基于計算機蛋白設計與篩選構建小分子生物傳感器的探索與實踐一、引言1.1研究背景小分子在生物過程中扮演著至關重要的角色，它們參與細胞代謝、信號傳導、基因表達調控等關鍵生理活動。例如，激素作為一類小分子，能夠調節(jié)人體的生長發(fā)育、新陳代謝和生殖功能；神經遞質則在神經元之間傳遞信號，影響大腦的認知、情緒和行為。此外，許多藥物也是小分子化合物，通過與特定的生物分子相互作用來治療疾病。對小分子的精確檢測和監(jiān)測對于理解生命過程、疾病診斷與治療以及藥物研發(fā)等領域具有重要意義。傳統的小分子檢測方法如色譜-質譜聯用技術、核磁共振技術等，雖然具有較高的準確性和靈敏度，但往往需要昂貴的儀器設備、復雜的樣品前處理過程以及專業(yè)的操作人員，限制了其在即時檢測（POCT）和現場監(jiān)測等場景中的應用。生物傳感器作為一種將生物識別元件與物理或化學換能器相結合的分析裝置，能夠實現對目標小分子的快速、靈敏、選擇性檢測，且具有操作簡便、成本低、可微型化等優(yōu)點，在臨床診斷、食品安全檢測、環(huán)境監(jiān)測等領域展現出巨大的應用潛力。例如，葡萄糖生物傳感器已廣泛應用于糖尿病患者的血糖監(jiān)測，為患者的自我管理提供了便利；基于免疫識別原理的生物傳感器可用于檢測食品中的有害物質，保障食品安全；環(huán)境監(jiān)測中，生物傳感器能夠實時監(jiān)測水體和空氣中的污染物，為環(huán)境保護提供數據支持。蛋白質作為生物體內最重要的生物大分子之一，具有高度特異性的結合能力和豐富的結構多樣性，是構建生物傳感器的理想生物識別元件。天然蛋白質往往難以直接滿足生物傳感器對特定小分子檢測的需求，需要對其進行設計和改造，以實現對目標小分子的高親和力、高選擇性結合，并將結合事件有效地轉化為可檢測的信號。隨著計算機技術和計算生物學的飛速發(fā)展，計算機蛋白設計與篩選技術應運而生。該技術利用計算機算法和模型，基于蛋白質的結構與功能關系，從理論上設計出具有特定性質和功能的蛋白質，并通過虛擬篩選從大量的設計方案中挑選出最具潛力的候選蛋白，極大地提高了蛋白設計的效率和成功率，減少了實驗工作量和成本。計算機蛋白設計與篩選技術在小分子生物傳感器領域的應用，為開發(fā)新型、高性能的小分子生物傳感器提供了新的途徑和方法，有望突破傳統生物傳感器的局限性，實現對更多種類小分子的高效檢測和監(jiān)測。1.2研究目的與意義本研究旨在通過計算機蛋白設計與篩選技術，構建高靈敏度、高選擇性的小分子生物傳感器，實現對多種重要小分子的快速、準確檢測。具體而言，利用計算機算法和模型，基于蛋白質的結構與功能關系，設計并篩選出能夠特異性結合目標小分子的蛋白質，并將其與合適的信號轉導機制相結合，開發(fā)出新型的小分子生物傳感器。從生物醫(yī)學角度來看，小分子生物傳感器的構建為疾病的早期診斷和治療監(jiān)測提供了有力工具。許多疾病的發(fā)生發(fā)展與體內小分子的濃度變化密切相關，例如腫瘤標志物如前列腺特異性抗原（PSA）、癌胚抗原（CEA）等小分子物質的異常表達可作為癌癥早期診斷的重要指標。通過構建針對這些小分子的生物傳感器，能夠實現對疾病的早期預警和實時監(jiān)測，有助于提高疾病的治療效果和患者的生存率。在藥物研發(fā)過程中，小分子生物傳感器可用于藥物靶點的驗證和藥物活性的評估，加速新藥的研發(fā)進程，降低研發(fā)成本。在環(huán)境監(jiān)測領域，小分子生物傳感器能夠對水體、土壤和空氣中的污染物進行快速檢測，及時發(fā)現環(huán)境污染問題，為環(huán)境保護和治理提供科學依據。工業(yè)廢水中常見的重金屬離子如汞、鎘、鉛等，以及有機污染物如多環(huán)芳烴、農藥殘留等小分子污染物，都可以利用相應的小分子生物傳感器進行檢測。這有助于實現對環(huán)境污染物的實時在線監(jiān)測，加強對環(huán)境污染的防控。在食品安全檢測方面，小分子生物傳感器可以檢測食品中的有害物質，如農藥殘留、獸藥殘留、生物毒素等，保障食品安全，維護公眾健康。以黃曲霉毒素為例，它是一種強致癌物質，廣泛存在于霉變的糧食、堅果等食品中。利用小分子生物傳感器能夠快速、靈敏地檢測食品中的黃曲霉毒素含量，防止其對人體造成危害。本研究將計算機蛋白設計與篩選技術應用于小分子生物傳感器的構建，不僅有助于解決傳統生物傳感器在檢測性能和應用范圍上的局限性，推動生物傳感器技術的創(chuàng)新發(fā)展，還將為生物醫(yī)學、環(huán)境監(jiān)測、食品安全檢測等多個領域的研究和應用提供新的方法和手段，具有重要的理論意義和實際應用價值。1.3國內外研究現狀在國外，華盛頓大學的DavidBaker教授團隊一直處于計算機蛋白設計領域的前沿。2024年，他們在《Science》期刊發(fā)表了一項重要研究成果，利用人工智能從頭設計了一種帶有中心空腔的、小分子量的假環(huán)肽。這種假環(huán)肽具有模塊化重復結構和中央結合口袋，通過改變重復單元的數量來調整中心空腔大小，以匹配不同目標配體的尺寸。研究團隊針對膽酸（CHD）、甲氨蝶呤（MTX）、甲狀腺素（T44）以及一種全新設計的細胞滲透性環(huán)四肽（AMA）這四種小分子進行設計，通過X射線晶體學證明了設計方法的準確性，并獲得了對這4種化合物具有高親和力的小分子結合蛋白。這些人工設計的小分子結合蛋白可整合到配體門控通道和化學誘導二聚化（CID）系統中，實現下游傳感，為蛋白質從頭設計和生物傳感開辟了新方向。不過，目前該方法在設計針對更多種類小分子的結合蛋白時，仍面臨著計算成本高、設計效率有待進一步提升的問題。瑞士洛桑聯邦理工學院的BrunoE.Correia團隊在《Nature》上發(fā)表論文，應用MaSIF-neosurf框架，基于幾何深度學習開發(fā)了一種蛋白質設計工具。該工具通過結合小分子的幾何特征和物理化學性質，能夠捕捉蛋白質與小分子結合界面的細節(jié)，進而優(yōu)化蛋白質設計。他們成功設計了三種分別針對Bcl2-維奈托克（Bcl2-VEN）、DB3-孕酮（DB3-PRO）和PDF1-阿克托寧（PDF1-ACT）復合物的特異性蛋白質結合物，并通過共結晶技術、AlphaFold2等工具驗證了設計的準確性和穩(wěn)定性。然而，該技術在實際應用中，對于復雜生物體系中蛋白質-小分子相互作用的模擬還不夠精準，需要更多實驗數據進行校準。國內的研究也取得了顯著進展。中國科學技術大學認知智能全國重點實驗室劉淇教授團隊與哈佛大學醫(yī)學院MarinkaZitnik教授課題組合作，設計了一種基于圖表示學習和蛋白質語言模型的深度生成算法PocketGen，相關成果發(fā)表于《自然?機器智能》（NatureMachineIntelligence）。PocketGen可以基于蛋白質框架和結合小分子生成蛋白質口袋序列和結構，主要由雙層圖Transformer編碼器和蛋白質預訓練語言模型兩部分組成。在實驗中，PocketGen模型在親和力和結構合理性等指標上超過傳統方法，計算效率相比傳統方法提升超過10倍。但在實際應用于小分子生物傳感器構建時，如何將PocketGen生成的蛋白質有效集成到傳感器系統中，以及如何進一步提高傳感器的穩(wěn)定性和可靠性，仍是需要解決的問題。雖然國內外在計算機蛋白設計與小分子生物傳感器結合方面取得了一定成果，但仍存在一些不足與空白。在蛋白設計方面，當前大多數方法主要集中在剛性疏水靶標小分子上，對于柔性和極性小分子的結合蛋白設計還面臨諸多挑戰(zhàn)，如結合親和力和選擇性難以同時達到理想水平。此外，如何準確預測蛋白質與小分子之間的相互作用，以及如何在復雜生物體系中實現穩(wěn)定、高效的結合，也是亟待解決的問題。在生物傳感器構建方面，將設計好的蛋白質成功轉化為實用的生物傳感器，仍需要克服信號轉導效率低、傳感器穩(wěn)定性差等問題。同時，目前對于新型生物傳感器的大規(guī)模制備技術和成本控制研究較少，限制了其實際應用和商業(yè)化推廣。在不同領域的應用研究中，針對特定小分子的生物傳感器在實際樣品檢測中的準確性和可靠性驗證還不夠充分，缺乏多中心、大樣本的臨床驗證或環(huán)境監(jiān)測實地驗證。二、計算機蛋白設計與篩選的理論基礎2.1計算機蛋白設計的原理與方法計算機蛋白設計是一門融合了生物學、計算機科學和物理學等多學科知識的交叉領域，旨在通過計算機算法和模型，從理論上設計出具有特定結構和功能的蛋白質。其核心原理是基于蛋白質的結構與功能關系，利用計算機模擬和優(yōu)化技術，探索蛋白質序列、結構和功能之間的內在聯系，從而實現對蛋白質的理性設計。目前，計算機蛋白設計主要有基于物理模型的設計方法和基于深度學習的設計方法，這兩種方法各有特點，相互補充，為蛋白質設計提供了多樣化的手段。2.1.1基于物理模型的設計方法基于物理模型的設計方法是計算機蛋白設計的傳統方法之一，它主要依據物理原理和化學知識，通過構建蛋白質的物理模型來進行設計。該方法的核心思想是將蛋白質視為由原子組成的物理系統，利用物理力場來描述原子之間的相互作用，如范德華力、靜電相互作用、氫鍵等。通過對這些相互作用的精確計算和模擬，預測蛋白質的折疊結構和穩(wěn)定性，進而設計出滿足特定要求的蛋白質序列。在基于物理模型的設計方法中，Rosetta能量設計方法是一種廣泛應用且具有代表性的技術。Rosetta軟件套件是華盛頓大學DavidBaker實驗室開發(fā)的一套用于蛋白質結構預測和設計的工具，其能量設計方法基于分子力學原理，通過優(yōu)化蛋白質的能量函數來尋找最低能量構象，從而實現蛋白質的設計。Rosetta能量函數由一系列可衡量的幾何統計或經典物理相互作用能量經過加權后得到，從相互作用類型來分，打分項通常分為三類：OneBody項，這類打分項只和單個氨基酸構象有關，比如骨架的二面角，側鏈的rotamer構象等；TwoBody項，與兩個氨基酸有關，比如范德華力相互作用，靜電相互作用；WholeBody項，從整體幾何性質或其他的指標考慮蛋白質的能量，如蛋白質的回旋半徑，二級結構組成等可統計的量。從打分項的擬合方法上來區(qū)分，可分為物理勢能項和統計勢能項。物理勢能項通常是從物理上定義的分子相互作用經典公式去計算得到的值，比如范德華力的LJ勢函數，庫侖力的靜電勢函數；統計勢能項，一般是從蛋白質結構數據庫中統計得到。在使用Rosetta進行蛋白質設計時，首先需要給定一個目標結構或結構約束，然后通過一系列的計算步驟，如片段組裝、側鏈優(yōu)化、能量最小化等，來搜索與目標結構相匹配且能量最低的蛋白質序列。在片段組裝階段，Rosetta從蛋白質結構數據庫中選取與目標結構局部相似的短片段，將這些片段組合成初始的蛋白質結構模型。接著，對模型的側鏈進行優(yōu)化，通過調整側鏈的構象，使蛋白質的能量進一步降低。最后，進行能量最小化處理，去除模型中的不合理構象，得到最終的設計結果。以設計一種能夠特異性結合某小分子的蛋白質為例，基于Rosetta能量設計方法，首先要確定小分子的結合位點和結合模式，將小分子的結構信息融入到蛋白質設計的目標結構中。在計算過程中，通過調整能量函數中的各項參數，使設計的蛋白質與小分子之間形成穩(wěn)定的相互作用，如氫鍵、疏水相互作用等。經過多次迭代優(yōu)化，最終得到具有高親和力和特異性的小分子結合蛋白。盡管基于物理模型的設計方法在蛋白質設計領域取得了一定的成果，能夠對蛋白質的結構和相互作用進行較為細致的物理描述和模擬，但該方法也存在一些局限性。其計算成本較高，基于蒙特卡洛的優(yōu)化速度慢且效率低，這是因為在搜索蛋白質的低能量構象時，需要對大量的可能構象進行采樣和評估，計算量巨大。此外，該方法在恢復蛋白質骨架結構的序列時，成功率并不理想，通常在30%-50%左右，且實驗成功率有限，這可能是由于物理模型對蛋白質復雜的生物環(huán)境和動態(tài)變化考慮不夠全面，導致設計結果與實際情況存在一定偏差。2.1.2基于深度學習的設計方法隨著深度學習技術的飛速發(fā)展，其在蛋白質結構預測和設計領域的應用日益廣泛，為計算機蛋白設計帶來了新的突破和機遇?；谏疃葘W習的設計方法利用神經網絡模型，通過對大量蛋白質序列和結構數據的學習，自動提取蛋白質的特征和模式，從而實現對蛋白質結構和功能的預測與設計。該方法能夠捕捉到蛋白質序列與結構之間復雜的非線性關系，具有較高的準確性和效率，能夠處理大規(guī)模的數據，發(fā)現傳統方法難以察覺的規(guī)律和特征。AlphaFold是深度學習在蛋白質結構預測領域的杰出代表。由DeepMind開發(fā)的AlphaFold，尤其是AlphaFold2和AlphaFold3，在蛋白質結構預測方面取得了重大突破，能夠根據氨基酸序列準確預測蛋白質的三維結構。AlphaFold基于Transformer架構，結合了多序列比對（MSA）和位置偏差（PositionalBias）等關鍵組件。MSA通過收集相關蛋白質序列，幫助識別保守的結構元素，為模型提供更多的進化信息；PositionalBias考慮到序列位置對結構的影響，讓模型更精準地預測每個位置的原子坐標。AlphaFold3在AlphaFold2的基礎上，進一步拓展了預測范圍，能夠高準確性預測蛋白質與其他各種生物分子相互作用的結構，包括配體（小分子）、蛋白質、核酸（DNA和RNA）等。其核心是一個改進版的Evoformer模塊（一種蛋白質語言模型），在處理輸入后，使用擴散網絡進行預測，從一團原子云開始，經過許多步驟后，最終生成最準確的分子結構。在小分子生物傳感器的蛋白質設計中，AlphaFold可以先根據已知的小分子結構和可能的結合模式，預測與之匹配的蛋白質結構框架。通過對大量蛋白質-小分子復合物數據的學習，模型能夠理解小分子與蛋白質結合的結構特征和規(guī)律。對于特定的小分子，AlphaFold能夠預測出具有合適結合口袋的蛋白質結構，口袋的形狀、大小和化學性質與小分子互補，以實現高親和力的結合。再結合其他的序列設計方法，對預測結構對應的氨基酸序列進行優(yōu)化和調整，從而得到能夠特異性結合目標小分子的蛋白質序列。除了AlphaFold，MaSIF-neosurf框架也是基于深度學習的蛋白質設計的重要工具。瑞士洛桑聯邦理工學院的BrunoE.Correia團隊開發(fā)的MaSIF-neosurf，是一種基于幾何深度學習的框架，用于設計具有所需分子表面特性的新蛋白質，特別是針對蛋白質與小分子相互作用的設計。它通過結合小分子的幾何特征和物理化學性質，能夠捕捉蛋白質與小分子結合界面的細節(jié)，進而優(yōu)化蛋白質設計。MaSIF-neosurf將小分子作為目標蛋白質分子表面表示的一部分，以根據新表面指紋預測界面和伴侶。在生成蛋白質-配體復合物的分子表面后，MaSIF-neosurf計算兩個幾何特征：形狀指數和距離相關曲率，還使用了三個化學特征：泊松-玻爾茲曼靜電、氫鍵供體/受體傾向和疏水性。通過這些特征的綜合分析，MaSIF-neosurf能夠設計出與小分子具有高親和力和特異性的蛋白質結合物。在實際應用中，研究團隊利用MaSIF-neosurf成功設計了三種分別針對Bcl2-維奈托克（Bcl2-VEN）、DB3-孕酮（DB3-PRO）和PDF1-阿克托寧（PDF1-ACT）復合物的特異性蛋白質結合物。通過共結晶技術獲得了DBAct553_1與actinonin-boundPDF1的三元復合物的晶體結構，并與計算模型進行對比，結果表明計算模型與晶體結構在空間結構上高度一致，CαRMSD為2.33?，證明了設計的準確性。進一步使用AlphaFold2等工具對設計的蛋白質結構進行驗證，也確認了設計的穩(wěn)定性?；谏疃葘W習的設計方法雖然在蛋白質設計中展現出強大的能力，但也面臨一些挑戰(zhàn)。深度學習模型的訓練需要大量的高質量數據，而目前蛋白質結構和功能數據的數量和質量仍有限，這可能影響模型的泛化能力和準確性。深度學習模型通常是黑盒模型，缺乏可解釋性，難以深入理解模型決策的依據和機制，這在一定程度上限制了其在蛋白質設計中的應用和改進。2.2蛋白篩選技術概述在小分子生物傳感器的構建過程中，蛋白篩選技術起著關鍵作用，它能夠從大量的蛋白質或蛋白質序列中挑選出具有特定功能，即能夠特異性結合目標小分子的蛋白質。蛋白篩選技術主要分為實驗室篩選技術和計算機輔助篩選技術，兩者各有優(yōu)勢，相互補充，為獲取高性能的小分子結合蛋白提供了多樣化的手段。2.2.1實驗室篩選技術實驗室篩選技術是傳統的蛋白篩選方法，它在真實的實驗環(huán)境中對蛋白質庫進行篩選，通過實驗手段直接檢測蛋白質與目標小分子的結合能力，從而獲取具有高親和力和特異性的目標蛋白。常見的實驗室篩選技術包括噬菌體展示技術、核糖體展示技術等。噬菌體展示技術是一種將外源蛋白或多肽的基因表達產物與噬菌體外殼蛋白融合，并展示在噬菌體表面的技術。其基本原理是將編碼蛋白質或多肽的基因片段插入到噬菌體外殼蛋白基因中，使外源基因表達的產物與外殼蛋白融合，展示在噬菌體的表面。這樣，每個噬菌體顆粒就攜帶了一種特定的蛋白質或多肽序列，通過構建包含大量不同序列的噬菌體文庫，就可以對各種蛋白質進行篩選。在小分子生物傳感器的蛋白篩選中，將噬菌體文庫與目標小分子進行孵育，能夠特異性結合小分子的噬菌體就會與小分子形成復合物。通過洗脫未結合的噬菌體，再對結合的噬菌體進行擴增和分析，就可以獲得編碼與小分子結合蛋白的基因，進而表達出目標蛋白。例如，在篩選能夠檢測環(huán)境中重金屬離子的小分子生物傳感器的蛋白時，利用噬菌體展示技術，從噬菌體文庫中篩選出了對汞離子具有高親和力的蛋白質，將其應用于生物傳感器中，實現了對汞離子的高靈敏檢測。噬菌體展示技術具有高通量、能夠直接將基因型和表型聯系起來等優(yōu)點，但其篩選過程較為復雜，需要進行多輪篩選和富集，且對實驗條件要求較高。核糖體展示技術是一種體外篩選技術，它利用核糖體在體外翻譯過程中形成的mRNA-核糖體-蛋白質三元復合物，將蛋白質的表型與編碼它的mRNA聯系起來。在核糖體展示技術中，首先構建包含大量不同蛋白質編碼序列的mRNA文庫，然后在體外進行翻譯反應。在翻譯過程中，由于缺乏終止密碼子，核糖體無法從mRNA上解離，從而形成穩(wěn)定的mRNA-核糖體-蛋白質三元復合物。將這些復合物與目標小分子進行孵育，能夠特異性結合小分子的蛋白質就會在復合物中保留下來。通過分離和富集這些復合物，再反轉錄得到cDNA，進一步擴增和表達，就可以獲得目標蛋白。核糖體展示技術的優(yōu)勢在于可以在完全體外的環(huán)境中進行篩選，不受細胞內環(huán)境的限制，能夠篩選出一些在細胞內難以表達或具有毒性的蛋白質。它也存在一些缺點，如體外翻譯系統的效率和穩(wěn)定性有待提高，篩選過程中可能會出現非特異性結合等問題。2.2.2計算機輔助篩選技術隨著計算機技術和生物信息學的發(fā)展，計算機輔助篩選技術逐漸成為蛋白篩選的重要手段。該技術利用計算機算法和模型，從海量的蛋白質序列數據庫中篩選出具有潛在功能的蛋白質，大大提高了篩選效率，降低了實驗成本。計算機輔助篩選技術主要基于蛋白質的序列相似性、結構特征以及與小分子的相互作用預測等方法來進行篩選?；谛蛄邢嗨菩缘暮Y選方法是計算機輔助篩選技術中較為常用的一種。其原理是通過將目標小分子的已知結合蛋白序列作為模板，在蛋白質序列數據庫中進行搜索，尋找與之具有較高序列相似性的蛋白質。假設具有相似序列的蛋白質可能具有相似的結構和功能，從而推測這些相似序列的蛋白質也可能與目標小分子具有結合能力。BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）是一種廣泛應用的序列相似性搜索工具。在小分子生物傳感器的蛋白篩選中，使用BLAST將已知的與葡萄糖結合的蛋白質序列在蛋白質數據庫中進行搜索，得到了一系列與該蛋白序列相似的蛋白質。對這些蛋白質進行進一步的分析和實驗驗證，發(fā)現其中一些蛋白質也能夠與葡萄糖特異性結合，可用于構建葡萄糖生物傳感器。這種方法簡單快捷，但它的局限性在于只能找到與已知模板序列相似的蛋白質，對于那些序列差異較大但功能相似的蛋白質則難以篩選出來?；诮Y構特征的篩選方法則是利用蛋白質的三維結構信息來進行篩選。通過分析蛋白質的結構特征，如結合口袋的形狀、大小、氨基酸組成等，預測其與目標小分子的結合能力。蛋白質結構數據庫（PDB）中存儲了大量已知結構的蛋白質，利用這些數據，可以開發(fā)相應的算法和模型來分析蛋白質結構與小分子結合的關系。研究人員開發(fā)了一種基于分子表面形狀互補性的算法，通過計算蛋白質表面與小分子表面的形狀互補程度，預測蛋白質與小分子的結合親和力。在篩選針對特定小分子的生物傳感器蛋白時，使用該算法對PDB數據庫中的蛋白質結構進行分析，篩選出了與小分子表面形狀高度互補的蛋白質，實驗驗證表明這些蛋白質對目標小分子具有較高的親和力?；诮Y構特征的篩選方法能夠更準確地預測蛋白質與小分子的結合能力，但它依賴于高質量的蛋白質結構數據，對于那些結構未知的蛋白質則無法進行有效篩選?；诘鞍踪|與小分子相互作用預測的篩選方法，是通過計算機模擬和計算，預測蛋白質與小分子之間的相互作用模式和親和力，從而篩選出具有潛在結合能力的蛋白質。分子對接是一種常用的預測蛋白質與小分子相互作用的方法。它將小分子配體與蛋白質的三維結構進行匹配，通過計算兩者之間的相互作用能量，預測小分子在蛋白質結合口袋中的最佳結合位置和取向。AutoDock是一款經典的分子對接軟件。在篩選用于檢測腫瘤標志物小分子的生物傳感器蛋白時，使用AutoDock將腫瘤標志物小分子與蛋白質數據庫中的蛋白質進行分子對接，根據對接結果篩選出與小分子相互作用能量較低，即親和力較高的蛋白質。這種方法能夠在分子水平上深入研究蛋白質與小分子的相互作用，為篩選特異性結合蛋白提供了有力支持，但它的計算量較大，且對接結果的準確性還受到多種因素的影響，如蛋白質和小分子結構的準確性、力場參數的選擇等。三、小分子生物傳感器的工作機制與類型3.1小分子生物傳感器的工作原理小分子生物傳感器是一種能夠特異性識別并檢測小分子物質的分析裝置，其工作原理基于生物識別元件與目標小分子之間的特異性相互作用，以及這種相互作用引發(fā)的物理或化學信號變化。生物識別元件通常是具有高度特異性結合能力的生物分子，如蛋白質、核酸、抗體等，它們能夠與目標小分子以非共價鍵的形式結合，形成穩(wěn)定的復合物。這種結合事件會導致生物識別元件自身的結構或物理化學性質發(fā)生改變，進而引發(fā)一系列可檢測的信號變化，這些信號變化通過合適的信號轉導機制被轉化為可檢測的電信號、光信號等，從而實現對目標小分子的定性或定量檢測。以蛋白質作為生物識別元件的小分子生物傳感器為例，當目標小分子與蛋白質的特定結合位點結合時，會引起蛋白質構象的變化。這種構象變化可能會導致蛋白質內部的電荷分布、電子云密度、氫鍵網絡等發(fā)生改變，從而影響蛋白質的電學性質。在基于電化學原理的小分子生物傳感器中，蛋白質構象變化引起的電學性質改變可以通過電極進行檢測。將修飾有目標蛋白質的電極浸入含有目標小分子的溶液中，當小分子與蛋白質結合時，電極表面的電子轉移速率、電容等電化學參數會發(fā)生變化，通過測量這些參數的變化，就可以實現對小分子的檢測。在檢測葡萄糖的電化學小分子生物傳感器中，葡萄糖氧化酶作為生物識別元件，當葡萄糖與葡萄糖氧化酶結合時，會發(fā)生酶促反應，產生過氧化氫。過氧化氫在電極表面發(fā)生氧化還原反應，產生電流信號，電流的大小與葡萄糖的濃度成正比，通過檢測電流信號就可以定量分析葡萄糖的濃度。除了電化學信號，小分子與蛋白質結合引發(fā)的信號變化還可以轉化為光信號進行檢測?；跓晒夤舱衲芰哭D移（FRET）原理的小分子生物傳感器，通常由供體熒光團、受體熒光團和連接兩者的蛋白質構成。當沒有目標小分子存在時，供體熒光團和受體熒光團之間的距離較遠，FRET效率較低，供體熒光團發(fā)射的熒光較強。當目標小分子與蛋白質結合時，會引起蛋白質構象的變化，使供體熒光團和受體熒光團之間的距離拉近，FRET效率增強，供體熒光團發(fā)射的熒光減弱，受體熒光團發(fā)射的熒光增強。通過檢測供體和受體熒光強度的變化，就可以實現對目標小分子的檢測。在檢測鈣離子的FRET小分子生物傳感器中，將鈣調蛋白作為生物識別元件，分別在鈣調蛋白的兩端連接供體熒光團和受體熒光團。當鈣離子與鈣調蛋白結合時，鈣調蛋白的構象發(fā)生變化，使供體和受體熒光團之間的距離改變，從而導致FRET信號變化，通過檢測熒光信號的變化就可以確定鈣離子的濃度。表面等離子體共振（SPR）技術也是一種常用的檢測小分子與蛋白質相互作用的方法。SPR現象基于物理學中的光學原理，當一束偏振光以特定角度照射到具有金屬薄膜（通常是金或銀）的棱鏡表面時，光子與金屬表面自由電子相互作用，激發(fā)表面等離子體。這種表面等離子體是一種位于金屬表面的電磁波，其振幅隨離開表面距離呈指數衰減。當生物分子（如蛋白質）與金屬薄膜表面發(fā)生相互作用時，會引起金屬表面附近折射率的變化，進而改變表面等離子體的共振條件。通過檢測反射光強度或角度的變化，可以精確地監(jiān)測生物分子間的結合與解離過程。在基于SPR的小分子生物傳感器中，將蛋白質固定在金屬薄膜表面，當含有目標小分子的溶液流過金屬薄膜表面時，小分子與蛋白質結合，會導致金屬表面附近折射率的變化，從而引起SPR信號的變化。通過實時監(jiān)測SPR信號的變化，就可以獲得小分子與蛋白質相互作用的動力學信息，如結合速率、解離速率、平衡解離常數等，實現對小分子的定量檢測。在藥物研發(fā)中，利用SPR技術可以快速篩選與藥物靶點蛋白具有高親和力的小分子化合物，為新藥研發(fā)提供重要的依據。3.2常見小分子生物傳感器的類型根據信號轉導機制的不同，小分子生物傳感器可分為多種類型，其中基于熒光的小分子生物傳感器、基于電化學的小分子生物傳感器和基于表面等離子體共振（SPR）的小分子生物傳感器是較為常見且應用廣泛的類型。這些不同類型的生物傳感器各自具有獨特的工作方式和性能特點，適用于不同的檢測場景和需求。3.2.1基于熒光的小分子生物傳感器基于熒光的小分子生物傳感器是利用熒光基團標記生物識別元件（如蛋白質），通過檢測熒光強度、波長或熒光壽命等參數的變化來實現對小分子的檢測。其工作原理主要基于熒光共振能量轉移（FRET）、熒光猝滅、熒光增強等效應。FRET是基于熒光的小分子生物傳感器中常用的原理之一。在FRET過程中，供體熒光團和受體熒光團之間存在一定的距離和相對取向，當供體熒光團被激發(fā)時，其激發(fā)態(tài)能量可以通過非輻射的方式轉移到受體熒光團，使受體熒光團被激發(fā)并發(fā)射熒光。在小分子生物傳感器中，通常將供體熒光團和受體熒光團分別連接到生物識別元件（如蛋白質）的特定位置。當沒有目標小分子存在時，供體和受體熒光團之間的距離較遠，FRET效率較低，供體熒光團發(fā)射的熒光較強。當目標小分子與生物識別元件結合時，會引起生物識別元件的構象變化，使供體和受體熒光團之間的距離拉近，FRET效率增強，供體熒光團發(fā)射的熒光減弱，受體熒光團發(fā)射的熒光增強。通過檢測供體和受體熒光強度的變化，就可以實現對目標小分子的檢測。例如，一種用于檢測cAMP的FRET小分子生物傳感器，將供體熒光團CFP和受體熒光團YFP分別連接到cAMP結合蛋白的兩端。當cAMP與cAMP結合蛋白結合時，蛋白構象發(fā)生變化，導致CFP和YFP之間的距離改變，FRET信號增強，通過檢測熒光信號的變化就可以定量檢測cAMP的濃度。熒光猝滅也是基于熒光的小分子生物傳感器的重要工作原理。熒光猝滅是指熒光分子與猝滅劑相互作用，導致熒光強度降低的現象。在小分子生物傳感器中，生物識別元件與目標小分子結合后，可能會引起熒光基團周圍環(huán)境的變化，或者形成熒光猝滅對，從而導致熒光猝滅。例如，在檢測汞離子的熒光小分子生物傳感器中，利用富含胸腺嘧啶（T）的DNA序列作為生物識別元件，該DNA序列可以與汞離子特異性結合形成T-Hg2+-T結構。將熒光基團標記在DNA序列上，當汞離子不存在時，熒光基團能夠正常發(fā)射熒光。當汞離子與DNA序列結合形成T-Hg2+-T結構后，熒光基團的熒光被猝滅，通過檢測熒光強度的變化就可以實現對汞離子的檢測。基于熒光的小分子生物傳感器在生物檢測中具有諸多應用優(yōu)勢。它具有較高的靈敏度，能夠檢測到低濃度的小分子，這是因為熒光信號可以通過熒光顯微鏡、熒光光譜儀等設備進行高靈敏度的檢測。其檢測速度快，可以實現實時監(jiān)測，能夠及時獲取小分子的濃度變化信息。該傳感器還具有良好的選擇性，通過合理設計生物識別元件和熒光標記策略，可以實現對特定小分子的特異性檢測。此外，基于熒光的小分子生物傳感器可以與熒光成像技術相結合，實現對細胞內、組織內小分子的原位檢測和成像，為研究小分子在生物體內的分布和動態(tài)變化提供了有力工具。在細胞生物學研究中，利用基于熒光的小分子生物傳感器可以實時監(jiān)測細胞內鈣離子、cAMP等第二信使小分子的濃度變化，揭示細胞信號傳導的機制。3.2.2基于電化學的小分子生物傳感器基于電化學的小分子生物傳感器是通過檢測電極表面的電流、電位或電阻等電化學參數的變化來監(jiān)測小分子與生物識別元件（如蛋白質）之間的相互作用。其工作原理主要基于電化學反應，當目標小分子與生物識別元件結合時，會引起電極表面的電子轉移速率、離子濃度等發(fā)生變化，從而導致電化學參數的改變。在基于電化學的小分子生物傳感器中，常見的檢測方法包括安培法、電位法和阻抗法等。安培法是在恒定電位下，測量由于電化學反應產生的電流變化。以葡萄糖生物傳感器為例，葡萄糖氧化酶作為生物識別元件固定在電極表面，當葡萄糖存在時，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化，產生過氧化氫。過氧化氫在電極表面發(fā)生氧化反應，產生電流，電流的大小與葡萄糖的濃度成正比，通過測量電流的大小就可以定量檢測葡萄糖的濃度。電位法是測量電極與參比電極之間的電位差變化，當目標小分子與生物識別元件結合時，會引起電極表面的離子濃度變化，從而導致電位的改變。在檢測鉀離子的電位型小分子生物傳感器中，采用離子選擇性電極作為工作電極，當鉀離子與電極表面的離子載體（生物識別元件）結合時，會改變電極表面的離子濃度，從而引起電位的變化，通過測量電位的變化就可以檢測鉀離子的濃度。阻抗法是通過測量電極-溶液界面的阻抗變化來檢測小分子與生物識別元件的相互作用。當小分子與生物識別元件結合時，會改變電極表面的電荷分布和離子遷移率，從而導致阻抗的變化。研究人員利用阻抗法構建了檢測腫瘤標志物小分子的生物傳感器，將識別腫瘤標志物的抗體固定在電極表面，當腫瘤標志物與抗體結合時，電極表面的阻抗發(fā)生變化，通過檢測阻抗的變化就可以實現對腫瘤標志物的檢測?；陔娀瘜W的小分子生物傳感器具有快速、定量檢測的優(yōu)勢。其響應速度快，能夠在短時間內給出檢測結果，適合于即時檢測（POCT）等應用場景。該傳感器可以實現對小分子的定量分析，通過建立電化學參數與小分子濃度之間的定量關系，能夠準確測定小分子的濃度?；陔娀瘜W的小分子生物傳感器還具有設備簡單、成本低的特點，不需要復雜的光學設備，易于實現小型化和便攜化。在臨床診斷中，基于電化學的小分子生物傳感器可以用于檢測血液、尿液等生物樣本中的葡萄糖、尿酸、膽固醇等小分子物質，為疾病的診斷和治療提供重要的參考依據。在環(huán)境監(jiān)測中，該傳感器可以用于檢測水體中的重金屬離子、有機污染物等小分子污染物，實現對環(huán)境的實時監(jiān)測。3.2.3基于表面等離子體共振（SPR）的小分子生物傳感器基于表面等離子體共振（SPR）的小分子生物傳感器是利用SPR效應來檢測小分子與生物識別元件（如蛋白質）之間的相互作用。SPR現象是指當一束偏振光以特定角度照射到金屬薄膜（通常是金或銀）與介質的界面時，光子與金屬表面的自由電子相互作用，激發(fā)表面等離子體波，使金屬表面的電子發(fā)生共振。這種共振會導致光的反射強度發(fā)生變化，當生物分子與金屬表面結合時，會引起金屬表面附近折射率的變化，進而改變表面等離子體的共振條件，導致反射光強度或角度的變化。在基于SPR的小分子生物傳感器中，首先將生物識別元件（如蛋白質）固定在金屬薄膜表面，當含有目標小分子的溶液流過金屬薄膜表面時，小分子與生物識別元件結合，會引起金屬表面附近折射率的變化，從而導致SPR信號的變化。通過實時監(jiān)測SPR信號的變化，就可以獲得小分子與生物識別元件相互作用的動力學信息，如結合速率、解離速率、平衡解離常數等，實現對小分子的定性和定量檢測。在藥物研發(fā)中，利用基于SPR的小分子生物傳感器可以快速篩選與藥物靶點蛋白具有高親和力的小分子化合物。將藥物靶點蛋白固定在金屬薄膜表面，將不同的小分子化合物溶液依次流過金屬薄膜表面，通過監(jiān)測SPR信號的變化，就可以確定小分子化合物與藥物靶點蛋白的結合情況，篩選出具有潛在活性的小分子化合物?；赟PR的小分子生物傳感器具有無需標記、實時監(jiān)測的特點。它不需要對小分子或生物識別元件進行熒光、放射性等標記，避免了標記過程對生物分子活性的影響，能夠在分子的自然狀態(tài)下進行檢測。該傳感器可以實時監(jiān)測小分子與生物識別元件的結合和解離過程，獲取相互作用的動力學信息，為研究分子間的相互作用機制提供了有力的手段?；赟PR的小分子生物傳感器還具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點，能夠檢測到微量的小分子，并且能夠準確區(qū)分不同的小分子。在生物醫(yī)學研究中，基于SPR的小分子生物傳感器可以用于檢測生物標志物小分子，實現對疾病的早期診斷和病情監(jiān)測。在食品安全檢測中，該傳感器可以用于檢測食品中的有害物質小分子，保障食品安全。四、計算機蛋白設計在小分子生物傳感器中的應用案例分析4.1DavidBaker團隊的研究成果華盛頓大學的DavidBaker教授團隊一直致力于計算機蛋白設計領域的研究，在小分子生物傳感器相關研究方面取得了一系列具有開創(chuàng)性的成果。他們利用人工智能和計算生物學技術，成功設計出新型的小分子結合蛋白，并將其應用于生物傳感領域，為小分子生物傳感器的發(fā)展開辟了新的方向。4.1.1基于假環(huán)肽的小分子結合蛋白設計2024年，DavidBaker團隊在《Science》期刊發(fā)表了一項重要研究，利用人工智能從頭設計了一種帶有中心空腔的、小分子量的假環(huán)肽。該假環(huán)肽具有模塊化重復結構和中央結合口袋，能夠通過改變重復單元的數量來調整中心空腔大小，以匹配不同目標配體的尺寸。研究團隊開發(fā)了一種集成深度學習和基于Rosetta能量設計的通用方法，為任何所需的小分子生成高形狀互補的、基于假環(huán)肽的結合蛋白。具體來說，基于深度學習技術，團隊生成了具有重復結構單元的假環(huán)肽，這些結構單元圍繞著中心形成口袋狀結構，其形狀取決于重復單元的幾何形狀和數量。研究團隊選擇了四種小分子作為結合靶點，分別是膽酸（CHD）、甲氨蝶呤（MTX）、甲狀腺素（T44）以及一種全新設計的細胞滲透性環(huán)四肽（AMA）。CHD是主要的膽汁酸，檢測其游離形態(tài)對判斷肝臟疾病有重要意義；MTX是一種抗葉酸癌癥治療劑，需要定期血液監(jiān)測以減少患者的不良后果；T44是一種調節(jié)能量使用和其他功能的人體激素，家庭監(jiān)測游離T44水平可用于甲狀腺疾病診斷。緊接著，研究團隊將上述四種小分子對接到這些假環(huán)肽的口袋狀結構中，設計高結合親和力的相互作用表面，并通過實驗篩選確定具有最高親和力的設計。他們將目標小分子的不同構象對接到包含大量中心口袋的深度學習生成的假環(huán)肽中，其界面序列經過優(yōu)化可進行高親和力結合。其中，排名靠前的設計進行實驗測試，并對最佳對接的骨架進行廣泛的重新采樣。序列設計完成后，對排名靠前的第二輪設計進行實驗檢驗。通過X射線晶體學證明了設計方法的準確性，并獲得了對這4種化合物具有高親和力的小分子結合蛋白。這種通過改變重復單元匹配小分子大小的設計策略，有效提高了假環(huán)肽與小分子之間的結合親和力，為小分子結合蛋白的設計提供了新的思路和方法。4.1.2應用于小分子傳感的納米孔融合及化學誘導二聚化DavidBaker團隊進一步探索了基于假環(huán)肽的小分子結合蛋白在小分子傳感中的應用。由于這些人工設計假環(huán)肽是多個獨立折疊的結構域，并依賴與靶標小分子結合驅動關聯整合，因此可以很容易地整合到配體門控通道和化學誘導二聚化（CID）系統中，最終轉化為生物傳感器。在將假環(huán)肽整合到配體門控通道中時，當目標小分子與假環(huán)肽結合后，會引起配體門控通道的構象變化，從而改變通道的離子通透性，產生可檢測的電信號變化。通過檢測這些電信號的變化，就可以實現對目標小分子的傳感。在檢測膽酸的生物傳感器中，將設計的與膽酸具有高親和力的假環(huán)肽融合到配體門控離子通道中，當膽酸存在時，膽酸與假環(huán)肽結合，導致離子通道打開，離子通過通道產生電流信號，通過檢測電流信號的大小就可以定量檢測膽酸的濃度。在化學誘導二聚化系統中，研究團隊將假環(huán)肽與分裂蛋白相結合。當目標小分子存在時，小分子與假環(huán)肽結合，促使分裂蛋白發(fā)生二聚化，從而激活下游的信號通路，產生可檢測的信號。在基于化學誘導二聚化的生物傳感器中，將針對甲氨蝶呤設計的假環(huán)肽與分裂的熒光蛋白片段相連，當甲氨蝶呤與假環(huán)肽結合時，會誘導熒光蛋白片段二聚化，恢復熒光信號，通過檢測熒光信號的變化就可以實現對甲氨蝶呤的檢測。通過將假環(huán)肽整合到配體門控通道和化學誘導二聚化系統中，DavidBaker團隊成功將基于假環(huán)肽的小分子結合蛋白轉化為生物傳感器，實現了對小分子的有效傳感，為小分子生物傳感器的構建提供了新的策略和方法，展示了計算機蛋白設計在小分子生物傳感器領域的巨大應用潛力。4.2瑞士洛桑聯邦理工學院的研究瑞士洛桑聯邦理工學院的BrunoE.Correia團隊在計算機蛋白設計用于小分子生物傳感器的研究方面取得了重要突破，他們開發(fā)的基于幾何深度學習的方法和工具，為蛋白質-小分子相互作用的設計和應用提供了新的思路和手段，在小分子生物傳感器的構建和應用中展現出巨大的潛力。4.2.1MaSIF-neosurf框架的應用隨著生物技術的快速發(fā)展，精確設計蛋白質和小分子間的相互作用成為了分子生物學和藥物開發(fā)中的一個關鍵挑戰(zhàn)。尤其是在小分子激活蛋白質功能的設計領域，人們長期面臨著如何在復雜的細胞環(huán)境中精確調控蛋白質間相互作用的問題。因此，設計出具有高親和力、高選擇性的蛋白質-小分子結合物，不僅能增強細胞療法的精準度，還能推動新型生物傳感器和合成生物學領域的發(fā)展。盡管現有的計算設計方法，如基于自然氨基酸的組合和其他結構預測方法，已經在蛋白質設計領域取得了一些進展，但它們在處理蛋白質與小分子復合物的設計時仍存在諸多挑戰(zhàn)。尤其是蛋白質與小分子結合界面復雜、缺乏足夠的結構數據，導致傳統方法往往難以捕捉到小分子和蛋白質之間微妙的結合特征。為了解決這些問題，瑞士洛桑聯邦理工學院的BrunoE.Correia團隊應用MaSIF-neosurf框架，基于幾何深度學習開發(fā)了一種蛋白質設計工具。該工具的核心在于其能夠捕捉分子表面的幾何特征，使其不僅適應于傳統蛋白質模型，還能廣泛應用于小分子誘導的新表面上。在生成蛋白質-配體復合物的分子表面后，MaSIF-neosurf計算兩個幾何特征：形狀指數和距離相關曲率，還使用了三個化學特征：泊松-玻爾茲曼靜電、氫鍵供體/受體傾向和疏水性。通過結合小分子的幾何特征和物理化學性質，MaSIF-neosurf能夠捕捉蛋白質與小分子結合界面的細節(jié)，進而優(yōu)化蛋白質設計。大多數基于深度學習的蛋白質設計流程主要以天然氨基酸庫為條件，因此缺乏對小分子相互作用設計的泛化能力。這一差距主要是由于基于蛋白質數據庫（PDB）的訓練集中缺乏蛋白質-配體結構數據，尤其是三元復合物，而此類結構在PDB中非常罕見。幾何深度學習方法以分子表面的物理和化學特征為原則，可以克服這些限制，并為蛋白質和小分子復合物提供聯合表征。由此產生的新表面能夠捕獲可推廣的分子特征，從而可以針對這些混合界面，設計蛋白質結合劑。MaSIF最初被訓練用于處理生物分子的一般化學和幾何表面特性，同時抽象底層結構。因此，它不僅限于蛋白質表面，原則上也應該捕捉非蛋白質表面產生的表面模式。在最初的構想中，MaSIF僅將典型氨基酸視為蛋白質分子表面的一部分，與小分子、聚糖或其他配體不兼容。因此，研究團隊推出了MaSIF-neosurf，它將小分子作為目標蛋白質分子表面表示的一部分，以根據新表面指紋預測界面和伴侶。4.2.2設計特異性蛋白質結合物用于細胞傳感通過使用MaSIF-neosurf框架，BrunoE.Correia團隊成功設計了三種特異性蛋白質結合物，分別針對Bcl2-維奈托克（Bcl2-VEN）、DB3-孕酮（DB3-PRO）和PDF1-阿克托寧（PDF1-ACT）復合物。這些設計在計算中表現出良好的穩(wěn)定性和親和力，符合設計目標。為了驗證設計的準確性和穩(wěn)定性，研究團隊通過共結晶技術，成功獲得了DBAct553_1與actinonin-boundPDF1的三元復合物的晶體結構，并將其與計算模型進行對比。結果表明，計算模型與晶體結構在空間結構上高度一致，CαRMSD為2.33?，表明計算設計的準確性。進一步使用AlphaFold2等工具對設計的蛋白質結構進行了驗證，發(fā)現其能夠精確預測蛋白質的折疊狀態(tài)并確認了設計的穩(wěn)定性。通過細致的結構分析，研究團隊發(fā)現計算模型與實驗結果之間的微小差異主要源自設計框架中一個殘基位置的偏差，進一步表明了設計工具的精確度。研究團隊還通過多種細胞實驗驗證了設計的蛋白質結合物在細胞系統中的功能。在無細胞報告系統中，利用化學誘導二聚化（CID）系統測試了設計的結合物對信號通路的激活能力。結果表明，在加入小分子激活劑后，系統能夠有效啟動轉錄因子和報告蛋白的表達，顯示出強烈的劑量依賴性。在哺乳動物細胞中通過GEMS系統進行的實驗也證實了這些CID系統的高靈敏度和準確性。特別是在使用維奈托克時，系統表現出了26.8倍的熒光變化，證明了其作為細胞傳感器的潛力。將設計的CID系統應用于CAR-T細胞療法中，通過將設計的蛋白質結合物與二代CAR系統結合，形成了SplitCID-CAR。在加入維奈托克后，這一系統能夠有效誘導CAR-T細胞的殺傷作用，表現出較高的療效。研究人員發(fā)現，這種新的CID-CAR系統相比傳統的二代CAR-T細胞療法，能夠提供更精細的藥物控制和更好的療效。瑞士洛桑聯邦理工學院的研究展示了使用MaSIF-neosurf框架設計的CID系統在蛋白質設計領域的巨大潛力。不僅證明了該框架在計算設計中的有效性，還通過多種細胞系統驗證了設計結果的功能性。設計的蛋白質結合物在細胞中的應用展示了它們在合成生物學、細胞治療等領域的廣泛潛力，特別是在CAR-T細胞治療中的應用，為未來癌癥免疫治療提供了更高效、更安全的治療方案，也為小分子生物傳感器的設計和應用提供了新的策略和方法。五、蛋白篩選對小分子生物傳感器性能提升的影響5.1提高傳感器的選擇性在小分子生物傳感器的應用中，選擇性是至關重要的性能指標，它決定了傳感器能否準確識別目標小分子，而不受其他干擾物質的影響。蛋白篩選技術為提高小分子生物傳感器的選擇性提供了有效的途徑，通過篩選出對特定小分子具有高選擇性結合的蛋白質，能夠顯著減少干擾，提升傳感器的檢測準確性。在復雜的生物樣品或環(huán)境樣品中，往往存在多種小分子物質，這些小分子可能具有相似的結構和化學性質，容易對目標小分子的檢測產生干擾。在生物醫(yī)學檢測中，血液、尿液等生物樣品中除了含有目標小分子生物標志物外，還存在大量的其他代謝產物、蛋白質、糖類等物質；在環(huán)境監(jiān)測中，水體、土壤和空氣中的污染物成分復雜，不同污染物之間可能存在交叉干擾。傳統的生物傳感器在面對這些復雜樣品時，常常難以準確區(qū)分目標小分子，導致檢測結果出現偏差。通過蛋白篩選技術，可以從大量的蛋白質或蛋白質序列中挑選出對目標小分子具有高度特異性結合能力的蛋白質。基于噬菌體展示技術構建的蛋白質文庫，包含了大量不同序列的蛋白質。將該文庫與目標小分子進行孵育，經過多輪篩選和富集，能夠篩選出與目標小分子特異性結合的噬菌體，進而獲得編碼特異性結合蛋白的基因。這種特異性結合蛋白能夠精準識別目標小分子，與目標小分子之間形成穩(wěn)定的相互作用，如氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用等，而對其他結構相似的小分子則幾乎不發(fā)生結合或結合能力極弱。在篩選用于檢測多巴胺的小分子生物傳感器的蛋白時，利用噬菌體展示技術，從噬菌體文庫中篩選出了對多巴胺具有高選擇性結合的蛋白質。該蛋白質能夠特異性地識別多巴胺分子中的兒茶酚結構和氨基結構，與多巴胺形成穩(wěn)定的復合物，而對與多巴胺結構相似的去甲腎上腺素、腎上腺素等小分子的結合能力非常低。將這種篩選得到的蛋白質應用于小分子生物傳感器中，能夠有效減少其他神經遞質對多巴胺檢測的干擾，提高傳感器的選擇性。計算機輔助篩選技術也在提高小分子生物傳感器選擇性方面發(fā)揮著重要作用?；诘鞍踪|與小分子相互作用預測的分子對接方法，通過將小分子配體與蛋白質的三維結構進行匹配，計算兩者之間的相互作用能量，能夠預測小分子在蛋白質結合口袋中的最佳結合位置和取向。在篩選針對腫瘤標志物小分子的生物傳感器蛋白時，使用分子對接軟件AutoDock將腫瘤標志物小分子與蛋白質數據庫中的蛋白質進行對接。通過對對接結果的分析，篩選出與腫瘤標志物小分子相互作用能量較低，即親和力較高的蛋白質。這些蛋白質的結合口袋形狀、大小和氨基酸組成與腫瘤標志物小分子高度互補，能夠特異性地結合腫瘤標志物小分子，而對其他非目標小分子的結合能力較弱。利用分子對接技術篩選出的蛋白質構建的小分子生物傳感器，在檢測腫瘤標志物時，能夠有效排除其他生物分子的干擾，提高檢測的選擇性。基于序列相似性和結構特征的計算機輔助篩選方法，也有助于篩選出具有高選擇性的蛋白質。通過將已知的與目標小分子特異性結合的蛋白質序列作為模板，在蛋白質序列數據庫中進行搜索，尋找與之具有較高序列相似性的蛋白質。這些相似序列的蛋白質可能具有相似的結構和功能，從而推測它們也可能對目標小分子具有較高的選擇性結合能力。通過分析蛋白質的三維結構特征，如結合口袋的形狀、大小、氨基酸組成等，預測其與目標小分子的結合特異性。具有特定結構特征的蛋白質結合口袋能夠與目標小分子形成特異性的相互作用，從而提高傳感器的選擇性。5.2增強傳感器的靈敏度在小分子生物傳感器的研究中，靈敏度是衡量其性能的關鍵指標之一，它直接關系到傳感器能否檢測到低濃度的目標小分子。通過對篩選得到的高親和力蛋白質進行深入分析和優(yōu)化，可以顯著提高傳感器對小分子的檢測靈敏度，實現低濃度檢測，滿足生物醫(yī)學、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等領域對痕量小分子檢測的需求。篩選得到的高親和力蛋白質與目標小分子之間的相互作用是提高傳感器靈敏度的基礎。對這些蛋白質進行結構分析，深入了解其與小分子結合的位點、結合模式以及相互作用的作用力類型，如氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用等。通過定點突變等技術，對蛋白質結合位點的氨基酸殘基進行優(yōu)化，增強蛋白質與小分子之間的相互作用，從而提高傳感器的靈敏度。研究發(fā)現，在一種用于檢測甲狀腺激素的小分子生物傳感器中，通過對篩選得到的與甲狀腺激素具有高親和力的蛋白質進行結構分析，發(fā)現結合位點的一個氨基酸殘基與甲狀腺激素之間形成的氫鍵較弱。通過定點突變技術，將該氨基酸殘基替換為能夠形成更強氫鍵的氨基酸，使得蛋白質與甲狀腺激素之間的結合親和力提高了數倍。將優(yōu)化后的蛋白質應用于生物傳感器中，傳感器對甲狀腺激素的檢測靈敏度得到了顯著提升，能夠檢測到更低濃度的甲狀腺激素。引入信號放大機制是提高小分子生物傳感器靈敏度的有效策略。在基于熒光的小分子生物傳感器中，可以利用熒光信號放大技術，如酶催化熒光底物反應、熒光共振能量轉移級聯放大等，將小分子與蛋白質結合產生的熒光信號進行放大。在檢測腫瘤標志物小分子的熒光生物傳感器中，將與腫瘤標志物特異性結合的蛋白質與辣根過氧化物酶（HRP）融合。當腫瘤標志物與蛋白質結合后，HRP催化熒光底物反應，產生大量的熒光產物，使得熒光信號得到顯著放大，從而提高了傳感器的檢測靈敏度。在基于電化學的小分子生物傳感器中，可以采用納米材料修飾電極等方法來增強電化學反應信號。納米材料具有高比表面積、良好的導電性和催化活性等特點，能夠增加電極表面的反應活性位點，促進電子轉移，提高傳感器的靈敏度。將金納米顆粒修飾在檢測葡萄糖的電化學傳感器電極表面，金納米顆粒能夠增強葡萄糖氧化酶與電極之間的電子傳遞效率，提高電化學反應信號，使傳感器對葡萄糖的檢測靈敏度提高了一個數量級。優(yōu)化傳感器的結構和制備工藝也對提高靈敏度起著重要作用。合理設計傳感器的結構，減小檢測元件與目標小分子之間的距離，縮短傳質路徑，有利于提高傳感器的響應速度和靈敏度。在基于表面等離子體共振（SPR）的小分子生物傳感器中，通過優(yōu)化金屬薄膜的厚度和表面粗糙度，以及生物識別元件在金屬薄膜表面的固定方式，能夠增強SPR信號的變化，提高傳感器的靈敏度。研究表明，當金屬薄膜厚度為某一特定值時，SPR信號最強，傳感器的靈敏度最高。采用合適的制備工藝，保證生物識別元件在傳感器表面的均勻分布和高活性，也能夠提高傳感器的性能。在制備基于熒光的小分子生物傳感器時，采用層層自組裝技術將熒光標記的蛋白質均勻地固定在傳感器表面，能夠保證蛋白質的活性和穩(wěn)定性，提高傳感器的靈敏度和重復性。5.3拓展傳感器的檢測范圍利用蛋白篩選技術，能夠獲取能結合多種小分子的蛋白質，從而拓展小分子生物傳感器的檢測范圍，使其能夠檢測更多種類的小分子，滿足不同領域的多樣化檢測需求。傳統的小分子生物傳感器往往只能針對某一種或少數幾種特定的小分子進行檢測，這在很大程度上限制了其應用范圍。通過蛋白篩選技術，可以從豐富的蛋白質資源中篩選出對不同小分子具有特異性結合能力的蛋白質，為構建多功能、多檢測目標的小分子生物傳感器提供可能。實驗室篩選技術在拓展傳感器檢測范圍方面發(fā)揮著重要作用。噬菌體展示技術通過構建龐大的噬菌體文庫，其中包含了各種不同序列的蛋白質，可以對多種小分子進行篩選。將噬菌體文庫分別與不同的小分子進行孵育，如在環(huán)境監(jiān)測中，針對水體中的多種有機污染物小分子，如多環(huán)芳烴、農藥殘留等，以及重金屬離子小分子，如汞、鎘、鉛等，分別進行篩選。經過多輪篩選和富集，能夠得到分別與這些不同小分子特異性結合的噬菌體，進而獲得相應的特異性結合蛋白。將這些不同的結合蛋白應用于小分子生物傳感器中，就可以構建出能夠同時檢測多種小分子的生物傳感器。研究人員利用噬菌體展示技術，成功篩選出了分別對苯并芘（一種多環(huán)芳烴）和甲基對硫磷（一種農藥）具有高親和力的蛋白質。將這兩種蛋白質分別固定在基于電化學原理的生物傳感器電極表面，通過檢測電極表面電信號的變化，實現了對苯并芘和甲基對硫磷的同時檢測，拓展了傳感器的檢測范圍。核糖體展示技術同樣可以用于篩選與多種小分子結合的蛋白質。由于核糖體展示技術能夠在完全體外的環(huán)境中進行篩選，不受細胞內環(huán)境的限制，因此可以對一些在細胞內難以表達或具有毒性的小分子結合蛋白進行篩選。在篩選針對生物毒素小分子的結合蛋白時，利用核糖體展示技術，從mRNA文庫中篩選出了對肉毒毒素、黃曲霉毒素等多種生物毒素具有特異性結合能力的蛋白質。將這些蛋白質應用于基于熒光的小分子生物傳感器中，通過檢測熒光信號的變化，實現了對多種生物毒素的檢測，為食品安全檢測提供了有力的工具。計算機輔助篩選技術為拓展小分子生物傳感器的檢測范圍提供了高效、便捷的手段?；谛蛄邢嗨菩缘暮Y選方法，可以在蛋白質序列數據庫中搜索與多種已知小分子結合蛋白序列相似的蛋白質。假設這些相似序列的蛋白質可能具有相似的結構和功能，從而推測它們也可能與其他小分子具有結合能力。通過將已知的與葡萄糖結合的蛋白質序列在蛋白質數據庫中進行搜索，不僅得到了與葡萄糖結合的相似蛋白質，還發(fā)現了一些與其他糖類小分子如果糖、半乳糖等結合的蛋白質。這些蛋白質可用于構建能夠同時檢測多種糖類小分子的生物傳感器?；诮Y構特征的篩選方法，通過分析蛋白質的三維結構信息，如結合口袋的形狀、大小、氨基酸組成等，預測其與不同小分子的結合能力。利用蛋白質結構數據庫（PDB）中的數據，開發(fā)相應的算法和模型來分析蛋白質結構與小分子結合的關系。研究人員通過分析蛋白質結合口袋的特征，篩選出了一些能夠與不同類型小分子結合的蛋白質。這些蛋白質的結合口袋具有一定的柔性和適應性，能夠通過構象變化與多種小分子形成穩(wěn)定的相互作用。將這些蛋白質應用于小分子生物傳感器中，能夠實現對多種不同類型小分子的檢測，如同時檢測生物胺類小分子和有機酸類小分子?；诘鞍踪|與小分子相互作用預測的篩選方法，通過分子對接等技術，將多種小分子與蛋白質進行對接，預測蛋白質與不同小分子之間的相互作用模式和親和力。在藥物研發(fā)中，利用分子對接軟件將多種潛在的藥物小分子與蛋白質靶點進行對接，篩選出與不同小分子具有高親和力的蛋白質。這些蛋白質可用于構建生物傳感器，用于監(jiān)測藥物在體內的濃度變化以及藥物與靶點的相互作用情況。也可以將環(huán)境污染物小分子、生物標志物小分子等與蛋白質進行對接，篩選出能夠特異性結合這些小分子的蛋白質，從而拓展小分子生物傳感器在環(huán)境監(jiān)測和生物醫(yī)學診斷等領域的檢測范圍。六、基于計算機蛋白設計與篩選建立小分子生物傳感器的策略與流程6.1目標小分子與蛋白質的選擇在基于計算機蛋白設計與篩選建立小分子生物傳感器的過程中，目標小分子與蛋白質的選擇是至關重要的起始步驟，直接關系到后續(xù)設計和篩選工作的方向以及最終生物傳感器的性能。根據檢測需求選擇目標小分子是首要任務。在生物醫(yī)學領域，疾病的診斷和治療監(jiān)測常常依賴于對特定生物標志物小分子的檢測。對于癌癥的早期診斷，需要選擇如癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）等在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中異常表達的小分子作為目標。CEA在胃腸道腫瘤、肺癌等多種癌癥患者的血液中濃度會顯著升高，檢測其含量對于癌癥的早期發(fā)現和病情評估具有重要意義。在心血管疾病的診斷中，心肌肌鈣蛋白（cTn）等小分子生物標志物能夠反映心肌損傷程度，是檢測的關鍵目標。cTn在急性心肌梗死發(fā)生時，血液中的濃度會迅速上升，通過對其精確檢測，醫(yī)生可以及時準確地判斷患者的病情，制定合理的治療方案。在環(huán)境監(jiān)測方面，檢測需求主要圍繞各類污染物小分子。在水體污染監(jiān)測中，重金屬離子如汞離子（Hg2?）、鎘離子（Cd2?）、鉛離子（Pb2?）等，以及有機污染物如多環(huán)芳烴（PAHs）、農藥殘留等小分子是重點檢測對象。Hg2?具有高毒性，會對人體神經系統、腎臟等造成嚴重損害，對水體中Hg2?的檢測對于保障飲用水安全和生態(tài)環(huán)境健康至關重要。在大氣污染監(jiān)測中，揮發(fā)性有機化合物（VOCs）如苯、甲苯、二甲苯等小分子污染物會對空氣質量和人體健康產生負面影響，是需要重點監(jiān)測的目標。食品安全檢測則側重于檢測食品中的有害物質小分子。農藥殘留如有機磷農藥、氨基甲酸酯類農藥等，獸藥殘留如抗生素、激素等，以及生物毒素如黃曲霉毒素、肉毒毒素等小分子物質都可能對人體健康構成威脅，是食品安全檢測的關鍵目標。黃曲霉毒素是一種強致癌物質，常存在于霉變的糧食、堅果等食品中，對其進行快速、準確的檢測對于保障食品安全和消費者健康至關重要。選擇合適的蛋白質作為設計和篩選的基礎是構建小分子生物傳感器的另一個關鍵環(huán)節(jié)。蛋白質的結構和功能多樣性為小分子生物傳感器的設計提供了豐富的素材，但不同的蛋白質具有不同的特性，需要根據目標小分子的特點和檢測要求進行選擇。天然存在的具有小分子結合能力的蛋白質是重要的選擇對象。酶是一類具有高度特異性催化活性的蛋白質，許多酶能夠特異性地結合特定的小分子底物。葡萄糖氧化酶能夠特異性地結合葡萄糖，在催化葡萄糖氧化的過程中，會產生可檢測的信號變化，因此被廣泛應用于葡萄糖生物傳感器中。通過檢測葡萄糖氧化酶與葡萄糖結合后產生的過氧化氫等產物，實現對葡萄糖濃度的檢測?？贵w是免疫系統產生的一類蛋白質，能夠特異性地識別和結合抗原分子，包括小分子抗原。針對特定小分子制備的抗體可以作為生物識別元件應用于小分子生物傳感器中。在檢測食品中的黃曲霉毒素時，利用抗黃曲霉毒素抗體構建的免疫傳感器，能夠通過抗體與黃曲霉毒素的特異性結合，實現對黃曲霉毒素的高靈敏度檢測。蛋白質家族中的成員也為蛋白質選擇提供了廣闊的空間。某些蛋白質家族具有相似的結構和功能特征，通過對家族成員的研究和篩選，可以找到與目標小分子具有潛在結合能力的蛋白質。鋅指蛋白家族中的一些成員能夠通過其特定的結構域與小分子結合，并且可以通過對鋅指結構域的改造來調節(jié)其與小分子的結合特異性和親和力。研究人員通過對鋅指蛋白家族成員的篩選和改造，成功設計出能夠特異性結合特定小分子的蛋白質，用于構建小分子生物傳感器。考慮蛋白質的穩(wěn)定性、可表達性和可修飾性等因素也十分重要。穩(wěn)定性好的蛋白質能夠在不同的環(huán)境條件下保持其結構和功能的完整性，有利于生物傳感器的長期使用和儲存。在實際應用中，生物傳感器可能會面臨溫度、pH值等環(huán)境因素的變化，選擇具有良好穩(wěn)定性的蛋白質可以確保傳感器在不同條件下都能準確檢測目標小分子?？杀磉_性高的蛋白質便于在實驗室中進行大量表達和純化，降低生產成本，提高生產效率。許多細菌來源的蛋白質在大腸桿菌等表達系統中能夠高效表達，為小分子生物傳感器的制備提供了便利?？尚揎椥詮姷牡鞍踪|能夠方便地進行化學修飾或與其他分子進行融合，以實現更好的信號轉導和檢測性能。通過對蛋白質進行熒光標記、生物素標記等化學修飾，可以將蛋白質與熒光信號、生物素-親和素系統等相結合，提高生物傳感器的檢測靈敏度和選擇性。將熒光蛋白與目標蛋白質融合，利用熒光信號的變化來檢測小分子與蛋白質的結合事件，實現對小分子的高靈敏度檢測。6.2計算機蛋白設計流程6.2.1結構預測與模型構建在基于計算機蛋白設計與篩選建立小分子生物傳感器的過程中，結構預測與模型構建是至關重要的起始步驟。這一步驟旨在利用計算機工具，根據蛋白質的氨基酸序列信息，預測其三維結構，并構建初始的蛋白質結構模型，為后續(xù)的設計和優(yōu)化提供基礎。準確的結構預測和合理的模型構建能夠極大地提高蛋白設計的效率和成功率，為獲得高性能的小分子生物傳感器奠定堅實基礎。隨著計算生物學的快速發(fā)展，多種計算機工具被廣泛應用于蛋白質結構預測。同源建模是一種經典的結構預測方法，它基于蛋白質結構在進化中的保守性原理，以與目標蛋白質具有較高序列同源性且已知結構的蛋白質作為模板，通過計算機模擬和計算，構建目標蛋白質的三維結構模型。當目標蛋白質的氨基酸序列確定后，首先利用序列比對工具，如BLAST，在蛋白質結構數據庫（PDB）中搜索與之序列相似性較高的已知結構蛋白質，作為同源建模的模板。以預測一種新發(fā)現的與小分子結合的蛋白質結構為例，假設該蛋白質與數據庫中的某一已知結構的蛋白質具有60%的序列相似性，且二者在功能上也具有一定的相關性，那么就可以選擇該已知結構蛋白質作為模板。通過序列比對，確定目標蛋白質與模板蛋白質的對應氨基酸殘基，根據模板蛋白質的結構信息，構建目標蛋白質的初始骨架結構。再對目標蛋白質的側鏈進行優(yōu)化，調整側鏈的構象，使其符合能量最低原理，從而得到較為準確的目標蛋白質三維結構模型。同源建模方法的優(yōu)勢在于，如果能夠找到合適的模板，其預測結果相對準確可靠，并且計算成本較低。該方法也存在局限性，它依賴于已知結構的蛋白質模板，對于那些沒有合適模板的蛋白質，無法進行準確的結構預測。除了同源建模，近年來深度學習技術在蛋白質結構預測領域取得了重大突破，AlphaFold系列算法就是其中的杰出代表。AlphaFold基于深度學習中的Transformer架構，通過對海量蛋白質序列和結構數據的學習，能夠直接根據蛋白質的氨基酸序列準確預測其三維結構。AlphaFold2引入了多序列比對（MSA）和位置偏差（PositionalBias）等關鍵組件，MSA通過收集相關蛋白質序列，幫助識別保守的結構元素，為模型提供更多的進化信息；PositionalBias考慮到序列位置對結構的影響，讓模型更精準地預測每個位置的原子坐標。AlphaFold3在AlphaFold2的基礎上，進一步拓展了預測范圍，能夠高準確性預測蛋白質與其他各種生物分子相互作用的結構，包括配體（小分子）、蛋白質、核酸（DNA和RNA）等。在預測與小分子結合的蛋白質結構時，AlphaFold3利用其改進版的Evoformer模塊（一種蛋白質語言模型），對輸入的蛋白質序列和小分子結構信息進行處理。在處理過程中，模型充分學習蛋白質與小分子之間可能的相互作用模式和結構特征，然后通過擴散網絡進行預測，從一團原子云開始，經過許多步驟后，最終生成最準確的蛋白質與小分子結合的三維結構模型。AlphaFold系列算法的優(yōu)勢在于其預測準確性高，能夠解決許多傳統方法難以預測的蛋白質結構問題。其計算成本較高，對計算資源的要求也較為苛刻。構建初始蛋白質結構模型后，需要對模型進行評估和驗證，以確保模型的質量和可靠性。常用的評估指標包括模型的均方根偏差（RMSD）、Ramachandran圖分析等。RMSD用于衡量預測結構與實驗測定結構（如果有）或參考結構之間的原子坐標偏差，RMSD值越小，說明預測結構與參考結構越相似，模型的準確性越高。Ramachandran圖分析則用于評估蛋白質主鏈二面角的合理性，在Ramachandran圖中，合理的二面角分布區(qū)域應該在特定的范圍內，如果模型的二面角分布大部分位于合理區(qū)域，說明模型的主鏈構象較為合理。還可以利用一些專門的蛋白質結構驗證工具，如PROCHECK、VERIFY3D等，對模型進行全面的質量評估。PROCHECK可以分析模型的立體化學質量，包括鍵長、鍵角、手性等參數的合理性；VERIFY3D則通過計算模型的三維結構與一維氨基酸序列的兼容性，評估模型的整體質量。通過這些評估和驗證方法，可以及時發(fā)現模型中存在的問題，并對模型進行進一步的優(yōu)化和改進，為后續(xù)的蛋白設計和篩選提供高質量的結構模型。6.2.2優(yōu)化與模擬在完成蛋白質結構預測與模型構建后，對模型進行優(yōu)化與模擬是提高蛋白質性能、深入理解蛋白質與小分子相互作用機制的關鍵環(huán)節(jié)。通過對模型的優(yōu)化，可以消除結構中的不合理因素，使模型更加符合實際情況；利用分子動力學模擬等方法，可以預測蛋白質與小分子的結合模式和穩(wěn)定性，為篩選出高親和力、高特異性的蛋白質提供依據，進而提升小分子生物傳感器的性能。優(yōu)化蛋白質結構模型是提高模型質量的重要步驟。能量最小化是常用的優(yōu)化方法之一，它通過調整蛋白質原子的坐標，使蛋白質的總能量達到最小化，從而消除模型中的不合理張力和扭曲。在能量最小化過程中，通常采用分子力學力場來描述蛋白質原子之間的相互作用，如AMBER、CHARMM等力場。以AMBER力場為例，它考慮了蛋白質原子之間的范德華力、靜電相互作用、氫鍵等多種相互作用，通過求解能量函數的最小值，找到蛋白質的最穩(wěn)定構象。在使用AMBER力場進行能量最小化時，首先定義蛋白質的初始結構和力場參數，然后通過迭代計算，逐步調整原子坐標，使蛋白質的總能量逐漸降低，直到達到能量最小值，得到優(yōu)化后的蛋白質結構。除了能量最小化，還可以采用分子動力學模擬進行結構優(yōu)化。分子動力學模擬基于牛頓運動定律，通過求解原子之間的相互作用力，模擬蛋白質在一段時間內的動態(tài)運動過程。在模擬過程中，蛋白質原子在力場的作用下不斷運動，其構象也隨之發(fā)生變化。通過對模擬軌跡的分析，可以找到蛋白質的多種構象狀態(tài)，并選擇其中能量較低、結構較為穩(wěn)定的構象作為優(yōu)化后的結構。在進行分子動力學模擬時，需要設置合適的模擬參數，如模擬時間、溫度、壓力等。模擬時間決定了能夠觀察到的蛋白質動態(tài)變化的時間尺度，溫度和壓力則影響蛋白質的構象和動力學行為。通常情況下，模擬時間可以設置為幾納秒到幾百納秒不等，溫度一般設置為生理溫度（310K），壓力設置為標準大氣壓（1atm）。通過合理設置這些參數，可以更真實地模擬蛋白質在生理條件下的行為，得到更準確的優(yōu)化結構。分子動力學模擬在預測蛋白質與小分子的結合模式和穩(wěn)定性方面具有重要作用。通過將小分子引入到蛋白質結構模型中，模擬蛋白質與小分子在溶液環(huán)境中的相互作用過程，可以獲得蛋白質與小分子的結合模式、結合親和力以及結合穩(wěn)定性等信息。在進行分子動力學模擬時，首先需要構建蛋白質-小分子復合物模型，將小分子放置在蛋白質的可能結合位點附近。然后，添加溶劑分子和離子，構建