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。依據(jù)BLG基因編碼序列是否發(fā)生突變，并提前引入終止密碼子，造成蛋白質(zhì)編碼異常，判斷是否敲除BLG基因。DB37/T4415—202124.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.2.1水：GB/T6682，三級(jí)。4.2.250×TAE緩沖液：稱取Tris-base242.2g，加入冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)100mL，用水定容至1000mL。使用時(shí)，用水稀釋為1×TAE。4.2.31%瓊脂糖凝膠：1g瓊脂糖充分溶解于1×TAE，定容至100mL。4.2.4BLG基因引物：——上游引物：5′-GCCTCTCGCATCTGACACTT-3′；——下游引物：5′-AGTTTCAAAGAGCCGTAGATGTGTG-3′；——預(yù)測(cè)野生型擴(kuò)增片段大小為6728bp。4.2.5內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因引物：參照農(nóng)業(yè)部2031號(hào)公告-14-2013。4.2.6引物溶液：引物用水稀釋到10μmol/L。4.3儀器設(shè)備4.3.1PCR擴(kuò)增儀：溫度范圍4℃~99℃,溫度梯度范圍20℃,模塊單元96×0.2mL。4.3.2離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速12000r/min，最大容量24×2mL。4.3.3電子天平：量程0.001g～100g，感量0.001g。4.3.4凝膠成像分析系統(tǒng)。4.3.5穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：輸出電壓0V～600V，輸出電流0mA～100mA。4.3.6高壓滅菌鍋：使用溫度范圍45℃~135℃,最高使用壓力0.255Mpa。4.3.7微波爐。4.4樣品4.4.1采集靜脈血樣3mL～5mL，醫(yī)用抗凝管或ACD抗凝，-20℃以下保存。4.4.2采集組織（耳組織等）0.1g～0.3g，浸入75%的酒精，-20℃以下保存。4.4.3采集帶毛囊的牛毛20～30根，浸入75%的酒精或置于毛囊卡，-20℃以下保存。4.4.4采集0.2mL～0.5mL鮮精或1～2支細(xì)管冷凍精液，備用。4.5試驗(yàn)步驟4.5.1DNA提取基因組DNA提取按照GB/T27642—2011附錄B規(guī)定執(zhí)行。4.5.2DNA濃度和純度檢測(cè)DNA濃度和純度檢測(cè)按照NY/T1672—2008中7.3的規(guī)定執(zhí)行。4.5.3PCR擴(kuò)增4.5.3.1樣品PCR擴(kuò)增4.5.3.1.1內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)程序按照農(nóng)業(yè)部2031號(hào)公告-14-2013。4.5.3.1.2基因特異性序列PCR擴(kuò)增DB37/T4415—202134.5.3.1.2.1PCR擴(kuò)增體系。TaqDNA聚合酶0.5μL；2×PCRbuffer25μL；dNTPMixture(2.5mM)4.5.3.2對(duì)照PCR擴(kuò)增以野生型奶?；蚪MDNA（序列信息見附錄A）作為陰性對(duì)照；以含有16bp缺失的BLG基因敲除奶?；蚪MDNA（序列信息見附錄B）作為陽(yáng)性對(duì)照；以水作為空白對(duì)照。除DNA模板外，對(duì)照PCR擴(kuò)增條件與4.5.3.1.2相同。4.5.4PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)按照NY/T2695—2015中6.4.2的規(guī)定執(zhí)行。4.5.5測(cè)序分析將檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序分析。4.6結(jié)果判定與表述4.6.1對(duì)照檢測(cè)結(jié)果分析在內(nèi)標(biāo)基因、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照PCR擴(kuò)增中，內(nèi)標(biāo)基因和BLG基因特異性序列均擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的產(chǎn)物，空白對(duì)照無(wú)預(yù)期擴(kuò)增片段，則表明PCR反應(yīng)體系正常；否則，需重新擴(kuò)增。4.6.2樣品檢測(cè)結(jié)果判定和表述PCR擴(kuò)增的β-乳球蛋白基因片段參考序列（野生型）見附錄A。對(duì)測(cè)序結(jié)果和參考序列進(jìn)行比對(duì)，判定樣品是否發(fā)生基因敲除。4.6.2.1如果樣品序列與參考序列一致，未造成蛋白質(zhì)編碼異常，表述為“BLG基因未敲除奶牛”。4.6.2.2如果樣品序列與參考序列比對(duì)，出現(xiàn)突變，且提前引入了終止密碼子，造成蛋白質(zhì)編碼異常，表述為“BLG基因敲除奶?！薄?免疫印跡（Western-Blot）法-蛋白定性檢測(cè)5.1原理對(duì)預(yù)處理的牛奶樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，使用牛β-乳球蛋白特異性第一抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)條帶位置和著色深度判定樣品中是否含有β-乳球蛋白。5.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.2.1水：GB/T6682，三級(jí)。5.2.2牛β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)液（10mg/mL）：稱取0.1g牛β-乳球蛋白，溶解于10mL雙蒸水中，分裝，-20℃以下保存。5.2.310%SDS：將10g的SDS粉末溶于80mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至100mL。5.2.430%丙烯酰胺：將29g丙烯酰胺和1gN,N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60mL的蒸餾水中，充分溶解后，定容至100mL。DB37/T4415—202145.2.51.5MTris-HCl(pH8.8)：將181.65gTris溶于800mL蒸餾水中，加濃鹽酸調(diào)pH至8.8，定5.2.61MTris-HCl(pH=6.8)：將121.1gTris溶于800mL蒸餾水中，加濃鹽酸調(diào)pH至6.8，定容5.2.710%過(guò)硫酸銨：將10g過(guò)硫酸銨粉末溶于80mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至100mL。5.2.815%SDS分離膠（5mL1.1mL蒸餾水，2.5mL30%丙烯酰胺溶液，1.3mL1.5MTris-HCl(pH8.8)，0.05mL10%SDS，0.05mL10%過(guò)硫酸銨，0.002mLTEMED。5.2.95%SDS濃縮膠（2mL1.4mL蒸餾水，0.33mL30%丙烯酰胺溶液，0.25mL1.0MTris-HCl(pH6.8)，0.02mL10%SDS，0.02mL10%過(guò)硫酸銨，0.002mLTEMED。5.2.1010×轉(zhuǎn)膜液（500mL15.1gTris，75g甘氨酸溶于蒸餾水中至終體積為500mL。5.2.1110×TBS（1L）：88g氯化鈉，12.1gTris溶于蒸餾水中至終體積為1L，濃鹽酸調(diào)整pH至7.6。5.2.121×TBST（1L100mL10×TBS緩沖液，899mL雙蒸水，1mL吐溫20。5.2.13BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。5.2.14ECL化學(xué)發(fā)光顯色液。5.3儀器設(shè)備5.3.1離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速12000r/min，最大容量24×2mL。5.3.2電子天平：量程0.001g～100g，感量0.001g。5.3.3高壓滅菌鍋：使用溫度范圍45℃~135℃,最高使用壓力0.255Mpa。5.3.4金屬水浴鍋：控溫范圍-10℃~100℃。5.3.5穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：輸出電壓0V～600V，輸出電流0mA～100mA。5.3.6半干轉(zhuǎn)膜儀。5.3.7化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。5.4樣品5.4.1液態(tài)樣品取液態(tài)樣品50mL，離心12000g，5min，去除脂肪層，取上清液，待測(cè)或-80℃以下保存。5.4.2固態(tài)樣品稱取固態(tài)樣品5g，加適量水溶解，定容至50mL，制成液態(tài)樣品，隨后按照5.4.1操作。5.5試驗(yàn)步驟5.5.1樣品蛋白濃度測(cè)定使用BCA試劑盒測(cè)定樣品中的蛋白濃度。5.5.2樣品制備分別取總蛋白含量為30μg的待檢樣品、陰性對(duì)照樣品（不含β-乳球蛋白的牛奶以及1μgβ-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，加入5×SDS加樣緩沖液，100℃水浴10min。5.5.3十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）采用NY/T1663—2008中的方法進(jìn)行SDS凝膠電泳。DB37/T4415—202155.5.4轉(zhuǎn)膜按照SN/T2497.16—2010中轉(zhuǎn)膜方法執(zhí)行。5.5.5封閉將PVDF膜置于封閉液中，室溫水平搖動(dòng)2h或4℃過(guò)夜。5.5.6第一抗體結(jié)合在自封袋中加入適當(dāng)比例稀釋的兔抗牛β-乳球蛋白一抗抗體，放入PVDF膜，排凈氣泡后封口，室溫水平搖動(dòng)2h。5.5.7洗膜用TBST溶液洗膜，10min/次，3～5次。5.5.8第二抗體結(jié)合在自封袋中加入適當(dāng)比例稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗抗體，放入PVDF膜，排凈氣泡后封口，室溫水平搖動(dòng)1h。5.5.9洗膜用TBST溶液洗膜，10min/次，3～5次。5.5.10顯影將ECL顯色液試劑A、B液等體積混合，加入到膜表面，1min～2min，置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中拍照保存結(jié)果。5.6結(jié)果判定與表述5.6.1對(duì)照檢測(cè)結(jié)果分析β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)到預(yù)期大?。?8kD）的條帶，空白和陰性對(duì)照無(wú)特異性條帶，則表明Western-Blot檢測(cè)方法正常；否則，需重新檢測(cè)。5.6.2樣品檢測(cè)結(jié)果判定與表述將樣品進(jìn)行SDS分離，使用牛β-乳球蛋白特異性抗體進(jìn)行Western-Blot鑒定，若在18kD分子量處出現(xiàn)和β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品泳道中大小一致的條帶，判定該樣品含β-乳球蛋白，表述為“β-乳球蛋白陽(yáng)性”；若在18kD分子量處無(wú)條帶，判定為不含β-乳球蛋白的樣品，表述為“β-乳球蛋白陰性”。6酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法-蛋白定量檢測(cè)6.1原理在微孔板上預(yù)包被牛β-乳球蛋白抗體，樣品中的β-乳球蛋白與生物素標(biāo)記的β-乳球蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地和微孔中的抗體結(jié)合，然后加入親和素-辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物，加入顯色底物，終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取450nm波長(zhǎng)下的吸光度值，吸光度值與β-乳球蛋白的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，再乘以稀釋倍數(shù)即可得出樣品中β-乳球蛋白的含量。DB37/T4415—202166.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.2.1水：GB/T6682，三級(jí)。6.2.2預(yù)包被96微孔板：已包被人乳鐵蛋白多克隆抗體的96孔板（8孔×12條）。6.2.3100×生物素偶聯(lián)物：生物素標(biāo)記的牛β-乳球蛋白偶聯(lián)物，使用前用稀釋緩沖液稀釋100倍。6.2.4100×親和素-辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物：使用前用稀釋緩沖液稀釋100倍。6.2.51×PBS緩沖液：將1.44g磷酸氫二鈉，0.24g磷酸二氫鉀，8g氯化鈉和0.2g氯化鉀溶于800mL蒸餾水中，濃鹽酸調(diào)整pH至7.4，加水定容至1L。6.2.6稀釋緩沖液：含有1%BSA的PBS緩沖液：將1gBSA溶于100mLPBS緩沖液中。6.2.7洗滌緩沖液：含有0.05%吐溫20的PBS緩沖液：將50μL吐溫20溶于100mLPBS緩沖液中，震蕩混勻。6.2.8四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色底物。6.2.92M硫酸反應(yīng)終止液：10mL98%濃硫酸加入60mL蒸餾水中，定容至100mL。6.2.10β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液：用樣品稀釋緩沖液按照10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL濃度梯度制備β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品稀釋緩沖液作為空白對(duì)照（0μg/mL）。6.3儀器設(shè)備6.3.1離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速12000r/min，最大容量24×2mL。6.3.2電子天平：量程0.001g～100g，感量0.001g。6.3.3高壓滅菌鍋：使用溫度范圍45℃~135℃,最高使用壓力0.255Mpa。6.3.4恒溫箱：溫控范圍為室溫+5℃~80℃。6.3.5酶標(biāo)儀：配備450nm濾光片。6.4樣品按照5.4.1和5.4.2對(duì)樣品進(jìn)行脫脂處理，用稀釋緩沖液將樣品稀釋1000倍（預(yù)測(cè)樣品中β-乳球蛋白含量?jī)?yōu)化稀釋比例）。6.5試驗(yàn)步驟6.5.1準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需試劑，并平衡至室溫（20℃~25℃)。6.5.2取合適數(shù)量（按照每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)）的微孔板放入板架上，每孔加入506.5.3每孔加入50μL生物素偶聯(lián)物，密封，37℃孵育30min。6.5.4吸凈孔中液體，每孔加入洗滌緩沖液200μL，浸泡2min，吸凈孔中液體，重復(fù)2次，最后用吸水紙拍干。6.5.5每孔加入100μL親和素-辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物，密封，37℃孵育30min。6.5.6按照6.5.4步驟洗板5次。6.5.7每孔加入90μLTMB顯色底物，避光，37℃孵育20min。6.5.8每孔加入50μL終止液，溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)下讀取吸光度值。6.6結(jié)果計(jì)算6.6.1計(jì)算樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均吸光度值。6.6.2以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為X-軸，對(duì)應(yīng)的平均吸光度值為Y-軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。DB37/T4415—202176.6.3標(biāo)準(zhǔn)曲線上樣品吸光度值對(duì)應(yīng)的β-乳球蛋白濃度，乘以樣品稀釋倍數(shù)，即為所測(cè)樣品中β-乳球蛋白含量。若檢測(cè)的β-乳球蛋白濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高濃度，對(duì)樣品進(jìn)行合適倍數(shù)稀釋后再檢測(cè)。計(jì)算公式如下：式中：X——樣品中β-乳球蛋白含量，單位為μg/mL；C——樣品吸光度值對(duì)應(yīng)的β-乳球蛋白濃度，單位為μg/mL；N——樣品稀釋倍數(shù)，本文件中使用的稀釋倍數(shù)為1000。6.7檢出靈敏度本文件ELISA方法的檢出靈敏度為0.13μg/mL。7檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403和GB/T19495.2規(guī)定執(zhí)行。8廢棄物的處理按照GB/T19495.2規(guī)定執(zhí)行。DB37/T4415—20218（資料性）PCR擴(kuò)增的野生型牛β-乳球蛋白基因序列g(shù)cctctcgcatctgacacttgtgttcaaaccacccatgctggtgttcggggggccacctatggggaaggctcctcactgcaggggtgcccctgtcccctgagagatcagaagtcccagtctggatgtcgaatggccgagctccctccagaggctccagggagggatccttgccccctccgccgccgcctccagctcctggtgccgcacccttgggcccgatctcgtagacgcctcagtccagtctctgcctccgtgttcactggcattctccccatgtcccctctgtgtccccgttttctctcacaaggacaccggacataagattagcccccgttccagcatcacctgaacagctcacatctgtaaagacctagattccaaacaagattccatcctgaagttcctggtggacgtgagttctggagcgacgcccttcaaccccatcacagcttgcggttcatcgcaaaacacggaacctgggatttatcgtaaaacccaggttcttcgtgaaacactgagcttcgaggcttgttgcaagaattaaaggtgctaatacagatcagggcaaggaccgaagctggccaagcctcctctttccatcacaggaaagggaggtctgggggcggccgggggtctgctcccgtgggtgggctctttctggtacagtcaccaacagtctctccgggaaggaaaccagaggccagagagcaagccagagctagtctaggagatccctgagcctccacccaagatgccgaccagccagcgggccccctggaaagaccctacagtctagggggggaacaggagccgacccgccaggcccccgctatcaggagacaccccaaccttgctcctgttcccctaccccagtacgcccacccgacccctgagatgagtggtttacttgcttagaatgtcaattgaaggcttttgtaccccctttgccagtggcacagggcacccacagcccgctgggtactgatgcccatgtggactcagccaggaggactgtcctgcgccctccctgctcgggccccctccatactcagcgacacacccagcaccagcattcccaccactcctgaggtctgaaggcagctcgctgtggtctgagcggtgcggagggaagtgccctgggagatttaaaatgtgagaggtgggaggtgggaggttgggtcctgtaggccttcccatcccacgtgcctgcacggagccctagtgctactcagtcatgcccccgcagcacccctcaggtcactttcccatcctgggggttattatgactgttgtcattgttgttgcctttttgctaccctaactgggcagcgggtgcttgcagagccctcgatactgaccaggttcccccctcggagctcgacctgaaccccatgtcaccctcgccccagcctgcagagggtgaggtgactgcagagataccctttacccaaggccacagtcacatggtttggaggagatggtgcccaaggcagaagccaccctccaggacacacctgcccccagtgctggctctgacctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctggcagccagcctggacccagagcctggacaccccctgcgcccccacttctggggcgtaccaggaaccgtccaggcccagagggggcctTCCTGCTTGGCCTCGAATGGAAGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAACCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGCCCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGTGACCCCAGCTGCAGCCATGAAGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGCCCTCACTTGTGGCGCCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATATCCAGAAGGTTCGAGGGTGCCCGGGTGGGTGGTGAGTTCGAGGGCTGGCTGGGGAGCTGGGCCTCAGAGACCAAGGGAGGCTGTGACGTCTGGGATTCCCATCAGTCAGCTAGAGCCGCCTGACAAATCGCCCGCCACAGGCTTCAACCAGGCCTTTAGTGTCTTGCATTCTGGAGGCTGGAAGCTGCAATCCGGGCATCGGCCCAGCTGGCTTCTCCTGCGGCCACTCTCCGGGGAGCAGACAGCCATCTTCTCCCTGTGTCCTTTGCGTGCCCTGGTTTCCTCTTCCTGTGAGGTCACCAGGCCTGCTGGATCCACGCCCGCCCACACAGCCTCACGTAACCTTTGTCATCTCTTTAAAGGCCGTGTCTCCAGTCCTGTGTTGAGGTTCTGGGGGTTAATGGGACACAGTTCAGCCCCTAAAAGAGTCCGCTCTGCCCCTCAAATTTTCCCCACCTCCAGCTATGGTCTCCCCAAGATCCAAATGTTGCCACGTGTGCGGGGGCTCATCTGGGTCCCTCTTTGGGCTCAGAGTGAGTCTGGGGAGAGCATTCCTCAGGGTGCCGAGTTGGGGGGAGGCATCTCAGGGCTGCCCAGGCCAGGGTGGGACAGAGAGCCCACTGTGGGGCTGGGGGCCCCTTCCCGCCCCTGGAGTGCAGCTCAAGGTCCCTCCCCAGGTGGCGGGGACTTGGTACTCCTTGGCCATGGCGGCCAGCGACATCTCCCTGCTGGACGCCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGCCCACCCCTGAGGGCGACCTGGAGATCCTGCTGCAGAAATGGTGGGCGTCCCCCCCAAAAAAAGCATGGAACCCCCACTCCCCAGGGATATGGACCCCCCGGGGTGGGGTGCAGGAGGGACCAGGGCCCCAGGGCTGGGGAACGGGGCTTGGAGTTTCCTGGTACCCCTGGAGGTCCACCCAAGGCTGCTTATCCAGGGCTTTCTCTTTCTTTTTTTCCCCCAACTTTTATTAATTTGATGCTTCAGAACATCATCAAACAAATGAACACAAAACATCATTTTCGTTAACTTGGAAGGGGAGATAAAATCCACTGAAGTGGAAATGCATAGGAAAGATACATACAGTAAGGCAGGTATTCTGAATTCGCTGTTAGTTTGAGGATTACAAATGCACTTGAGCAACAGAGAGACGTTTTCATTATTTCTCGGTCTGAACAGCTCAGTATCTAAAATGAACAAGATGTCATGGAGACAAAGCCGGCGGGGGAGAGGCCCGTGTGAAGGCCGCTGGGCGTGCAGACCTGGGTCCTCGGGGCCCAGGCAGTTCCCACTACCAGCCCTGTCCACCCTCAGACGGGGGTCAGAGTGCAGGAGAGAGCTGGGTGGGTGTGGGGCAGAGATGGGGACCTGAACCCCAGGACTGCCTTTTGGGGTGCCTGTGGTCAAGGCTCTCCCCAACCTTTTCTCCCTGGCTCCATCTGACTTCTCCTGGCCCATCCACCCGGTCACCTGTGGCCCCAGAGGTGACAGTGAGTGCAGCCAAGGCCGGTTGGCCAGCCGGCCCCCTATGCCCACGCCACCCGCCTCCAG9CCCCTCCTGGGGCCGCCTTCTGCCCCTGGCCCTCAGTTCATCCTGATGAAAATGGTCCATGCCCGTGGCTCAGAAAGCAGCTGTCTTTCAGGGAGAACGGTGAGTGTGCTCAGAAGAAGATCATTGCAGAAAAAACCAAGATCCCTGCGGTGTTCAAGATCGATGGTGAGTGCTGGGTCCCCAGGGGACGCCCACCACCCCCCAGGGACTGTGGGCAGGTGCAGGGGGCTGGCGTCAGGCCCCGAGATGCTAAGGGGCTGGTGGTGATGAAGACACTGCCGTGCCACCTGCTTCCCTGGCCTCCCTGCCACCTGCCCGGGGCCTTGGGCCGGTGGCCGTGGGCAGGTCCCGGCTGGGCAGGTCTGACACCCCAGGGTGACACCCGAGCTCTCTTTGCTGAGGGTGGGGTGGTGCTCGGGGCCCTCAGGCTGAGCTCAGGAGGTCCCTGTGCCCACCCAGGGGTAACCGAGAGCCGCTGCCCGCTCCAGGGGTCCAGGTGCCCCACGATCCCAGCCCACCCCACGGCTCCTTCATCTCCTGAAGACGAACTCTGTCCGCCCTCGCTCATTCACTTGTTTGTCCTAAATCCAAGATGAGAAAGCTTCGAGGTGGGGTTGGGGTTCCATCAGGGCCTGCCCTTCCGCCGGGCAGCCTGGGCCACATCTGCCCTTGGCCTCTTCAGGACTCACTCTGACTGGAGGCCCTGCACTGACTGATGCCAGGGTGCCCAGCCCAGGGTCTCCTGTGCCATCCGGCTGCACGGGGTTTGGATGCTGGTCCTGCCCCCAAGCTGCCCAGACACTGCAGGGCAGCTGGGGCCACCCGCAGGCCTCGGTCAGGGAGAGCCCCAGCTGCCCCCGCTCAGCGCTGCCCCCCAACAATTCCCCAGTCCTCAGGACGCATCCCTCTTCCCTTGCTGGGCAGTGTTCAGCCCCACCCGAGATCGGGGAAGCCCTATTTCTTGACCACTCCGGTCCCTGGGGAGGGCGGCCTCAGACTCAGTGGTGAGTGTTCCCAAGTCCAGGAGGTGGTGGAGGGTCCCTGGCGGATCCAGAGTTGGGCTTCCAGAGTGAGGGCTTCCTGGGCCCCATGTGCCTGGCAGTGGCAGCAGGGAAGGGGCCACACCATTTTGGGGCTGGGGGATGCCAGAGGGCGCTCCCCACCCCGTCCTCACCAAGTGGTGACCCCGGGGGAGCCCCGCTGGTTGTGGGGGGTGCTGGGGGCTGACCAGAAACCCCCCTCCTGCTGGAACTCACTTTCCTCCCGTCTTGATCTCTTCCAGCCTTGAATGAGAACAAAGTCCTTGTGCTGGACACCGACTACAAAAAGTACCTGCTCTTCTGCATGGAGAACAGTGCTGAGCCCGAGCAAAGCCTGGCCTGCCAGTGCCTGGGTGGGTGCCAACCCTGGCTGCCCAGGGAGACCAGCTGTGTGGTCCTCGCTGCAACGGGGCCGGGGGGGACGGTGGGAGCAGGGAGCTTGATTCCCAGGAGGAGGAGGGATGGGGGGTCCCCGAGTCCCGCCAGGAGAGGGTGGTCATATACCGGGAGCCGGTGTCCTGGGGGCCTGTGGGTGACTGGGGACGGGGGCCAGACACACAGGCTGGGAGACGGGGGGCTGCAGCGCTCTGGTGTGACCATCACGATGGAGCCGGCGGTCACTATGAATCTAACAGCCTTTGTTACCGGGGAGTTTCAATTATTTCATCAAATAAGAACTCAGGCACAAAGCTGTCTTTCAACTGTCACGTCCTGAAAACAAATGGCAGGTGACATTTTCCATGCCATAGCAGTGCCACTGGGCATTTTCAGGGCCCATGTGCCAGGAGGGCGTGGGCATCGGCGAGTGGAGGCTCCTGGCCGTGTCAGCTGGCCCAGGGGGAGGAGGGGACCCAGACAGCCAGAGGTGGGGAGCAGGCTTTCCCCCTGTGACGCTGCAGACCCACCGCACTGCCCTGGGAGGAAGGGGAGGGAACTGGGCCAAGGGGGAAGGGCAGGTGTGCTGGAGGCCAAGGCAGACCTGCACACCACCCTGGAGAGCAGGGGTTGACCCCGTCCCGGCCCCACAGTCAGGACCCCGGAGGTGGACGACGAGGCCCTGGAGAAATTCGACAAAGCCCTCAAGGCCCTGCCCATGCACATCCGGCTGTCCTTCAACCCAACCCAGCTGGAGGGTGAGCACCCAGGCCCCACCCTGCTCCTGGGGCAGGAAGCCACCCGGCCCAGGACCACCTCCTCCCATGGTGACCCCCAGCTCCCCAGGCCTCCCGGGAGGATGGAGACGGGGTGCAGGGCCCCGAGGTGGCCCCCTCCCCACCCCCTCCCCAGCTCCCTCTGTCCTGGGGTGTCCAGTCCCATCCTGACGCTCCCCCGCCACGGCTCTCCCTCCCCCACAGAGCAGTGCCACATCTAGTGAGCCCCTGCCGGCGCCTCTGGGGTAAGCTGCCTGCCCTGCCCCACGTCCTGGGCACACACATGGGGTAGGGGTTCTTGGTTGGGCCCGGGAGCCCCCATTAGGCCCTGGGGTCCCCCGTAGGAATGGCTGGAAGCTGGGGTCCTTCCTGGAGACTACAGAGCCGGCTGGCCACATGCTCGCTCTTGTGGGGTGACCTGTGTCCTGGCCTCACTCACACGCTGATCTCCTCCACCTCCTTCCTGGCAGACCTAAGGGCCAAGGTGGAGGGCTCAGGAAGTGACACCTAAGGGGGAGGCTAGGGGGGTCCTTCTCCCAAAGGAGGGGCCGTCCTGAATCCCCAGCCACGGACAGGCTGGCAAGGGTCTGGCAGGTACCCCAGGAATCACAGGGGAGCCCCATGTCCATTTCAGAGCCCGGGAGCCTTGGCCCCTCTGGGGACAGACGATGTCATCCCCGCCTGCCCCATCAGGGGACCAGGAGGAACCGGGACCACATTCACCCCTCCTGGGACCCAGGCCCCTCCAGGCCCCTCCTGGGGCCTCCTGCTTGGGGCCGCTCCTCCTTCAGCAATAAAGGCATAAACCTGTGCTCTCccttctgagtctttcctggatgatgggccgggggtggagaaggcccgggacagggtggggagtggtctggctcagaggatgatggtagggctgggatccagggcgtctgcattacagtcttgtgacatctgggggcccacacacatctacggctctttgaaact注：下劃線部分為引物序列位置；大寫字母部分為β-乳球蛋白基因序列；大（資料性）PCR擴(kuò)增的16bp缺失牛β-乳球蛋白基因序列g(shù)cctctcgcatctgacacttgtgttcaaaccacccatgctggtgttcggggggccacctatggggaaggctcctcactgcaggggtgcccctgtcccctgagagatcagaagtcccagtctggatgtcgaatggccgagctccctccagaggctccagggagggatccttgccccctccgccgccgcctccagctcctggtgccgcacccttgggcccgatctcgtagacgcctcagtccagtctctgcctccgtgttcactggcattctccccatgtcccctctgtgtccccgttttctctcacaaggacaccggacataagattagcccccgttccagcatcacctgaacagctcacatctgtaaagacctagattccaaacaagattccatcctgaagttcctggtggacgtgagttctggagcgacgcccttcaaccccatcacagcttgcggttcatcgcaaaacacggaacctgggatttatcgtaaaacccaggttcttcgtgaaacactgagcttcgaggcttgttgcaagaattaaaggtgctaatacagatcagggcaaggaccgaagctggccaagcctcctctttccatcacaggaaagggaggtctgggggcggccgggggtctgctcccgtgggtgggctctttctggtacagtcaccaacagtctctccgggaaggaaaccagaggccagagagcaagccagagctagtctaggagatccctgagcctccacccaagatgccgaccagccagcgggccccctggaaagaccctacagtctagggggggaacaggagccgacccgccaggcccccgctatcaggagacaccccaaccttgctcctgttcccctaccccagtacgcccacccgacccctgagatgagtggtttacttgcttagaatgtcaattgaaggcttttgtaccccctttgccagtggcacagggcacccacagcccgctgggtactgatgcccatgtggactcagccaggaggactgtcctgcgccctccctgctcgggccccctccatactcagcgacacacccagcaccagcattcccaccactcctgaggtctgaaggcagctcgctgtggtctgagcggtgcggagggaagtgccctgggagatttaaaatgtgagaggtgggaggtgggaggttgggtcctgtaggccttcccatcccacgtgcctgcacggagccctagtgctactcagtcatgcccccgcagcacccctcaggtcactttcccatcctgggggttattatgactgttgtcattgttgttgcctttttgctaccctaactgggcagcgggtgcttgcagagccctcgatactgaccaggttcccccctcggagctcgacctgaaccccatgtcaccctcgccccagcctgcagagggtgaggtgactgcagagataccctttacccaaggccacagtcacatggtttggaggagatggtgcccaaggcagaagccaccctccaggacacacctgcccccagtgctggctctgacctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctggcagccagcctggacccagagcctggacaccccctgcgcccccacttctggggcgtaccaggaaccgtccaggcccagagggggcctTCCTGCTTGGCCTCGAATGGAAGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAACCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGCCCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGTGACCCCAGCTGCAGCCATGAAGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGCCCTCACTTGTGGCGCCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATATCCAGAAGGTTCGAGGGTGCCCGGGTGGGTGGTGAGTTCGAGGGCTGGCTGGGGAGCTGGGCCTCAGAGACCAAGGGAGGCTGTGACGTCTGGGATTCCCATCAGTCAGCTAGAGCCGCCTGACAAATCGCCCGCCACAGGCTTCAACCAGGCCTTTAGTGTCTTGCATTCTGGAGGCTGGAAGCTGCAATCCGGGCATCGGCCCAGCTGGCTTCTCCTGCGGCCACTCTCCGGGGAGCAGACAGCCATCTTCTCCCTGTGTCCTTTGCGTGCCCTGGTTTCCTCTTCCTGTGAGGTCACCAGGCCTGCTGGATCCACGCCCGCCCACACAGCCTCACGTAACCTTTGTCATCTCTTTAAAGGCCGTGTCTCCAGTCCTGTGTTGAGGTTCTGGGGGTTAATGGGACACAGTTCAGCCCCTAAAAGAGTCCGCTCTGCCCCTCAAATTTTCCCCACCTCCAGCTATGGTCTCCCCAAGATCCAAATGTTGCCACGTGTGCGGGGGCTCATCTGGGTCCCTCTTTGGGCTCAGAGTGAGTCTGGGGAGAGCATTCCTCAGGGTGCCGAGTTGGGGGGAGGCATCTCAGGGCTGCCCAGGCCAGGGTGGGACAGAGAGCCCACTGTGGGGCTGGGGGCCCCTTCCCGCCCCTGGAGTGCAGCTCAAGGTCCCTCCCCAGGTGGCGGGGACTTGGTACTCCTTGGCCATGGCGGCCAGCGACATCTCCCTGCTGGACGCCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGCCCACCCCTGAGGGCGACCTGGAGATCCTGCTGCAGAAATGGTGGGCGTCCCCCCCAAAAAAAGCATGGAACCCCCACTCCCCAGGGATATGGACCCCCCGGGGTGGGGTGCAGGAGGGACCAGGGCCCCAGGGCTGGGGAACGGGGCTTGGAGTTTCCTGGTACCCCTGGAGGTCCACCCAAGGCTGCTTATCCAGGGCTTTCTCTTTCTTTTTTTCCCCCAACTTTTATTAATTTGATGCTTCAGAACATCATCAAACAAATGAACACAAAACATCATTTTCGTTAACTTGGAAGGGGAGATAAAATCCACTGAAGTGGAAATGCATAGGAAAGATACATACAGTAAGGCAGGTATTCTGAATTCGCTGTTAGTTTGAGGATTACAAATGCACTTGAGCAACAGAGAGACGTTTTCATTATTTCTCGGTCTGAACAGCTCAGTATCTAAAATGAACAAGATGTCATGGAGACAAAGCCGGCGGGGGAGAGGCCCGTGTGAAGGCCGCTGGGCGTGCAGACCTGGGTCCTCGGGGCCCAGGCAGTTCCCACTACCAGCCCTGTCCACCCTCAGACGGGGGTCAGAGTGCAGGAGAGAGCTGGGTGGGTGTGGGGCAGAGATGGGGACCTGAACCCCAGGACTGCCTTTTGGGGTGCCTGTGGTCAAGGCTCTCCCCAACCTTTTCTCCCTGGCTCCATCTGACTTCTCCTGGCCCATCCACCCGGTCACCTGTGGCCCCAGAGGTGACAGTGAGTGCAGCCAAGGCCGGTTGGCCAGCCGGCCCCCTATGCCCACGCCACCCGCCTCCAGCCCCTCCTGGGGCCGCCTTCTGCCCCTGGCCCTCAGTTCATCCTGATGAAAATGGTCCATGCCCGTGGCTCAGAAAGCAGCTGTCTTTCAGGGAGAACGGTGAGTGTGCTCAGAAGAAGATCATTGCAGAAAAAACCAAGATCCCTGCGGTGTTCAAGATCGATGGTGAGTGCTGGGTCCCCAGGGGACGCCCACCACCCCCCAGGGACTGTGGGCAGGTGCAGGGGGCTGGCGTCAGGCCCCGAGATGCTAAGGGGCTGGTGGTGATGAAGACACTGCCGTGCCACCTGCTTCCCTGGCCTCCCTGCCACCTGCCCGGGGCCTTGGGCCGGTGGCCGTGGGCAGGTCCCGGCTGGGCAGGTCTGACACCCCAGGGTGACACCCGAGCTCTCTTTGCTGAGGGTGGGGTGGTGCTCGGGGCCCTCAGGCTGAGCTCAGGAGGTCCCTGTGCCCACCCAGGGGTAACCGAGAGCCGCTGCCCGCTCCAGGGGTCCAGGTGCCCCACGATCCCAGCCCACCCCACGGCTCCTTCATCTCCTGAAGACGAACTCTGTCCGCCCTCGCTCATTCACTTGTTTGTCCTAAATCCAAGATGAGAAAGCTTCGAGGTGGGGTTGGGGTTCCATCAGGGCCTGCCCTTCCGCCGGGCAGCCTGGGCCACATCTGCCCTTGGCCTCTTCAGGACTCACTCTGACTGGAGGCCCTGCACTGACTGATGCCAGGGTGCCCAGCCCAGGGTCTCCTGTGCCATCCGGCTGCACGGGGTTTGGATGCTGGTCCTGCCCCCAAGCTGCCCAGACACTGCAGGGCAGCTGGGGCCACCCGCAGGCCTCGGTCAGGGAGAGCCCCAGCTGCCCCCGCTCAGCGCTGCCCCCCAACAATTCCCCAGTCCTCAGGACGCATCCCTCTTCCCTTGCTGGGCAGTGTTCAGCCCCACCCGAGATCGGGGAAGCCCTATTTCTTGACCACTCCGGTCCCTGGGGAGGGCGGCCTCAGACTCAGTGGTGAGTGTTCCCAAGTCCAGGAGGTGGTGGAGGGTCCCTGGCGGATCCAGAGT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